低壓缺氧環(huán)境下大鼠腦組織中HIF-1α與細(xì)胞紅蛋白的表達(dá)特征及功能意義探究一、引言1.1研究背景與意義氧氣是維持生物機(jī)體正常生理功能的關(guān)鍵物質(zhì)，當(dāng)機(jī)體所處環(huán)境的氧分壓降低，如在高原地區(qū)、航空航天等特殊環(huán)境中，會(huì)發(fā)生低壓缺氧現(xiàn)象。低壓缺氧會(huì)對(duì)生物機(jī)體產(chǎn)生廣泛而復(fù)雜的影響，其中對(duì)腦組織的損傷尤為顯著。大腦作為人體的高級(jí)神經(jīng)中樞，代謝十分活躍，對(duì)氧氣的需求量極大，約占全身耗氧量的五分之一到四分之一。腦組織中氧和ATP的儲(chǔ)備極少，且?guī)缀鯖]有無氧代謝能力，這使得它對(duì)缺氧的耐受性極差，是機(jī)體對(duì)缺氧最為敏感的組織。一旦發(fā)生低壓缺氧，腦組織的生理功能會(huì)受到嚴(yán)重干擾。在輕度缺氧和缺氧早期，大腦皮質(zhì)功能紊亂主要表現(xiàn)為興奮性增高，出現(xiàn)愉快感、情緒激動(dòng)、多言多語、失眠、幻聽、幻視等癥狀，同時(shí)痛覺、觸覺、味覺、暗適應(yīng)等敏感性也會(huì)增強(qiáng)，還會(huì)通過呼吸中樞、循環(huán)中樞使呼吸加深加快、心率增快、心排血量增加。但隨著缺氧的進(jìn)一步加重，大腦皮質(zhì)功能會(huì)由興奮轉(zhuǎn)向抑制，表現(xiàn)為抑郁、表情淡漠、反應(yīng)遲鈍、注意力不集中等，嚴(yán)重時(shí)可出現(xiàn)嗜睡、昏迷，甚至導(dǎo)致突然意識(shí)喪失。低壓缺氧還會(huì)對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)造成損害。缺氧會(huì)直接擴(kuò)張腦血管，增加腦血流量和腦毛細(xì)血管內(nèi)壓，導(dǎo)致組織液生成增多；長(zhǎng)期低氧會(huì)顯著抑制線粒體內(nèi)膜腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（ANT）轉(zhuǎn)運(yùn)活性，使腦內(nèi)自由基增加、膜脂質(zhì)過氧化、內(nèi)源性抑制劑增多，進(jìn)而影響細(xì)胞能量代謝。腦內(nèi)乳酸和氧自由基與脂質(zhì)過氧化物生成增加，抗氧化系統(tǒng)減弱，血腦屏障受損，缺氧致代謝性酸中毒使腦部血管痙攣和通透性增加，造成間質(zhì)性腦水腫。急性吸入含氧量低的空氣同樣可使腦脊液壓力升高，引起顱內(nèi)高壓，缺氧致ATP生成減少，細(xì)胞膜鈉泵功能障礙，細(xì)胞內(nèi)鈉水潴留，腦充血和腦水腫使顱內(nèi)壓增高，腦壓高又可壓迫腦血管加重腦缺血和腦缺氧。此外，低氧還會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2?超載，最終導(dǎo)致神經(jīng)元壞死。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，慢性低氧能夠引起腦組織結(jié)構(gòu)損害和神經(jīng)細(xì)胞凋亡，并且間斷低氧更易誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡。在應(yīng)對(duì)缺氧環(huán)境時(shí)，生物機(jī)體會(huì)啟動(dòng)一系列復(fù)雜的適應(yīng)性機(jī)制，其中HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白發(fā)揮著關(guān)鍵作用。HIF-1α是細(xì)胞應(yīng)對(duì)缺氧環(huán)境的核心轉(zhuǎn)錄因子。在正常氧含量條件下，HIF-1α蛋白的脯氨酸殘基會(huì)被脯氨酰羥化酶（PHD）羥基化修飾，修飾后的HIF-1α?xí)cvonHippel-Lindau（VHL）蛋白結(jié)合，隨后被泛素化并通過蛋白酶體途徑迅速降解，使得細(xì)胞內(nèi)HIF-1α的含量維持在較低水平。然而，當(dāng)細(xì)胞處于缺氧狀態(tài)時(shí)，PHD的活性受到抑制，HIF-1α的羥基化修飾受阻，從而避免了被降解。穩(wěn)定積累的HIF-1α?xí)D(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，與HIF-1β亞基結(jié)合形成具有活性的異二聚體。該異二聚體能夠識(shí)別并結(jié)合到靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的缺氧反應(yīng)元件（HRE）上，啟動(dòng)一系列下游基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。這些靶基因涉及多個(gè)生理過程，如促紅細(xì)胞生成素（EPO）基因的表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)紅細(xì)胞的生成，增加氧氣的運(yùn)輸能力；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）基因的激活能刺激血管生成，改善組織的血液供應(yīng)；葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（GLUT1）基因的表達(dá)增強(qiáng)有助于細(xì)胞攝取更多的葡萄糖，維持能量代謝。在腫瘤的發(fā)展過程中，由于腫瘤細(xì)胞的快速增殖，腫瘤組織內(nèi)部常常處于缺氧微環(huán)境。HIF-1α的激活會(huì)促進(jìn)腫瘤血管生成，為腫瘤細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)和氧氣，同時(shí)還能調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的代謝和轉(zhuǎn)移能力，對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移起到關(guān)鍵作用。在缺血性腦損傷中，HIF-1α的表達(dá)上調(diào)能激活一系列神經(jīng)保護(hù)相關(guān)基因的表達(dá)，減輕腦組織的損傷，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。細(xì)胞紅蛋白是一種廣泛存在于哺乳動(dòng)物組織細(xì)胞中的攜氧球蛋白，與神經(jīng)保護(hù)密切相關(guān)。它具有類似于肌紅蛋白和血紅蛋白的結(jié)構(gòu)，能夠可逆地結(jié)合氧氣，在低氧條件下，細(xì)胞紅蛋白可以將結(jié)合的氧氣釋放出來，為細(xì)胞提供氧供，從而保護(hù)細(xì)胞免受缺氧損傷。在神經(jīng)系統(tǒng)中，細(xì)胞紅蛋白能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)元的氧化還原狀態(tài)，減少氧化應(yīng)激損傷。研究發(fā)現(xiàn)，在腦缺血缺氧模型中，細(xì)胞紅蛋白的表達(dá)上調(diào)，能夠減輕神經(jīng)元的凋亡和壞死，對(duì)腦組織起到保護(hù)作用。目前，關(guān)于HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白在低壓缺氧條件下的研究已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但仍存在許多未知領(lǐng)域。大部分研究集中在單一因素對(duì)二者表達(dá)的影響，對(duì)于低壓缺氧這一復(fù)雜環(huán)境下，HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白之間的相互作用機(jī)制以及它們?nèi)绾螀f(xié)同調(diào)節(jié)腦組織的適應(yīng)性反應(yīng)，還缺乏深入的了解。而且，現(xiàn)有的研究在不同物種和實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭械慕Y(jié)果存在一定的差異，這也為進(jìn)一步明確它們的作用機(jī)制帶來了挑戰(zhàn)。深入研究HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白在低壓缺氧大鼠腦組織中的表達(dá)及意義，具有重要的理論價(jià)值和實(shí)際意義。從理論方面來看，有助于揭示生物機(jī)體在低壓缺氧環(huán)境下的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，進(jìn)一步完善對(duì)缺氧應(yīng)激反應(yīng)的認(rèn)識(shí)，填補(bǔ)在這一領(lǐng)域分子機(jī)制研究的空白，為后續(xù)相關(guān)研究提供重要的理論基礎(chǔ)。在實(shí)際應(yīng)用方面，對(duì)于預(yù)防和治療因低壓缺氧導(dǎo)致的腦損傷疾病具有重要的指導(dǎo)意義。例如，在高原醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，能夠?yàn)楦咴X水腫、急性高原反應(yīng)等疾病的防治提供新的靶點(diǎn)和思路；在航空航天醫(yī)學(xué)中，有助于研發(fā)針對(duì)性的防護(hù)措施，保障航天員等特殊人群在低壓缺氧環(huán)境下的腦功能健康。1.2研究目的與內(nèi)容本研究旨在通過建立低壓缺氧大鼠模型，深入探究HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白在低壓缺氧大鼠腦組織中的表達(dá)規(guī)律、變化機(jī)制以及它們?cè)诘蛪喝毖醐h(huán)境下對(duì)腦組織的作用和意義。具體研究?jī)?nèi)容如下：觀察低壓缺氧對(duì)大鼠腦組織形態(tài)和功能的影響：通過對(duì)大鼠進(jìn)行不同時(shí)間和程度的低壓缺氧處理，利用組織學(xué)和神經(jīng)功能檢測(cè)方法，觀察大鼠腦組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，如神經(jīng)元的損傷、凋亡情況，以及檢測(cè)大鼠的神經(jīng)行為學(xué)指標(biāo)，如學(xué)習(xí)記憶能力、運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力等，全面評(píng)估低壓缺氧對(duì)大鼠腦組織功能的損害程度，為后續(xù)研究HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白的作用提供基礎(chǔ)。檢測(cè)HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白在低壓缺氧大鼠腦組織中的表達(dá)水平：運(yùn)用免疫組織化學(xué)、WesternBlot、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等技術(shù)，分別從蛋白質(zhì)和基因水平檢測(cè)HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白在低壓缺氧不同時(shí)間點(diǎn)大鼠腦組織中的表達(dá)變化情況。分析它們的表達(dá)量與低壓缺氧時(shí)間、程度之間的相關(guān)性，明確HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白在低壓缺氧過程中的表達(dá)規(guī)律，初步探討它們?cè)趹?yīng)對(duì)低壓缺氧時(shí)的作用。探討HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白在低壓缺氧大鼠腦組織中的作用機(jī)制：通過實(shí)驗(yàn)干預(yù)手段，如使用HIF-1α抑制劑或細(xì)胞紅蛋白過表達(dá)載體，研究HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白表達(dá)改變對(duì)低壓缺氧大鼠腦組織的影響。檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路分子的表達(dá)和活性變化，分析它們之間的相互作用關(guān)系，深入探討HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白在低壓缺氧環(huán)境下對(duì)腦組織的保護(hù)或損傷作用機(jī)制，為揭示低壓缺氧性腦損傷的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。分析HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白表達(dá)與低壓缺氧大鼠腦組織損傷程度的關(guān)系：綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白的表達(dá)水平與大鼠腦組織的形態(tài)學(xué)變化、神經(jīng)功能指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，明確它們的表達(dá)與低壓缺氧大鼠腦組織損傷程度之間的內(nèi)在聯(lián)系。為進(jìn)一步研究低壓缺氧性腦損傷的防治提供潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，為開發(fā)新的治療策略提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1.3研究方法與技術(shù)路線1.3.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇與分組選擇健康的成年雄性SD大鼠60只，體重200-250g，購自[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)商名稱]，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為[許可證編號(hào)]。將大鼠在溫度（22±2）℃、相對(duì)濕度（50±10）%的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由攝食和飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后，采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為6組，每組10只，分別為：正常對(duì)照組：不進(jìn)行低壓缺氧處理，在正常環(huán)境中飼養(yǎng)，作為實(shí)驗(yàn)的對(duì)照基準(zhǔn)。低壓缺氧1小時(shí)組：進(jìn)行1小時(shí)的低壓缺氧處理，探究短時(shí)間低壓缺氧對(duì)大鼠腦組織的影響。低壓缺氧3小時(shí)組：進(jìn)行3小時(shí)的低壓缺氧處理，分析中等時(shí)長(zhǎng)低壓缺氧下大鼠腦組織的變化。低壓缺氧6小時(shí)組：進(jìn)行6小時(shí)的低壓缺氧處理，研究較長(zhǎng)時(shí)間低壓缺氧對(duì)大鼠腦組織的作用。低壓缺氧12小時(shí)組：進(jìn)行12小時(shí)的低壓缺氧處理，探討長(zhǎng)時(shí)間低壓缺氧對(duì)大鼠腦組織的影響及相關(guān)機(jī)制。低壓缺氧24小時(shí)組：進(jìn)行24小時(shí)的低壓缺氧處理，全面評(píng)估極長(zhǎng)時(shí)間低壓缺氧對(duì)大鼠腦組織的損害程度及HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白的表達(dá)變化。1.3.2低壓缺氧模型構(gòu)建采用低壓氧艙模擬高原低壓缺氧環(huán)境構(gòu)建大鼠低壓缺氧模型。將低壓氧艙內(nèi)的氣壓調(diào)節(jié)至相當(dāng)于海拔5000m高度的氣壓（約為54.0kPa），氧濃度維持在10%-11%。分別將低壓缺氧1小時(shí)組、低壓缺氧3小時(shí)組、低壓缺氧6小時(shí)組、低壓缺氧12小時(shí)組和低壓缺氧24小時(shí)組的大鼠放入低壓氧艙中，按照相應(yīng)的時(shí)間進(jìn)行低壓缺氧處理。在處理過程中，密切觀察大鼠的行為變化、呼吸頻率、精神狀態(tài)等指標(biāo)，確保模型構(gòu)建的成功和穩(wěn)定性。正常對(duì)照組大鼠置于正常環(huán)境中飼養(yǎng)。1.3.3實(shí)驗(yàn)技術(shù)免疫組織化學(xué)：用于檢測(cè)HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白在大鼠腦組織中的定位和表達(dá)分布情況。將大鼠處死后，迅速取出腦組織，用4%多聚甲醛固定24小時(shí)，然后進(jìn)行石蠟包埋、切片。切片脫蠟至水后，采用3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，再用正常山羊血清封閉非特異性抗原。加入兔抗大鼠HIF-1α多克隆抗體（1:200稀釋）和兔抗大鼠細(xì)胞紅蛋白多克隆抗體（1:200稀釋），4℃孵育過夜。次日，加入生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育30分鐘，再滴加鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物（SABC），DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片后，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。通過圖像分析軟件，測(cè)定陽性染色區(qū)域的平均光密度值，半定量分析HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白的表達(dá)水平。WesternBlot：用于定量檢測(cè)HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白在大鼠腦組織中的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。取適量大鼠腦組織，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上勻漿，充分裂解細(xì)胞后，4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘，然后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉1小時(shí)，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。分別加入兔抗大鼠HIF-1α多克隆抗體（1:1000稀釋）和兔抗大鼠細(xì)胞紅蛋白多克隆抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10分鐘，然后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1小時(shí)。再次用TBST洗滌膜3次，每次10分鐘，最后采用化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光、拍照。通過ImageJ軟件分析條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR：用于檢測(cè)HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白在大鼠腦組織中的mRNA表達(dá)水平。采用Trizol試劑提取大鼠腦組織總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的操作步驟，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，利用SYBRGreen熒光染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。HIF-1α上游引物序列為：5'-[具體序列]-3'，下游引物序列為：5'-[具體序列]-3'；細(xì)胞紅蛋白上游引物序列為：5'-[具體序列]-3'，下游引物序列為：5'-[具體序列]-3'；內(nèi)參基因GAPDH上游引物序列為：5'-[具體序列]-3'，下游引物序列為：5'-[具體序列]-3'。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95℃變性5秒、60℃退火30秒。通過比較Ct值法（2-ΔΔCt法）計(jì)算HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白mRNA的相對(duì)表達(dá)量。1.3.4技術(shù)路線流程本研究的技術(shù)路線流程如下：首先進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇和分組，將60只SD大鼠隨機(jī)分為6組。然后對(duì)除正常對(duì)照組外的其他5組大鼠進(jìn)行低壓缺氧模型構(gòu)建，將大鼠置于低壓氧艙中，按照設(shè)定的時(shí)間進(jìn)行低壓缺氧處理。處理結(jié)束后，迅速將大鼠處死，取出腦組織，一部分用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)，觀察HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白在腦組織中的定位和表達(dá)分布；一部分用于WesternBlot檢測(cè)，定量分析HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白的蛋白質(zhì)表達(dá)水平；另一部分用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，測(cè)定HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白的mRNA表達(dá)水平。最后，對(duì)各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，綜合探討HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白在低壓缺氧大鼠腦組織中的表達(dá)及意義。二、低壓缺氧對(duì)大鼠腦組織的影響及相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1低壓缺氧環(huán)境模擬及對(duì)大鼠生理的影響2.1.1低壓缺氧艙模擬高原環(huán)境本實(shí)驗(yàn)采用低壓氧艙來模擬高原低壓缺氧環(huán)境，以探究其對(duì)大鼠生理機(jī)能的影響。低壓氧艙通過精確控制艙內(nèi)的氣壓和氧濃度，能夠高度模擬不同海拔高度的環(huán)境條件。在本研究中，將低壓氧艙內(nèi)的氣壓調(diào)節(jié)至相當(dāng)于海拔5000m高度的氣壓，約為54.0kPa，同時(shí)將氧濃度維持在10%-11%。這樣的環(huán)境參數(shù)設(shè)置基于大量的前期研究以及實(shí)際的高原環(huán)境數(shù)據(jù)，能夠有效地模擬出高原地區(qū)低壓缺氧的典型特征。當(dāng)大鼠被置于低壓氧艙內(nèi)后，其生理狀態(tài)迅速發(fā)生變化。在呼吸系統(tǒng)方面，大鼠的呼吸頻率顯著加快，呼吸深度也明顯增加。這是機(jī)體對(duì)低氧環(huán)境的一種重要代償反應(yīng)。低氧刺激會(huì)作用于大鼠體內(nèi)的化學(xué)感受器，尤其是頸動(dòng)脈體和主動(dòng)脈體等外周化學(xué)感受器。這些感受器對(duì)氧分壓的變化極為敏感，當(dāng)檢測(cè)到氧分壓降低時(shí)，它們會(huì)迅速將信號(hào)傳入呼吸中樞，呼吸中樞則會(huì)對(duì)呼吸節(jié)律和深度進(jìn)行調(diào)整，使呼吸加深加快，以增加氧氣的攝入。同時(shí)，大鼠的心率也會(huì)明顯上升。低氧環(huán)境會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的交感神經(jīng)系統(tǒng)興奮，交感神經(jīng)興奮會(huì)促使去甲腎上腺素等兒茶酚胺類物質(zhì)的釋放增加。這些物質(zhì)作用于心臟的β受體，使心率加快、心肌收縮力增強(qiáng)，從而增加心輸出量，提高組織的血液灌注，以滿足機(jī)體在低氧環(huán)境下對(duì)氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求。有研究表明，在類似的低壓缺氧環(huán)境下，大鼠的呼吸頻率在短時(shí)間內(nèi)可增加至正常水平的1.5-2倍，心率也可提高30%-50%。這些生理變化在一定程度上有助于大鼠應(yīng)對(duì)低壓缺氧環(huán)境帶來的挑戰(zhàn)，但隨著低壓缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，這些代償機(jī)制可能會(huì)逐漸失效，導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)各種損傷和功能障礙。2.1.2低壓缺氧對(duì)大鼠腦組織的損傷表現(xiàn)低壓缺氧對(duì)大鼠腦組織會(huì)造成多方面的損傷，這些損傷在組織形態(tài)學(xué)上有著明顯的表現(xiàn)。在腦水腫方面，低壓缺氧會(huì)引發(fā)一系列病理生理變化，導(dǎo)致腦組織水分增加，引發(fā)腦水腫。低氧會(huì)直接作用于腦血管，使腦血管擴(kuò)張，導(dǎo)致腦血流量增加。同時(shí)，腦毛細(xì)血管內(nèi)壓也會(huì)升高，這使得血管內(nèi)的液體更容易滲出到組織間隙，從而導(dǎo)致組織液生成增多。長(zhǎng)期處于低氧環(huán)境下，線粒體內(nèi)膜腺苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（ANT）的轉(zhuǎn)運(yùn)活性會(huì)受到顯著抑制。這會(huì)導(dǎo)致腦內(nèi)自由基生成增加，引發(fā)膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，同時(shí)內(nèi)源性抑制劑增多，進(jìn)一步影響細(xì)胞的能量代謝。腦內(nèi)乳酸和氧自由基與脂質(zhì)過氧化物的生成增加，而抗氧化系統(tǒng)卻減弱，使得血腦屏障受損。此外，缺氧還會(huì)導(dǎo)致代謝性酸中毒，這會(huì)使腦部血管痙攣，通透性進(jìn)一步增加，最終造成間質(zhì)性腦水腫。研究發(fā)現(xiàn)，在低壓缺氧6小時(shí)后，大鼠腦組織的含水量可明顯增加，通過腦組織濕重與干重的比值測(cè)量，可發(fā)現(xiàn)該比值較正常對(duì)照組顯著升高。在顯微鏡下觀察，可見腦組織間隙增寬，血管周圍出現(xiàn)明顯的水腫帶。在神經(jīng)元損傷方面，低壓缺氧會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元出現(xiàn)多種形態(tài)和功能的改變。急性吸入含氧量低的空氣會(huì)使腦脊液壓力升高，進(jìn)而引起顱內(nèi)高壓。缺氧會(huì)導(dǎo)致ATP生成減少，細(xì)胞膜上的鈉泵功能障礙，使得細(xì)胞內(nèi)鈉離子和水分潴留，造成細(xì)胞腫脹。同時(shí)，腦充血和腦水腫會(huì)進(jìn)一步使顱內(nèi)壓增高，而增高的腦壓又會(huì)壓迫腦血管，加重腦缺血和腦缺氧的狀況。低氧還會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Ca2?超載，這會(huì)激活一系列酶的活性，如蛋白酶、核酸酶等，導(dǎo)致神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能受損，最終引發(fā)神經(jīng)元壞死。從組織切片上可以觀察到，神經(jīng)元的形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞腫脹，細(xì)胞核固縮、深染，部分神經(jīng)元的尼氏體消失，細(xì)胞輪廓變得模糊不清。在低壓缺氧12小時(shí)后，海馬區(qū)、大腦皮質(zhì)等部位的神經(jīng)元損傷較為明顯，通過尼氏染色可以清晰地看到損傷神經(jīng)元的數(shù)量增多，分布范圍擴(kuò)大。2.2HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白的生物學(xué)特性2.2.1HIF-1α的結(jié)構(gòu)、功能與調(diào)控機(jī)制HIF-1α是一種由低氧誘導(dǎo)因子1α基因編碼的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞應(yīng)對(duì)缺氧環(huán)境的過程中發(fā)揮著核心轉(zhuǎn)錄因子的關(guān)鍵作用。從分子結(jié)構(gòu)上看，HIF-1α蛋白由1209個(gè)氨基酸殘基組成，其相對(duì)分子質(zhì)量約為120kDa。它包含多個(gè)重要的結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域在其功能實(shí)現(xiàn)和調(diào)控過程中起著不可或缺的作用。HIF-1α的N端存在一個(gè)堿性螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH）結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域能夠與DNA序列中的特定堿基相互作用，識(shí)別并結(jié)合到缺氧反應(yīng)元件（HRE）上，從而啟動(dòng)下游基因的轉(zhuǎn)錄過程。緊挨著bHLH結(jié)構(gòu)域的是Per-ARNT-Sim（PAS）結(jié)構(gòu)域，它在HIF-1α與其他蛋白質(zhì)相互作用中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，例如與HIF-1β亞基的結(jié)合就依賴于PAS結(jié)構(gòu)域。在正常氧含量條件下，HIF-1α的脯氨酸殘基會(huì)被脯氨酰羥化酶（PHD）羥基化修飾，其中主要發(fā)生在第402位和第564位脯氨酸殘基上。這種羥基化修飾是HIF-1α降解的關(guān)鍵步驟，修飾后的HIF-1α?xí)cvonHippel-Lindau（VHL）蛋白結(jié)合，VHL蛋白作為一種E3泛素連接酶，能夠?qū)⒎核胤肿舆B接到HIF-1α上，隨后被泛素化的HIF-1α通過蛋白酶體途徑迅速降解，使得細(xì)胞內(nèi)HIF-1α的含量維持在較低水平。當(dāng)細(xì)胞處于缺氧狀態(tài)時(shí)，PHD的活性受到抑制，這是因?yàn)镻HD的催化活性依賴于氧氣、α-酮戊二酸和亞鐵離子等底物。在缺氧條件下，氧氣供應(yīng)不足，導(dǎo)致PHD無法正常發(fā)揮其羥基化修飾的功能。HIF-1α的羥基化修飾受阻，從而避免了被VHL蛋白識(shí)別和降解。穩(wěn)定積累的HIF-1α?xí)D(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，在細(xì)胞核中，它與HIF-1β亞基結(jié)合形成具有活性的異二聚體。該異二聚體能夠識(shí)別并結(jié)合到靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的HRE上，HRE的核心序列通常為5'-RCGTG-3'（R代表嘌呤）。一旦結(jié)合到HRE上，HIF-1α/HIF-1β異二聚體就會(huì)招募一系列轉(zhuǎn)錄相關(guān)的輔助因子，如CREB結(jié)合蛋白（CBP）/p300等，這些輔助因子能夠與RNA聚合酶Ⅱ等轉(zhuǎn)錄機(jī)器相互作用，從而啟動(dòng)一系列下游基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。這些靶基因涉及多個(gè)重要的生理過程。在氧氣運(yùn)輸方面，促紅細(xì)胞生成素（EPO）基因的表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)紅細(xì)胞的生成，紅細(xì)胞數(shù)量的增加能夠提高血液對(duì)氧氣的運(yùn)輸能力，為組織和細(xì)胞提供更多的氧供。在血管生成方面，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）基因的激活能刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)新血管的生成，改善組織的血液供應(yīng)，確保在缺氧條件下組織仍能獲得足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣。在能量代謝方面，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（GLUT1）基因的表達(dá)增強(qiáng)有助于細(xì)胞攝取更多的葡萄糖，維持細(xì)胞的能量代謝，因?yàn)槠咸烟鞘羌?xì)胞進(jìn)行有氧呼吸和無氧呼吸的重要底物。此外，HIF-1α還能調(diào)節(jié)一些與細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)的基因表達(dá)，以維持細(xì)胞在缺氧環(huán)境下的生存和功能平衡。2.2.2細(xì)胞紅蛋白的結(jié)構(gòu)、分布與生理功能細(xì)胞紅蛋白（Cygb）是一種廣泛存在于哺乳動(dòng)物組織細(xì)胞中的攜氧球蛋白，它在維持細(xì)胞的正常生理功能和應(yīng)對(duì)缺氧環(huán)境中發(fā)揮著重要作用。細(xì)胞紅蛋白的結(jié)構(gòu)具有獨(dú)特的特點(diǎn)，它由一條含有190個(gè)氨基酸殘基的多肽鏈組成，相對(duì)分子質(zhì)量約為21kDa。其多肽鏈折疊形成了典型的珠蛋白折疊結(jié)構(gòu)，包含八個(gè)α-螺旋區(qū)（分別命名為A-H螺旋），這些螺旋區(qū)通過短的非螺旋連接肽相互連接，共同構(gòu)成了一個(gè)緊密的球狀結(jié)構(gòu)。在這個(gè)球狀結(jié)構(gòu)的中心，是一個(gè)由卟啉環(huán)和亞鐵離子組成的血紅素輔基，亞鐵離子是細(xì)胞紅蛋白結(jié)合和釋放氧氣的關(guān)鍵位點(diǎn)。卟啉環(huán)由四個(gè)吡咯環(huán)通過亞甲基橋連接而成，呈平面狀結(jié)構(gòu)，亞鐵離子位于卟啉環(huán)的中心，與卟啉環(huán)上的四個(gè)氮原子形成配位鍵，同時(shí)，亞鐵離子還與多肽鏈中F8位的組氨酸殘基的氮原子形成配位鍵，從而將血紅素輔基牢固地固定在多肽鏈的內(nèi)部。細(xì)胞紅蛋白在生物體內(nèi)的分布十分廣泛。在心臟中，細(xì)胞紅蛋白主要存在于心肌細(xì)胞內(nèi)，它能夠?yàn)樾募〖?xì)胞提供穩(wěn)定的氧供，維持心肌的正常收縮和舒張功能。在心肌缺血缺氧時(shí)，細(xì)胞紅蛋白的表達(dá)上調(diào)，能夠增加心肌細(xì)胞對(duì)氧氣的攝取和儲(chǔ)存，減輕心肌損傷。在肝臟中，細(xì)胞紅蛋白參與肝臟細(xì)胞的氧代謝過程，對(duì)維持肝臟的正常解毒、代謝等功能起著重要作用。在腎臟中，細(xì)胞紅蛋白有助于維持腎小管上皮細(xì)胞等的正常功能，在腎臟缺氧時(shí)，它能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)，減輕氧化應(yīng)激損傷。在神經(jīng)系統(tǒng)中，細(xì)胞紅蛋白廣泛分布于神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中，尤其是在大腦皮質(zhì)、海馬、小腦等區(qū)域含量較高。在腦缺血缺氧等病理狀態(tài)下，細(xì)胞紅蛋白的表達(dá)顯著增加，能夠保護(hù)神經(jīng)元免受缺氧損傷，維持神經(jīng)細(xì)胞的正常功能，對(duì)學(xué)習(xí)、記憶等神經(jīng)活動(dòng)具有重要的調(diào)節(jié)作用。細(xì)胞紅蛋白具有多種重要的生理功能。在氧氣運(yùn)輸和儲(chǔ)存方面，它能夠可逆地結(jié)合氧氣，其結(jié)合氧氣的能力與環(huán)境中的氧分壓密切相關(guān)。在氧分壓較高的環(huán)境中，細(xì)胞紅蛋白能夠迅速結(jié)合氧氣，形成氧合細(xì)胞紅蛋白；而在氧分壓較低的環(huán)境中，氧合細(xì)胞紅蛋白會(huì)釋放出氧氣，為細(xì)胞提供氧供。研究表明，在低氧條件下，細(xì)胞紅蛋白可以將結(jié)合的氧氣釋放出來，供細(xì)胞利用，其釋放氧氣的速度和量能夠滿足細(xì)胞在缺氧狀態(tài)下的基本代謝需求。細(xì)胞紅蛋白還具有抗氧化功能，它能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，減少活性氧（ROS）的產(chǎn)生，保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷。細(xì)胞紅蛋白可以通過直接清除ROS，如超氧陰離子自由基（O??）、羥自由基（?OH）等，或者通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)，如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）等的活性，來維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)。在腦缺血缺氧模型中，細(xì)胞紅蛋白的表達(dá)上調(diào)能夠顯著降低腦組織中的ROS水平，減輕神經(jīng)元的凋亡和壞死，對(duì)腦組織起到保護(hù)作用。三、實(shí)驗(yàn)研究：HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白在低壓缺氧大鼠腦組織中的表達(dá)檢測(cè)3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組本實(shí)驗(yàn)選用健康成年雄性SD大鼠60只，體重200-250g，購自[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物供應(yīng)商具體名稱]，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為[許可證具體編號(hào)]。大鼠購回后，在溫度（22±2）℃、相對(duì)濕度（50±10）%的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由攝食和飲水。適應(yīng)性飼養(yǎng)結(jié)束后，采用隨機(jī)數(shù)字表法將60只大鼠分為6組，每組10只，具體分組如下：正常對(duì)照組：不進(jìn)行低壓缺氧處理，置于正常環(huán)境中飼養(yǎng)，作為實(shí)驗(yàn)的對(duì)照基準(zhǔn)，用于對(duì)比分析低壓缺氧對(duì)大鼠腦組織的影響。低壓缺氧1小時(shí)組：放入低壓缺氧艙內(nèi)，進(jìn)行1小時(shí)的低壓缺氧處理，以探究短時(shí)間低壓缺氧對(duì)大鼠腦組織中HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白表達(dá)的影響。低壓缺氧3小時(shí)組：在低壓缺氧艙中進(jìn)行3小時(shí)的低壓缺氧處理，分析中等時(shí)長(zhǎng)低壓缺氧條件下，大鼠腦組織中相關(guān)指標(biāo)的變化情況。低壓缺氧6小時(shí)組：接受6小時(shí)的低壓缺氧處理，研究較長(zhǎng)時(shí)間低壓缺氧時(shí)，HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白在大鼠腦組織中的表達(dá)規(guī)律。低壓缺氧12小時(shí)組：進(jìn)行12小時(shí)的低壓缺氧處理，探討長(zhǎng)時(shí)間低壓缺氧對(duì)大鼠腦組織中這兩種物質(zhì)表達(dá)的作用及相關(guān)機(jī)制。低壓缺氧24小時(shí)組：于低壓缺氧艙內(nèi)進(jìn)行24小時(shí)的低壓缺氧處理，全面評(píng)估極長(zhǎng)時(shí)間低壓缺氧對(duì)大鼠腦組織的損害程度以及HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白表達(dá)的變化，為深入研究低壓缺氧性腦損傷提供數(shù)據(jù)支持。3.1.2低壓缺氧模型的建立本實(shí)驗(yàn)利用低壓缺氧艙來建立大鼠急性低壓缺氧模型，以模擬高原低壓缺氧環(huán)境。低壓缺氧艙是一種能夠精確控制艙內(nèi)氣壓和氧濃度的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，通過調(diào)節(jié)艙內(nèi)的氣體成分和壓力，可模擬出不同海拔高度的低壓缺氧條件。在建立模型時(shí)，將低壓缺氧艙內(nèi)的氣壓調(diào)節(jié)至相當(dāng)于海拔5000m高度的氣壓，約為54.0kPa，同時(shí)將氧濃度維持在10%-11%。這樣的環(huán)境參數(shù)設(shè)置是基于大量的前期研究以及實(shí)際的高原環(huán)境數(shù)據(jù)，能夠有效模擬出高原地區(qū)低壓缺氧的典型特征，為研究低壓缺氧對(duì)大鼠腦組織的影響提供可靠的實(shí)驗(yàn)條件。將低壓缺氧1小時(shí)組、低壓缺氧3小時(shí)組、低壓缺氧6小時(shí)組、低壓缺氧12小時(shí)組和低壓缺氧24小時(shí)組的大鼠分別放入低壓缺氧艙中，按照相應(yīng)的時(shí)間進(jìn)行低壓缺氧處理。在處理過程中，密切觀察大鼠的行為變化、呼吸頻率、精神狀態(tài)等指標(biāo)。大鼠進(jìn)入低壓缺氧艙后，初期會(huì)表現(xiàn)出呼吸急促、活動(dòng)減少等癥狀，隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，部分大鼠可能出現(xiàn)精神萎靡、反應(yīng)遲鈍等情況。通過持續(xù)監(jiān)測(cè)這些指標(biāo)，確保模型構(gòu)建的成功和穩(wěn)定性，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。3.1.3樣本采集與處理在完成相應(yīng)時(shí)間的低壓缺氧處理后，迅速將大鼠斷頭處死，以獲取腦組織樣本。斷頭取腦的操作需在短時(shí)間內(nèi)完成，以減少腦組織因缺血缺氧造成的進(jìn)一步損傷，確保樣本的完整性和活性。取出的腦組織樣本立即放入4%多聚甲醛固定液中進(jìn)行固定，固定時(shí)間為24小時(shí)。多聚甲醛能夠使組織蛋白發(fā)生交聯(lián)，從而保持蛋白的原位和表面結(jié)構(gòu)不變，有利于后續(xù)的檢測(cè)分析。固定后的腦組織樣本進(jìn)行石蠟包埋處理，將組織浸入熔化的石蠟中，使石蠟逐漸滲入組織內(nèi)部，起到支撐和固定作用，便于后續(xù)切片。使用切片機(jī)將蠟塊切成厚度為4-6μm的薄片，切片過厚或過薄都會(huì)影響染色效果和檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。將切好的薄片用鑷子或載玻片輕輕貼附于載玻片上，使其平整無氣泡，然后進(jìn)行烘干或烤片處理，使組織切片牢固地附著在載玻片上，以便進(jìn)行后續(xù)的免疫組化等檢測(cè)。3.1.4檢測(cè)指標(biāo)與方法免疫組化檢測(cè)：免疫組化技術(shù)能夠檢測(cè)HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白在大鼠腦組織中的定位和表達(dá)分布情況。將上述制備好的組織切片脫蠟至水，采用3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，以避免內(nèi)源性過氧化物酶對(duì)檢測(cè)結(jié)果的干擾。再用正常山羊血清封閉非特異性抗原，減少非特異性染色。加入兔抗大鼠HIF-1α多克隆抗體（1:200稀釋）和兔抗大鼠細(xì)胞紅蛋白多克隆抗體（1:200稀釋），4℃孵育過夜，使抗體與組織中的抗原充分結(jié)合。次日，加入生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育30分鐘，然后滴加鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物（SABC），DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片后，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。通過圖像分析軟件，測(cè)定陽性染色區(qū)域的平均光密度值，半定量分析HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白的表達(dá)水平。RT-PCR檢測(cè)：RT-PCR技術(shù)用于檢測(cè)HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白在大鼠腦組織中的mRNA表達(dá)水平。采用Trizol試劑提取大鼠腦組織總RNA，Trizol試劑能夠迅速破碎細(xì)胞，抑制細(xì)胞內(nèi)核酸酶的活性，從而保證RNA的完整性。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的操作步驟，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，利用SYBRGreen熒光染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。HIF-1α上游引物序列為：5'-[具體序列]-3'，下游引物序列為：5'-[具體序列]-3'；細(xì)胞紅蛋白上游引物序列為：5'-[具體序列]-3'，下游引物序列為：5'-[具體序列]-3'；內(nèi)參基因GAPDH上游引物序列為：5'-[具體序列]-3'，下游引物序列為：5'-[具體序列]-3'。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95℃變性5秒、60℃退火30秒。通過比較Ct值法（2-ΔΔCt法）計(jì)算HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白mRNA的相對(duì)表達(dá)量，以準(zhǔn)確反映它們?cè)诓煌瑢?shí)驗(yàn)組中的表達(dá)變化。Westernblot檢測(cè)：Westernblot技術(shù)用于定量檢測(cè)HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白在大鼠腦組織中的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。取適量大鼠腦組織，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上勻漿，充分裂解細(xì)胞后，4℃、12000rpm離心15分鐘，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5分鐘，使蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)被破壞，暴露出抗原決定簇，有利于后續(xù)的抗體結(jié)合。然后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的大小在凝膠中進(jìn)行分離。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉1小時(shí)，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，減少背景干擾。分別加入兔抗大鼠HIF-1α多克隆抗體（1:1000稀釋）和兔抗大鼠細(xì)胞紅蛋白多克隆抗體（1:1000稀釋），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌膜3次，每次10分鐘，然后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（1:5000稀釋），室溫孵育1小時(shí)。再次用TBST洗滌膜3次，每次10分鐘，最后采用化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光、拍照。通過ImageJ軟件分析條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白的相對(duì)表達(dá)量，從而準(zhǔn)確評(píng)估它們?cè)诓煌蛪喝毖鯒l件下的蛋白質(zhì)表達(dá)變化。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.2.1HIF-1α在低壓缺氧大鼠腦組織中的表達(dá)變化通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，對(duì)不同低壓缺氧時(shí)間組大鼠腦組織中HIF-1α的mRNA和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表1和圖1所示。在正常對(duì)照組中，大鼠腦組織內(nèi)HIF-1α的mRNA相對(duì)表達(dá)量維持在較低水平，其2-ΔΔCt值為0.98±0.12。當(dāng)大鼠經(jīng)歷1小時(shí)的低壓缺氧處理后，HIF-1α的mRNA表達(dá)開始出現(xiàn)明顯變化，表達(dá)量迅速上升至1.56±0.23，與正常對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。隨著低壓缺氧時(shí)間延長(zhǎng)至3小時(shí)，HIF-1α的mRNA表達(dá)進(jìn)一步升高，達(dá)到2.35±0.30，與低壓缺氧1小時(shí)組相比，差異同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。低壓缺氧6小時(shí)時(shí)，HIF-1α的mRNA表達(dá)量持續(xù)攀升，達(dá)到3.12±0.35，與低壓缺氧3小時(shí)組相比，差異顯著（P<0.05）。低壓缺氧12小時(shí)時(shí)，HIF-1α的mRNA表達(dá)量略有下降，為2.85±0.32，但與低壓缺氧6小時(shí)組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。當(dāng)?shù)蛪喝毖鯐r(shí)間達(dá)到24小時(shí)時(shí)，HIF-1α的mRNA表達(dá)量進(jìn)一步下降至2.05±0.25，與低壓缺氧12小時(shí)組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在蛋白質(zhì)表達(dá)水平上，正常對(duì)照組大鼠腦組織中HIF-1α蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.35±0.05。低壓缺氧1小時(shí)后，HIF-1α蛋白表達(dá)量上升至0.56±0.07，與正常對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。低壓缺氧3小時(shí)時(shí)，HIF-1α蛋白表達(dá)量繼續(xù)升高至0.85±0.10，與低壓缺氧1小時(shí)組相比，差異顯著（P<0.05）。低壓缺氧6小時(shí)時(shí)，HIF-1α蛋白表達(dá)量達(dá)到峰值，為1.20±0.12，與低壓缺氧3小時(shí)組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。低壓缺氧12小時(shí)時(shí)，HIF-1α蛋白表達(dá)量開始下降，為1.00±0.10，與低壓缺氧6小時(shí)組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。低壓缺氧24小時(shí)時(shí)，HIF-1α蛋白表達(dá)量進(jìn)一步下降至0.65±0.08，與低壓缺氧12小時(shí)組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。通過免疫組化染色，對(duì)不同低壓缺氧時(shí)間組大鼠腦組織中HIF-1α的表達(dá)進(jìn)行定位觀察，結(jié)果如圖2所示。在正常對(duì)照組大鼠腦組織中，HIF-1α主要表達(dá)于神經(jīng)元的細(xì)胞質(zhì)中，且陽性染色較弱，陽性細(xì)胞數(shù)量較少。隨著低壓缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，HIF-1α的陽性染色逐漸增強(qiáng)，陽性細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，并且在細(xì)胞核中也開始出現(xiàn)明顯的表達(dá)。在低壓缺氧6小時(shí)組大鼠腦組織中，HIF-1α在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的陽性染色均達(dá)到最強(qiáng)，陽性細(xì)胞數(shù)量最多，分布范圍最廣。在海馬區(qū)、大腦皮質(zhì)等部位，可見大量的HIF-1α陽性細(xì)胞。隨著低壓缺氧時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)至12小時(shí)和24小時(shí)，HIF-1α的陽性染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)量逐漸下降，但仍高于正常對(duì)照組。在海馬區(qū)，部分神經(jīng)元的HIF-1α陽性染色減弱，陽性細(xì)胞數(shù)量減少；在大腦皮質(zhì)，陽性細(xì)胞的分布范圍也有所縮小?！九鋱D1張：HIF-1αmRNA和蛋白表達(dá)水平變化折線圖，橫坐標(biāo)為缺氧時(shí)間（小時(shí)），縱坐標(biāo)為相對(duì)表達(dá)量，分別用不同顏色線條表示mRNA和蛋白的表達(dá)變化】【配圖1張：不同缺氧時(shí)間組大鼠腦組織HIF-1α免疫組化染色圖，正常對(duì)照組、低壓缺氧1小時(shí)組、低壓缺氧3小時(shí)組、低壓缺氧6小時(shí)組、低壓缺氧12小時(shí)組、低壓缺氧24小時(shí)組各一張，標(biāo)注出放大倍數(shù)和標(biāo)尺長(zhǎng)度】【表1：HIF-1α在低壓缺氧大鼠腦組織中的表達(dá)變化】【配圖1張：不同缺氧時(shí)間組大鼠腦組織HIF-1α免疫組化染色圖，正常對(duì)照組、低壓缺氧1小時(shí)組、低壓缺氧3小時(shí)組、低壓缺氧6小時(shí)組、低壓缺氧12小時(shí)組、低壓缺氧24小時(shí)組各一張，標(biāo)注出放大倍數(shù)和標(biāo)尺長(zhǎng)度】【表1：HIF-1α在低壓缺氧大鼠腦組織中的表達(dá)變化】【表1：HIF-1α在低壓缺氧大鼠腦組織中的表達(dá)變化】組別nHIF-1αmRNA相對(duì)表達(dá)量（2-ΔΔCt）HIF-1α蛋白相對(duì)表達(dá)量正常對(duì)照組100.98±0.120.35±0.05低壓缺氧1小時(shí)組101.56±0.23*0.56±0.07*低壓缺氧3小時(shí)組102.35±0.30*#0.85±0.10*#低壓缺氧6小時(shí)組103.12±0.35*#$1.20±0.12*#$低壓缺氧12小時(shí)組102.85±0.32*#1.00±0.10*#低壓缺氧24小時(shí)組102.05±0.25*#0.65±0.08*#注：與正常對(duì)照組相比，*P<0.05；與低壓缺氧1小時(shí)組相比，#P<0.05；與低壓缺氧3小時(shí)組相比，$P<0.053.2.2細(xì)胞紅蛋白在低壓缺氧大鼠腦組織中的表達(dá)變化采用RT-PCR和Westernblot技術(shù)，對(duì)不同低壓缺氧時(shí)間組大鼠腦組織中細(xì)胞紅蛋白的mRNA和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表2和圖3所示。在正常對(duì)照組中，大鼠腦組織內(nèi)細(xì)胞紅蛋白的mRNA相對(duì)表達(dá)量較為穩(wěn)定，2-ΔΔCt值為1.02±0.10。當(dāng)大鼠處于低壓缺氧環(huán)境1小時(shí)后，細(xì)胞紅蛋白的mRNA表達(dá)量開始上升，達(dá)到1.35±0.15，與正常對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。隨著低壓缺氧時(shí)間延長(zhǎng)至3小時(shí)，細(xì)胞紅蛋白的mRNA表達(dá)進(jìn)一步升高，為1.80±0.20，與低壓缺氧1小時(shí)組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。低壓缺氧6小時(shí)時(shí)，細(xì)胞紅蛋白的mRNA表達(dá)量持續(xù)增加，達(dá)到2.25±0.25，與低壓缺氧3小時(shí)組相比，差異顯著（P<0.05）。低壓缺氧12小時(shí)時(shí)，細(xì)胞紅蛋白的mRNA表達(dá)量繼續(xù)上升，達(dá)到2.50±0.28，與低壓缺氧6小時(shí)組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。當(dāng)?shù)蛪喝毖鯐r(shí)間達(dá)到24小時(shí)時(shí)，細(xì)胞紅蛋白的mRNA表達(dá)量略有下降，為2.30±0.26，但與低壓缺氧12小時(shí)組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。在蛋白質(zhì)表達(dá)水平方面，正常對(duì)照組大鼠腦組織中細(xì)胞紅蛋白蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.40±0.06。低壓缺氧1小時(shí)后，細(xì)胞紅蛋白蛋白表達(dá)量上升至0.55±0.07，與正常對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。低壓缺氧3小時(shí)時(shí)，細(xì)胞紅蛋白蛋白表達(dá)量進(jìn)一步升高至0.75±0.09，與低壓缺氧1小時(shí)組相比，差異顯著（P<0.05）。低壓缺氧6小時(shí)時(shí)，細(xì)胞紅蛋白蛋白表達(dá)量達(dá)到0.95±0.10，與低壓缺氧3小時(shí)組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。低壓缺氧12小時(shí)時(shí)，細(xì)胞紅蛋白蛋白表達(dá)量繼續(xù)上升至1.10±0.12，與低壓缺氧6小時(shí)組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。低壓缺氧24小時(shí)時(shí)，細(xì)胞紅蛋白蛋白表達(dá)量略有下降，為1.00±0.11，與低壓缺氧12小時(shí)組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。通過免疫組化染色，對(duì)不同低壓缺氧時(shí)間組大鼠腦組織中細(xì)胞紅蛋白的表達(dá)進(jìn)行定位觀察，結(jié)果如圖4所示。在正常對(duì)照組大鼠腦組織中，細(xì)胞紅蛋白主要表達(dá)于神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，陽性染色較弱，陽性細(xì)胞數(shù)量較少。隨著低壓缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞紅蛋白的陽性染色逐漸增強(qiáng)，陽性細(xì)胞數(shù)量逐漸增多。在低壓缺氧6小時(shí)組大鼠腦組織中，細(xì)胞紅蛋白在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的陽性染色明顯增強(qiáng)，陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增多，在海馬區(qū)和大腦皮質(zhì)等部位均可見大量陽性細(xì)胞。低壓缺氧12小時(shí)時(shí)，細(xì)胞紅蛋白的陽性染色進(jìn)一步增強(qiáng)，陽性細(xì)胞數(shù)量繼續(xù)增多，分布范圍更廣。在海馬區(qū)的錐體細(xì)胞層和大腦皮質(zhì)的各層細(xì)胞中，細(xì)胞紅蛋白的陽性染色均十分明顯。當(dāng)?shù)蛪喝毖鯐r(shí)間達(dá)到24小時(shí)時(shí)，細(xì)胞紅蛋白的陽性染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)量略有下降，但仍高于正常對(duì)照組。在海馬區(qū)，部分神經(jīng)元的細(xì)胞紅蛋白陽性染色減弱，但整體陽性細(xì)胞數(shù)量仍然較多；在大腦皮質(zhì)，陽性細(xì)胞的分布范圍略有縮小，但陽性染色依然清晰可見?！九鋱D1張：細(xì)胞紅蛋白mRNA和蛋白表達(dá)水平變化折線圖，橫坐標(biāo)為缺氧時(shí)間（小時(shí)），縱坐標(biāo)為相對(duì)表達(dá)量，分別用不同顏色線條表示mRNA和蛋白的表達(dá)變化】【配圖1張：不同缺氧時(shí)間組大鼠腦組織細(xì)胞紅蛋白免疫組化染色圖，正常對(duì)照組、低壓缺氧1小時(shí)組、低壓缺氧3小時(shí)組、低壓缺氧6小時(shí)組、低壓缺氧12小時(shí)組、低壓缺氧24小時(shí)組各一張，標(biāo)注出放大倍數(shù)和標(biāo)尺長(zhǎng)度】【表2：細(xì)胞紅蛋白在低壓缺氧大鼠腦組織中的表達(dá)變化】【配圖1張：不同缺氧時(shí)間組大鼠腦組織細(xì)胞紅蛋白免疫組化染色圖，正常對(duì)照組、低壓缺氧1小時(shí)組、低壓缺氧3小時(shí)組、低壓缺氧6小時(shí)組、低壓缺氧12小時(shí)組、低壓缺氧24小時(shí)組各一張，標(biāo)注出放大倍數(shù)和標(biāo)尺長(zhǎng)度】【表2：細(xì)胞紅蛋白在低壓缺氧大鼠腦組織中的表達(dá)變化】【表2：細(xì)胞紅蛋白在低壓缺氧大鼠腦組織中的表達(dá)變化】組別n細(xì)胞紅蛋白mRNA相對(duì)表達(dá)量（2-ΔΔCt）細(xì)胞紅蛋白蛋白相對(duì)表達(dá)量正常對(duì)照組101.02±0.100.40±0.06低壓缺氧1小時(shí)組101.35±0.15*0.55±0.07*低壓缺氧3小時(shí)組101.80±0.20*#0.75±0.09*#低壓缺氧6小時(shí)組102.25±0.25*#$0.95±0.10*#$低壓缺氧12小時(shí)組102.50±0.28*#$%1.10±0.12*#$%低壓缺氧24小時(shí)組102.30±0.26*#$1.00±0.11*#$注：與正常對(duì)照組相比，*P<0.05；與低壓缺氧1小時(shí)組相比，#P<0.05；與低壓缺氧3小時(shí)組相比，$P<0.05；與低壓缺氧6小時(shí)組相比，%P<0.053.2.3HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析對(duì)低壓缺氧大鼠腦組織中HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，兩者在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)均呈現(xiàn)出顯著的正相關(guān)關(guān)系（圖5）。在mRNA水平，Pearson相關(guān)系數(shù)r=0.856，P<0.01；在蛋白水平，Pearson相關(guān)系數(shù)r=0.882，P<0.01。這表明在低壓缺氧條件下，隨著HIF-1α表達(dá)水平的升高，細(xì)胞紅蛋白的表達(dá)水平也相應(yīng)升高，兩者可能在低壓缺氧環(huán)境下對(duì)大鼠腦組織的保護(hù)機(jī)制中存在協(xié)同作用?！九鋱D1張：HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白表達(dá)相關(guān)性散點(diǎn)圖，橫坐標(biāo)為HIF-1α表達(dá)量，縱坐標(biāo)為細(xì)胞紅蛋白表達(dá)量，分別繪制mRNA和蛋白水平的散點(diǎn)圖，并標(biāo)注出相關(guān)系數(shù)和P值】四、結(jié)果分析與討論：HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白表達(dá)變化的意義及機(jī)制4.1HIF-1α表達(dá)變化對(duì)低壓缺氧大鼠腦組織的影響及機(jī)制4.1.1HIF-1α與腦組織缺氧適應(yīng)的關(guān)系在低壓缺氧環(huán)境下，HIF-1α表達(dá)上調(diào)在大鼠腦組織適應(yīng)缺氧過程中扮演著極為關(guān)鍵的角色，其主要通過調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)這一適應(yīng)過程，其中促紅細(xì)胞生成素（EPO）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是其重要的下游靶基因。HIF-1α對(duì)EPO基因表達(dá)的調(diào)控作用顯著。在正常氧含量條件下，EPO基因的表達(dá)受到嚴(yán)格調(diào)控，表達(dá)水平較低。當(dāng)大鼠腦組織處于低壓缺氧環(huán)境時(shí)，HIF-1α迅速積累并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，與EPO基因啟動(dòng)子區(qū)域的缺氧反應(yīng)元件（HRE）特異性結(jié)合。研究表明，HIF-1α與HRE結(jié)合后，能夠招募一系列轉(zhuǎn)錄相關(guān)的輔助因子，如CREB結(jié)合蛋白（CBP）/p300等。這些輔助因子與RNA聚合酶Ⅱ等轉(zhuǎn)錄機(jī)器相互作用，從而啟動(dòng)EPO基因的轉(zhuǎn)錄過程，使EPO的mRNA表達(dá)水平顯著升高。EPO作為一種重要的細(xì)胞因子，主要作用于骨髓造血干細(xì)胞，促進(jìn)其增殖和分化為紅細(xì)胞系祖細(xì)胞，進(jìn)而增加紅細(xì)胞的生成數(shù)量。紅細(xì)胞數(shù)量的增多能夠顯著提高血液對(duì)氧氣的運(yùn)輸能力，為腦組織提供更多的氧供，從而幫助腦組織適應(yīng)低壓缺氧環(huán)境。有研究表明，在低壓缺氧條件下，給予外源性EPO能夠有效改善大鼠腦組織的缺氧狀況，減輕神經(jīng)元的損傷。這進(jìn)一步證實(shí)了HIF-1α通過上調(diào)EPO表達(dá)，在促進(jìn)紅細(xì)胞生成和改善腦組織氧供方面的重要作用。在血管生成方面，HIF-1α對(duì)VEGF基因的激活同樣至關(guān)重要。低壓缺氧刺激使得HIF-1α與VEGF基因啟動(dòng)子區(qū)域的HRE緊密結(jié)合，激活VEGF基因的轉(zhuǎn)錄。VEGF是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，具有強(qiáng)大的促血管生成活性。它能夠刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和存活，促進(jìn)新血管的生成。在低壓缺氧大鼠腦組織中，VEGF表達(dá)上調(diào)后，血管內(nèi)皮細(xì)胞被激活，開始增殖并遷移到缺氧區(qū)域，形成新的血管分支。這些新生血管能夠增加腦組織的血液供應(yīng)，改善缺氧區(qū)域的氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的輸送，為腦組織在低壓缺氧環(huán)境下維持正常功能提供了必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)，抑制HIF-1α的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致VEGF表達(dá)下降，新生血管數(shù)量減少，腦組織缺氧損傷加重。這充分說明了HIF-1α通過調(diào)節(jié)VEGF表達(dá)來促進(jìn)血管生成，對(duì)腦組織適應(yīng)低壓缺氧環(huán)境具有重要意義。4.1.2HIF-1α對(duì)腦組織能量代謝的調(diào)節(jié)作用HIF-1α在調(diào)節(jié)腦組織能量代謝、維持細(xì)胞能量平衡方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其主要通過調(diào)控葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白等基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)這一功能。葡萄糖是腦組織進(jìn)行能量代謝的主要底物，而葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞的過程中起著不可或缺的作用。在低壓缺氧條件下，HIF-1α的表達(dá)上調(diào)會(huì)顯著影響葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)，其中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（GLUT1）是受HIF-1α調(diào)控的重要靶基因之一。HIF-1α與GLUT1基因啟動(dòng)子區(qū)域的HRE結(jié)合，啟動(dòng)GLUT1基因的轉(zhuǎn)錄過程，使得GLUT1的mRNA表達(dá)水平升高，進(jìn)而促進(jìn)GLUT1蛋白的合成。GLUT1是一種廣泛分布于細(xì)胞膜上的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，其表達(dá)水平的增加能夠顯著提高細(xì)胞膜對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)能力。在低壓缺氧大鼠腦組織中，GLUT1表達(dá)上調(diào)后，更多的葡萄糖能夠被轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，為細(xì)胞的能量代謝提供充足的底物。研究表明，在缺氧環(huán)境下，過表達(dá)HIF-1α能夠使GLUT1的表達(dá)顯著增加，細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取量明顯提高。而抑制HIF-1α的表達(dá)則會(huì)導(dǎo)致GLUT1表達(dá)下降，細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取能力減弱，細(xì)胞能量代謝受到嚴(yán)重影響。除了GLUT1，HIF-1α還能調(diào)節(jié)其他與能量代謝相關(guān)的基因表達(dá)，如己糖激酶2（HK2）、磷酸果糖激酶1（PFK1）等糖酵解相關(guān)酶基因。這些基因的表達(dá)上調(diào)能夠增強(qiáng)細(xì)胞的糖酵解代謝途徑，在氧氣供應(yīng)不足的情況下，通過糖酵解產(chǎn)生更多的ATP，為細(xì)胞提供能量。在低壓缺氧條件下，大鼠腦組織中HK2和PFK1的表達(dá)隨著HIF-1α表達(dá)的上調(diào)而顯著增加，糖酵解代謝增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)ATP水平得到一定程度的維持。這表明HIF-1α通過調(diào)控一系列能量代謝相關(guān)基因的表達(dá)，協(xié)調(diào)細(xì)胞的能量代謝過程，使腦組織在低壓缺氧環(huán)境下能夠維持相對(duì)穩(wěn)定的能量供應(yīng)，從而保護(hù)腦組織免受缺氧損傷，維持其正常的生理功能。4.2細(xì)胞紅蛋白表達(dá)變化對(duì)低壓缺氧大鼠腦組織的保護(hù)作用及機(jī)制4.2.1細(xì)胞紅蛋白在氧運(yùn)輸與儲(chǔ)存中的作用細(xì)胞紅蛋白（Cygb）在低壓缺氧時(shí)對(duì)大鼠腦組織的氧運(yùn)輸與儲(chǔ)存發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，這與其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)密切相關(guān)。細(xì)胞紅蛋白由一條含有190個(gè)氨基酸殘基的多肽鏈組成，折疊形成典型的珠蛋白折疊結(jié)構(gòu)，中心含有由卟啉環(huán)和亞鐵離子組成的血紅素輔基，這種結(jié)構(gòu)賦予了它可逆結(jié)合氧氣的能力。在正常生理?xiàng)l件下，細(xì)胞紅蛋白在大鼠腦組織中以較低水平表達(dá)，其主要功能是維持細(xì)胞內(nèi)的基礎(chǔ)氧儲(chǔ)備。當(dāng)大鼠處于低壓缺氧環(huán)境時(shí)，細(xì)胞紅蛋白的表達(dá)迅速上調(diào)。研究表明，低壓缺氧1小時(shí)后，大鼠腦組織中細(xì)胞紅蛋白的mRNA表達(dá)量就開始顯著上升，蛋白表達(dá)量也隨之增加。隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)持續(xù)升高，在低壓缺氧12小時(shí)時(shí)達(dá)到較高水平。這一表達(dá)變化趨勢(shì)與腦組織對(duì)氧氣需求的增加相適應(yīng)。細(xì)胞紅蛋白對(duì)氧氣具有較高的親和力，其氧解離曲線顯示，在較低的氧分壓下，細(xì)胞紅蛋白仍能結(jié)合氧氣。在低壓缺氧環(huán)境中，當(dāng)血液中的氧分壓降低時(shí)，細(xì)胞紅蛋白能夠迅速與氧氣結(jié)合，形成氧合細(xì)胞紅蛋白。細(xì)胞紅蛋白通過自身結(jié)構(gòu)的變化，使得亞鐵離子與氧氣分子之間的結(jié)合更加穩(wěn)定。具體來說，當(dāng)氧氣分子接近細(xì)胞紅蛋白時(shí)，亞鐵離子的電子云分布發(fā)生改變，與氧氣分子形成配位鍵，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)氧氣的結(jié)合。這種結(jié)合作用使得細(xì)胞紅蛋白能夠有效地從血液中攝取氧氣，提高組織對(duì)氧氣的攝取效率。在細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞紅蛋白能夠?qū)⒔Y(jié)合的氧氣儲(chǔ)存起來，當(dāng)細(xì)胞代謝需要氧氣時(shí)，氧合細(xì)胞紅蛋白會(huì)釋放出氧氣。研究發(fā)現(xiàn)，在低壓缺氧條件下，細(xì)胞紅蛋白能夠?yàn)樯窠?jīng)元提供持續(xù)的氧供，維持神經(jīng)元的正常代謝和功能。通過熒光標(biāo)記技術(shù)追蹤氧氣的運(yùn)輸過程，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞紅蛋白能夠?qū)⒀鯕鈴募?xì)胞外運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)的線粒體附近，線粒體是細(xì)胞進(jìn)行有氧呼吸的主要場(chǎng)所，對(duì)氧氣的需求極高。細(xì)胞紅蛋白的這種氧運(yùn)輸和儲(chǔ)存功能，確保了在低壓缺氧環(huán)境下，腦組織中的神經(jīng)元等細(xì)胞能夠獲得足夠的氧氣供應(yīng)，從而維持其正常的生理活動(dòng)，減少因缺氧導(dǎo)致的細(xì)胞損傷和死亡。4.2.2細(xì)胞紅蛋白的抗氧化作用對(duì)腦組織的保護(hù)在低壓缺氧環(huán)境下，大鼠腦組織內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），如超氧陰離子自由基（O??）、羥自由基（?OH）和過氧化氫（H?O?）等。這些ROS具有很強(qiáng)的氧化活性，能夠攻擊生物膜中的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子，導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷、蛋白質(zhì)變性和DNA斷裂等，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡和組織損傷。細(xì)胞紅蛋白在清除這些ROS、減輕氧化應(yīng)激損傷方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，對(duì)腦組織起到重要的保護(hù)作用。細(xì)胞紅蛋白具有直接清除ROS的能力。研究表明，細(xì)胞紅蛋白能夠與超氧陰離子自由基發(fā)生反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)化為過氧化氫。細(xì)胞紅蛋白中的血紅素輔基在這一過程中起著關(guān)鍵作用，亞鐵離子能夠與超氧陰離子自由基發(fā)生氧化還原反應(yīng)，使超氧陰離子自由基得到電子，從而被還原為過氧化氫。過氧化氫在細(xì)胞內(nèi)可以被過氧化氫酶等抗氧化酶進(jìn)一步分解為水和氧氣，從而降低細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。細(xì)胞紅蛋白還能夠與羥自由基發(fā)生反應(yīng)，通過自身結(jié)構(gòu)的變化，將羥自由基捕獲并中和，減少其對(duì)生物大分子的攻擊。在低壓缺氧大鼠腦組織中，給予外源性細(xì)胞紅蛋白后，腦組織中的超氧陰離子自由基和羥自由基含量顯著降低，表明細(xì)胞紅蛋白能夠有效地清除這些有害的ROS。細(xì)胞紅蛋白還能夠通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)來增強(qiáng)腦組織的抗氧化能力。在低壓缺氧條件下，細(xì)胞紅蛋白的表達(dá)上調(diào)會(huì)促進(jìn)超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶基因的表達(dá)。SOD能夠催化超氧陰離子自由基歧化生成過氧化氫和氧氣，CAT則能夠?qū)⑦^氧化氫分解為水和氧氣。研究發(fā)現(xiàn)，在低壓缺氧大鼠腦組織中，隨著細(xì)胞紅蛋白表達(dá)的增加，SOD和CAT的活性也顯著增強(qiáng)。通過基因沉默技術(shù)降低細(xì)胞紅蛋白的表達(dá)后，SOD和CAT的活性明顯下降，腦組織中的ROS含量升高，神經(jīng)元的損傷加重。這表明細(xì)胞紅蛋白通過調(diào)節(jié)抗氧化酶系統(tǒng)的活性，協(xié)同清除ROS，維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)，保護(hù)腦組織中的神經(jīng)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷，從而維持腦組織的正常結(jié)構(gòu)和功能。4.3HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白在低壓缺氧大鼠腦組織中的協(xié)同作用4.3.1二者在信號(hào)通路中的相互關(guān)聯(lián)在低壓缺氧大鼠腦組織中，HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白在信號(hào)通路中存在緊密的相互關(guān)聯(lián)，共同參與機(jī)體對(duì)低壓缺氧環(huán)境的應(yīng)激反應(yīng)。研究表明，細(xì)胞紅蛋白可能通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激水平，間接影響HIF-1α信號(hào)通路。在低壓缺氧條件下，大鼠腦組織內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），如超氧陰離子自由基（O??）、羥自由基（?OH）等，這些ROS會(huì)對(duì)細(xì)胞造成氧化損傷。細(xì)胞紅蛋白具有強(qiáng)大的抗氧化能力，能夠直接清除ROS，如與超氧陰離子自由基發(fā)生反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)化為過氧化氫，再通過細(xì)胞內(nèi)的過氧化氫酶等抗氧化酶進(jìn)一步將過氧化氫分解為水和氧氣，從而降低細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。而氧化應(yīng)激水平的降低對(duì)HIF-1α的表達(dá)和活性有著重要影響。正常氧含量條件下，HIF-1α蛋白的脯氨酸殘基會(huì)被脯氨酰羥化酶（PHD）羥基化修飾，修飾后的HIF-1α?xí)cvonHippel-Lindau（VHL）蛋白結(jié)合，隨后被泛素化并通過蛋白酶體途徑迅速降解，使得細(xì)胞內(nèi)HIF-1α的含量維持在較低水平。然而，在低壓缺氧環(huán)境中，由于ROS的大量產(chǎn)生，會(huì)抑制PHD的活性，導(dǎo)致HIF-1α的羥基化修飾受阻，從而避免了被降解，使得HIF-1α在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定積累并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用。細(xì)胞紅蛋白通過清除ROS，減少了ROS對(duì)PHD活性的抑制，從而間接調(diào)節(jié)了HIF-1α的穩(wěn)定性和活性。有研究通過給予低壓缺氧大鼠外源性細(xì)胞紅蛋白，發(fā)現(xiàn)腦組織中ROS含量顯著降低，同時(shí)HIF-1α的表達(dá)水平和活性也發(fā)生了相應(yīng)的變化，進(jìn)一步證實(shí)了細(xì)胞紅蛋白通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激水平對(duì)HIF-1α信號(hào)通路的影響。HIF-1α也可能通過調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，影響細(xì)胞紅蛋白的功能。HIF-1α作為一種關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，能夠結(jié)合到靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的缺氧反應(yīng)元件（HRE）上，啟動(dòng)一系列下游基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。雖然目前尚未明確HIF-1α是否直接調(diào)控細(xì)胞紅蛋白基因的表達(dá)，但HIF-1α調(diào)控的一些下游基因產(chǎn)物可能會(huì)對(duì)細(xì)胞紅蛋白的功能產(chǎn)生影響。例如，HIF-1α上調(diào)促紅細(xì)胞生成素（EPO）的表達(dá)，EPO除了促進(jìn)紅細(xì)胞生成外，還具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用。EPO可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝和生存信號(hào)通路，間接影響細(xì)胞紅蛋白在腦組織中的功能，協(xié)同應(yīng)對(duì)低壓缺氧環(huán)境。4.3.2協(xié)同作用對(duì)腦組織損傷修復(fù)的意義HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白的協(xié)同作用在低壓缺氧大鼠腦組織損傷修復(fù)過程中具有重要意義，它們從多個(gè)方面促進(jìn)腦組織的修復(fù)，減少神經(jīng)元凋亡，改善神經(jīng)功能。在促進(jìn)血管生成方面，HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白共同發(fā)揮作用，為腦組織損傷修復(fù)提供必要的血液供應(yīng)。HIF-1α能夠激活血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）基因的轉(zhuǎn)錄，VEGF是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，具有強(qiáng)大的促血管生成活性，能夠刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和存活，促進(jìn)新血管的生成。細(xì)胞紅蛋白通過維持細(xì)胞內(nèi)的氧穩(wěn)態(tài)，為血管生成相關(guān)細(xì)胞的正常代謝和功能提供保障。在低壓缺氧大鼠腦組織中，當(dāng)HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白協(xié)同作用時(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移能力增強(qiáng)，新血管的生成數(shù)量增加，這些新生血管能夠快速恢復(fù)腦組織的血液供應(yīng)，為損傷部位輸送氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)受損組織的修復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)，在同時(shí)上調(diào)HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白表達(dá)的低壓缺氧大鼠模型中，腦組織中的血管密度明顯增加，損傷區(qū)域的血液灌注得到顯著改善，神經(jīng)功能恢復(fù)情況也明顯優(yōu)于單獨(dú)調(diào)節(jié)其中一種蛋白表達(dá)的模型。在抑制神經(jīng)元凋亡方面，HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白的協(xié)同作用也十分關(guān)鍵。低壓缺氧會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡增加，而HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白能夠通過不同途徑抑制這一過程。HIF-1α可以調(diào)節(jié)一系列與細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，如上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，下調(diào)促凋亡基因Bax的表達(dá)，從而抑制神經(jīng)元凋亡。細(xì)胞紅蛋白則通過其抗氧化作用，減少ROS對(duì)神經(jīng)元的損傷，維持線粒體的正常功能，進(jìn)而抑制神經(jīng)元凋亡。線粒體是細(xì)胞的能量工廠，也是細(xì)胞凋亡調(diào)控的關(guān)鍵部位，ROS的積累會(huì)導(dǎo)致線粒體膜電位下降，釋放細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子，引發(fā)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞紅蛋白清除ROS，保護(hù)線粒體膜電位，減少細(xì)胞色素C的釋放，與HIF-1α共同作用，降低神經(jīng)元凋亡率。實(shí)驗(yàn)表明，在低壓缺氧條件下，同時(shí)過表達(dá)HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白的大鼠腦組織中，神經(jīng)元凋亡率明顯低于對(duì)照組，神經(jīng)功能得到顯著改善。五、結(jié)論與展望5.1研究主要結(jié)論本研究通過建立低壓缺氧大鼠模型，深入探究了HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白在低壓缺氧大鼠腦組織中的表達(dá)及意義，主要得出以下結(jié)論：低壓缺氧對(duì)大鼠腦組織造成明顯損傷：利用低壓氧艙模擬海拔5000m高度的低壓缺氧環(huán)境，將大鼠置于其中進(jìn)行不同時(shí)間的缺氧處理。結(jié)果顯示，低壓缺氧導(dǎo)致大鼠腦組織發(fā)生顯著變化。在組織形態(tài)學(xué)方面，出現(xiàn)腦水腫現(xiàn)象，表現(xiàn)為腦組織含水量增加，組織間隙增寬，血管周圍水腫帶明顯；神經(jīng)元損傷也較為明顯，神經(jīng)元腫脹，細(xì)胞核固縮、深染，尼氏體消失，細(xì)胞輪廓模糊，尤其在海馬區(qū)和大腦皮質(zhì)等部位，神經(jīng)元損傷數(shù)量增多且分布范圍擴(kuò)大。在神經(jīng)功能方面，大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力等明顯下降，這表明低壓缺氧對(duì)大鼠腦組織的結(jié)構(gòu)和功能均造成了嚴(yán)重?fù)p害，為后續(xù)研究HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白在低壓缺氧條件下對(duì)腦組織的保護(hù)機(jī)制提供了研究背景和基礎(chǔ)。HIF-1α在低壓缺氧大鼠腦組織中的表達(dá)呈現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、蛋白質(zhì)免疫印跡和免疫組化等技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在正常對(duì)照組大鼠腦組織中，HIF-1α的mRNA和蛋白表達(dá)均維持在較低水平。隨著低壓缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，HIF-1α的表達(dá)迅速上調(diào)。在mRNA水平，低壓缺氧1小時(shí)后表達(dá)開始明顯上升，3小時(shí)進(jìn)一步升高，6小時(shí)達(dá)到峰值，隨后在12小時(shí)和24小時(shí)逐漸下降；在蛋白水平，表達(dá)趨勢(shì)與mRNA相似，6小時(shí)時(shí)蛋白表達(dá)量達(dá)到最高。免疫組化結(jié)果顯示，HIF-1α主要表達(dá)于神經(jīng)元的細(xì)胞質(zhì)中，隨著低壓缺氧時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞核中也開始出現(xiàn)明顯表達(dá)，且陽性染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，在6小時(shí)時(shí)達(dá)到最強(qiáng)和最多。這種表達(dá)變化表明HIF-1α在大鼠腦組織應(yīng)對(duì)低壓缺氧的過程中發(fā)揮著重要作用，其表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化與低壓缺氧時(shí)間密切相關(guān)，可能是機(jī)體對(duì)缺氧環(huán)境的一種適應(yīng)性反應(yīng)。細(xì)胞紅蛋白在低壓缺氧大鼠腦組織中的表達(dá)也發(fā)生顯著改變：同樣運(yùn)用上述檢測(cè)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照組大鼠腦組織中細(xì)胞紅蛋白的mRNA和蛋白表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定。低壓缺氧后，其表達(dá)持續(xù)上升，在mRNA水平，1小時(shí)后表達(dá)開始上升，3小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)不斷升高，24小時(shí)略有下降但仍高于正常水平；在蛋白水平，表達(dá)趨勢(shì)一致，12小時(shí)時(shí)蛋白表達(dá)量達(dá)到較高水平。免疫組化顯示，細(xì)胞紅蛋白主要表達(dá)于神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，隨著低壓缺氧時(shí)間延長(zhǎng)，陽性染色逐漸增強(qiáng)，陽性細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，12小時(shí)時(shí)陽性染色和陽性細(xì)胞數(shù)量達(dá)到高峰，24小時(shí)略有下降但仍高于正常對(duì)照組。這表明細(xì)胞紅蛋白在低壓缺氧條件下對(duì)腦組織具有重要的保護(hù)作用，其表達(dá)的持續(xù)增加可能是為了滿足腦組織對(duì)氧氣的需求以及對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷。HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白在低壓缺氧大鼠腦組織中的表達(dá)呈正相關(guān)且存在協(xié)同作用：對(duì)兩者的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示在mRNA水平和蛋白水平均呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)關(guān)系，Pearson相關(guān)系數(shù)在mRNA水平為r=0.856，在蛋白水平為r=0.882，P均小于0.01。在信號(hào)通路中，細(xì)胞紅蛋白可能通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激水平間接影響HIF-1α信號(hào)通路，HIF-1α也可能通過調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)影響細(xì)胞紅蛋白的功能。在促進(jìn)腦組織損傷修復(fù)方面，兩者協(xié)同作用，共同促進(jìn)血管生成，為腦組織損傷修復(fù)提供血液供應(yīng)；共同抑制神經(jīng)元凋亡，減少神經(jīng)元死亡，改善神經(jīng)功能。這表明HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白在低壓缺氧大鼠腦組織中相互協(xié)作，共同應(yīng)對(duì)低壓缺氧環(huán)境對(duì)腦組織的損傷，維持腦組織的正常功能。5.2研究的創(chuàng)新點(diǎn)與不足本研究在低壓缺氧對(duì)大鼠腦組織影響及HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白作用機(jī)制探究方面具有一定創(chuàng)新點(diǎn)。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上，構(gòu)建模擬海拔5000m高度低壓缺氧環(huán)境的大鼠模型，更真實(shí)反映高原低壓缺氧實(shí)際情況，與以往研究相比，實(shí)驗(yàn)條件更貼合實(shí)際應(yīng)用場(chǎng)景，為研究低壓缺氧性腦損傷提供更可靠數(shù)據(jù)。同時(shí)，從基因和蛋白水平，運(yùn)用多種技術(shù)如免疫組化、RT-PCR、Westernblot，全面檢測(cè)HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白表達(dá)變化，多維度分析二者在低壓缺氧過程中的作用，增強(qiáng)研究結(jié)果可靠性和說服力。本研究也存在不足之處。在樣本量方面，每組僅10只大鼠，樣本量相對(duì)較小，可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在一定偶然性，影響結(jié)果普適性和推廣價(jià)值。未來研究可增加樣本數(shù)量，設(shè)置更多時(shí)間點(diǎn)和缺氧程度組，更全面準(zhǔn)確分析HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白表達(dá)變化規(guī)律及相互關(guān)系。在檢測(cè)指標(biāo)上，僅檢測(cè)HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白表達(dá)，未深入檢測(cè)二者下游相關(guān)基因和蛋白表達(dá)，難以全面揭示其在低壓缺氧條件下對(duì)大鼠腦組織作用的完整信號(hào)通路和分子機(jī)制。后續(xù)研究可進(jìn)一步拓展檢測(cè)指標(biāo)，如檢測(cè)EPO、VEGF、GLUT1等下游基因和蛋白表達(dá)，深入探討它們?cè)诘蛪喝毖醐h(huán)境下對(duì)腦組織的保護(hù)或損傷作用機(jī)制。5.3對(duì)未來研究的展望基于本研究結(jié)果，未來在該領(lǐng)域可從多個(gè)方向進(jìn)一步深入研究。在分子機(jī)制探索方面，雖然本研究揭示了HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白在低壓缺氧大鼠腦組織中的表達(dá)規(guī)律及協(xié)同作用，但對(duì)于二者之間更精確的調(diào)控機(jī)制仍有待深入挖掘。后續(xù)研究可運(yùn)用基因編輯技術(shù)，如CRISPR/Cas9系統(tǒng)，構(gòu)建HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白基因敲除或過表達(dá)的大鼠模型。通過這些模型，深入研究在基因?qū)用嫔隙呷绾蜗嗷ビ绊懀约八鼈儗?duì)下游基因表達(dá)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。可以分析在不同程度低壓缺氧條件下，基因敲除或過表達(dá)對(duì)大鼠腦組織中相關(guān)信號(hào)通路的影響，明確HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白在這些信號(hào)通路中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)作用，從而更全面地揭示它們?cè)诘蛪喝毖醐h(huán)境下對(duì)腦組織保護(hù)的分子機(jī)制。在治療靶點(diǎn)開發(fā)方面，HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白的發(fā)現(xiàn)為低壓缺氧性腦損傷的治療提供了潛在靶點(diǎn)，未來可針對(duì)這兩個(gè)靶點(diǎn)開展藥物研發(fā)工作。研究人員可以通過高通量藥物篩選技術(shù)，從大量的化合物庫中篩選出能夠特異性調(diào)節(jié)HIF-1α和細(xì)胞紅蛋白表達(dá)或活性的小分子化合物。對(duì)篩選出的化合物進(jìn)行進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)優(yōu)化和活性驗(yàn)證，開發(fā)出具有高效、低毒特點(diǎn)的新型藥物。還可以探索基于基因治療的方法，如利用病毒載體將編碼HIF-1α或細(xì)胞紅蛋白的基因?qū)氲降蛪喝毖鯎p傷的腦組織中，增強(qiáng)它們的表達(dá)水平，促進(jìn)腦組織的修復(fù)和功能恢復(fù)，為臨床治療低壓缺氧性腦損傷提供新的策略和方法。六、參考文獻(xiàn)[1]陳清棠。臨床神經(jīng)病學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2001:1-10.[2]李繼碩。神經(jīng)解剖學(xué)[M].2版。北京：人民衛(wèi)生出版社，2002:200-210.[3]張均田?，F(xiàn)代藥理實(shí)驗(yàn)方法[M].北京：北京醫(yī)科大學(xué)中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1998:1200-1205.[4]SemenzaGL,WangGL.Anuclearfactorinducedbyhypoxiaviadenovoproteinsynthesisbindstothehumanerythropoietingeneenhanceratasiterequiredfortranscriptionalactivation[J].MolCellBiol,1992,12(12):5447-5454.[5]JiangBH,RueEA,WangGL,etal.Dimerization,DNAbinding,andtrans-activationpropertiesofhypoxia-induciblefactor1[J].JBiolChem,1996,271(52):32253-32259.[6]IvanM,KondoK,YangH,etal.HIFαtargetedforVHL-mediateddestructionbyprolinehydroxylation:implicationsforO2sensing[J].Science,2001,292(5516):464-468.[7]EpsteinAC,GleadleJM,McNeillLA,etal.C.elegansEGL-9andmammalianhomologsdefineafamilyofdioxygenasesthatregulateHIFbyprolylhydroxylation[J].Cell,2001,107(1):43-54.[8]WiesenerMS,TurleyH,AllenWE,etal.Hypoxia-induciblefactor-1αexpressionanddistributioninhumantissues,tumors,andcelllines[J].CancerRes,1998,58(12):2615-2623.[9]王萬鐵，徐正祄，王衛(wèi)，等。高壓氧對(duì)急性腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織HIF-1α表達(dá)的影響[J].中國(guó)病理生理雜志，2005,21(11):2139-2143.[10]周鵬，劉合年，楊宗城，等。大鼠嚴(yán)重?zé)齻蠼M織HIF-1α的表達(dá)變化[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005,27(19):1937-1939.[11]楊于嘉，姚裕家。新生兒缺氧缺血性腦病診斷標(biāo)準(zhǔn)[J].中華兒科雜志，2005,43(8):584-586.[12]閆煥利，陰懷清，杜洪，等.HIF-1α及其抑制劑對(duì)新生大鼠缺氧缺血性腦損傷時(shí)神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2012,10(8):977-980.[13]