DB42湖北省市場監(jiān)督管理局發(fā)布I 2 3 3 3 4 5 本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利，本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利本文件實(shí)施應(yīng)用中的疑問，可咨詢湖北省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳，聯(lián)系電話郵箱郵箱：597871辣椒炭疽病抗性鑒定技術(shù)規(guī)程N(yùn)Y/T2060.1辣椒抗病性鑒定技術(shù)規(guī)程第1部分：辣椒抗疫病鑒定技術(shù)規(guī)程4接種體制備上用紗布過濾馬鈴薯殘?jiān)?，收集濾液置于干凈鍋中，加入1將鑒定的新鮮膠孢炭疽菌進(jìn)行3次單孢分離純化后，轉(zhuǎn)接于含PDA斜面培養(yǎng)基的5cm試管中，28℃2將保存在PDA斜面培養(yǎng)基上的接種體置于28℃下黑暗培養(yǎng)3d,從菌絲邊緣用打孔器截取直徑0.5cm將復(fù)壯分離后獲得的病原物接種在PDA培養(yǎng)基上，置于28℃、濕度為90%的環(huán)境中黑暗培養(yǎng)7菌絲長滿平板后，將平板置于28℃、濕度為90%的環(huán)境中光照和黑暗(12h/12h)交替培養(yǎng)，待產(chǎn)生分取辣椒青熟果(花后35d～40d)或紅熟果(花后45d～50d),每個(gè)鑒定品種或材料設(shè)3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10個(gè)果實(shí)，一半接種分生孢子懸浮液，一半用無菌水做對照。感病對照品種：“茄門甜椒”,中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所提供。鑒定材料適時(shí)播種、育苗、定植、采摘，按照常規(guī)田間管理(不噴施殺菌劑),保持鑒定材料的一75%的乙醇溶液中浸泡2min,用1%次氯酸鈉溶液浸泡2min,用無菌水洗凈，置于超凈工作臺(tái)晾干。5.5接種孢子懸浮液。每個(gè)果實(shí)接種2～3個(gè)點(diǎn)。接種后，置于適宜規(guī)格的透明帶蓋塑料整理箱中，箱底鋪設(shè)4層濕潤的滅菌濾紙，接種點(diǎn)朝上并用保鮮膜密閉。置于室內(nèi)28℃黑暗保濕(相對濕度100%)24h,培養(yǎng)條件控制為：溫度28℃,相對濕度80%～100%,每天光照和黑暗各12h。36病情調(diào)查6.1調(diào)查時(shí)間接種后5d～7d開始病情調(diào)查。6.2調(diào)查方法按照附錄C表C.1的病情分級(jí)描述，逐一觀察果實(shí)每一接種處的病斑擴(kuò)展情況，記載各病級(jí)病果數(shù)，并將發(fā)病結(jié)果記入附錄C表C.3。6.3病情分級(jí)辣椒炭疽病的病情分級(jí)參見附錄C的表C.1。6.4病情記載調(diào)查記載每一鑒定果實(shí)的病情級(jí)別，計(jì)算病情指數(shù)(Diseaseindex:DI)。病情指數(shù)按公式(1)計(jì)式中：DI——病情指數(shù)；s——各病情級(jí)別的果實(shí)數(shù)；n——相對病情級(jí)別的數(shù)值；N——調(diào)查總果數(shù)；S——最高病情級(jí)別的代表數(shù)值。7抗病性評價(jià)7.1抗病性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)鑒定材料3次重復(fù)的病情指數(shù)(DI)的平均值確定其抗病水平，劃分標(biāo)準(zhǔn)見附錄C表C.2。7.2鑒定結(jié)果的有效性判別當(dāng)感病對照的病情指數(shù)DI>30,該批次的抗炭疽病鑒定即為有效。8記載表格統(tǒng)計(jì)鑒定品種的病情指數(shù)，將結(jié)果記載在附錄C表C.3。4(資料性)辣椒炭疽病是由半知菌亞門刺盤孢屬(Colletotrichumspp.)致病菌種引起的一種常見辣椒病害，黑點(diǎn)炭疽病菌(C.capsici)、尖孢炭疽菌(C.acutatum)和黑線炭疽菌(C.dematium)果實(shí)染病，病斑表面初生水漬狀，逐漸擴(kuò)展為褐色凹陷、中心著生黑(紅)點(diǎn)的圓形或不規(guī)則形狀病，病部呈現(xiàn)不規(guī)則或梭形病斑，縱裂凹陷，51×TEBuffer（500mL）：1mol/LTris-HClBuffer，pH8.0，5mL；0.5mol/LEDTA，pH8.0，1mL；均勻混合定容到500mL，高溫高壓滅菌后，室溫保存。2%CTAB裂解液（1L）：NaCl82g，EDTA7.44g，Tris12.12g，CTAB20g，PVP2g，用ddH2O定容至1L，常溫保存，使用時(shí)可加入1%的β-巰基乙醇。50×Tris-乙酸（TAE）電泳緩沖液：242gTris；57.1mL冰乙酸；100mL0.5MEDTA（pH=8.0去離子水定容至1000ml，室溫保存。將保存的病原菌菌株在PDA培養(yǎng)基上、28℃暗培養(yǎng)7d～10d后，將培養(yǎng)基表面菌絲輕輕刮下，液氮45min～60min，并不時(shí)輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)離心管。加入等體積的氯仿：異戊醇，輕輕地顛倒混勻，室溫下10000r/min離心10min，轉(zhuǎn)移上清液至另一新離心管中。加入2倍體積的無水乙醇或0.7倍體積的異丙醇，出現(xiàn)絮狀沉淀后，-20℃放置30min，12000r/min離心10min～15min，回收DNA沉淀。用70%的乙醇清洗沉淀2次，吹干后溶于適量的滅菌水中。PCR反應(yīng)體系和PCR引物分別見表B.1和表B.6擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1