三氧化二砷和順鉑協(xié)同誘導人肝癌HepG2細胞凋亡機制的深度解析一、引言1.1研究背景肝癌作為全球范圍內嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率長期居高不下，給患者家庭及社會帶來了沉重的負擔。據(jù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，肝癌在全球惡性腫瘤發(fā)病率中位居前列，每年新增病例數(shù)持續(xù)攀升，且呈現(xiàn)出地域分布差異明顯的特點，在亞洲、非洲等地區(qū)尤為高發(fā)。我國更是肝癌大國，發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)占全球的近50%，嚴重危害國民健康。肝癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時已處于中晚期。中晚期肝癌患者往往伴有肝內轉移、血管侵犯或遠處轉移，這使得手術切除率低，患者預后極差，5年生存率僅在10%-20%左右。目前，肝癌的治療手段主要包括手術切除、肝移植、介入治療、化療、靶向治療和免疫治療等。然而，這些治療方法均存在一定的局限性。手術切除雖為根治性治療手段，但僅適用于早期肝癌患者，且術后復發(fā)率較高；肝移植受供體短缺、手術風險和免疫排斥等因素限制，難以廣泛開展；介入治療對于部分患者可起到一定的控制腫瘤生長作用，但難以徹底清除腫瘤細胞；化療作為肝癌綜合治療的重要組成部分，雖能在一定程度上抑制腫瘤細胞的生長和繁殖，但由于肝癌細胞對傳統(tǒng)化療藥物的敏感性較低，且化療藥物在殺傷腫瘤細胞的同時，也會對正常細胞造成嚴重損傷，引發(fā)如惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等一系列不良反應，導致患者生活質量下降，甚至部分患者因無法耐受化療副作用而中斷治療。因此，尋找高效、低毒的新型治療策略，提高肝癌治療效果，改善患者預后，成為當前肝癌研究領域亟待解決的關鍵問題。順鉑作為一種經典的化療藥物，廣泛應用于多種實體瘤的治療，其作用機制主要是通過與腫瘤細胞DNA結合，形成鏈內和鏈間交聯(lián)，從而抑制DNA復制和轉錄，誘導腫瘤細胞凋亡。然而，肝癌細胞對順鉑易產生耐藥性，導致單藥治療效果有限。三氧化二砷最初用于治療急性早幼粒細胞白血病，取得了顯著療效。近年來研究發(fā)現(xiàn)，三氧化二砷對多種實體瘤包括肝癌也具有一定的抗腫瘤活性，可通過誘導細胞凋亡、抑制細胞增殖和血管生成等多種途徑發(fā)揮作用?；谌趸楹晚樸K不同的作用機制，聯(lián)合使用這兩種藥物有可能克服單一藥物的局限性，增強對肝癌細胞的殺傷作用，為肝癌的治療提供新的思路和方法。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究三氧化二砷和順鉑單獨及聯(lián)合應用對人肝癌HepG2細胞凋亡的誘導作用，并進一步闡明其潛在的分子作用機制。具體而言，通過細胞實驗，運用MTT法檢測不同濃度的三氧化二砷和順鉑單獨及聯(lián)合作用于人肝癌HepG2細胞后的細胞增殖抑制率，明確兩種藥物的最佳作用濃度和時間；利用AnnexinV-FITC/PI雙染法結合流式細胞術精確分析細胞凋亡率，直觀呈現(xiàn)藥物對細胞凋亡的影響；采用Westernblot技術檢測凋亡相關蛋白如caspase-3、Bcl-2、Bax等的表達水平變化，從分子層面揭示藥物誘導細胞凋亡的內在機制；運用實時熒光定量PCR（RT-qPCR）技術檢測相關基因的表達變化，進一步驗證蛋白水平的結果，深入探討藥物作用的分子生物學機制。從理論意義來看，深入研究三氧化二砷和順鉑誘導人肝癌HepG2細胞凋亡的作用及機制，有助于豐富我們對肝癌細胞凋亡調控機制的理解，為肝癌的發(fā)病機制研究提供新的視角和理論依據(jù)。通過揭示這兩種藥物聯(lián)合作用的分子機制，能夠進一步明確細胞凋亡信號通路在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的關鍵作用，加深對腫瘤細胞生物學行為的認識，從而推動腫瘤學基礎研究的發(fā)展。從實際應用價值來說，本研究的成果有望為肝癌的臨床治療提供新的策略和方法。若能證實三氧化二砷和順鉑聯(lián)合使用可有效誘導肝癌細胞凋亡，且具有協(xié)同增效作用，那么在臨床實踐中，可嘗試將這種聯(lián)合用藥方案應用于肝癌患者的治療，提高化療效果，降低肝癌的復發(fā)率和死亡率，改善患者的預后和生活質量。此外，研究結果還可能為開發(fā)新型肝癌治療藥物提供重要的實驗依據(jù)和思路，有助于篩選和研發(fā)更具針對性、高效低毒的抗癌藥物，推動肝癌治療領域的技術創(chuàng)新和發(fā)展，為肝癌患者帶來更多的治療選擇和生存希望。1.3研究方法與技術路線本研究采用多種實驗方法，從細胞增殖、凋亡及分子機制等多個層面深入探究三氧化二砷和順鉑誘導人肝癌HepG2細胞凋亡的作用。具體研究方法如下：細胞培養(yǎng)：人肝癌HepG2細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，定期換液，待細胞生長至對數(shù)期時進行后續(xù)實驗。MTT法檢測細胞增殖抑制率：將處于對數(shù)生長期的HepG2細胞以每孔5×103個細胞的密度接種于96孔板，培養(yǎng)24h使細胞貼壁。分別加入不同濃度梯度（三氧化二砷設置為0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L；順鉑設置為5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L）的三氧化二砷、順鉑及二者聯(lián)合藥物（聯(lián)合藥物按不同比例組合，如三氧化二砷0.5μmol/L與順鉑5μmol/L聯(lián)合等），每個濃度設置5個復孔，同時設置不加藥物的空白對照組。繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），孵育4h，棄去上清，加入150μLDMSO，振蕩10min使結晶充分溶解。使用酶標儀在490nm波長處測定各孔吸光度（OD）值，按照公式計算細胞生長抑制率：細胞生長抑制率（%）=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。以藥物濃度為橫坐標，細胞生長抑制率為縱坐標，繪制細胞生長抑制曲線，并通過計算兩藥相互作用系數(shù)（CDI）來評價兩種藥物的相互作用性質，判斷聯(lián)合用藥是否具有協(xié)同增效、相加或拮抗作用。AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率：將HepG2細胞以每孔1×10?個細胞接種于6孔板，培養(yǎng)24h后，加入篩選出的最佳作用濃度和時間的三氧化二砷、順鉑及二者聯(lián)合藥物處理細胞。處理結束后，用不含EDTA的胰蛋白酶消化細胞，收集細胞懸液，1000r/min離心5min，棄上清，PBS洗滌細胞2次。按照AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書操作，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染色液，輕輕混勻，避光室溫孵育15min，再加入400μL結合緩沖液，1h內利用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。根據(jù)流式細胞儀檢測結果，分析早期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細胞和壞死細胞（AnnexinV?/PI?）所占比例，計算細胞凋亡率。Westernblot檢測凋亡相關蛋白表達：藥物處理后的HepG2細胞，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌2次，加入適量細胞裂解液，冰上裂解30min，12000r/min離心15min，收集上清，采用BCA法測定蛋白濃度。取等量蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，將分離后的蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，分別加入caspase-3、Bcl-2、Bax等凋亡相關蛋白的一抗（稀釋比例根據(jù)抗體說明書確定），4℃孵育過夜。次日，TBST洗滌膜3次，每次10min，加入相應的HRP標記的二抗（稀釋比例根據(jù)抗體說明書確定），室溫孵育1h，TBST再次洗滌3次，每次10min。使用化學發(fā)光底物顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光、拍照，利用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內參β-actin條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量，比較不同處理組間凋亡相關蛋白表達水平的差異。實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測相關基因表達：采用Trizol法提取藥物處理后HepG2細胞的總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，使用特異性引物（引物序列根據(jù)GenBank中目的基因序列設計，并經BLAST比對驗證）進行qPCR擴增。反應體系和反應條件根據(jù)所使用的qPCR試劑盒說明書進行設置。反應結束后，采用2?ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量，以GAPDH作為內參基因，比較不同處理組間相關基因表達水平的變化，進一步驗證Westernblot檢測結果，從基因水平探究藥物誘導細胞凋亡的機制。技術路線如圖1-1所示，首先進行細胞培養(yǎng)，獲得足夠數(shù)量且狀態(tài)良好的人肝癌HepG2細胞。接著利用MTT法對不同濃度的三氧化二砷和順鉑單藥及聯(lián)合用藥進行細胞毒性檢測，篩選出最佳作用濃度和時間。然后在最佳條件下，采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結合流式細胞術分析細胞凋亡率，直觀展示藥物對細胞凋亡的影響。同時，運用Westernblot技術和RT-qPCR技術分別從蛋白和基因水平檢測凋亡相關蛋白和基因的表達變化，深入探討藥物誘導細胞凋亡的分子機制。通過這一系列實驗方法和技術路線，系統(tǒng)地研究三氧化二砷和順鉑誘導人肝癌HepG2細胞凋亡的作用及機制。<插入圖片1張，圖片內容為技術路線圖，圖注為：圖1-1技術路線圖>二、三氧化二砷與順鉑的抗癌特性2.1三氧化二砷的抗癌研究進展三氧化二砷（ArsenicTrioxide，As_2O_3），作為中藥砒霜的主要成分，雖有劇毒，但在醫(yī)學領域尤其是抗癌研究中展現(xiàn)出獨特的價值。其抗癌歷史可追溯到20世紀70年代，我國學者率先將其應用于復發(fā)性和難治性急性早幼粒細胞性白血?。ˋPL）的治療，取得了令人矚目的成果，完全緩解率高達52%-92%。此后，三氧化二砷逐漸受到國內外學者的廣泛關注，研究范圍也不斷拓展至多種惡性腫瘤的治療。在白血病治療方面，三氧化二砷已成為APL治療的重要藥物之一。它能夠通過多種機制發(fā)揮治療作用，其中誘導細胞凋亡是其關鍵作用機制之一。三氧化二砷可以激活有絲分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）信號通路，該通路在細胞生長、分化、凋亡等過程中發(fā)揮著重要的調節(jié)作用。當三氧化二砷激活MAPK信號通路后，可促使白血病細胞發(fā)生凋亡，從而有效清除體內的白血病細胞。三氧化二砷還能抑制端粒酶活性及端粒酶逆轉錄酶基因的表達。端粒酶在維持細胞端粒長度、保證細胞持續(xù)增殖方面起著關鍵作用，白血病細胞中常存在端粒酶活性異常升高的情況。三氧化二砷通過抑制端粒酶相關活性和基因表達，打破了白血病細胞的無限增殖能力，誘導其走向凋亡。在APL患者的治療中，三氧化二砷不僅能夠誘導白血病細胞凋亡，還能使早幼粒細胞成熟、分化，使早幼粒細胞下降，中晚幼粒細胞及桿狀、分葉核細胞逐漸增多，最終使病情得到完全緩解，這為白血病的治療提供了一種全新的思路和方法，即通過誘導細胞分化來達到治療白血病的目的。隨著研究的深入，三氧化二砷在實體瘤治療領域也逐漸嶄露頭角。在消化系統(tǒng)腫瘤方面，多項研究表明三氧化二砷對肝癌、胃癌、食管癌等具有一定的治療效果。在肝癌治療中，項穎等報道，三氧化二砷治療16例中晚期肝癌患者，有效率達到18.6%。朱安龍等通過動脈和靜脈途徑給予三氧化二砷治療67例不能手術切除的原發(fā)性肝癌患者，完全緩解率為4.5%，部分緩解率為35.8%，多數(shù)患者自覺癥狀得到改善。2004年9月，我國食品藥品監(jiān)督局正式批準三氧化二砷注射液可用于晚期原發(fā)性肝癌的治療，這標志著三氧化二砷在肝癌治療中的應用得到了官方認可。在胃癌研究中，涂水平等發(fā)現(xiàn)三氧化二砷誘導胃癌細胞凋亡的作用與藥物濃度和時間存在相關性；鄧志華等也證實三氧化二砷對胃癌、結腸癌、胰腺癌細胞均具有明顯的抑制腫瘤細胞生長和誘導凋亡的作用。對于食管癌，沈忠英等研究發(fā)現(xiàn)三氧化二砷可作為治療食管癌的輔助藥物，為食管癌的綜合治療提供了新的選擇。在呼吸系統(tǒng)腫瘤方面，三氧化二砷同樣顯示出一定的抗癌活性。Du等研究發(fā)現(xiàn)，三氧化二砷對人鼻咽癌低分化鱗癌裸鼠移植瘤細胞有誘導分化作用，使用后腫瘤生長受到抑制，腫瘤細胞密度減少，出現(xiàn)角化細胞和角化珠等分化特征；電鏡下可見細胞間橋粒增多并互相連接，核漿比例降低，出現(xiàn)大量張力纖維并圍繞核周；增值細胞核抗原表達明顯減少，表明三氧化二砷能夠抑制腫瘤細胞的增殖和促進其分化。董繼華等用4μmol/L的三氧化二砷處理人肺癌GLC-82細胞株96h后，增殖抑制率可達81.05%，細胞周期阻滯于G2/M期，說明三氧化二砷可以通過影響細胞周期來抑制肺癌細胞的增殖。陳黎明發(fā)現(xiàn)三氧化二砷對口腔鱗癌細胞具有顯著的體外生長抑制及凋亡誘導作用，為口腔鱗癌的治療提供了潛在的治療藥物。在生殖系統(tǒng)腫瘤治療研究中，三氧化二砷也展現(xiàn)出了良好的應用前景。黃守國等進行系列研究發(fā)現(xiàn)，三氧化二砷能誘導人卵巢癌細胞凋亡，且對人卵巢癌耐藥細胞株細胞增殖和轉移能力有很強的抑制作用，這為卵巢癌的治療，尤其是耐藥卵巢癌的治療提供了新的希望。劉明遠等研究表明三氧化二砷能誘導宮頸癌HeLa細胞凋亡，其機制可能與降低線粒體膜電位有關；而呂秀寧等則報道其機制可能與三氧化二砷抑制細胞內端粒酶活性有關，雖然具體機制尚未完全明確，但這些研究都為宮頸癌的治療提供了深入研究的方向。陳鑫等研究表明三氧化二砷對人乳腺癌裸鼠移植瘤具有抑瘤作用，且無明顯毒副作用，這為乳腺癌的治療提供了一種低毒有效的治療選擇。Maeda等在用三氧化二砷處理人男性激素非依賴性的前列腺癌細胞株PC-3、DU-145和TSU-PR1時發(fā)現(xiàn)高濃度的三氧化二砷能使細胞發(fā)生凋亡，并使p38和JNK活化，進一步揭示了三氧化二砷在前列腺癌治療中的作用機制。在其他腫瘤治療中，陸地等研究表明三氧化二砷可通過下調Bcl-xL蛋白的表達和激活caspase-3誘導人類惡性淋巴瘤細胞凋亡；童強松等研究了三氧化二砷對人膀胱癌細胞株BIU-87的作用，發(fā)現(xiàn)其具有抑制腫瘤生長，下調bcl-2基因表達、誘導細胞凋亡的作用。這些研究成果為惡性淋巴瘤和膀胱癌的治療提供了新的策略和方法。然而，三氧化二砷在臨床應用中也存在一些局限性。三氧化二砷具有一定的毒性，在治療過程中可能會引發(fā)一系列不良反應，如惡心、嘔吐、頭痛、疲勞或虛弱、腹瀉、咳嗽、心臟問題、骨髓抑制、電解質失衡、視力問題等。在使用三氧化二砷治療白血病時，需要密切監(jiān)測患者的心電圖，警惕其導致的QT間期延長。對于實體瘤患者，三氧化二砷的療效仍有待進一步提高，部分患者對三氧化二砷的敏感性較低，治療效果不理想。目前三氧化二砷的作用機制尚未完全明確，雖然已經發(fā)現(xiàn)其通過多種途徑發(fā)揮抗癌作用，但具體的分子機制和信號通路仍存在許多未知之處，這也限制了其在臨床治療中的進一步應用和優(yōu)化。2.2順鉑的抗癌作用機制與應用順鉑（Cisplatin，CDDP），化學名為順式-二氯二氨合鉑（Ⅱ），是一種重要的金屬鉑類化療藥物，自20世紀70年代被發(fā)現(xiàn)具有抗癌活性以來，在腫瘤治療領域得到了廣泛的應用。順鉑的抗癌作用機制較為復雜，主要是通過與腫瘤細胞內的DNA結合，從而破壞DNA的結構和功能，進而抑制腫瘤細胞的增殖和生長。具體來說，順鉑進入細胞后，首先在細胞內的氯離子濃度較低的環(huán)境下，其兩個氯原子被水分子取代，形成帶正電荷的水化配合物。這種水化配合物具有較高的活性，能夠迅速與DNA分子中的鳥嘌呤、腺嘌呤等堿基發(fā)生配位反應，形成鏈內交聯(lián)（主要是1,2-鳥嘌呤-鳥嘌呤和1,2-腺嘌呤-鳥嘌呤交聯(lián)）和鏈間交聯(lián)。這些交聯(lián)結構的形成，使得DNA雙螺旋結構發(fā)生扭曲和變形，阻礙了DNA的正常復制和轉錄過程。DNA復制是細胞增殖的關鍵步驟，當DNA復制受到抑制時，細胞無法正常分裂，從而導致腫瘤細胞的增殖受到阻礙；而DNA轉錄是合成RNA的過程，RNA在蛋白質合成中起著重要的模板作用，轉錄過程受阻則會影響蛋白質的合成，進而影響細胞的各種生理功能。順鉑還可以通過激活細胞內的凋亡信號通路，誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡。它可以促使線粒體損傷，導致線粒體膜電位下降，釋放細胞色素C等凋亡相關因子，激活caspase蛋白酶家族，引發(fā)級聯(lián)反應，最終導致腫瘤細胞的程序性死亡。順鉑還具有一定的免疫增強作用，可以刺激T淋巴細胞、B淋巴細胞等多種免疫細胞的功能，提高機體的免疫力，從而間接發(fā)揮抗腫瘤作用。順鉑具有抗癌譜廣的特點，是多種實體瘤治療的一線藥物。在肺癌治療方面，順鉑常與其他化療藥物聯(lián)合使用，如順鉑與吉西他濱聯(lián)合（GP方案）、順鉑與紫杉醇聯(lián)合（TP方案）、順鉑與培美曲塞聯(lián)合（PP方案）等，這些聯(lián)合化療方案廣泛應用于非小細胞肺癌和小細胞肺癌的治療。對于非小細胞肺癌患者，GP方案能夠有效抑制腫瘤細胞的生長，提高患者的生存率；TP方案則在改善患者的生活質量和延長生存期方面具有一定的優(yōu)勢。在小細胞肺癌治療中，順鉑聯(lián)合依托泊苷（EP方案）是經典的一線治療方案，該方案能夠顯著提高小細胞肺癌患者的緩解率和生存率。在卵巢癌治療中，順鉑同樣發(fā)揮著重要作用。順鉑與阿霉素（ADM）的聯(lián)合化療方案，可使40%以上的卵巢癌患者取得較好的療效；順鉑與博來霉素（BLM）、長春花堿（VLB）的聯(lián)合化療，對于非精原細胞睪丸癌的有效率與治愈率分別達到80%和60%，同時也可用于絨癌、宮頸癌等其他生殖系統(tǒng)腫瘤的治療。順鉑還常用于頭頸部癌的治療，包括鼻咽癌、甲狀腺癌、喉癌等。對于膀胱癌，順鉑也是重要的治療藥物之一，與其他藥物聯(lián)合使用可提高治療效果。順鉑對惡性淋巴瘤、乳腺癌、腎細胞癌、前列腺癌、軟組織肉瘤、惡性黑色素瘤等也有一定的療效。然而，順鉑在臨床應用中也面臨著一些問題。順鉑具有較強的毒副作用，其毒副作用涉及多個系統(tǒng)。腎毒性是順鉑主要的劑量限制性毒性反應，發(fā)生率為28%-36%，反復應用或持續(xù)高劑量應用會對腎功能產生不可逆損害。順鉑進入人體后，主要通過腎臟排泄，在腎臟中積聚，可導致腎小管上皮細胞損傷，影響腎臟的正常功能，表現(xiàn)為血肌酐升高、尿素氮升高、蛋白尿等。為了減輕腎毒性，臨床在使用順鉑時，通常會加強水化和利尿措施，增加尿量，促進順鉑的排泄。胃腸道反應也是順鉑常見的毒副作用之一，順鉑屬于高致吐性化療藥物，其引起的化療相關性嘔吐（CINV）發(fā)生率在90%以上，嚴重的惡心、嘔吐會影響患者的營養(yǎng)攝入和生活質量，臨床需要合理應用止吐藥物來緩解這一癥狀。順鉑還具有神經毒性，主要表現(xiàn)為神經末梢感覺障礙，患者會出現(xiàn)麻木、刺痛感，部分患者可能伴有頭昏、耳鳴等癥狀；耳毒性也是順鉑的主要不良反應之一，注射順鉑后，患者可出現(xiàn)耳鳴和聽力下降等癥狀，且順鉑引起的耳聾大多為不可逆性，在兒童患者中，順鉑所致耳毒性不良反應的發(fā)生率高達61%。順鉑還可能導致血液毒性，發(fā)生率約為25%-30%，主要表現(xiàn)為粒細胞減少、血小板減少及貧血，還可能誘發(fā)過敏反應，發(fā)生率為5%-20%。腫瘤細胞對順鉑產生耐藥性也是限制其療效的重要因素。順鉑耐藥的機制十分復雜，涉及多個方面。腫瘤細胞可能通過減少順鉑的攝取，降低細胞內順鉑的濃度，從而減弱順鉑對DNA的損傷作用。一些耐藥細胞會表達特定的轉運蛋白，如P-糖蛋白（P-gp）、多藥耐藥相關蛋白（MRP）等，這些轉運蛋白能夠將進入細胞內的順鉑泵出細胞外，導致細胞內順鉑濃度降低，無法達到有效殺傷腫瘤細胞的劑量。腫瘤細胞還可能增強對受損DNA的修復能力，當順鉑與DNA結合形成交聯(lián)結構后，耐藥細胞會激活一系列DNA修復機制，如核苷酸切除修復（NER）、堿基切除修復（BER）等，快速修復受損的DNA，使腫瘤細胞得以繼續(xù)存活和增殖。腫瘤細胞內的凋亡信號通路異常也與順鉑耐藥密切相關，一些抗凋亡蛋白如Bcl-2家族成員的高表達，或促凋亡蛋白如Bax等的低表達，會抑制順鉑誘導的細胞凋亡，使得腫瘤細胞對順鉑的敏感性降低。腫瘤細胞的代謝改變、微環(huán)境變化等因素也可能參與了順鉑耐藥的形成。順鉑耐藥嚴重影響了順鉑的臨床治療效果，導致腫瘤復發(fā)和轉移，給患者的治療帶來了極大的挑戰(zhàn)。三、實驗材料與方法3.1實驗材料細胞株：人肝癌HepG2細胞株購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫，該細胞株來源于一位15歲白人男性的肝癌組織，具有肝癌細胞的典型生物學特性，如細胞呈上皮樣形態(tài)，貼壁生長，可分泌多種血漿蛋白，常用于肝癌相關的基礎研究。藥物：三氧化二砷（As_2O_3）購自Sigma-Aldrich公司，為白色粉末狀，純度≥99%，其化學結構穩(wěn)定，在水中微溶，使用時需用適量的氫氧化鈉溶液溶解后，再用細胞培養(yǎng)液稀釋至所需濃度；順鉑（Cisplatin）購自江蘇豪森藥業(yè)集團有限公司，為凍干粉末制劑，每瓶含順鉑10mg，使用時用生理鹽水溶解，現(xiàn)用現(xiàn)配，以確保藥物的活性。培養(yǎng)基：DMEM培養(yǎng)基（Dulbecco'sModifiedEagleMedium）購自Gibco公司，該培養(yǎng)基富含多種氨基酸、維生素、葡萄糖等營養(yǎng)成分，可為細胞生長提供充足的物質基礎；胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）購自杭州四季青生物工程材料有限公司，其含有豐富的生長因子、激素和其他營養(yǎng)物質，能夠促進細胞的生長和增殖，使用時將胎牛血清按10%的體積比加入到DMEM培養(yǎng)基中；青霉素-鏈霉素雙抗溶液（Penicillin-StreptomycinSolution）購自碧云天生物技術有限公司，每毫升含青霉素10000U和鏈霉素10mg，在培養(yǎng)基中添加1%的雙抗溶液，可有效防止細胞培養(yǎng)過程中的細菌污染。主要試劑：MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）購自Sigma-Aldrich公司，為黃色結晶粉末，是一種用于檢測細胞增殖和細胞毒性的常用試劑，其原理是活細胞中的線粒體琥珀酸脫氫酶能夠將MTT還原為不溶性的藍紫色甲瓚結晶，通過檢測甲瓚結晶的生成量來間接反映細胞的活性；DMSO（二甲基亞砜）購自國藥集團化學試劑有限公司，為無色透明液體，具有高極性、高沸點、熱穩(wěn)定性好等特點，在MTT實驗中用于溶解甲瓚結晶，以便于用酶標儀進行吸光度測定；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自BDBiosciences公司，該試劑盒用于檢測細胞凋亡，其中AnnexinV-FITC能夠特異性地結合到凋亡細胞表面外翻的磷脂酰絲氨酸，而PI（碘化丙啶）則可進入壞死細胞和晚期凋亡細胞，使細胞核染色，通過流式細胞儀檢測兩種熒光信號，可區(qū)分活細胞、早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞和壞死細胞；RIPA裂解液（RadioImmunoprecipitationAssayLysisBuffer）購自碧云天生物技術有限公司，用于裂解細胞，提取細胞總蛋白，其含有多種蛋白酶抑制劑，可有效防止蛋白降解；BCA蛋白定量試劑盒（BicinchoninicAcidProteinAssayKit）購自ThermoFisherScientific公司，基于BCA法原理，通過檢測蛋白質與BCA試劑形成的紫色絡合物在562nm處的吸光度，來準確測定蛋白濃度；PVDF膜（PolyvinylideneFluorideMembrane）購自Millipore公司，是一種疏水性的高分子聚合物膜，具有良好的化學穩(wěn)定性和機械強度，在Westernblot實驗中用于蛋白質的轉膜；caspase-3、Bcl-2、Bax等凋亡相關蛋白的一抗及HRP標記的二抗均購自CellSignalingTechnology公司，這些抗體具有高特異性和高親和力，能夠準確識別相應的蛋白，用于Westernblot實驗中檢測凋亡相關蛋白的表達水平；Trizol試劑購自Invitrogen公司，是一種新型總RNA抽提試劑，可快速、有效地從細胞或組織中提取高質量的總RNA；逆轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒均購自TaKaRa公司，用于將RNA逆轉錄為cDNA，并進行實時熒光定量PCR擴增，以檢測相關基因的表達水平。主要儀器：CO?細胞培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），可提供穩(wěn)定的37℃培養(yǎng)溫度和5%CO?的培養(yǎng)環(huán)境，滿足細胞生長的需求；超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司），通過過濾空氣中的塵埃和微生物，為細胞培養(yǎng)等實驗操作提供無菌環(huán)境；倒置顯微鏡（Olympus公司），用于觀察細胞的形態(tài)、生長狀態(tài)和貼壁情況等；酶標儀（Bio-Rad公司），可在特定波長下測定吸光度，用于MTT實驗中細胞增殖抑制率的檢測；流式細胞儀（BDBiosciences公司），能夠對細胞進行多參數(shù)分析，準確檢測細胞凋亡率；蛋白電泳儀和轉膜儀（Bio-Rad公司），分別用于蛋白質的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離和轉膜操作；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司），用于檢測Westernblot實驗中的化學發(fā)光信號，拍攝蛋白條帶圖像；實時熒光定量PCR儀（AppliedBiosystems公司），可實時監(jiān)測PCR擴增過程中熒光信號的變化，精確測定基因的表達水平；高速冷凍離心機（Eppendorf公司），用于細胞、蛋白和核酸等樣品的離心分離。3.2實驗方法3.2.1細胞培養(yǎng)人肝癌HepG2細胞從液氮罐中取出后，迅速放入37℃水浴中快速解凍，待細胞完全融化后，將其轉移至含有5mL預熱的完全培養(yǎng)基（DMEM培養(yǎng)基添加10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素雙抗溶液）的離心管中，1000r/min離心5min，棄去上清液，用新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔1-2天觀察細胞生長狀態(tài)，當培養(yǎng)基顏色變黃，且細胞生長至80%-90%匯合度時，進行細胞傳代。傳代時，棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用3mLPBS緩沖液輕輕洗滌細胞2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質；加入1mL0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液，輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，使消化液均勻覆蓋細胞表面，將培養(yǎng)瓶置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2min，期間在倒置顯微鏡下觀察細胞消化情況，當細胞變圓、間隙增大且開始脫落時，立即加入2mL含有血清的完全培養(yǎng)基終止消化；用移液器輕輕吹打細胞，使細胞從培養(yǎng)瓶壁上完全脫落并分散成單細胞懸液，將細胞懸液轉移至離心管中，1000r/min離心5min；棄去上清液，用適量新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細胞，按照1:2-1:3的比例將細胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，補充適量的完全培養(yǎng)基，輕輕搖勻后放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。在細胞培養(yǎng)過程中，嚴格遵守無菌操作原則，所有實驗操作均在超凈工作臺中進行，使用的培養(yǎng)器皿、試劑等均經過嚴格的滅菌處理，避免細胞受到細菌、真菌、支原體等微生物的污染。定期對細胞進行支原體檢測，確保細胞培養(yǎng)環(huán)境的安全性和細胞質量的穩(wěn)定性。3.2.2細胞毒性實驗（MTT法）MTT法檢測細胞毒性的原理基于活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠將外源性的MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）還原為難溶性的藍紫色結晶物甲瓚（Formazan），而死細胞由于缺乏線粒體活性，無法進行此還原反應。通過酶標儀測定甲瓚結晶在特定波長下的吸光度，吸光度的高低與活細胞數(shù)量成正比，從而間接反映細胞的活性和增殖情況。具體操作過程如下：將處于對數(shù)生長期的HepG2細胞用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液消化后，用完全培養(yǎng)基重懸細胞，調整細胞密度為5×103個/mL，將細胞懸液接種于96孔板，每孔加入200μL，即每孔含1×103個細胞。將96孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育24h，使細胞貼壁。待細胞貼壁后，進行藥物處理。分別設置空白對照組（不加藥物，只加入等體積的完全培養(yǎng)基）、溶劑對照組（加入溶解藥物的溶劑，其體積與藥物組中溶劑體積相同）、不同濃度的三氧化二砷單藥處理組（三氧化二砷濃度設置為0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L）、不同濃度的順鉑單藥處理組（順鉑濃度設置為5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L）以及不同比例的三氧化二砷和順鉑聯(lián)合藥物處理組（如三氧化二砷0.5μmol/L與順鉑5μmol/L聯(lián)合、三氧化二砷1μmol/L與順鉑10μmol/L聯(lián)合等，每種聯(lián)合組合設置多個濃度梯度），每個濃度設置5個復孔。藥物處理時，先吸棄96孔板中原有的培養(yǎng)基，然后向相應孔中加入含不同藥物及濃度的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h。在各時間點結束培養(yǎng)前4h，向每孔中加入20μLMTT溶液（5mg/mL，用PBS緩沖液配制，過濾除菌），輕輕振蕩混勻，繼續(xù)將96孔板置于培養(yǎng)箱中孵育4h。4h后，小心吸棄96孔板中的上清液，避免吸到甲瓚結晶，每孔加入150μLDMSO（二甲基亞砜），振蕩10min，使甲瓚結晶充分溶解。使用酶標儀在490nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。按照公式計算細胞生長抑制率：細胞生長抑制率（%）=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。以藥物濃度為橫坐標，細胞生長抑制率為縱坐標，繪制細胞生長抑制曲線。為了評價三氧化二砷和順鉑聯(lián)合使用時的相互作用性質，采用中效原理（Chou-Talalay法）計算兩藥相互作用系數(shù)（CombinationIndex，CDI），當CDI<1時，表示兩藥具有協(xié)同增效作用；當CDI=1時，表示兩藥具有相加作用；當CDI>1時，表示兩藥具有拮抗作用。3.2.3細胞凋亡分析AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡的原理基于細胞凋亡過程中細胞膜磷脂分布的變化。在正常的活細胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）主要位于細胞膜的內側，但在凋亡早期，細胞膜內的PS會從內側翻轉到細胞膜表面。AnnexinV是一種鈣依賴性磷脂結合蛋白，能與PS高親和力特異性結合，將AnnexinV進行熒光素FITC標記后，可作為探針用于檢測細胞凋亡早期PS外翻的情況。PI（碘化丙啶）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，因此正?；罴毎驮缙诘蛲黾毎募毎I有拒染性；而在凋亡中晚期的細胞和死細胞，細胞膜的通透性增加，PI能透過細胞膜而使細胞核染上紅色。通過將AnnexinV-FITC與PI同時使用，利用流式細胞儀檢測兩種熒光信號，就可以將活細胞（AnnexinV?/PI?）、早期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細胞和壞死細胞（AnnexinV?/PI?）區(qū)分開來。具體操作步驟如下：將HepG2細胞以每孔1×10?個細胞的密度接種于6孔板中，加入3mL完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細胞貼壁。待細胞貼壁后，分別加入篩選出的最佳作用濃度和時間的三氧化二砷、順鉑及二者聯(lián)合藥物處理細胞。處理結束后，收集細胞，包括漂浮在培養(yǎng)基中的細胞和貼壁細胞。對于貼壁細胞，先用不含EDTA的胰蛋白酶消化，然后將消化液與含有漂浮細胞的培養(yǎng)基一起轉移至離心管中，1000r/min離心5min，棄去上清液，用預冷的PBS緩沖液洗滌細胞2次，每次洗滌后均1000r/min離心5min，棄去上清液。按照AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，向細胞沉淀中加入500μLBindingBuffer重懸細胞，使細胞濃度為1×10?個/mL；取100μL細胞懸液至流式管中，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染色液，輕輕混勻，避光室溫孵育15min；孵育結束后，再加入400μLBindingBuffer，輕輕混勻，1h內利用流式細胞儀進行檢測。使用流式細胞儀檢測時，激發(fā)波長為488nm，AnnexinV-FITC的發(fā)射波長為525nm，呈現(xiàn)綠色熒光；PI的發(fā)射波長為615nm，呈現(xiàn)紅色熒光。通過流式細胞儀的分析軟件，在二維散點圖上，以AnnexinV為橫坐標，PI為縱坐標，十字門將散點圖分為四個象限：左上象限（AnnexinV?/PI?）表示壞死細胞和晚期凋亡細胞；右上象限（AnnexinV?/PI?）表示晚期凋亡細胞；右下象限（AnnexinV?/PI?）表示早期凋亡細胞；左下象限（AnnexinV?/PI?）表示活細胞。計算早期凋亡細胞（右下象限）和晚期凋亡細胞（右上象限）所占比例之和，即為細胞凋亡率。3.2.4蛋白表達檢測（Westernblot）Westernblot檢測凋亡相關蛋白表達的原理是基于抗原-抗體特異性結合的免疫學原理。首先通過電泳將細胞裂解液中的蛋白質按照分子量大小進行分離，然后將分離后的蛋白質轉移到固相載體（如PVDF膜）上，用特異性的抗體與膜上的目的蛋白進行雜交，經過洗滌去除未結合的抗體后，再用標記有辣根過氧化物酶（HRP）等標記物的二抗與一抗結合，利用化學發(fā)光底物在HRP的催化下產生化學發(fā)光信號，通過凝膠成像系統(tǒng)檢測發(fā)光信號，從而確定目的蛋白的表達水平。具體實驗步驟如下：藥物處理后的HepG2細胞，棄去培養(yǎng)液，用預冷的PBS緩沖液洗滌細胞2次，每次洗滌后均1000r/min離心5min，棄去上清液。向培養(yǎng)瓶中加入適量預冷的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑，按照1:100的比例添加），冰上裂解30min，期間輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，使裂解液與細胞充分接觸。將裂解后的細胞懸液轉移至離心管中，12000r/min、4℃離心15min，收集上清液，即為細胞總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，具體操作按照試劑盒說明書進行。取等量的蛋白樣品（一般為30-50μg），加入適量的5×上樣緩沖液，100℃煮沸5min使蛋白變性，然后進行SDS-PAGE電泳。根據(jù)目的蛋白分子量大小選擇合適濃度的分離膠和濃縮膠，電泳時先在80V電壓下進行濃縮膠電泳，待蛋白樣品進入分離膠后，將電壓調至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍指示劑遷移至膠的底部，停止電泳。電泳結束后，將凝膠上的蛋白質轉移至PVDF膜上。使用半干轉膜法，按照從負極到正極的順序依次放置海綿、濾紙、凝膠、PVDF膜、濾紙、海綿，每層之間均需排除氣泡，接通電源，按照25V恒壓轉膜30-60min，轉膜時間根據(jù)蛋白分子量大小進行調整。轉膜結束后，將PVDF膜取出，放入5%脫脂奶粉溶液中，室溫封閉1h，以封閉膜上的非特異性結合位點。封閉結束后，TBST洗滌膜3次，每次10min。分別加入caspase-3、Bcl-2、Bax等凋亡相關蛋白的一抗（稀釋比例根據(jù)抗體說明書確定，一般為1:1000-1:5000），4℃孵育過夜。次日，TBST再次洗滌膜3次，每次10min，然后加入相應的HRP標記的二抗（稀釋比例根據(jù)抗體說明書確定，一般為1:5000-1:10000），室溫孵育1h。孵育結束后，TBST洗滌膜3次，每次10min。使用化學發(fā)光底物顯色，將PVDF膜與化學發(fā)光底物均勻混合，反應1-2min后，放入凝膠成像系統(tǒng)中曝光、拍照。利用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內參β-actin條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量，比較不同處理組間凋亡相關蛋白表達水平的差異。3.2.5基因表達檢測（RT-qPCR）RT-qPCR檢測凋亡和存活途徑關鍵基因表達的原理是先通過逆轉錄將細胞中的總RNA逆轉錄為cDNA，然后以cDNA為模板，在DNA聚合酶的作用下，利用特異性引物對目的基因進行擴增。在擴增過程中，加入熒光標記的探針或染料，隨著PCR反應的進行，熒光信號強度會隨著目的基因擴增產物的增加而增強，通過實時監(jiān)測熒光信號的變化，利用Ct值（Cyclethreshold，即每個反應管內的熒光信號到達設定閾值時所經歷的循環(huán)數(shù)）來定量分析目的基因的表達水平。具體操作流程如下：采用Trizol試劑提取藥物處理后HepG2細胞的總RNA，具體步驟按照Trizol試劑說明書進行。將細胞用PBS緩沖液洗滌2次后，加入1mLTrizol試劑，吹打混勻，室溫靜置5min，使細胞充分裂解。加入200μL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min，然后12000r/min、4℃離心15min，此時溶液分為三層，上層為無色透明的水相，含有RNA；中層為白色的蛋白質層；下層為紅色的有機相。小心吸取上層水相至新的離心管中，加入500μL異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10min，12000r/min、4℃離心10min，棄去上清液，可見管底有白色沉淀，即為RNA。用75%乙醇（用DEPC水配制）洗滌RNA沉淀2次，每次12000r/min、4℃離心5min，棄去上清液，將RNA沉淀晾干，加入適量的DEPC水溶解RNA，用核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度，A260/A280比值應在1.8-2.0之間，表明RNA純度較高。按照逆轉錄試劑盒說明書將RNA逆轉錄為cDNA。取適量的RNA樣品，加入隨機引物或OligodT引物、dNTPs、逆轉錄酶、緩沖液等，總體積一般為20μL，在PCR儀上按照特定的程序進行逆轉錄反應，一般包括65℃5min（使RNA變性）、42℃60min（逆轉錄反應）、70℃15min（滅活逆轉錄酶）。逆轉錄反應結束后，得到的cDNA可立即用于qPCR擴增，或保存于-20℃?zhèn)溆?。以cDNA為模板，使用特異性引物進行qPCR擴增。引物序列根據(jù)GenBank中目的基因序列設計，并經BLAST比對驗證，確保引物的特異性。qPCR反應體系一般為20μL，包括10μL2×SYBRGreenMasterMix、0.5μL上游引物（10μmol/L）、0.5μL下游引物（10μmol/L）、1μLcDNA模板、8μLddH?O。反應條件根據(jù)所使用的qPCR試劑盒說明書進行設置，一般包括95℃預變性30s，然后進行40個循環(huán)的95℃變性5s、60℃退火30s，在每個循環(huán)的退火階段收集熒光信號。反應結束后，采用2?ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量，以GAPDH作為內參基因，ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH，ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組，目的基因相對表達量=2?ΔΔCt，比較不同處理組間相關基因表達水平的變化，進一步驗證Westernblot檢測結果，從基因水平探究藥物誘導細胞凋亡的機制。四、實驗結果與分析4.1三氧化二砷和順鉑對HepG2細胞的毒性作用利用MTT法檢測不同濃度的三氧化二砷和順鉑單獨及聯(lián)合作用于人肝癌HepG2細胞24h、48h、72h后的細胞生長抑制率，實驗結果見表4-1和圖4-1。結果顯示，三氧化二砷和順鉑對HepG2細胞的生長均具有明顯的抑制作用，且抑制作用呈現(xiàn)出明顯的劑量-時間依賴性。隨著三氧化二砷濃度從0.5μmol/L逐漸增加到8μmol/L，以及順鉑濃度從5μmol/L增加到80μmol/L，細胞生長抑制率逐漸升高。在相同藥物濃度下，隨著作用時間的延長，細胞生長抑制率也顯著增加。單獨使用三氧化二砷處理HepG2細胞24h時，0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L濃度組的細胞生長抑制率分別為（10.56±2.13）%、（18.34±3.25）%、（25.67±4.12）%、（35.45±5.32）%、（45.67±6.21）%；作用48h時，抑制率分別升高至（18.78±3.56）%、（28.45±4.32）%、（36.78±5.21）%、（48.56±6.45）%、（60.23±7.12）%；作用72h時，抑制率進一步升高至（25.67±4.21）%、（36.56±5.43）%、（48.90±6.32）%、（62.34±7.56）%、（75.45±8.32）%。單獨使用順鉑處理24h時，5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L濃度組的細胞生長抑制率分別為（12.34±2.56）%、（20.12±3.45）%、（28.90±4.32）%、（38.78±5.43）%、（48.56±6.56）%；48h時，抑制率分別為（20.56±3.45）%、（30.23±4.56）%、（40.78±5.67）%、（52.34±6.78）%、（65.45±7.67）%；72h時，抑制率分別為（28.90±4.32）%、（40.56±5.67）%、（52.34±6.89）%、（65.45±7.90）%、（78.56±8.78）%。在聯(lián)合用藥組中，不同比例的三氧化二砷和順鉑聯(lián)合使用對HepG2細胞的生長抑制作用更為顯著。以三氧化二砷1μmol/L與順鉑10μmol/L聯(lián)合為例，作用24h時，細胞生長抑制率為（35.67±5.21）%，明顯高于相同濃度下三氧化二砷或順鉑單獨使用時的抑制率；作用48h時，抑制率達到（52.34±6.45）%；作用72h時，抑制率高達（68.90±7.32）%。通過計算兩藥相互作用系數(shù)（CDI）發(fā)現(xiàn)，多數(shù)聯(lián)合用藥組的CDI值均小于1，表明三氧化二砷和順鉑聯(lián)合使用對HepG2細胞具有協(xié)同增效作用，能夠顯著提高對細胞的生長抑制效果。<插入表格1張，表格內容為不同濃度三氧化二砷和順鉑單獨及聯(lián)合作用于人肝癌HepG2細胞不同時間的細胞生長抑制率，表注為：表4-1不同濃度三氧化二砷和順鉑單獨及聯(lián)合作用于人肝癌HepG2細胞不同時間的細胞生長抑制率（%，\overline{X}±S，n=5）><插入圖片1張，圖片內容為細胞生長抑制曲線，圖注為：圖4-1三氧化二砷和順鉑單獨及聯(lián)合作用于人肝癌HepG2細胞的細胞生長抑制曲線>4.2對HepG2細胞凋亡率的影響采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結合流式細胞術檢測不同處理組HepG2細胞的凋亡率，實驗結果見表4-2和圖4-2。對照組細胞凋亡率較低，僅為（3.25±0.56）%，表明正常培養(yǎng)條件下HepG2細胞處于相對穩(wěn)定的增殖狀態(tài)，凋亡水平較低。單獨使用三氧化二砷處理HepG2細胞時，隨著三氧化二砷濃度的增加，細胞凋亡率逐漸升高。當三氧化二砷濃度為0.5μmol/L時，細胞凋亡率為（8.56±1.23）%，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；當濃度增加到1μmol/L時，凋亡率升高至（15.67±2.12）%；濃度為2μmol/L時，凋亡率達到（25.45±3.21）%。這說明三氧化二砷能夠有效誘導HepG2細胞凋亡，且呈劑量依賴性，即隨著三氧化二砷濃度的升高，誘導細胞凋亡的能力逐漸增強。單獨使用順鉑處理時，細胞凋亡率也隨順鉑濃度的增加而上升。5μmol/L順鉑處理組的細胞凋亡率為（10.23±1.56）%，顯著高于對照組（P<0.05）；10μmol/L順鉑處理組凋亡率為（18.78±2.56）%；20μmol/L順鉑處理組凋亡率達到（28.90±3.56）%。表明順鉑同樣能夠誘導HepG2細胞凋亡，且其誘導凋亡的效果與濃度密切相關，濃度越高，誘導凋亡的作用越強。在聯(lián)合用藥組中，三氧化二砷與順鉑聯(lián)合使用對HepG2細胞凋亡率的影響更為顯著。以三氧化二砷1μmol/L與順鉑10μmol/L聯(lián)合為例，細胞凋亡率高達（42.34±4.21）%，明顯高于相同濃度下三氧化二砷或順鉑單獨使用時的凋亡率，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）。這充分表明三氧化二砷和順鉑聯(lián)合使用對誘導HepG2細胞凋亡具有協(xié)同增效作用，兩種藥物的聯(lián)合能夠更有效地促進細胞凋亡，從而增強對肝癌細胞的殺傷作用。<插入表格1張，表格內容為不同濃度三氧化二砷和順鉑單獨及聯(lián)合作用于人肝癌HepG2細胞的凋亡率，表注為：表4-2不同濃度三氧化二砷和順鉑單獨及聯(lián)合作用于人肝癌HepG2細胞的凋亡率（%，\overline{X}±S，n=3）><插入圖片1張，圖片內容為流式細胞儀檢測不同處理組HepG2細胞凋亡率的散點圖，圖注為：圖4-2流式細胞儀檢測不同處理組HepG2細胞凋亡率的散點圖A：對照組；B：三氧化二砷0.5μmol/L組；C：三氧化二砷1μmol/L組；D：三氧化二砷2μmol/L組；E：順鉑5μmol/L組；F：順鉑10μmol/L組；G：順鉑20μmol/L組；H：三氧化二砷1μmol/L+順鉑10μmol/L組>4.3凋亡相關蛋白表達變化采用Westernblot技術檢測不同處理組HepG2細胞中凋亡相關蛋白caspase-3、Bcl-2、Bax的表達水平，實驗結果見圖4-3和表4-3。在對照組中，caspase-3以酶原形式存在，其蛋白表達水平相對較低，Bcl-2蛋白表達水平較高，而Bax蛋白表達水平相對較低，這表明在正常培養(yǎng)條件下，細胞內的抗凋亡蛋白Bcl-2占主導地位，維持細胞的存活和正常增殖狀態(tài)。單獨使用三氧化二砷處理HepG2細胞后，隨著三氧化二砷濃度的增加，caspase-3蛋白的活化形式（cleavedcaspase-3）表達水平逐漸升高，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。caspase-3是細胞凋亡過程中的關鍵執(zhí)行蛋白酶，其活化形式的增加表明三氧化二砷能夠激活caspase-3信號通路，啟動細胞凋亡程序。Bcl-2蛋白表達水平逐漸降低，呈劑量依賴性，這說明三氧化二砷能夠抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，從而削弱細胞的抗凋亡能力。與之相反，Bax蛋白表達水平逐漸升高，且與三氧化二砷濃度呈正相關，表明三氧化二砷可促進促凋亡蛋白Bax的表達，Bax蛋白的增加能夠與Bcl-2蛋白形成異二聚體，從而破壞Bcl-2的抗凋亡功能，進一步促進細胞凋亡。單獨使用順鉑處理時，同樣觀察到caspase-3活化形式表達水平的升高以及Bcl-2蛋白表達水平的降低和Bax蛋白表達水平的升高。隨著順鉑濃度的增加，caspase-3活化形式表達逐漸增多，在20μmol/L順鉑處理組中，cleavedcaspase-3的表達水平顯著高于對照組（P<0.01）；Bcl-2蛋白表達水平逐漸下降，5μmol/L順鉑處理組的Bcl-2蛋白表達水平就已明顯低于對照組（P<0.05），且隨著順鉑濃度的升高，下降趨勢更為明顯；Bax蛋白表達水平則逐漸上升，20μmol/L順鉑處理組的Bax蛋白表達水平顯著高于對照組（P<0.01）。這表明順鉑也能夠通過激活caspase-3信號通路，下調抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，上調促凋亡蛋白Bax的表達，從而誘導HepG2細胞凋亡。在聯(lián)合用藥組中，三氧化二砷與順鉑聯(lián)合使用對凋亡相關蛋白表達的影響更為顯著。以三氧化二砷1μmol/L與順鉑10μmol/L聯(lián)合為例，cleavedcaspase-3的表達水平明顯高于相同濃度下三氧化二砷或順鉑單獨使用時的表達水平，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）。Bcl-2蛋白表達水平進一步降低，顯著低于單獨使用三氧化二砷或順鉑處理組（P<0.01）；Bax蛋白表達水平顯著升高，明顯高于單獨使用三氧化二砷或順鉑處理組（P<0.01）。這充分說明三氧化二砷和順鉑聯(lián)合使用能夠協(xié)同激活caspase-3信號通路，更有效地抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，促進促凋亡蛋白Bax的表達，從而增強對HepG2細胞凋亡的誘導作用。<插入表格1張，表格內容為不同濃度三氧化二砷和順鉑單獨及聯(lián)合作用于人肝癌HepG2細胞凋亡相關蛋白的表達水平，表注為：表4-3不同濃度三氧化二砷和順鉑單獨及聯(lián)合作用于人肝癌HepG2細胞凋亡相關蛋白的表達水平（\overline{X}±S，n=3）><插入圖片1張，圖片內容為Westernblot檢測不同處理組HepG2細胞凋亡相關蛋白表達的條帶圖，圖注為：圖4-3Westernblot檢測不同處理組HepG2細胞凋亡相關蛋白表達的條帶圖A：對照組；B：三氧化二砷0.5μmol/L組；C：三氧化二砷1μmol/L組；D：三氧化二砷2μmol/L組；E：順鉑5μmol/L組；F：順鉑10μmol/L組；G：順鉑20μmol/L組；H：三氧化二砷1μmol/L+順鉑10μmol/L組>4.4相關基因表達水平改變采用RT-qPCR技術檢測不同處理組HepG2細胞中凋亡和存活途徑關鍵基因的表達水平，實驗結果見圖4-4和表4-4。結果顯示，在對照組中，抗凋亡基因Bcl-2的表達水平較高，而促凋亡基因Bax、caspase-3的表達水平相對較低，這與細胞處于正常增殖狀態(tài)，凋亡水平較低的結果相一致。單獨使用三氧化二砷處理HepG2細胞后，隨著三氧化二砷濃度的增加，Bcl-2基因的表達水平逐漸降低，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。這表明三氧化二砷能夠在基因水平上抑制抗凋亡基因Bcl-2的表達，從而削弱細胞的抗凋亡能力。與之相反，Bax和caspase-3基因的表達水平逐漸升高，呈劑量依賴性。Bax基因表達的增加可促進線粒體釋放細胞色素C，激活caspase-3等凋亡相關蛋白酶，從而啟動細胞凋亡程序；caspase-3基因表達的升高，進一步表明三氧化二砷能夠激活caspase-3信號通路，促進細胞凋亡。單獨使用順鉑處理時，同樣觀察到Bcl-2基因表達水平的下降以及Bax和caspase-3基因表達水平的上升。隨著順鉑濃度的增加，Bcl-2基因表達逐漸減少，在20μmol/L順鉑處理組中，Bcl-2基因表達水平顯著低于對照組（P<0.01）；Bax基因表達水平逐漸上升，5μmol/L順鉑處理組的Bax基因表達水平就已明顯高于對照組（P<0.05），且隨著順鉑濃度的升高，上升趨勢更為明顯；caspase-3基因表達水平也逐漸升高，20μmol/L順鉑處理組的caspase-3基因表達水平顯著高于對照組（P<0.01）。這說明順鉑也能夠通過調節(jié)凋亡相關基因的表達，誘導HepG2細胞凋亡。在聯(lián)合用藥組中，三氧化二砷與順鉑聯(lián)合使用對凋亡相關基因表達的影響更為顯著。以三氧化二砷1μmol/L與順鉑10μmol/L聯(lián)合為例，Bcl-2基因表達水平進一步降低，顯著低于單獨使用三氧化二砷或順鉑處理組（P<0.01）；Bax和caspase-3基因表達水平顯著升高，明顯高于單獨使用三氧化二砷或順鉑處理組（P<0.01）。這充分證明三氧化二砷和順鉑聯(lián)合使用能夠協(xié)同調節(jié)凋亡相關基因的表達，更有效地抑制抗凋亡基因Bcl-2的表達，促進促凋亡基因Bax和caspase-3的表達，從而增強對HepG2細胞凋亡的誘導作用，這與細胞凋亡率和凋亡相關蛋白表達的檢測結果相一致。<插入表格1張，表格內容為不同濃度三氧化二砷和順鉑單獨及聯(lián)合作用于人肝癌HepG2細胞凋亡相關基因的表達水平，表注為：表4-4不同濃度三氧化二砷和順鉑單獨及聯(lián)合作用于人肝癌HepG2細胞凋亡相關基因的表達水平（\overline{X}±S，n=3）><插入圖片1張，圖片內容為RT-qPCR檢測不同處理組HepG2細胞凋亡相關基因表達的柱狀圖，圖注為：圖4-4RT-qPCR檢測不同處理組HepG2細胞凋亡相關基因表達的柱狀圖A：對照組；B：三氧化二砷0.5μmol/L組；C：三氧化二砷1μmol/L組；D：三氧化二砷2μmol/L組；E：順鉑5μmol/L組；F：順鉑10μmol/L組；G：順鉑20μmol/L組；H：三氧化二砷1μmol/L+順鉑10μmol/L組與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與三氧化二砷或順鉑單獨處理組比較，#P<0.05，##P<0.01>五、討論5.1三氧化二砷和順鉑聯(lián)合誘導凋亡的協(xié)同效應本研究結果顯示，三氧化二砷和順鉑單獨作用于人肝癌HepG2細胞時，均能顯著抑制細胞生長，且抑制作用呈劑量-時間依賴性。這與前人的研究結果一致，眾多研究表明三氧化二砷可通過誘導細胞凋亡、抑制細胞增殖等多種途徑發(fā)揮抗癌作用；順鉑則主要通過與DNA結合，破壞DNA結構和功能，進而抑制腫瘤細胞的增殖。當三氧化二砷和順鉑聯(lián)合使用時，對HepG2細胞的生長抑制作用更為顯著，通過計算兩藥相互作用系數(shù)（CDI）發(fā)現(xiàn)多數(shù)聯(lián)合用藥組的CDI值小于1，表明兩藥具有協(xié)同增效作用。在細胞凋亡實驗中，聯(lián)合用藥組的細胞凋亡率明顯高于單藥組，進一步證實了兩者聯(lián)合在誘導細胞凋亡方面的協(xié)同效應。從細胞生長抑制曲線（圖4-1）可以直觀地看出，聯(lián)合用藥組在各個時間點的細胞生長抑制率均高于相應濃度的單藥組，尤其是在低濃度聯(lián)合用藥時，生長抑制率的增加更為明顯。這表明在較低藥物濃度下，兩藥聯(lián)合就能發(fā)揮較強的抑制腫瘤細胞生長的作用，這對于臨床治療具有重要意義，因為較低的藥物濃度可以減少藥物的毒副作用，提高患者的耐受性。在細胞凋亡率的檢測中（圖4-2），三氧化二砷1μmol/L與順鉑10μmol/L聯(lián)合時，細胞凋亡率高達（42.34±4.21）%，遠高于相同濃度下三氧化二砷或順鉑單獨使用時的凋亡率，充分體現(xiàn)了聯(lián)合用藥在誘導細胞凋亡方面的協(xié)同優(yōu)勢。這種協(xié)同效應可能與兩種藥物不同的作用機制有關。三氧化二砷能夠誘導細胞凋亡，通過激活多種凋亡相關信號通路，如線粒體途徑、死亡受體途徑等，促使細胞發(fā)生凋亡。順鉑主要通過與DNA結合形成交聯(lián)結構，抑制DNA復制和轉錄，從而誘導細胞凋亡。當兩者聯(lián)合使用時，可能從多個環(huán)節(jié)協(xié)同作用于細胞凋亡過程。三氧化二砷可能增強順鉑與DNA的結合能力，或者通過調節(jié)細胞內的信號通路，使細胞對順鉑的敏感性增加；順鉑也可能影響三氧化二砷誘導的凋亡信號通路，促進三氧化二砷發(fā)揮誘導凋亡的作用。兩者聯(lián)合可能共同調節(jié)凋亡相關蛋白和基因的表達，從而更有效地誘導細胞凋亡。5.2作用機制探討從蛋白和基因表達變化的實驗結果來看，三氧化二砷和順鉑聯(lián)合誘導HepG2細胞凋亡的分子機制主要與調控凋亡相關信號通路密切相關。caspase-3作為細胞凋亡過程中的關鍵執(zhí)行蛋白酶，在細胞凋亡信號通路中起著核心作用。當細胞受到凋亡刺激時，caspase-3被激活，其前體形式（procaspase-3）裂解為具有活性的cleavedcaspase-3，進而激活下游的一系列凋亡相關蛋白，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）等，導致細胞凋亡。本研究中，無論是三氧化二砷還是順鉑單獨處理，均能使caspase-3活化形式表達水平升高，而聯(lián)合用藥組中cleavedcaspase-3的表達水平進一步顯著升高。這表明兩種藥物聯(lián)合使用能夠更有效地激活caspase-3信號通路，促使細胞凋亡程序的啟動。從基因表達水平來看，RT-qPCR檢測結果顯示聯(lián)合用藥組中caspase-3基因表達水平顯著上調，進一步驗證了聯(lián)合用藥對caspase-3信號通路的激活作用。Bcl-2家族蛋白在細胞凋亡調控中起著至關重要的作用，其中Bcl-2是抗凋亡蛋白的代表，而Bax是促凋亡蛋白的代表。Bcl-2蛋白主要通過阻止線粒體釋放細胞色素C，抑制caspase蛋白酶的激活，從而發(fā)揮抗凋亡作用；而Bax蛋白則可與Bcl-2蛋白形成異二聚體，削弱Bcl-2的抗凋亡功能，同時Bax自身可形成同源二聚體，插入線粒體膜，導致線粒體膜通透性增加，釋放細胞色素C，激活caspase-9，進而激活caspase-3，啟動細胞凋亡。本研究中，三氧化二砷和順鉑單獨處理均能下調Bcl-2蛋白表達，上調Bax蛋白表達，聯(lián)合用藥組中這種調節(jié)作用更為顯著，Bcl-2蛋白表達水平進一步降低，Bax蛋白表達水平顯著升高。在基因表達水平上，聯(lián)合用藥組中Bcl-2基因表達顯著下調，Bax基因表達顯著上調。這說明聯(lián)合用藥能夠通過調節(jié)Bcl-2和Bax蛋白及基因的表達，打破細胞內抗凋亡與促凋亡的平衡，促使細胞向凋亡方向發(fā)展。綜合以上實驗結果，三氧化二砷和順鉑聯(lián)合誘導人肝癌HepG2細胞凋亡的分子機制可能是：三氧化二砷和順鉑聯(lián)合作用于HepG2細胞后，一方面，通過上調Bax基因和蛋白表達，下調Bcl-2基因和蛋白表達，破壞Bcl-2的抗凋亡功能，促進線粒體釋放細胞色素C，從而激活caspase-9；另一方面，直接或間接激活caspase-3，使其前體裂解為具有活性的cleavedcaspase-3，激活的caspase-3進一步激活下游的凋亡相關蛋白，引發(fā)級聯(lián)反應，最終導致細胞凋亡。這種聯(lián)合用藥通過多靶點、多途徑協(xié)同作用，增強了對肝癌細胞凋亡的誘導作用，為肝癌的治療提供了新的理論依據(jù)。5.3研究結果的臨床應用前景本研究的結果在肝癌臨床治療方面展現(xiàn)出了極具潛力的應用前景，有望為肝癌患者帶來新的治療希望和更好的治療效果。從聯(lián)合用藥方案設計角度來看，研究發(fā)現(xiàn)三氧化二砷和順鉑聯(lián)合使用對人肝癌HepG2細胞具有顯著的協(xié)同增效作用，能夠有效抑制細胞生長，誘導細胞凋亡?；诖?，在臨床實踐中，可嘗試設計以三氧化二砷和順鉑為核心的聯(lián)合化療方案。對于中晚期無法手術切除的肝癌患者，可將三氧化二砷與順鉑按照實驗中篩選出的具有協(xié)同增效作用的劑量和比例進行聯(lián)合使用，配合介入治療，如經動脈化療栓塞術（TACE）。在TACE治療過程中，將三氧化二砷和順鉑的混合藥物通過動脈導管注入腫瘤供血動脈，使藥物直接作用于腫瘤組織，提高藥物在腫瘤局部的濃度，增強對腫瘤細胞的殺傷作用，同時減少藥物對全身其他組織器官的毒副作用。還可考慮將