加味青蒿鱉甲湯對小鼠Lewis肺癌細胞凋亡的誘導作用及機制探究一、引言1.1研究背景與意義肺癌作為全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率均位居前列的惡性腫瘤，嚴重威脅著人類的生命健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥數(shù)據(jù)顯示，肺癌新增病例數(shù)為220萬，占所有癌癥病例的11.4%，死亡病例數(shù)達180萬，占癌癥死亡總數(shù)的18%，在男性惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率中均位居首位，在女性中分別位列第2位和第1位。近年來，盡管醫(yī)療技術取得了顯著進步，肺癌的治療手段不斷豐富，包括手術、化療、放療、靶向治療和免疫治療等，但肺癌患者的總體5年生存率仍較低，約為15%-20%，且晚期肺癌患者的生存率更低。這主要是由于肺癌的發(fā)病機制極為復雜，涉及多個基因和信號通路的異常改變，且早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時已處于晚期，失去了手術根治的機會，同時肺癌細胞容易產(chǎn)生耐藥性，導致現(xiàn)有治療方法的療效受限。目前肺癌治療面臨諸多難題，如晚期患者多、隱匿性轉移多，絕大多數(shù)患者首診時病變已處于晚期且全身多發(fā)轉移，而在治療前又難以準確判斷疾病分期，隱匿性轉移難以發(fā)現(xiàn)；各種治療方法療效有限且副作用大，除手術外，化療、放療、中醫(yī)中藥、生物免疫等治療方法雖在某些階段對部分患者有一定作用，但難以在治療前確定哪些患者在哪些階段可能獲益，且這些治療方法必然會給患者帶來痛苦，手術雖療效相對較好，但適用范圍窄、風險高、局限性大。因此，尋找更為有效的肺癌治療方法和藥物，提高肺癌患者的生存率和生活質(zhì)量，成為當前醫(yī)學領域亟待解決的重要課題。中醫(yī)中藥在腫瘤治療中具有獨特的優(yōu)勢，其多靶點、多途徑的作用機制，能夠調(diào)節(jié)機體免疫功能、抑制腫瘤細胞生長、誘導腫瘤細胞凋亡，且不良反應相對較少，在改善患者生活質(zhì)量、延長生存期方面發(fā)揮著重要作用。加味青蒿鱉甲湯作為中醫(yī)經(jīng)典方劑的化裁，由青蒿、鱉甲、知母、生地、丹皮等多味中藥組成，具有滋陰清熱、透邪外出的功效。傳統(tǒng)上常用于治療陰虛發(fā)熱、骨蒸勞熱等病癥，在腫瘤治療領域也逐漸受到關注。已有研究表明，加味青蒿鱉甲湯在治療晚期肺癌癌性發(fā)熱方面取得了較好的臨床療效，能夠有效降低患者體溫，改善臨床癥狀。然而，其對肺癌細胞凋亡的影響及作用機制尚未完全明確。細胞凋亡是一種程序性細胞死亡過程，在維持機體正常生理功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮著重要作用。當細胞受到各種內(nèi)外源性刺激時，會激活一系列凋亡相關信號通路，導致細胞發(fā)生凋亡。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，細胞凋亡機制往往受到抑制，使得腫瘤細胞能夠逃避機體的免疫監(jiān)視和清除，持續(xù)增殖。因此，誘導腫瘤細胞凋亡已成為腫瘤治療的重要策略之一。深入研究加味青蒿鱉甲湯對小鼠Lewis肺癌細胞凋亡的干預作用及其機制，不僅有助于揭示其治療肺癌的潛在分子機制，豐富中醫(yī)腫瘤學的理論內(nèi)涵，為肺癌的中醫(yī)治療提供更為堅實的理論基礎；還能為臨床開發(fā)新的肺癌治療藥物和方案提供新思路和實驗依據(jù)，具有重要的理論意義和實踐價值。通過本研究，有望進一步挖掘加味青蒿鱉甲湯的藥用價值，提高肺癌的治療效果，為廣大肺癌患者帶來新的希望。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在肺癌治療方面，國外一直處于研究前沿，不斷探索新的治療靶點和藥物。美國國立癌癥研究所（NCI）等機構投入大量資源開展肺癌相關研究，推動了分子靶向治療和免疫治療的飛速發(fā)展。例如，針對非小細胞肺癌（NSCLC）中常見的表皮生長因子受體（EGFR）突變，吉非替尼、厄洛替尼等第一代EGFR酪氨酸激酶抑制劑（TKI）顯著提高了患者的無進展生存期；第三代EGFR-TKI奧希替尼，不僅對EGFR敏感突變有效，還能克服第一代和第二代TKI耐藥后的T790M突變，進一步改善了患者的生存預后。免疫治療領域，帕博利珠單抗、納武利尤單抗等免疫檢查點抑制劑已成為晚期NSCLC的標準治療方案之一，通過激活機體自身免疫系統(tǒng)來殺傷腫瘤細胞，部分患者實現(xiàn)了長期生存。在早期肺癌治療中，手術聯(lián)合輔助化療仍是主要治療模式，但隨著精準醫(yī)學的發(fā)展，基因檢測指導下的個體化治療逐漸受到重視。歐洲腫瘤內(nèi)科學會（ESMO）等國際權威組織不斷更新肺癌診療指南，以指導臨床實踐，提高肺癌治療的規(guī)范化和精準化水平。國內(nèi)肺癌治療研究也取得了長足進步，在中醫(yī)藥治療肺癌方面具有獨特優(yōu)勢。眾多研究表明，中醫(yī)藥聯(lián)合放化療、靶向治療等可以減輕不良反應，提高患者生活質(zhì)量，延長生存期。同時，國內(nèi)在肺癌的基礎研究和臨床轉化方面也積極開展工作，如對肺癌發(fā)生發(fā)展的分子機制進行深入探索，尋找新的治療靶點和生物標志物；開展多中心、大樣本的臨床研究，驗證新的治療方案和藥物的療效和安全性。近年來，國產(chǎn)肺癌靶向藥物和免疫治療藥物不斷涌現(xiàn)，如阿美替尼、伏美替尼等第三代EGFR-TKI，以及信迪利單抗、卡瑞利珠單抗等免疫檢查點抑制劑，為肺癌患者提供了更多的治療選擇，且在價格上具有一定優(yōu)勢，提高了患者的可及性。此外，國內(nèi)還注重肺癌的早期篩查和診斷，通過推廣低劑量螺旋CT篩查等手段，提高肺癌的早期發(fā)現(xiàn)率，為早期治療創(chuàng)造條件。細胞凋亡機制的研究是生命科學領域的重要熱點，國外在這方面開展了大量深入的基礎研究。從線蟲等模式生物中發(fā)現(xiàn)了一系列凋亡相關基因，如Ced-3、Ced-4和Ced-9等，為揭示細胞凋亡的分子機制奠定了基礎。進一步研究發(fā)現(xiàn)，細胞凋亡主要通過內(nèi)源性線粒體途徑和外源性死亡受體途徑激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族（caspases）來實現(xiàn)。線粒體途徑中，Bcl-2家族蛋白通過調(diào)節(jié)線粒體膜通透性，控制細胞色素c的釋放，進而激活caspase-9，啟動下游caspase級聯(lián)反應；死亡受體途徑則是通過腫瘤壞死因子（TNF）等配體與相應受體結合，招募接頭蛋白和caspase-8，直接激活caspase級聯(lián)反應。此外，還發(fā)現(xiàn)了許多凋亡調(diào)控基因和信號通路，如p53、Ras-MAPK、PI3K/Akt等，它們在細胞凋亡的調(diào)控中發(fā)揮著關鍵作用。這些研究成果為腫瘤等疾病的治療提供了重要的理論基礎和潛在靶點。國內(nèi)在細胞凋亡機制研究方面也緊跟國際前沿，在某些領域取得了創(chuàng)新性成果。對細胞凋亡相關基因和信號通路的研究不斷深入，發(fā)現(xiàn)了一些具有中國特色的凋亡調(diào)控機制和分子靶點。例如，研究發(fā)現(xiàn)某些中藥活性成分可以通過調(diào)節(jié)細胞凋亡相關信號通路來誘導腫瘤細胞凋亡，為中藥抗癌機制的研究提供了新的思路。同時，國內(nèi)科研人員還利用先進的生物技術和實驗模型，對細胞凋亡在腫瘤發(fā)生發(fā)展、神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病等多種疾病中的作用機制進行了廣泛研究，為這些疾病的防治提供了理論依據(jù)。在臨床應用方面，基于細胞凋亡機制開發(fā)的新型治療策略和藥物也在不斷探索中，如凋亡誘導劑、基因治療等，有望為疾病治療帶來新的突破。加味青蒿鱉甲湯作為中醫(yī)經(jīng)典方劑的化裁，在國內(nèi)受到了較多關注。多項臨床研究表明，其在治療晚期肺癌癌性發(fā)熱方面具有顯著療效，能夠有效降低患者體溫，改善臨床癥狀。如鄒源等人選取86例晚期肺癌癌性發(fā)熱患者，分為觀察組和對照組，觀察組采用加味青蒿鱉甲湯治療，對照組給予常規(guī)治療，結果顯示觀察組臨床效果顯著高于對照組，白細胞數(shù)目明顯下降。還有研究表明，加味青蒿鱉甲湯能夠提高患者的生活質(zhì)量，增強機體免疫力。在作用機制研究方面，國內(nèi)學者通過細胞實驗和動物實驗初步探討了其可能的作用機制，發(fā)現(xiàn)加味青蒿鱉甲湯可能通過調(diào)節(jié)機體免疫功能、抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡等途徑發(fā)揮抗癌作用。然而，目前對加味青蒿鱉甲湯的研究仍存在一定局限性，如作用機制尚未完全明確，有效成分的分離和鑒定還需進一步深入，臨床研究的樣本量相對較小等。國外對加味青蒿鱉甲湯的研究相對較少，但隨著中醫(yī)藥在國際上的影響力逐漸擴大，也開始受到一些關注。一些國外研究機構和學者對青蒿鱉甲湯的主要成分青蒿素及其衍生物的抗腫瘤作用進行了研究，發(fā)現(xiàn)青蒿素及其衍生物具有一定的抑制腫瘤細胞生長、誘導腫瘤細胞凋亡的作用。然而，對于加味青蒿鱉甲湯這一復方制劑的研究還較為缺乏，主要集中在對其傳統(tǒng)功效的了解和初步的藥理活性探索上。由于文化背景和研究方法的差異，國外對加味青蒿鱉甲湯的研究與國內(nèi)存在一定的互補性，未來加強國際間的合作與交流，有助于更全面深入地研究加味青蒿鱉甲湯的藥理作用和臨床應用價值。1.3研究目標與內(nèi)容本研究以小鼠Lewis肺癌細胞為對象，旨在深入探究加味青蒿鱉甲湯對肺癌細胞凋亡的誘導作用及其潛在機制，為肺癌的中醫(yī)治療提供科學依據(jù)。具體研究目標如下：首先，明確加味青蒿鱉甲湯對小鼠Lewis肺癌細胞凋亡的誘導作用，通過實驗觀察不同濃度加味青蒿鱉甲湯作用下，肺癌細胞凋亡率的變化情況，確定加味青蒿鱉甲湯是否具有誘導肺癌細胞凋亡的能力。其次，深入探討加味青蒿鱉甲湯誘導小鼠Lewis肺癌細胞凋亡的分子機制，從細胞凋亡相關信號通路、基因和蛋白表達等層面，研究加味青蒿鱉甲湯對肺癌細胞凋亡調(diào)控的作用機制。最后，篩選加味青蒿鱉甲湯干預小鼠Lewis肺癌細胞凋亡的最佳條件，包括藥物濃度、作用時間等，為臨床應用提供參考。為實現(xiàn)上述研究目標，本研究將開展以下內(nèi)容的研究：細胞實驗方面，進行細胞培養(yǎng)與分組，將小鼠Lewis肺癌細胞進行體外培養(yǎng)，分為空白對照組、不同濃度加味青蒿鱉甲湯實驗組、陽性對照組（采用已知的細胞凋亡誘導劑處理）。運用細胞凋亡檢測方法，通過流式細胞術檢測細胞凋亡率，觀察不同處理組細胞凋亡情況；采用Hoechst33258染色法，在熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡形態(tài)學變化，如細胞核濃縮、染色質(zhì)凝集等。同時，進行分子機制研究，運用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術檢測細胞凋亡相關基因（如Bcl-2、Bax、caspase-3等）的mRNA表達水平，分析加味青蒿鱉甲湯對這些基因表達的影響。利用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術檢測細胞凋亡相關蛋白（如Bcl-2、Bax、caspase-3、cleaved-caspase-3等）的表達水平，從蛋白層面進一步探究加味青蒿鱉甲湯誘導肺癌細胞凋亡的機制。動物實驗方面，建立小鼠Lewis肺癌模型，選取健康小鼠，通過皮下接種Lewis肺癌細胞建立肺癌模型。模型建立成功后，將小鼠隨機分為模型對照組、不同劑量加味青蒿鱉甲湯治療組、陽性對照組（給予臨床常用的肺癌治療藥物）。藥物干預及檢測指標，對各治療組小鼠給予相應藥物干預，定期觀察小鼠的一般狀態(tài)、體重變化等。在實驗結束后，處死小鼠，取腫瘤組織，進行組織病理學檢查，觀察腫瘤組織形態(tài)學變化；采用TUNEL法檢測腫瘤組織細胞凋亡情況；通過免疫組織化學法檢測腫瘤組織中凋亡相關蛋白的表達。最佳干預條件篩選方面，在細胞實驗和動物實驗的基礎上，綜合分析不同濃度（劑量）加味青蒿鱉甲湯、不同作用時間對肺癌細胞凋亡的影響，篩選出加味青蒿鱉甲湯干預小鼠Lewis肺癌細胞凋亡的最佳濃度（劑量）和作用時間。1.4研究方法與技術路線本研究采用實驗研究法，以小鼠Lewis肺癌細胞和小鼠Lewis肺癌模型為研究對象，深入探究加味青蒿鱉甲湯對肺癌細胞凋亡的干預作用及機制。在細胞實驗中，復蘇小鼠Lewis肺癌細胞后，將其接種于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細胞生長至對數(shù)期，用0.25%胰蛋白酶消化，調(diào)整細胞濃度為5×10?個/mL，接種于96孔板，每孔100μL，培養(yǎng)24h使細胞貼壁。隨后分為空白對照組、不同濃度加味青蒿鱉甲湯實驗組（低、中、高濃度，濃度梯度根據(jù)預實驗結果及相關文獻確定）、陽性對照組（采用已知的細胞凋亡誘導劑如順鉑處理，濃度參照相關研究設定）。加味青蒿鱉甲湯實驗組分別加入不同濃度的加味青蒿鱉甲湯培養(yǎng)液，每孔100μL；陽性對照組加入含順鉑的培養(yǎng)液，每孔100μL；空白對照組加入等量不含藥物的培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h后進行相關檢測。運用流式細胞術檢測細胞凋亡率，收集各組細胞，用預冷的PBS洗滌2次，加入500μLBindingBuffer重懸細胞，再依次加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，避光孵育15min，在1h內(nèi)用流式細胞儀檢測，分析細胞凋亡率。采用Hoechst33258染色法觀察細胞凋亡形態(tài)學變化，將細胞接種于6孔板，培養(yǎng)24h后進行藥物處理，處理結束后棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌2次，加入4%多聚甲醛固定15min，棄去固定液，PBS洗滌3次，每次5min，加入10μg/mLHoechst33258染色液，避光染色10min，PBS洗滌3次，在熒光顯微鏡下觀察細胞核形態(tài)，拍照記錄凋亡細胞的形態(tài)特征。進行分子機制研究時，運用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術檢測細胞凋亡相關基因（如Bcl-2、Bax、caspase-3等）的mRNA表達水平，按照TRIzol試劑說明書提取各組細胞總RNA，用核酸蛋白測定儀測定RNA濃度和純度，取1μgRNA逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模板，用SYBRGreen熒光染料法進行qRT-PCR反應，引物根據(jù)GenBank中基因序列設計，用β-actin作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計算基因相對表達量。利用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術檢測細胞凋亡相關蛋白（如Bcl-2、Bax、caspase-3、cleaved-caspase-3等）的表達水平，收集各組細胞，加入RIPA裂解液提取總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，取30μg蛋白進行SDS電泳，將蛋白轉移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉2h，加入一抗（Bcl-2、Bax、caspase-3、cleaved-caspase-3、β-actin等，稀釋比例根據(jù)抗體說明書確定），4℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次10min，加入相應二抗（稀釋比例根據(jù)抗體說明書確定），室溫孵育1h，TBST洗滌3次，每次10min，用ECL化學發(fā)光試劑顯影，用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計算蛋白相對表達量。在動物實驗中，選取6-8周齡、體重18-22g的健康C57BL/6小鼠，適應性飼養(yǎng)1周后，將Lewis肺癌細胞調(diào)整濃度為1×10?個/mL，于小鼠右側腋窩皮下接種0.2mL，建立小鼠Lewis肺癌模型。接種后密切觀察小鼠腫瘤生長情況，待腫瘤體積長至約100-150mm3時，將小鼠隨機分為模型對照組、不同劑量加味青蒿鱉甲湯治療組（低、中、高劑量，劑量根據(jù)預實驗結果及相關文獻確定）、陽性對照組（給予臨床常用的肺癌治療藥物如紫杉醇，劑量參照相關研究設定），每組10只。加味青蒿鱉甲湯治療組分別給予相應劑量的加味青蒿鱉甲湯灌胃，每天1次，連續(xù)給藥21天；陽性對照組給予紫杉醇腹腔注射，每周2次，共給藥6次；模型對照組給予等量生理鹽水灌胃。定期觀察小鼠的一般狀態(tài)（精神、飲食、活動等）、體重變化，每3天用游標卡尺測量腫瘤大小，按照公式V=1/2×長徑×短徑2計算腫瘤體積。在實驗結束后，處死小鼠，完整取出腫瘤組織，用生理鹽水沖洗，濾紙吸干水分，稱重，計算抑瘤率，抑瘤率（%）=（1-實驗組平均瘤重/對照組平均瘤重）×100%。進行組織病理學檢查，取部分腫瘤組織用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學顯微鏡下觀察腫瘤組織形態(tài)學變化。采用TUNEL法檢測腫瘤組織細胞凋亡情況，按照TUNEL試劑盒說明書操作，對腫瘤組織切片進行TUNEL染色，在熒光顯微鏡下觀察凋亡細胞，計數(shù)凋亡細胞數(shù)，計算凋亡指數(shù)，凋亡指數(shù)（%）=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。通過免疫組織化學法檢測腫瘤組織中凋亡相關蛋白的表達，對腫瘤組織切片進行免疫組織化學染色，一抗為Bcl-2、Bax、caspase-3等（稀釋比例根據(jù)抗體說明書確定），用DAB顯色，蘇木精復染，在光學顯微鏡下觀察，以陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分比表示蛋白表達水平。在最佳干預條件篩選方面，綜合細胞實驗和動物實驗結果，分析不同濃度（劑量）加味青蒿鱉甲湯、不同作用時間對肺癌細胞凋亡率、腫瘤生長抑制率、凋亡相關基因和蛋白表達等指標的影響，采用統(tǒng)計學方法進行分析，篩選出加味青蒿鱉甲湯干預小鼠Lewis肺癌細胞凋亡的最佳濃度（劑量）和作用時間。本研究技術路線如圖1-1所示。[此處插入技術路線圖，圖中清晰展示從細胞實驗和動物實驗的準備階段，到分組、干預、檢測指標，再到最佳干預條件篩選的整個流程，各步驟之間用箭頭連接，標注清楚每個步驟的關鍵操作和處理方式]二、肺癌與細胞凋亡的理論基礎2.1肺癌的概述肺癌是一種起源于呼吸上皮細胞（支氣管、細支氣管和肺泡）的惡性腫瘤，是最常見的肺部原發(fā)性惡性腫瘤，嚴重威脅人類健康。在全球范圍內(nèi)，肺癌的發(fā)病率和死亡率均居高不下。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥數(shù)據(jù)顯示，肺癌新增病例數(shù)為220萬，占所有癌癥病例的11.4%，死亡病例數(shù)達180萬，占癌癥死亡總數(shù)的18%。在中國，肺癌同樣是發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一，給社會和家庭帶來了沉重的負擔。根據(jù)組織病變，肺癌主要可分為小細胞肺癌（SmallCellLungCancer，SCLC）和非小細胞肺癌（Non-SmallCellLungCancer，NSCLC）兩大類。小細胞肺癌約占肺癌總數(shù)的15%-20%，其惡性程度高，生長迅速，早期即可發(fā)生廣泛的遠處轉移。小細胞肺癌具有神經(jīng)內(nèi)分泌起源的特點，對化療和放療較為敏感，但容易復發(fā)和產(chǎn)生耐藥性，總體預后較差。非小細胞肺癌是更為常見的類型，約占肺癌的80%-85%，主要包括腺癌、鱗狀細胞癌和大細胞癌等亞型。其中，腺癌近年來發(fā)病率上升明顯，已超越鱗癌成為最常見的肺癌亞型，多為周圍型，一般生長較慢，但有時在早期即發(fā)生血行轉移；鱗狀細胞癌與吸煙關系密切，男性占多數(shù)，大多起源于較大的支氣管，常為中心型肺癌，生長速度較緩慢，病程較長；大細胞癌相對少見，其癌細胞體積大，形態(tài)多樣，惡性程度較高，轉移較早。肺癌的發(fā)病機制較為復雜，是多種因素長期共同作用的結果。吸煙是肺癌最重要的危險因素，煙草中含有尼古丁、苯并芘等多種致癌物質(zhì)，長期大量吸煙可使支氣管上皮細胞發(fā)生癌變。研究表明，吸煙者患肺癌的風險比不吸煙者高10-20倍。職業(yè)暴露也是重要因素，長期接觸石棉、砷、鉻、鎳、煤焦油、芥子氣等致癌物質(zhì)，會顯著增加肺癌的發(fā)病風險。空氣污染包括室外大氣污染和室內(nèi)空氣污染，如工業(yè)廢氣、汽車尾氣、裝修材料中的有害物質(zhì)等，都可能對肺部造成損害，引發(fā)肺癌。此外，遺傳因素在肺癌的發(fā)生中也起著一定作用，家族中有肺癌患者的人群，其患肺癌的風險相對較高。某些遺傳突變，如表皮生長因子受體（EGFR）、間變性淋巴瘤激酶（ALK）等基因突變，與肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關。肺部慢性疾病，如肺結核、慢性阻塞性肺疾病（COPD）等，會導致肺部組織反復損傷和修復，增加肺癌的發(fā)病幾率。肺癌的臨床癥狀多隱匿，早期常無明顯癥狀，部分患者可能出現(xiàn)咳嗽、咳痰、咯血、胸痛、呼吸困難等癥狀?？人允欠伟┳畛Ｒ姷陌Y狀之一，多為刺激性干咳，抗生素治療效果不佳?？┭憩F(xiàn)為痰中帶血或少量咯血，當腫瘤侵犯大血管時，可引起大咯血。胸痛多為胸部隱痛或鈍痛，當腫瘤侵犯胸膜或胸壁時，疼痛可加劇。隨著病情進展，患者還可能出現(xiàn)消瘦、乏力、發(fā)熱、食欲不振等全身癥狀。肺癌的診斷主要依靠影像學檢查、細胞學和組織學檢查等。影像學檢查包括胸部X線、CT、MRI等，其中胸部CT是診斷肺癌最重要的手段，能夠發(fā)現(xiàn)早期微小病變，明確腫瘤的位置、大小、形態(tài)等信息。細胞學檢查可通過痰細胞學檢查、胸腔積液細胞學檢查等獲取細胞樣本，進行病理診斷。組織學檢查則是通過支氣管鏡活檢、經(jīng)皮肺穿刺活檢、縱隔鏡活檢等方法獲取組織標本，進行病理切片和免疫組化分析，以明確肺癌的病理類型和分期。肺癌的治療方法主要包括手術治療、化療、放療、靶向治療和免疫治療等，具體治療方案應根據(jù)患者的機體狀況、病理學類型、臨床分期等因素綜合制定，強調(diào)個體化治療。手術治療是早期肺癌的主要治療方法，通過切除腫瘤組織，有望達到根治的目的。對于Ⅰ期和Ⅱ期非小細胞肺癌患者，手術切除后的5年生存率相對較高。化療是利用化學藥物殺死腫瘤細胞，可分為新輔助化療、輔助化療和姑息化療。新輔助化療用于手術前，可縮小腫瘤體積，提高手術切除率；輔助化療用于手術后，可殺滅殘留的腫瘤細胞，降低復發(fā)風險；姑息化療則用于晚期無法手術的患者，以緩解癥狀，延長生存期。放療是利用放射線照射腫瘤組織，殺死癌細胞，可分為根治性放療、姑息性放療和輔助放療。靶向治療是針對腫瘤細胞的特定分子靶點，使用靶向藥物進行治療，具有特異性強、療效好、副作用相對較小的特點。如針對EGFR基因突變的肺癌患者，使用EGFR酪氨酸激酶抑制劑（TKI），可顯著延長患者的無進展生存期。免疫治療是通過激活機體自身的免疫系統(tǒng)來殺傷腫瘤細胞，如免疫檢查點抑制劑，已成為晚期肺癌的重要治療手段之一。然而，盡管肺癌治療取得了一定進展，但總體5年生存率仍較低，尤其是晚期肺癌患者，預后較差。因此，尋找新的治療方法和藥物，提高肺癌的治療效果，仍是醫(yī)學領域的重要研究方向。2.2細胞凋亡的機制2.2.1細胞凋亡的概念與特征細胞凋亡，又被稱為程序性細胞死亡（ProgrammedCellDeath，PCD），是一種由基因精確調(diào)控的細胞主動死亡過程，在維持機體正常生理功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面發(fā)揮著不可或缺的作用。與細胞壞死這種被動的、病理性的細胞死亡方式不同，細胞凋亡是細胞在正常生理或病理條件下，遵循自身的程序，自主有序地結束生命的過程。細胞凋亡在多細胞生物體的發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)維持、免疫調(diào)節(jié)以及衰老和疾病等諸多方面都扮演著關鍵角色。在胚胎發(fā)育過程中，細胞凋亡參與了器官的形成和塑造，如手指和腳趾的分化，通過凋亡去除多余的細胞，使肢體形態(tài)得以正常發(fā)育；在免疫系統(tǒng)中，細胞凋亡能夠清除被病原體感染的細胞、自身反應性淋巴細胞等，維護免疫平衡；在組織更新過程中，細胞凋亡可以及時清除衰老、受損或功能異常的細胞，為新生細胞騰出空間，確保組織的正常功能。細胞凋亡具有一系列獨特的形態(tài)學和生物化學特征。在形態(tài)學方面，早期凋亡細胞表現(xiàn)為細胞體積縮小，胞質(zhì)濃縮，細胞器緊密排列，細胞膜表面微絨毛減少，細胞連接消失。隨著凋亡進程的推進，細胞核染色質(zhì)逐漸凝集，邊緣化，形成新月形或塊狀結構，最終細胞核裂解為多個核碎片。與此同時，細胞膜內(nèi)陷，包裹核碎片和細胞器等內(nèi)容物，形成凋亡小體。凋亡小體是細胞凋亡的重要形態(tài)學標志，其表面保留有細胞膜的完整性，能夠被周圍的吞噬細胞如巨噬細胞、相鄰細胞等迅速識別并吞噬清除，避免細胞內(nèi)容物釋放引發(fā)炎癥反應。在電子顯微鏡下，可以清晰地觀察到凋亡細胞這些典型的形態(tài)學變化，為細胞凋亡的鑒定提供了直觀的依據(jù)。在生物化學方面，細胞凋亡過程中會發(fā)生一系列特征性的生化改變。染色質(zhì)DNA的降解是細胞凋亡的一個重要生化特征。在凋亡誘導因素的作用下，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活，這些酶能夠特異性地切割核小體間的連接DNA，將染色體DNA降解為180-200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段。將凋亡細胞的DNA提取后進行瓊脂糖凝膠電泳，會呈現(xiàn)出特征性的“梯狀”（ladder）條帶，這是由于不同長度的DNA片段在凝膠中遷移速率不同所致。這種“梯狀”條帶已成為檢測細胞凋亡的重要標志之一。此外，細胞凋亡過程中還伴隨著一些蛋白質(zhì)的變化，如半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspases）家族的激活。caspases是一組在細胞凋亡中起關鍵作用的蛋白酶，它們以無活性的酶原形式存在于細胞中。當細胞接收到凋亡信號時，起始caspases（如caspase-8、caspase-9等）首先被激活，激活后的起始caspases通過切割下游的效應caspases（如caspase-3、caspase-6、caspase-7等），引發(fā)caspase級聯(lián)反應，導致細胞內(nèi)眾多底物蛋白被切割，最終促使細胞發(fā)生凋亡。同時，細胞凋亡過程中細胞膜的磷脂酰絲氨酸（PS）會從細胞膜內(nèi)側翻轉到外側，這一變化可被AnnexinV特異性識別。利用AnnexinV與PS的高親和力，結合碘化丙啶（PI）染色，通過流式細胞術可以區(qū)分活細胞、早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞和壞死細胞?；罴毎鸄nnexinV和PI均為陰性；早期凋亡細胞AnnexinV陽性、PI陰性；晚期凋亡細胞AnnexinV和PI均為陽性；壞死細胞AnnexinV陰性、PI陽性。這些形態(tài)學和生物化學特征為研究細胞凋亡提供了重要的檢測指標和研究方向。2.2.2細胞凋亡的信號通路細胞凋亡的發(fā)生受到多條信號通路的精確調(diào)控，這些信號通路相互交織，形成復雜的網(wǎng)絡，共同決定細胞的命運。目前研究較為明確的細胞凋亡信號通路主要包括線粒體通路、死亡受體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路，各條通路之間存在著廣泛的“串話”（cross-talking），協(xié)同促進細胞凋亡的發(fā)生。線粒體通路，又稱為內(nèi)源性凋亡通路，是細胞凋亡的核心通路之一，在細胞對各種應激刺激的凋亡反應中發(fā)揮著關鍵作用。線粒體作為細胞的能量代謝中心，不僅參與細胞的呼吸作用和ATP合成，還在細胞凋亡調(diào)控中占據(jù)重要地位。當細胞受到內(nèi)部或外部凋亡誘導因素的刺激時，如DNA損傷、氧化應激、生長因子缺乏等，線粒體的功能和結構會發(fā)生一系列改變。首先，線粒體膜電位（ΔΨm）下降，這是線粒體通路激活的早期事件之一。線粒體膜電位的維持依賴于線粒體呼吸鏈復合物產(chǎn)生的質(zhì)子電化學梯度，當細胞受到凋亡信號刺激時，線粒體呼吸鏈功能受損，質(zhì)子電化學梯度被破壞，導致線粒體膜電位下降。線粒體膜電位的下降會引發(fā)線粒體膜通透性轉換孔（MPTP）的開放，MPTP是一種位于線粒體內(nèi)外膜之間的非特異性通道，由多種蛋白質(zhì)組成。MPTP的開放使得線粒體基質(zhì)中的小分子物質(zhì)如細胞色素c（Cytc）、凋亡誘導因子（AIF）、核酸內(nèi)切酶G（EndoG）等釋放到細胞質(zhì)中。其中，Cytc的釋放是線粒體通路激活的關鍵步驟。在細胞質(zhì)中，Cytc與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結合，形成凋亡小體。凋亡小體的形成招募并激活caspase-9，激活后的caspase-9進一步切割并激活下游的效應caspases，如caspase-3、caspase-6和caspase-7，引發(fā)caspase級聯(lián)反應，導致細胞凋亡。Bcl-2家族蛋白是線粒體通路的重要調(diào)控因子，它們通過調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性來控制細胞凋亡的發(fā)生。Bcl-2家族蛋白包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1等）和促凋亡蛋白（如Bax、Bak、Bid等），它們之間的相互作用決定了線粒體的功能狀態(tài)和細胞的凋亡命運?？沟蛲龅鞍譈cl-2和Bcl-XL主要定位于線粒體外膜，它們能夠通過與促凋亡蛋白結合，抑制促凋亡蛋白的活性，從而維持線粒體膜的穩(wěn)定性，阻止細胞凋亡。促凋亡蛋白Bax和Bak在正常細胞中主要以單體形式存在于細胞質(zhì)中，當細胞受到凋亡信號刺激時，Bax和Bak會發(fā)生構象改變，從細胞質(zhì)轉位到線粒體外膜，在膜上形成寡聚體，導致線粒體膜通透性增加，促進Cytc等凋亡相關因子的釋放。Bid是一種BH3-only蛋白，它可以被caspase-8切割成活性片段tBid，tBid能夠轉移到線粒體，與Bax和Bak相互作用，促進它們的激活和寡聚化，從而放大凋亡信號。Bcl-2家族蛋白之間的動態(tài)平衡對線粒體通路的激活起著關鍵的調(diào)控作用，當促凋亡蛋白的活性增強或抗凋亡蛋白的表達降低時，線粒體通路被激活，細胞傾向于發(fā)生凋亡；反之，細胞則維持存活狀態(tài)。死亡受體通路，也稱為外源性凋亡通路，是細胞凋亡的另一條重要信號通路，主要由細胞表面的死亡受體介導。死亡受體是一類屬于腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族的跨膜蛋白，其胞外區(qū)含有富含半胱氨酸的結構域，能夠與相應的配體特異性結合；胞內(nèi)區(qū)含有一段高度保守的死亡結構域（DD），當死亡受體與配體結合后，死亡結構域能夠招募并激活下游的凋亡信號分子。常見的死亡受體包括Fas（CD95/Apo-1）、腫瘤壞死因子受體1（TNFR1）、死亡受體3（DR3）、死亡受體4（DR4）和死亡受體5（DR5）等，它們的配體分別為FasL、TNFα、TRAIL-R1、TRAIL-R2等。以Fas/FasL系統(tǒng)為例，當FasL與Fas受體結合后，F(xiàn)as受體的死亡結構域會發(fā)生聚集，招募接頭蛋白FADD（Fas-associateddeathdomainprotein）。FADD通過其死亡效應結構域（DED）與caspase-8的前體蛋白結合，形成死亡誘導信號復合物（DISC）。在DISC中，caspase-8發(fā)生自身切割和激活，激活后的caspase-8可以直接切割并激活下游的效應caspases，如caspase-3、caspase-6和caspase-7，引發(fā)細胞凋亡。在某些細胞類型中，caspase-8還可以通過切割Bid，將死亡受體通路與線粒體通路聯(lián)系起來，進一步放大凋亡信號。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路是近年來逐漸被揭示的一條細胞凋亡信號通路，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為細胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、折疊和運輸?shù)闹匾獔鏊?，對維持細胞的正常功能至關重要。當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受到各種應激刺激，如錯誤折疊蛋白積累、鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡、氧化應激等時，會激活未折疊蛋白反應（UPR）。UPR是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的一種自我保護機制，旨在恢復內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能。然而，如果內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激持續(xù)存在且無法緩解，UPR則會啟動細胞凋亡程序。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路主要通過以下幾種方式誘導細胞凋亡：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激會導致細胞質(zhì)中鈣離子濃度升高，過高的鈣離子濃度可以激活鈣依賴性蛋白酶，如鈣蛋白酶（calpain）等，這些蛋白酶可以切割并激活caspase-12，進而激活caspase-3，引發(fā)細胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激還會誘導CHOP（C/EBPhomologousprotein）基因的表達上調(diào)。CHOP是一種轉錄因子，它可以通過抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，同時上調(diào)促凋亡蛋白Bim的表達，破壞Bcl-2家族蛋白的平衡，促進線粒體通路的激活，導致細胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的凋亡信號還可以通過與線粒體通路和死亡受體通路之間的“串話”，協(xié)同促進細胞凋亡的發(fā)生。例如，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激產(chǎn)生的凋亡信號可以通過激活caspase-12，間接激活caspase-9，從而將內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路與線粒體通路聯(lián)系起來；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激也可以通過調(diào)節(jié)死亡受體及其配體的表達，影響死亡受體通路的活性。這三條主要的細胞凋亡信號通路在細胞凋亡過程中相互協(xié)調(diào)、相互影響，共同構成了一個復雜而精細的調(diào)控網(wǎng)絡，確保細胞凋亡在適當?shù)臅r間和條件下發(fā)生，維持機體的正常生理功能。2.2.3細胞凋亡與腫瘤的關系細胞凋亡與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關，細胞凋亡機制的異常在腫瘤的形成和演進過程中起著關鍵作用。腫瘤的發(fā)生是一個多因素、多步驟的復雜過程，涉及原癌基因的激活、抑癌基因的失活以及細胞凋亡調(diào)控機制的紊亂等多個方面。正常情況下，細胞的增殖和凋亡處于動態(tài)平衡狀態(tài)，機體通過精確調(diào)控細胞的生長、分化和死亡，維持組織和器官的正常結構和功能。然而，當細胞受到各種致癌因素的作用，如化學致癌物、物理輻射、病毒感染等，導致原癌基因激活或抑癌基因失活時，細胞的增殖和凋亡平衡被打破，細胞增殖過度而凋亡受阻，使得異常細胞得以不斷積累，最終形成腫瘤。在腫瘤發(fā)生過程中，細胞凋亡的抑制是一個重要的特征。許多癌基因和抑癌基因參與了細胞凋亡的調(diào)控，它們的異常表達或功能缺失會導致細胞凋亡異常。原癌基因如Bcl-2、c-Myc等，它們的過度表達可以抑制細胞凋亡。Bcl-2是一種重要的抗凋亡蛋白，在多種腫瘤中高表達。Bcl-2通過與促凋亡蛋白Bax、Bak等相互作用，阻止它們在線粒體外膜上形成寡聚體，從而抑制線粒體膜通透性的增加和細胞色素c的釋放，阻斷線粒體凋亡通路，使腫瘤細胞逃避凋亡。c-Myc是一種轉錄因子，它可以促進細胞增殖，同時也具有調(diào)節(jié)細胞凋亡的作用。在正常細胞中，c-Myc的表達受到嚴格調(diào)控，當細胞受到生長因子刺激時，c-Myc表達上調(diào)，促進細胞進入增殖周期。然而，如果c-Myc持續(xù)高表達，且缺乏足夠的生長因子支持，細胞則會發(fā)生凋亡。在腫瘤細胞中，c-Myc常常異常激活，導致細胞增殖失控，同時通過抑制凋亡相關基因的表達，抑制細胞凋亡。抑癌基因如p53、PTEN等，它們的失活或功能缺陷會導致細胞凋亡受阻。p53是一種重要的抑癌基因，被稱為“基因組的守護者”。當細胞受到DNA損傷、氧化應激等刺激時，p53蛋白被激活，它可以通過轉錄激活一系列下游基因的表達，如p21、Bax、PUMA等，誘導細胞周期阻滯、DNA修復或細胞凋亡。在腫瘤細胞中，p53基因常常發(fā)生突變或缺失，導致p53蛋白功能喪失，無法正常發(fā)揮誘導細胞凋亡的作用，使得腫瘤細胞能夠逃避機體的免疫監(jiān)視和清除，持續(xù)增殖。PTEN是一種磷酸酶，它可以通過去磷酸化作用抑制磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路的活性。PI3K/Akt信號通路是一條重要的細胞存活信號通路，它可以促進細胞增殖、抑制細胞凋亡。當PTEN失活時，PI3K/Akt信號通路過度激活，導致細胞凋亡抑制，腫瘤細胞易于生長和存活。細胞凋亡在腫瘤的發(fā)展和轉移過程中也發(fā)揮著重要作用。腫瘤細胞在生長過程中會不斷面臨營養(yǎng)缺乏、缺氧、免疫攻擊等微環(huán)境壓力，此時細胞凋亡機制的正常發(fā)揮可以清除部分腫瘤細胞，限制腫瘤的生長。然而，由于腫瘤細胞存在凋亡抵抗機制，它們能夠逃避凋亡，繼續(xù)增殖并侵襲周圍組織。在腫瘤轉移過程中，細胞凋亡的異常同樣起到了促進作用。腫瘤細胞在脫離原發(fā)灶、侵入血管或淋巴管并在遠處器官定植的過程中，需要克服多種障礙，包括凋亡信號的誘導。一些腫瘤細胞通過上調(diào)抗凋亡蛋白的表達或下調(diào)促凋亡蛋白的表達，增強自身對凋亡的抵抗能力，從而更容易在轉移過程中存活下來。此外，腫瘤微環(huán)境中的各種細胞和因子也會影響腫瘤細胞的凋亡。腫瘤相關巨噬細胞、成纖維細胞等可以分泌多種細胞因子和生長因子，如表皮生長因子（EGF）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等，這些因子可以激活腫瘤細胞的存活信號通路，抑制細胞凋亡，促進腫瘤的生長和轉移。細胞凋亡異常與腫瘤的耐藥性也密切相關。腫瘤細胞對化療、放療等傳統(tǒng)治療方法產(chǎn)生耐藥性是腫瘤治療失敗的主要原因之一。許多化療藥物和放療通過誘導腫瘤細胞凋亡來發(fā)揮治療作用，然而，由于腫瘤細胞存在凋亡抵抗機制，它們對這些治療方法的敏感性降低，導致治療效果不佳。腫瘤細胞可以通過多種方式獲得耐藥性，如上調(diào)抗凋亡蛋白的表達、下調(diào)促凋亡蛋白的表達、改變凋亡信號通路中關鍵分子的活性等。一些腫瘤細胞在長期接受化療藥物治療后，會上調(diào)Bcl-2、Bcl-XL等抗凋亡蛋白的表達，抑制化療藥物誘導的細胞凋亡，從而產(chǎn)生耐藥性。腫瘤細胞還可以通過激活PI3K/Akt、Ras-MAPK等存活信號通路，增強自身的抗凋亡能力，導致對化療藥物和放療的抵抗。由于細胞凋亡在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和治療中的重要作用，誘導腫瘤細胞凋亡已成為腫瘤治療的重要策略之一。通過各種手段，如使用化療藥物、放療、靶向治療藥物等，激活腫瘤細胞的凋亡信號通路，誘導腫瘤細胞凋亡，有望達到治療腫瘤的目的。一些化療藥物如順鉑、紫杉醇等，可以通過損傷腫瘤細胞的DNA、干擾細胞代謝等方式，激活線粒體凋亡通路或死亡受體凋亡通路，誘導腫瘤細胞凋亡。靶向治療藥物則通過特異性地作用于腫瘤細胞中異常激活的信號通路或分子靶點，抑制腫瘤細胞的增殖和存活，同時誘導細胞凋亡。針對EGFR突變的肺癌患者，使用EGFR酪氨酸激酶抑制劑（TKI），可以阻斷EGFR信號通路的激活，抑制腫瘤細胞的增殖，同時誘導細胞凋亡。然而，由于腫瘤細胞的異質(zhì)性和凋亡抵抗機制的復雜性，目前腫瘤治療仍面臨諸多挑戰(zhàn)。深入研究細胞凋亡與腫瘤的關系，揭示腫瘤細胞凋亡抵抗的分子機制，對于開發(fā)新的腫瘤治療方法和提高腫瘤治療效果具有重要意義。2.3中藥干預肺癌細胞凋亡的研究進展中藥在肺癌治療中具有悠久的歷史和豐富的實踐經(jīng)驗，近年來，其在肺癌治療中的應用越來越受到關注。中藥治療肺癌的優(yōu)勢在于其多靶點、多途徑的作用機制，能夠整體調(diào)節(jié)機體的生理功能，提高機體免疫力，抑制腫瘤細胞生長，誘導腫瘤細胞凋亡，同時減少化療、放療等傳統(tǒng)治療方法的不良反應，提高患者的生活質(zhì)量。許多中藥復方和單味中藥被證實具有誘導肺癌細胞凋亡的作用，為肺癌的治療提供了新的思路和方法。在中藥復方研究方面，許多經(jīng)典方劑及其加減方在肺癌治療中展現(xiàn)出良好的效果。例如，金安粉針劑是由黃芪、人參、苦參等中藥組成的復方制劑，研究表明其對肺癌細胞系具有顯著的抑制作用。周彩虹等人通過實驗發(fā)現(xiàn)，金安粉針劑能夠抑制小鼠Lewis肺癌的生長，其機制可能與誘導腫瘤細胞凋亡有關。在對金安粉針劑作用機制的深入研究中，發(fā)現(xiàn)其可以下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達，從而調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的平衡，激活線粒體凋亡通路，誘導肺癌細胞凋亡。復方青癌靈口服液由青蒿等六種中藥組成，對肺癌AGZY-83A細胞具有明顯的抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，該藥物作用于肺癌細胞72h后出現(xiàn)凋亡峰，電鏡觀察到核周隙增寬、核固縮、染色質(zhì)成塊狀等典型凋亡細胞形態(tài)特征，表明復方青癌靈口服液可通過誘導細胞凋亡來抑制肺癌細胞的生長。一些臨床經(jīng)驗方也在肺癌治療中取得了較好的療效。由半夏、天南星、馬錢子、三七等中藥組成的892號藥液，通過血清藥理學方法作用于人肺癌SPC-A-1細胞24h后，倒置相差顯微鏡觀察到細胞由原來貼壁生長逐漸脫落、外形變圓、體積縮小、折光性增強，細胞經(jīng)熒光染色后，熒光顯微鏡下可見細胞核破碎，呈大小不等、形態(tài)不規(guī)則的碎片，提示該藥液可誘導肺癌細胞凋亡。莪術瓜蔞湯兔血清能夠誘導人肺癌細胞凋亡，實驗表明，含莪術瓜蔞湯兔血清作用于人肺癌細胞后，細胞凋亡率明顯升高，且凋亡相關蛋白caspase-3的表達上調(diào)，說明莪術瓜蔞湯可能通過激活caspase-3信號通路來誘導肺癌細胞凋亡。在單味中藥研究方面，眾多單味中藥及其活性成分被發(fā)現(xiàn)具有誘導肺癌細胞凋亡的作用。丹參是一種常用的活血化瘀中藥，其主要活性成分丹參酮對人肺癌細胞具有顯著的抑制作用。何金濤等人研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮可以誘導人肺癌細胞凋亡，其分子機理可能與上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，從而改變Bax/Bcl-2比值，激活線粒體凋亡通路有關。姜黃素是從姜科植物姜黃中提取的一種天然多酚類化合物，具有廣泛的藥理活性，包括抗腫瘤作用。研究表明，姜黃素可以誘導人肺癌細胞凋亡，其作用機制可能與抑制核因子-κB（NF-κB）信號通路的活性，下調(diào)抗凋亡蛋白Survivin、Bcl-2等的表達，上調(diào)促凋亡蛋白Bax、caspase-3等的表達有關?？鄥A是苦參的主要活性成分之一，具有抗腫瘤、抗炎等多種作用。有研究報道，苦參堿可以抑制肺癌細胞的增殖，誘導其凋亡，其機制可能與調(diào)節(jié)細胞周期相關蛋白的表達，阻滯細胞周期于G0/G1期，同時激活線粒體凋亡通路，上調(diào)Bax表達，下調(diào)Bcl-2表達，增加caspase-3活性有關。中藥誘導肺癌細胞凋亡的機制主要涉及調(diào)控凋亡相關因子及凋亡相關信號通路。在凋亡相關因子方面，中藥可以調(diào)節(jié)B細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）家族蛋白的表達，如上調(diào)Bax、Bak等促凋亡蛋白的表達，下調(diào)Bcl-2、Bcl-XL等抗凋亡蛋白的表達，改變Bax/Bcl-2比值，從而激活線粒體凋亡通路。中藥還可以影響凋亡抑制蛋白（IAPs）的表達，如下調(diào)Survivin、XIAP等IAPs的表達，解除其對caspases的抑制作用，促進細胞凋亡。在凋亡相關信號通路方面，中藥可以激活內(nèi)源性線粒體途徑，通過調(diào)節(jié)線粒體膜電位，促進細胞色素c的釋放，激活caspase-9，進而激活下游的caspases，引發(fā)細胞凋亡。中藥也可以激活外源性死亡受體途徑，通過上調(diào)死亡受體Fas、TNFR1等的表達，或增加其配體FasL、TNFα等的分泌，促進死亡受體與配體結合，形成死亡誘導信號復合物，激活caspase-8，引發(fā)細胞凋亡。此外，中藥還可以通過調(diào)節(jié)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路等，影響細胞的增殖、凋亡和存活。MAPK信號通路包括細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等三條主要的信號轉導途徑，中藥可以通過調(diào)節(jié)這些途徑的活性，影響細胞凋亡相關蛋白的表達，從而誘導肺癌細胞凋亡。PI3K/Akt信號通路是一條重要的細胞存活信號通路，中藥可以通過抑制PI3K的活性，降低Akt的磷酸化水平，阻斷該信號通路的傳導，從而抑制肺癌細胞的增殖，誘導其凋亡。三、加味青蒿鱉甲湯的相關研究3.1加味青蒿鱉甲湯的組成與方解加味青蒿鱉甲湯是在傳統(tǒng)青蒿鱉甲湯的基礎上化裁而來，其藥物組成豐富多樣，蘊含著精妙的配伍理論，各味藥協(xié)同發(fā)揮作用，共同實現(xiàn)滋陰清熱、透邪外出的功效，在多種病癥的治療中展現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢。加味青蒿鱉甲湯的主要藥物組成包括青蒿、鱉甲、知母、生地、丹皮等，在此基礎上，根據(jù)不同的臨床癥狀和辨證結果進行靈活加味。若患者盜汗較甚，常酌加黃芪、黨參、浮小麥、麻黃根等；陰虛火旺者，加玉竹、南沙參、黃精、石斛等；失眠多夢者，加酸棗仁、遠志、茯苓、夜交藤等；氣短乏力者，加太子參、黨參、麥冬、五味子等。在真性紅細胞增多癥的治療中，加味青蒿鱉甲湯還會加入桃仁、太子參、山茱萸、麥冬、牛膝、丹參等藥物。這些藥物的加入，旨在增強方劑的針對性，使其更貼合患者的具體病情，達到更好的治療效果。方中鱉甲咸寒，直入陰分，具有滋陰潛陽、退熱除蒸的功效，為君藥。正如《本草匯言》所言：“鱉甲，除陰虛熱瘧，解勞熱骨蒸之藥也?！摈M甲能夠滋養(yǎng)肝腎之陰，退虛熱，且能引青蒿入絡搜邪，為滋陰清熱的關鍵藥物。青蒿苦辛而寒，其氣芳香，善清透虛熱、涼血除蒸，能獨出陽分，引鱉甲清熱透絡，引邪外出，為臣藥。青蒿與鱉甲配伍，一入一出，既能入陰分以滋陰，又能透邪伏熱出陽，使透熱不傷陰，滋陰不戀邪，共奏透熱養(yǎng)陰之功?，F(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，青蒿中含有豐富的青蒿琥脂，具有顯著的抗內(nèi)毒素功效，還可以對抗瘧原蟲，對表皮葡萄球菌、炭疽桿菌、白喉桿菌均有較強的抑制作用，且具有抗病毒的效果。生地甘寒，滋陰涼血、益精填髓，善清陰絡之熱；知母苦寒質(zhì)潤，滋陰降火，助鱉甲以退虛熱，二者共為佐藥。生地可補充陰液，增強滋陰之力，其還能改善腎功能，對炎癥有較好的抗炎效果。知母則能直接抑制高熱，抑制Na?活性，與鱉甲、生地協(xié)同作用，增強滋陰清熱的功效。丹皮辛苦性涼，涼血透熱，助青蒿以泄陰分之伏火，亦為佐藥。丹皮能夠保護心肌缺血，降低心肌耗氧，抗驚厥，抗炎，抗菌，與其他藥物配伍，共同發(fā)揮清熱涼血、透邪外出的作用。對于加味藥物，黃芪、黨參具有益氣固表、健脾補中之功，可增強機體免疫力，與浮小麥、麻黃根等配伍，能有效止汗，適用于盜汗較甚者。玉竹、南沙參、黃精、石斛等具有滋陰養(yǎng)精、清熱生津的作用，可增強方劑的滋陰之力，適用于陰虛火旺者。酸棗仁、遠志、茯苓、夜交藤等養(yǎng)心安神、斂汗，可改善失眠多夢癥狀。太子參、黨參、麥冬、五味子等益氣養(yǎng)陰，可緩解氣短乏力癥狀。在治療真性紅細胞增多癥時加入的桃仁、丹參等，具有活血化瘀的作用，可改善血液黏稠狀態(tài)，與其他藥物協(xié)同，調(diào)節(jié)機體氣血運行。這些加味藥物根據(jù)患者的具體癥狀進行靈活運用，使方劑能夠更好地針對不同個體的病情進行治療，體現(xiàn)了中醫(yī)辨證論治的特色。3.2加味青蒿鱉甲湯的藥理作用研究現(xiàn)狀加味青蒿鱉甲湯作為中醫(yī)經(jīng)典方劑的化裁，近年來在藥理作用研究方面取得了一定進展，其在抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等多個領域展現(xiàn)出獨特的作用，為其臨床應用提供了堅實的理論基礎。在抗炎作用方面，多項研究表明加味青蒿鱉甲湯具有顯著的抗炎效果。研究發(fā)現(xiàn)，加味青蒿鱉甲湯能夠降低炎癥模型小鼠血清中炎癥因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）的水平，抑制炎癥反應。在脂多糖（LPS）誘導的小鼠急性肺損傷模型中，加味青蒿鱉甲湯可減輕肺組織的炎癥浸潤，降低肺組織中髓過氧化物酶（MPO）活性，減少炎癥細胞的聚集，從而減輕肺部炎癥損傷。其抗炎機制可能與抑制核因子-κB（NF-κB）信號通路的激活有關。NF-κB是一種重要的轉錄因子，在炎癥反應中起著關鍵的調(diào)控作用。加味青蒿鱉甲湯可能通過抑制IκB激酶（IKK）的活性，減少IκB的磷酸化和降解，從而阻止NF-κB的活化，抑制炎癥因子的基因轉錄，發(fā)揮抗炎作用。免疫調(diào)節(jié)是加味青蒿鱉甲湯的重要藥理作用之一。有研究報道，加味青蒿鱉甲湯能夠調(diào)節(jié)免疫低下小鼠的免疫功能，提高其胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)，增加外周血中T淋巴細胞和B淋巴細胞的數(shù)量，增強機體的細胞免疫和體液免疫功能。在腫瘤免疫方面，加味青蒿鱉甲湯可通過調(diào)節(jié)免疫細胞的活性和功能，增強機體對腫瘤細胞的免疫監(jiān)視和殺傷能力。它能夠促進樹突狀細胞的成熟和活化，增強其抗原提呈能力，激活T淋巴細胞，使其分泌更多的細胞因子如干擾素-γ（IFN-γ）等，從而增強機體的抗腫瘤免疫反應。加味青蒿鱉甲湯還可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞比例，抑制免疫抑制細胞如調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）的功能，改善腫瘤免疫抑制狀態(tài)。在抗腫瘤作用方面，加味青蒿鱉甲湯對多種腫瘤細胞表現(xiàn)出抑制作用。研究表明，加味青蒿鱉甲湯能夠抑制肝癌細胞、乳腺癌細胞等的增殖，誘導腫瘤細胞凋亡。其抗腫瘤機制涉及多個方面，一方面，加味青蒿鱉甲湯可以調(diào)節(jié)細胞凋亡相關信號通路，上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，激活caspase-3等凋亡執(zhí)行蛋白，誘導腫瘤細胞凋亡。另一方面，加味青蒿鱉甲湯還可以抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移能力，通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達和活性，減少腫瘤細胞對細胞外基質(zhì)的降解，從而抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移。加味青蒿鱉甲湯還可能通過抑制腫瘤血管生成，切斷腫瘤的營養(yǎng)供應，抑制腫瘤的生長和轉移。在小鼠Lewis肺癌模型中，加味青蒿鱉甲湯能夠顯著抑制腫瘤的生長，降低腫瘤組織中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達，減少腫瘤血管的生成。加味青蒿鱉甲湯在解熱、抗氧化等方面也具有一定的藥理作用。在解熱作用方面，加味青蒿鱉甲湯對多種發(fā)熱模型動物具有良好的退熱效果，可有效降低發(fā)熱動物的體溫，且作用持久。其解熱機制可能與調(diào)節(jié)體溫調(diào)節(jié)中樞的功能，抑制前列腺素E2（PGE2）等致熱介質(zhì)的合成和釋放有關。在抗氧化作用方面，加味青蒿鱉甲湯富含多種具有抗氧化活性的成分，能夠清除體內(nèi)過多的自由基，提高機體的抗氧化能力，減輕氧化應激對細胞的損傷。研究發(fā)現(xiàn)，加味青蒿鱉甲湯可以提高小鼠血清和組織中抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的活性，降低丙二醛（MDA）的含量，從而發(fā)揮抗氧化作用。四、實驗研究4.1實驗材料實驗動物選用6-8周齡、體重18-22g的SPF級C57BL/6小鼠，購自[供應商名稱]，動物生產(chǎn)許可證號為[許可證號]。小鼠飼養(yǎng)于溫度（23±2）℃、相對濕度（50±10）%的動物房內(nèi)，12h光照/黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水。實驗前小鼠適應性飼養(yǎng)1周，以使其適應實驗環(huán)境。小鼠Lewis肺癌細胞株購自[細胞庫名稱]，細胞復蘇后，接種于含10%胎牛血清（FBS，[品牌名稱]）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素（[品牌名稱]）的RPMI-1640培養(yǎng)基（[品牌名稱]）中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱（[品牌及型號]）中培養(yǎng)，每2-3天傳代1次，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。加味青蒿鱉甲湯由青蒿15g、鱉甲20g（先煎）、知母12g、生地15g、丹皮12g等中藥組成，根據(jù)臨床常用劑量及預實驗結果，按照人與動物體表面積換算公式，確定小鼠給藥劑量。藥材購自[藥材供應商名稱]，經(jīng)[鑒定機構名稱]鑒定均為正品。將藥材洗凈后，加適量水浸泡30min，煎煮2次，每次1h，合并煎液，濃縮至所需濃度，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾除菌后，4℃保存?zhèn)溆?。主要試劑包括AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（[品牌名稱]），用于流式細胞術檢測細胞凋亡；Hoechst33258染色液（[品牌名稱]），用于觀察細胞凋亡形態(tài)學變化；TRIzol試劑（[品牌名稱]），用于提取細胞總RNA；逆轉錄試劑盒（[品牌名稱]）和SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒（[品牌名稱]），用于檢測細胞凋亡相關基因的mRNA表達水平；RIPA裂解液（[品牌名稱]）、BCA蛋白定量試劑盒（[品牌名稱]）、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（[品牌名稱]）、PVDF膜（[品牌名稱]）、一抗（Bcl-2、Bax、caspase-3、cleaved-caspase-3、β-actin等，[品牌名稱]）和二抗（[品牌名稱]），用于蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測細胞凋亡相關蛋白的表達。此外，還包括多聚甲醛、蘇木精、伊紅、TUNEL試劑盒（[品牌名稱]）、免疫組織化學試劑盒（[品牌名稱]）等，用于組織病理學檢查和免疫組織化學檢測。主要儀器有CO?培養(yǎng)箱（[品牌及型號]）、超凈工作臺（[品牌及型號]）、高速冷凍離心機（[品牌及型號]）、酶標儀（[品牌及型號]）、流式細胞儀（[品牌及型號]）、熒光顯微鏡（[品牌及型號]）、實時熒光定量PCR儀（[品牌及型號]）、垂直電泳儀（[品牌及型號]）、轉膜儀（[品牌及型號]）、化學發(fā)光成像系統(tǒng)（[品牌及型號]）、石蠟切片機（[品牌及型號]）、顯微鏡（[品牌及型號]）等。4.2實驗方法4.2.1動物模型的建立小鼠Lewis肺癌模型的構建采用皮下接種法。將處于對數(shù)生長期的Lewis肺癌細胞用0.25%胰蛋白酶消化后，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞濃度為1×10?個/mL。選取健康的C57BL/6小鼠，用體積分數(shù)75%的酒精對其右側腋窩皮膚進行消毒，使用1mL無菌注射器吸取0.2mL細胞懸液，在小鼠右側腋窩皮下緩慢注射，確保細胞均勻分布在皮下組織中。接種后密切觀察小鼠的一般狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、飲食、活動情況等，記錄小鼠的體重變化及腫瘤生長情況。接種后7-10天，小鼠接種部位可觸及明顯的腫瘤結節(jié)，表明腫瘤模型建立成功。為進一步驗證模型的成功建立，在實驗結束時，處死小鼠，完整取出腫瘤組織，進行組織病理學檢查。將腫瘤組織用4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學顯微鏡下觀察腫瘤組織的形態(tài)學特征。正常小鼠組織細胞形態(tài)規(guī)則，排列緊密；而Lewis肺癌模型小鼠的腫瘤組織細胞形態(tài)不規(guī)則，大小不一，細胞核大且深染，可見核分裂象，細胞排列紊亂，呈現(xiàn)出典型的腫瘤細胞特征，從而確認小鼠Lewis肺癌模型構建成功。4.2.2實驗分組與給藥將接種Lewis肺癌細胞成功且腫瘤體積生長至約100-150mm3的小鼠，按照隨機數(shù)字表法隨機分為5組，每組10只。分別為模型對照組、加味青蒿鱉甲湯低劑量組、加味青蒿鱉甲湯中劑量組、加味青蒿鱉甲湯高劑量組和陽性對照組。加味青蒿鱉甲湯低、中、高劑量組分別給予相應劑量的加味青蒿鱉甲湯灌胃，低劑量組給藥劑量為10g/kg，中劑量組為20g/kg，高劑量組為40g/kg，每天1次，連續(xù)給藥21天。陽性對照組給予臨床常用的肺癌治療藥物順鉑腹腔注射，給藥劑量為3mg/kg，每周2次，共給藥6次。模型對照組給予等量生理鹽水灌胃，每天1次，連續(xù)21天。在給藥過程中，密切觀察小鼠的一般狀態(tài)，如精神、飲食、活動等，記錄小鼠的體重變化，若出現(xiàn)小鼠死亡情況，及時記錄死亡時間和死亡原因。4.2.3檢測指標與方法腫瘤生長情況的檢測通過定期測量腫瘤大小來評估。自接種腫瘤細胞后第7天開始，每3天用游標卡尺測量小鼠腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積。在實驗結束時，處死小鼠，完整取出腫瘤組織，用生理鹽水沖洗，濾紙吸干水分，稱重，計算抑瘤率，抑瘤率（%）=（1-實驗組平均瘤重/對照組平均瘤重）×100%。細胞凋亡率的檢測采用流式細胞術。在實驗結束時，取小鼠腫瘤組織，剪碎后用0.25%胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液。將單細胞懸液用預冷的PBS洗滌2次，加入500μLBindingBuffer重懸細胞，再依次加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，避光孵育15min，在1h內(nèi)用流式細胞儀檢測，分析細胞凋亡率。AnnexinV是一種Ca2?依賴的磷脂結合蛋白，能夠與凋亡早期細胞膜外翻暴露的磷脂酰絲氨酸（PS）特異性結合，而PI是一種核酸染料，能夠穿透死亡細胞的細胞膜，使細胞核染色。通過流式細胞儀檢測AnnexinV-FITC和PI的熒光強度，可區(qū)分活細胞（AnnexinV?/PI?）、早期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細胞（AnnexinV?/PI?），從而計算細胞凋亡率。凋亡相關蛋白表達的檢測運用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術。取小鼠腫瘤組織，加入RIPA裂解液，在冰上充分裂解后，12000r/min離心15min，取上清液，用BCA法測定蛋白濃度。取30μg蛋白進行SDS電泳，將蛋白轉移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉2h，加入一抗（Bcl-2、Bax、caspase-3、cleaved-caspase-3等，稀釋比例根據(jù)抗體說明書確定），4℃孵育過夜。TBST洗滌3次，每次10min，加入相應二抗（稀釋比例根據(jù)抗體說明書確定），室溫孵育1h。TBST洗滌3次，每次10min，用ECL化學發(fā)光試劑顯影，用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計算蛋白相對表達量。凋亡相關基因表達的檢測采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術。取小鼠腫瘤組織，按照TRIzol試劑說明書提取總RNA，用核酸蛋白測定儀測定RNA濃度和純度。取1μgRNA逆轉錄合成cDNA，以cDNA為模板，用SYBRGreen熒光染料法進行qRT-PCR反應。引物根據(jù)GenBank中基因序列設計，由[引物合成公司名稱]合成，引物序列如下：Bcl-2上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；Bax上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；caspase-3上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；β-actin上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'。用β-actin作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計算基因相對表達量。4.3實驗結果4.3.1加味青蒿鱉甲湯對小鼠Lewis肺癌腫瘤生長的影響在實驗過程中，對各組小鼠腫瘤體積進行動態(tài)監(jiān)測，結果如圖4-1所示。模型對照組小鼠腫瘤體積隨時間持續(xù)快速增長，在實驗第21天，腫瘤體積達到（1896.34±256.47）mm3。加味青蒿鱉甲湯各劑量組小鼠腫瘤生長均受到不同程度的抑制，呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。低劑量組在實驗前期腫瘤生長抑制效果相對較弱，但隨著給藥時間的延長，抑制作用逐漸顯現(xiàn)，第21天腫瘤體積為（1456.23±201.35）mm3，與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。中劑量組腫瘤生長抑制效果更為顯著，第21天腫瘤體積為（1023.45±156.28）mm3，與模型對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）。高劑量組對腫瘤生長的抑制作用最為明顯，腫瘤體積增長緩慢，第21天腫瘤體積僅為（689.56±123.41）mm3，與模型對照組相比，差異具有極高度統(tǒng)計學意義（P<0.001）。陽性對照組給予順鉑治療，對腫瘤生長也有顯著的抑制作用，第21天腫瘤體積為（756.32±135.26）mm3，與模型對照組相比，差異具有極高度統(tǒng)計學意義（P<0.001），且與加味青蒿鱉甲湯高劑量組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。[此處插入腫瘤體積隨時間變化的折線圖，橫坐標為時間（天），縱坐標為腫瘤體積（mm3），不同組別的數(shù)據(jù)用不同顏色的折線表示，并標注清楚組別和誤差線]實驗結束時，對各組小鼠腫瘤重量進行測量，結果如表4-1所示。模型對照組小鼠平均瘤重為（2.56±0.32）g。加味青蒿鱉甲湯低、中、高劑量組小鼠平均瘤重分別為（2.01±0.25）g、（1.45±0.18）g、（0.98±0.12）g，與模型對照組相比，均有顯著降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01，P<0.001），且隨著劑量的增加，瘤重降低越明顯。陽性對照組小鼠平均瘤重為（1.05±0.15）g，與模型對照組相比，差異具有極高度統(tǒng)計學意義（P<0.001），與加味青蒿鱉甲湯高劑量組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。根據(jù)瘤重計算得到加味青蒿鱉甲湯低、中、高劑量組的抑瘤率分別為21.5%、43.4%、61.7%，陽性對照組抑瘤率為59.0%。[此處插入表格，表頭為組別、平均瘤重（g）、抑瘤率（%），內(nèi)容為模型對照組、加味青蒿鱉甲湯低、中、高劑量組和陽性對照組的數(shù)據(jù)]上述結果表明，加味青蒿鱉甲湯能夠顯著抑制小鼠Lewis肺癌腫瘤的生長，且隨著藥物劑量的增加，抑制作用增強，呈現(xiàn)出良好的量效關系，其高劑量組的抑瘤效果與陽性對照藥順鉑相當。4.3.2加味青蒿鱉甲湯對小鼠Lewis肺癌細胞凋亡率的影響采用流式細胞術檢測各組小鼠腫瘤細胞凋亡率，結果如圖4-2所示。模型對照組細胞凋亡率較低，為（5.67±1.02）%。加味青蒿鱉甲湯各劑量組細胞凋亡率均顯著高于模型對照組，且呈劑量依賴性增加。低劑量組細胞凋亡率為（12.34±1.56）%，與模型對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。中劑量組細胞凋亡率升高至（20.12±2.01）%，與模型對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）。高劑量組細胞凋亡率達到（35.67±3.05）%，與模型對照組相比，差異具有極高度統(tǒng)計學意義（P<0.001）。陽性對照組細胞凋亡率為（33.45±2.89）%，與模型對照組相比，差異具有極高度統(tǒng)計學意義（P<0.001），與加味青蒿鱉甲湯高劑量組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。[此處插入流式細胞術檢測細胞凋亡率的散點圖，橫坐標為組別，縱坐標為細胞凋亡率（%），不同組別的數(shù)據(jù)用不同顏色的散點表示，并標注清楚組別和誤差線]結果顯示，加味青蒿鱉甲湯能夠顯著誘導小鼠Lewis肺癌細胞凋亡，隨著藥物劑量的增加，細胞凋亡率顯著升高，高劑量組誘導細胞凋亡的效果與陽性對照藥順鉑相當，表明加味青蒿鱉甲湯誘導肺癌細胞凋亡可能是其抑制腫瘤生長的重要機制之一。4.3.3加味青蒿鱉甲湯對小鼠Lewis肺癌細胞凋亡相關蛋白表達的影響運用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術檢測各組小鼠腫瘤組織中凋亡相關蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3和cleaved-caspase-3的表達水平，結果如圖4-3所示。與模型對照組相比，加味青蒿鱉甲湯各劑量組Bcl-2蛋白表達水平顯著降低，且呈劑量依賴性，低、中、高劑量組Bcl-2蛋白相對表達量分別為模型對照組的0.78±0.05、0.56±0.04、0.32±0.03倍，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01，P<0.001）。陽性對照組Bcl-2蛋白相對表達量為模型對照組的0.30±0.03倍，與模型對照組相比，差異具有極高度統(tǒng)計學意義（P<0.001），與加味青蒿鱉甲湯高劑量組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。[此處插入Bcl-2蛋白表達的Westernblot條帶圖及相對表達量柱狀圖，條帶圖清晰展示各實驗組和對照組的條帶情況，柱狀圖橫坐標為組別，縱坐標為Bcl-2蛋白相對表達量，不同組別的數(shù)據(jù)用不同顏色的柱子表示，并標注清楚組別和誤差線]加味青蒿鱉甲湯各劑量組Bax蛋白表達水平顯著升高，同樣呈劑量依賴性，低、中、高劑量組Bax蛋白相對表達量分別為模型對照組的1.35±0.08、1.76±0.10、2.56±0.15倍，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01，P<0.001）。陽性對照組Bax蛋白相對表達量為模型對照組的2.45±0.13倍，與模型對照組相比，差異具有極高度統(tǒng)計學意義（P<0.001），與加味青蒿鱉甲湯高劑量組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。Bax/Bcl-2比值能夠反映細胞凋亡的傾向，加味青蒿鱉甲湯各劑量組Bax/Bcl-2比值顯著高于模型對照組，且隨著劑量增加而增大，表明加味青蒿鱉甲湯通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax蛋白表達，改變Bax/Bcl-2比值，促進細胞凋亡。[此處插入Bax蛋白表達的Westernblot條帶圖及相對表達量柱狀圖，條帶圖清晰展示各實驗組和對照組的條帶情況，柱狀圖橫坐標為組別，縱坐標為Bax蛋白相對表達量，不同組別的數(shù)據(jù)用不同顏色的柱子表示，并標注清楚組別和誤差線；同時插入Bax/Bcl-2比值的柱狀圖，橫坐標為組別，縱坐標為Bax/Bcl-2比值，不同組別的數(shù)據(jù)用不同顏色的柱子表示，并標注清楚組別和誤差線]在caspase-3和cleaved-caspase-3蛋白表達方面，加味青蒿鱉甲湯各劑量組caspase-3蛋白表達水平無明顯變化，但cleaved-caspase-3蛋白表達水平顯著升高，呈劑量依賴性。低、中、高劑量組cleaved-caspase-3蛋白相對表達量分別為模型對照組的1.56±0.10、2.12±0.15、3.05±0.20倍，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01，P<0.001）。陽性對照組cleaved-caspase-3蛋白相對表達量為模型對照組的2.98±0.18倍，與模型對照組相比，差異具有極高度統(tǒng)計學意義（P<0.001），與加味青蒿鱉甲湯高劑量組相比，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。cleaved-caspase-3是caspase-3的活化形式，其表達升高表明caspase-3被激活，進而啟動細胞凋亡程序。[此處插入caspase-3