穩(wěn)定細(xì)胞株的構(gòu)建方法演講人：日期:目錄CONTENTS01載體設(shè)計(jì)與構(gòu)建02轉(zhuǎn)染方法與優(yōu)化03篩選壓力與條件04單克隆化驗(yàn)證05穩(wěn)定性評(píng)估體系06質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)01載體設(shè)計(jì)與構(gòu)建目標(biāo)基因克隆策略從cDNA文庫(kù)中克隆或通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增?；騺?lái)源使用限制性內(nèi)切酶切割、連接、轉(zhuǎn)化等常規(guī)克隆方法?？寺》椒y(cè)序驗(yàn)證克隆的準(zhǔn)確性，確保目標(biāo)基因序列無(wú)誤。驗(yàn)證方法啟動(dòng)子與篩選標(biāo)記選擇啟動(dòng)子與篩選標(biāo)記組合根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，將啟動(dòng)子與篩選標(biāo)記進(jìn)行組合，構(gòu)建載體。03根據(jù)細(xì)胞特性選擇合適的篩選標(biāo)記，如抗生素抗性基因、熒光蛋白基因等。02篩選標(biāo)記啟動(dòng)子類型選擇強(qiáng)啟動(dòng)子，如CMV、SV40等，確保目標(biāo)基因的高效表達(dá)。01報(bào)告基因/標(biāo)簽融合設(shè)計(jì)報(bào)告基因選擇根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇報(bào)告基因，如熒光素酶、β-半乳糖苷酶等。01標(biāo)簽蛋白選擇根據(jù)需要選擇標(biāo)簽蛋白，如GFP、FLAG等，用于后續(xù)檢測(cè)和純化。02融合方式將報(bào)告基因或標(biāo)簽蛋白與目標(biāo)基因進(jìn)行融合，構(gòu)建融合表達(dá)載體。0302轉(zhuǎn)染方法與優(yōu)化脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染利用脂質(zhì)體包裹DNA，通過(guò)靜電相互作用將DNA導(dǎo)入細(xì)胞。該方法轉(zhuǎn)染效率高，但細(xì)胞毒性較大。PEI（聚乙烯亞胺）介導(dǎo)轉(zhuǎn)染PEI具有較高的正電荷密度，能與DNA緊密結(jié)合形成復(fù)合物，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。該方法轉(zhuǎn)染效率較高，但細(xì)胞毒性隨PEI分子量增大而增大?；瘜W(xué)轉(zhuǎn)染（脂質(zhì)體/PEI）物理轉(zhuǎn)染（電穿孔/顯微注射）利用高壓電場(chǎng)短暫破壞細(xì)胞膜，使DNA進(jìn)入細(xì)胞。該方法適用于難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類型，但細(xì)胞損傷較大。電穿孔法在顯微鏡下將DNA直接注入細(xì)胞核內(nèi)。該方法轉(zhuǎn)染效率接近100%，但對(duì)細(xì)胞損傷較大，技術(shù)要求高。顯微注射法病毒載體遞送系統(tǒng)腺相關(guān)病毒載體具有較低的免疫原性和較高的安全性，但其包裝容量有限，且轉(zhuǎn)染效率受細(xì)胞類型影響。03能整合到宿主細(xì)胞基因組中，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)，但制備過(guò)程復(fù)雜，且存在致瘤風(fēng)險(xiǎn)。02逆轉(zhuǎn)錄病毒載體腺病毒載體具有高效感染細(xì)胞的能力，可攜帶大片段外源基因，但存在免疫反應(yīng)和潛在安全風(fēng)險(xiǎn)。0103篩選壓力與條件抗生素篩選濃度梯度測(cè)試根據(jù)細(xì)胞特性和目的篩選抗生素種類，確定最佳篩選濃度?？股剡x擇濃度梯度設(shè)置細(xì)胞生長(zhǎng)狀況觀察將抗生素濃度分為若干等級(jí)，通過(guò)逐步增加濃度，篩選出具有抗性的細(xì)胞株。在不同抗生素濃度下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，確定最小致死濃度和最佳篩選濃度。標(biāo)記基因選擇根據(jù)細(xì)胞特性和篩選需求，選擇適合的熒光或生物發(fā)光標(biāo)記基因。熒光/生物發(fā)光篩選標(biāo)記應(yīng)用標(biāo)記基因?qū)胪ㄟ^(guò)轉(zhuǎn)染、感染或其他方法將標(biāo)記基因?qū)爰?xì)胞，使其表達(dá)熒光或生物發(fā)光蛋白。篩選效果評(píng)估通過(guò)熒光或生物發(fā)光檢測(cè)，篩選出成功導(dǎo)入標(biāo)記基因的細(xì)胞株，并評(píng)估其表達(dá)強(qiáng)度。雙篩選系統(tǒng)原理可以是將兩種篩選標(biāo)記基因同時(shí)導(dǎo)入細(xì)胞，或者采用一種篩選標(biāo)記基因加上一種其他篩選方法（如形態(tài)學(xué)觀察、生理功能檢測(cè)等）。系統(tǒng)構(gòu)建方法篩選效果評(píng)估通過(guò)雙篩選系統(tǒng)篩選出同時(shí)滿足兩種篩選條件的細(xì)胞株，并進(jìn)行進(jìn)一步鑒定和驗(yàn)證。利用兩種獨(dú)立的篩選標(biāo)記或篩選方法，同時(shí)篩選目標(biāo)細(xì)胞株，提高篩選準(zhǔn)確性。雙篩選系統(tǒng)構(gòu)建策略04單克隆化驗(yàn)證有限稀釋法操作流程6px6px6px將細(xì)胞懸液進(jìn)行計(jì)數(shù)，并將其稀釋至適當(dāng)?shù)臐舛?。?xì)胞計(jì)數(shù)與稀釋培養(yǎng)一段時(shí)間后，觀察培養(yǎng)板中細(xì)胞克隆的形成情況?？寺⌒纬蓪⑾♂尯蟮募?xì)胞懸液分至培養(yǎng)板中，每個(gè)孔加入適量的培養(yǎng)基。分板培養(yǎng)010302挑選出只含有一個(gè)細(xì)胞克隆的培養(yǎng)孔，并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。挑選單克隆04流式細(xì)胞分選技術(shù)細(xì)胞標(biāo)記使用特異性抗體對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記。01細(xì)胞分選利用流式細(xì)胞儀對(duì)標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行分選，獲得目標(biāo)細(xì)胞。02純度檢測(cè)對(duì)分選后的細(xì)胞進(jìn)行純度檢測(cè)，確保單克隆性。03后續(xù)培養(yǎng)將分選后的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)，并檢測(cè)其生物學(xué)特性。04單克隆擴(kuò)增與凍存單克隆擴(kuò)增凍存前處理凍存操作復(fù)蘇與檢測(cè)將挑選出的單克隆細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，以獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞。在凍存前，需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行特殊處理，如加入凍存保護(hù)劑。將處理好的細(xì)胞懸液分裝入凍存管中，并進(jìn)行逐步降溫，最終放入液氮中保存。在需要使用細(xì)胞時(shí)，可從液氮中取出凍存管進(jìn)行復(fù)蘇，并檢測(cè)其生物學(xué)特性。05穩(wěn)定性評(píng)估體系基因組整合位點(diǎn)檢測(cè)熒光原位雜交技術(shù)（FISH）利用熒光標(biāo)記的探針與染色體上的特定DNA序列雜交，檢測(cè)外源基因在宿主基因組中的整合位點(diǎn)。SouthernblottingPCR方法通過(guò)電泳分離DNA片段，再利用特異性探針雜交檢測(cè)目的基因的存在。利用特異性引物擴(kuò)增目的基因與宿主基因組的連接區(qū)，檢測(cè)外源基因的整合位點(diǎn)。123長(zhǎng)期傳代表達(dá)穩(wěn)定性分析Westernblotting檢測(cè)細(xì)胞株中目的蛋白的表達(dá)情況，評(píng)估蛋白水平上的穩(wěn)定性。03通過(guò)熒光標(biāo)記抗體檢測(cè)細(xì)胞表面或胞內(nèi)特定蛋白的表達(dá)，分析傳代過(guò)程中蛋白表達(dá)的穩(wěn)定性。02流式細(xì)胞術(shù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)不同傳代細(xì)胞株中目的基因的表達(dá)水平，評(píng)估長(zhǎng)期傳代對(duì)基因表達(dá)穩(wěn)定性的影響。01表型/功能維持驗(yàn)證細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定比較穩(wěn)定細(xì)胞株與原始細(xì)胞在生長(zhǎng)速度、形態(tài)等方面的差異，評(píng)估表型穩(wěn)定性。01特定功能檢測(cè)根據(jù)細(xì)胞株的特定功能，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)該功能在穩(wěn)定細(xì)胞株中的維持情況。02耐藥性檢測(cè)針對(duì)特定藥物或化合物，檢測(cè)穩(wěn)定細(xì)胞株是否具有與原代細(xì)胞相似的耐藥性。0306質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)遺傳背景一致性檢測(cè)利用PCR、測(cè)序等技術(shù)驗(yàn)證細(xì)胞株的遺傳背景是否與預(yù)期一致。基因型檢測(cè)通過(guò)細(xì)胞遺傳學(xué)方法檢測(cè)細(xì)胞株的染色體數(shù)目、結(jié)構(gòu)等是否正常。染色體核型分析利用高通量測(cè)序等技術(shù)，檢測(cè)細(xì)胞株是否存在與疾病相關(guān)的基因突變?；蛲蛔兒Y查支原體/微生物污染排查采用培養(yǎng)法、PCR法等檢測(cè)細(xì)胞株是否受到支原體污染。支原體檢測(cè)細(xì)菌、真菌檢測(cè)病毒檢測(cè)通過(guò)培養(yǎng)、染色等方法排查細(xì)胞株是否受到細(xì)菌、真菌等微生物的污染。采用PCR、病毒分離等技術(shù)，檢測(cè)細(xì)胞株是否攜帶病毒。