資料來源于網(wǎng)絡(luò)整理，更多高質(zhì)量文檔請聯(lián)系。菌種管理規(guī)定1．目的：規(guī)范檢定用菌的管理，最大限度降低變異率，確保菌種的溯源性與穩(wěn)定性，從而確保檢驗結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。2．范圍：本制度適用于檢定用菌種的管理，包括菌種的申購、保存、傳代、使用及銷毀等。3．術(shù)語3.1標(biāo)準(zhǔn)菌種是指由中國藥品生物制品檢定所醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心提供的冷凍干燥菌。傳代用菌種是指用標(biāo)準(zhǔn)菌種制備的采用特定保存方法長期固定保存的菌種，用于傳代及制備工作用菌種。3.2

工作用菌種是指用標(biāo)準(zhǔn)菌種或傳代用菌種接種至普通瓊脂斜面培養(yǎng)后，作為日常工作使用的菌種。3.3

菌種的代是指將其接種至一新鮮培養(yǎng)基上或培養(yǎng)基內(nèi)，每萌發(fā)一次即稱為一代，從菌種保藏中心獲得的冷凍干燥菌種為第0代。4．職責(zé)：質(zhì)量部經(jīng)理負(fù)責(zé)菌種的申購、接收、保存和分發(fā)，檢驗員負(fù)責(zé)菌種的確認(rèn)、傳代、使用及銷毀。5．內(nèi)容5.1菌種的接收與保管5.1.1從菌種保藏中心購買的原始菌種(玻璃菌種管裝),為凍干粉劑(第G0代)。5.1.2實驗室購到菌種后,應(yīng)做好接收記錄，登記相關(guān)的信息,如:名稱、數(shù)量和接收日期等。5.1.3按照產(chǎn)品說明保存菌種，并加鎖保存，雙人管理。5.2標(biāo)準(zhǔn)菌種的復(fù)蘇5.2.1開啟菌種前，用75%酒精棉消毒西林瓶表面。在無菌條件下，按鋁蓋上的箭頭方向打開塑蓋，撕開鋁蓋，打開西林瓶膠塞，加入0.3ml左右的復(fù)蘇液，用無菌滴管反復(fù)吹吸，將凍干菌種溶解成為懸液，然后將菌種管內(nèi)的菌液接種至相應(yīng)的流體培養(yǎng)基(細(xì)菌用硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基;真菌沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基)試管中,依據(jù)菌種類型將其培養(yǎng)于適宜的培養(yǎng)條件（細(xì)菌培養(yǎng)溫度30～35℃、2d;真菌培養(yǎng)溫度23～28℃、3d）下,仔細(xì)觀察流體培養(yǎng)基是否渾濁,渾濁說明菌種復(fù)活生長；若不渾濁,可適當(dāng)延長培養(yǎng)時間，培養(yǎng)后的菌種為G1代。5.2.2

若延長培養(yǎng)時間流體培養(yǎng)基仍不顯渾濁，在將其作為無活菌生長的培養(yǎng)物丟棄之前，細(xì)菌應(yīng)至少培養(yǎng)一周以上，真菌至少應(yīng)培養(yǎng)兩周以上，并在丟棄前應(yīng)做高溫滅活處理。5.3

標(biāo)準(zhǔn)菌種的確認(rèn)5.3.1無菌環(huán)境下，用接種環(huán)取上述培養(yǎng)物接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（細(xì)菌）或玫瑰紅鈉培養(yǎng)基（真菌）平板上，然后在30～35℃條件下培養(yǎng)3天（細(xì)菌），23～28℃培養(yǎng)條件下5天（真菌）。5.3.2培養(yǎng)后，首先觀察其是否具有典型的菌落形態(tài)，然后挑取生長旺盛的單一的純菌落，劃線于平皿培養(yǎng)基，收集較多的生長旺盛的典型單菌落。5.4菌種保存與傳代5.4.1：菌種保存5.4.1.1甘油一生理鹽水保存液：取甘油(分析純)8份加入生理鹽水2份，充分混合后，經(jīng)121℃、20min滅菌后備用。按5份培養(yǎng)液加入2份甘油一生理鹽水保存液的比例，在純化后的菌種培養(yǎng)液中加入已滅菌的甘油一生理鹽水保存液

，平行制作兩份分別作為菌種保存液G2和菌種工作液W3，并分裝于滅菌的微量離心管或細(xì)胞凍存管，放置冰箱冷凍室保存，保存效期為5年。該方法主要適用于需氧細(xì)菌和酵母菌的保藏（如大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型副傷寒沙門菌）。5.4.1.2液體石蠟：將菌種穿刺接種于半固體高層培養(yǎng)基中，在適宜條件下培養(yǎng)結(jié)束后，在層流臺下用無菌吸管吸取無菌液體石蠟至培養(yǎng)好的菌種管內(nèi)，并使石蠟高出菌種表面約

1cm使菌體與空氣隔絕，并將試管直立，置于-20℃冷凍冰箱中保存。此法主要適用于霉菌、厭氧菌、放線菌、芽孢桿菌的保存（如枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌等）。5.4.1.3菌種穿刺接種于半固體高層培養(yǎng)基中，在適宜條件下培養(yǎng)結(jié)束后，置于冰箱保存2～8℃，具體保存時間看菌種使用說明。5.4.2標(biāo)準(zhǔn)菌種傳代5.4.2.1將標(biāo)準(zhǔn)凍干菌種復(fù)蘇后，轉(zhuǎn)種于適宜的增菌培養(yǎng)基內(nèi)，稱第1代（G1），復(fù)壯后轉(zhuǎn)接至平板上，并在適當(dāng)溫度下培養(yǎng)適當(dāng)時間，分離單個純種菌落，此為第2代（G2）。5.4.2.2菌種確認(rèn)后，挑取平板上純菌落制成濃菌懸液用于制備甘油冷凍管，作為保存菌種（G2），也稱傳代用菌種，同時挑取純菌落轉(zhuǎn)接斜面菌種數(shù)支，作為工作用菌種，此為第3代（W3）。5.4.2.3將第2代（G2）菌種管冷凍保存，將工作用菌（W3）于適當(dāng)溫度下培養(yǎng)適當(dāng)時間后用于日常檢驗。5.4.2.4取一支冷凍保存的第2代（G2）菌種轉(zhuǎn)種于平板和斜面培養(yǎng)基上，平板上的菌種制成冷凍保存管第3代（G3）；斜面培養(yǎng)基的菌種經(jīng)適當(dāng)溫度下培養(yǎng)適當(dāng)時間后用作工作用菌種，此仍為第3代（W3）。5.4.2.5將第3代菌種（G3）冷凍或低溫保存，將生長、轉(zhuǎn)種后的第2代（G2）菌種經(jīng)高溫滅活處理后丟棄。5.4.2.6按上述規(guī)程操作，直至G4轉(zhuǎn)為W5為止，需重新開啟新的冷凍干燥菌種，重復(fù)上述規(guī)程操作，保存和使用菌種。5.4.2.7當(dāng)工作用菌種代數(shù)小于5時，在規(guī)定保存期限內(nèi)，可直接用上一代工作用菌種轉(zhuǎn)接下一代工作用菌種。5.4.3工作用菌種的傳代5.4.3.1當(dāng)工作用菌種代數(shù)小于5時，可直接用上一代工作用菌種轉(zhuǎn)接下一代工作用菌種。a.取在冰箱

2～8℃保存的工作用菌種用普通瓊脂斜面?zhèn)鞔?，并將新傳代的培養(yǎng)物替代原有的菌種，作為工作用菌種。b.也可取用5.4.1保存的菌種，進(jìn)行復(fù)蘇，直接作為工作用菌種。5.4.3.2細(xì)菌每1個月傳代一次；酵母菌每2個月傳代一次；霉菌及芽胞每3個月傳代一次。當(dāng)超過5代，須用傳代用菌種傳代。5.4.4

工作用菌種（廢棄）的銷毀5.4.4.1

下列情況的菌種或培養(yǎng)物或被污染的器具等，必須采用121℃，45分鐘滅活處理：a.

新一代菌種制備成功后的上一代菌種；b.

使用完后的菌種和帶有標(biāo)準(zhǔn)菌種的器具和培養(yǎng)物；c.

超過有效期的菌種；d.

凡被污染，可疑變異等情況菌種；e.

其他應(yīng)廢棄的菌種。5.4.4.2

凡是需要銷毀的菌種由相關(guān)人員提出申請，經(jīng)批準(zhǔn)后進(jìn)行銷毀處理，并填寫《廢棄菌種銷毀處理記錄》。5.5菌種編號5.5.1編號方法：采用字母加數(shù)字表示為“英文縮寫字母—代次—傳代日期—順序號”，其中：a.菌種的英文縮寫字母：大腸埃希菌（E.c）、金黃色葡萄球菌（S.a）、枯草芽孢桿菌（B.s）、白色念珠菌（C.a）、黑曲霉菌（A.n）、乙型副傷寒沙門菌（S.p）b.代數(shù)用一位帶有下標(biāo)數(shù)字的字母表示：傳代用菌種用G表示；工作用菌種用W表示；如G3表示傳代用菌種第3代；W3表示工