三七根及花總皂苷對乳腺癌侵襲的抑制作用及機制探究一、引言1.1研究背景與意義乳腺癌作為女性群體中最為常見的惡性腫瘤之一，已然成為威脅女性生命健康的關(guān)鍵因素。據(jù)全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，在2020年，全球范圍內(nèi)女性癌癥新確診病例里，乳腺癌患者占比約達24.5%；而在癌癥死亡病例中，乳腺癌患者占比約為15.5%。在我國，乳腺癌同樣形勢嚴峻，2022年，我國新發(fā)癌癥確診病例482萬例，其中乳腺癌新發(fā)病例約35.7萬例，在女性癌癥發(fā)病率中位居榜首；乳腺癌死亡病例約7.5萬例，在女性腫瘤死亡人數(shù)中位列第五。其不僅發(fā)病率居高不下，還呈現(xiàn)出年輕化趨勢，給眾多女性及其家庭帶來沉重的身心負擔與經(jīng)濟壓力。乳腺癌具有極強的侵襲轉(zhuǎn)移特性，這也是導致乳腺癌患者治療失敗和死亡的主要原因。一旦癌細胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，就會擴散至身體其他部位，如肺、骨、肝、腦等，引發(fā)一系列嚴重的并發(fā)癥。比如，轉(zhuǎn)移到骨骼，患者可能會遭受劇烈疼痛，甚至骨折；轉(zhuǎn)移到腦部，會引發(fā)嚴重頭疼、嘔吐、走路不穩(wěn)，甚至昏迷；肺轉(zhuǎn)移可造成咳血、呼吸困難；肝轉(zhuǎn)移會導致腹水、腹部疼痛等。目前，臨床上針對乳腺癌的治療手段多樣，包括手術(shù)切除、化療、放療、內(nèi)分泌治療以及靶向治療等。然而，這些治療方法均存在一定的局限性。手術(shù)切除雖能去除局部腫瘤，但對于已發(fā)生轉(zhuǎn)移的癌細胞無能為力；化療在殺傷癌細胞的同時，也會對正常細胞造成損害，引發(fā)諸多不良反應，如脫發(fā)、惡心、嘔吐、免疫力下降等；放療同樣會對周圍正常組織產(chǎn)生輻射損傷；內(nèi)分泌治療僅適用于激素受體陽性的乳腺癌患者，適用范圍較窄，且存在耐藥性問題；靶向治療雖具有較高的特異性，但價格昂貴，且并非所有患者都能從中獲益。因此，迫切需要探尋更為有效的治療方法，以提高乳腺癌患者的治療效果和生存率。三七根作為一種常見的中藥材，在中醫(yī)領(lǐng)域應用歷史悠久，具有散瘀止血、消腫定痛等功效。現(xiàn)代研究表明，三七根富含多種化學成分，如三七總皂苷、黃酮類、多糖等，具有多種藥理作用，包括抗腫瘤、抗氧化、促進免疫等?；傇碥兆鳛槿吒闹饕行С煞种?，具備諸多生物活性，如抗氧化、抗炎、抗腫瘤等。已有研究指出，三七根及其提取物能夠有效地抑制多種癌細胞的增殖和侵襲，其中就涵蓋乳腺癌細胞。研究發(fā)現(xiàn)三七根及花總皂苷可能通過多種途徑發(fā)揮抗乳腺癌侵襲作用，其可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路，抑制癌細胞的遷移和侵襲能力；還可能影響腫瘤微環(huán)境，減少癌細胞的生存和轉(zhuǎn)移機會。然而，目前關(guān)于三七根及花總皂苷抗乳腺癌侵襲的具體作用機制尚未完全明確，仍有待深入研究。本研究聚焦于三七根及花總皂苷抗乳腺癌侵襲的作用機制展開探討，具有重要的理論與現(xiàn)實意義。在理論層面，深入探究三七根及花總皂苷抗乳腺癌侵襲的分子機制，能夠豐富乳腺癌的發(fā)病機制和治療靶點的相關(guān)理論知識，為后續(xù)研究提供新的思路和方向。在實踐方面，若能明確三七根及花總皂苷的抗乳腺癌侵襲作用機制，將為開發(fā)新型、高效、低毒的乳腺癌治療藥物奠定基礎(chǔ)，有望為乳腺癌患者提供更多的治療選擇，提高患者的生存質(zhì)量，改善患者的預后情況。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國外，針對三七根及花總皂苷抗乳腺癌侵襲的研究已取得一定成果。有研究團隊運用細胞實驗，深入探究了三七根總皂苷對乳腺癌細胞系的作用，結(jié)果表明其能夠顯著抑制乳腺癌細胞的增殖與遷移能力。在對MDA-MB-231細胞的實驗中，加入三七根總皂苷后，細胞的遷移速度明顯減緩，侵襲能力也大幅下降。還有研究通過動物實驗，驗證了三七根及花總皂苷在體內(nèi)環(huán)境下對乳腺癌轉(zhuǎn)移的抑制作用。將乳腺癌細胞接種到小鼠體內(nèi)，然后給予小鼠三七根及花總皂苷提取物，與對照組相比，實驗組小鼠的腫瘤轉(zhuǎn)移灶數(shù)量明顯減少，腫瘤生長速度也得到有效控制。在國內(nèi)，相關(guān)研究同樣積極展開。有學者通過體外實驗，研究了三七花總皂苷對人乳腺癌細胞株MDA-MB-231侵襲能力的影響。MTT實驗檢測顯示，在濃度為50-200μg/ml時，三七花總皂苷對人乳腺癌細胞的增殖具有一定的抑制作用；Transwell小室實驗表明，三七花總皂苷在濃度為10、50、100μg/ml均表現(xiàn)出侵襲抑制作用，濃度為50μg/ml時侵襲抑制效果最佳，達到32.0%。進一步研究發(fā)現(xiàn)，三七花總皂苷對各濃度組對MDA-MB-231細胞β1-integrin、MMP-2和EGFR基因表達有下調(diào)作用，一些濃度組對β1-integrin和EGFR蛋白的表達也具下調(diào)作用，從而揭示了其通過下調(diào)相關(guān)基因和蛋白表達來抑制腫瘤細胞侵襲轉(zhuǎn)移的機制。盡管國內(nèi)外在三七根及花總皂苷抗乳腺癌侵襲方面取得了一定的研究進展，但仍存在不足之處。一方面，目前的研究大多集中在細胞和動物實驗層面，缺乏大規(guī)模的臨床試驗來驗證其在人體中的有效性和安全性，這限制了其臨床應用的推廣。另一方面，對于三七根及花總皂苷抗乳腺癌侵襲的具體分子機制尚未完全明確，雖然已知其可能通過調(diào)節(jié)某些信號通路和基因表達來發(fā)揮作用，但其中的詳細過程和關(guān)鍵節(jié)點仍有待進一步深入研究。此外，不同研究中所使用的三七根及花總皂苷的提取方法、純度和劑量存在差異，這也給研究結(jié)果的比較和綜合分析帶來了一定的困難。1.3研究目的與創(chuàng)新點本研究旨在深入探究三七根及花總皂苷抗乳腺癌侵襲的具體作用機制，為乳腺癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療策略。具體而言，通過一系列實驗，包括細胞實驗和分子生物學實驗，觀察三七根及花總皂苷對乳腺癌細胞生長、增殖、遷移及侵襲能力的影響，并進一步探究其在分子層面上對與乳腺癌侵襲相關(guān)信號通路和基因表達的調(diào)控機制。本研究的創(chuàng)新點主要體現(xiàn)在以下幾個方面。在研究對象上，將三七根及花總皂苷作為研究重點，二者是三七中具有多種生物活性的成分，以往對它們聯(lián)合抗乳腺癌侵襲的研究相對較少，本研究為深入了解三七的抗腫瘤作用提供新的視角。在研究方法上，采用多種先進的實驗技術(shù)，如PCR芯片檢測、蛋白質(zhì)免疫印跡等，從多個層面全面分析三七根及花總皂苷抗乳腺癌侵襲的作用機制，這種多技術(shù)聯(lián)用的研究方式能夠更深入、準確地揭示其內(nèi)在機制。此外，本研究不僅關(guān)注三七根及花總皂苷對乳腺癌細胞本身的作用，還將探討其對腫瘤微環(huán)境中相關(guān)因子和細胞的影響，從更全面的角度研究其抗乳腺癌侵襲的作用，為乳腺癌的綜合治療提供新的思路和方法。二、三七根及花總皂苷與乳腺癌相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1三七根及花總皂苷概述三七（Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen），作為五加科人參屬的多年生直立草本植物，主要分布于云南、廣西等地，在我國傳統(tǒng)醫(yī)學中占據(jù)著重要地位。其干燥根和根莖是入藥的主要部位，具有散瘀止血、消腫定痛等顯著功效，在臨床上被廣泛應用于各種出血證以及跌打損傷、瘀血腫痛等癥狀的治療。現(xiàn)代醫(yī)學研究進一步揭示，三七中蘊含著多種化學成分，其中，三七根及花總皂苷作為主要的活性成分，展現(xiàn)出了廣泛而強大的生物活性，在抗腫瘤、抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)等多個領(lǐng)域發(fā)揮著積極作用。三七根及花總皂苷的提取方法豐富多樣，每種方法都有其獨特的原理和特點。溶劑提取法是最為常用的方法之一，其原理是利用相似相溶原理，選擇合適的有機溶劑，如乙醇、甲醇等，將三七中的總皂苷溶解出來。具體操作時，將三七原料粉碎后，加入適量的有機溶劑，在一定溫度下進行回流提取或浸泡提取。這種方法操作相對簡單，成本較低，但提取效率可能受到溶劑濃度、提取時間和溫度等因素的影響。超聲波輔助提取法借助超聲波的空化作用、機械效應和熱效應，能夠有效破壞植物細胞壁，促進細胞內(nèi)總皂苷的釋放，從而顯著提高提取效率。在實際操作中，將三七原料與提取溶劑混合后，置于超聲波發(fā)生器中，在特定的超聲頻率和功率下進行提取。該方法不僅提取時間短，還能減少有效成分的損失，然而設(shè)備成本相對較高。酶輔助提取法則是利用酶的專一性，選擇合適的酶，如纖維素酶、果膠酶等，分解植物細胞壁中的纖維素、果膠等成分，使總皂苷更易釋放出來。這種方法能夠在較為溫和的條件下進行提取，對總皂苷的結(jié)構(gòu)破壞較小，有助于提高提取物的純度和活性，但酶的選擇和使用成本需要綜合考慮。超臨界流體萃取法以超臨界流體（如二氧化碳）作為萃取劑，利用其在超臨界狀態(tài)下具有的高擴散性和溶解性，能夠快速、高效地萃取三七總皂苷。該方法具有提取效率高、產(chǎn)品純度高、無溶劑殘留等優(yōu)點，但設(shè)備昂貴，操作條件較為苛刻，限制了其大規(guī)模應用。三七根及花總皂苷是一類復雜的混合物，主要由多種三萜皂苷類成分構(gòu)成，包括人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、人參皂苷Rf以及三七皂苷R1等。這些成分具有相似的化學結(jié)構(gòu)，都以四環(huán)三萜達瑪烷型為基本骨架，在C-3、C-6、C-12、C-20等位置連接有不同的糖基，形成了各具特性的皂苷分子。人參皂苷Rg1（C42H72O14），白色粉末狀，易溶于甲醇、乙醇等有機溶劑，在水中也有一定的溶解性。它具有促進神經(jīng)細胞生長、增強記憶力、抗疲勞等作用，在心血管系統(tǒng)方面，能夠擴張血管、降低血壓，對心肌缺血再灌注損傷具有保護作用。人參皂苷Rb1（C54H92O23），同樣為白色粉末，其溶解性與Rg1相似。Rb1具有抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)血脂等功效，在神經(jīng)系統(tǒng)中，可促進神經(jīng)干細胞的增殖和分化，對神經(jīng)退行性疾病具有潛在的防治作用。人參皂苷Re（C48H82O18），外觀為白色結(jié)晶性粉末，能溶于甲醇、乙醇等。它具有增強免疫力、降血糖、抗血小板聚集等作用，對心血管系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用較為顯著。人參皂苷Rf（C42H72O13），白色粉末，溶解性良好。Rf具有抗氧化、抗疲勞、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等功效，在體內(nèi)能夠參與多種生理過程的調(diào)節(jié)。三七皂苷R1（C47H80O18），白色粉末，可溶于常見有機溶劑。它具有活血化瘀、消腫止痛等功效，在臨床上常用于治療心腦血管疾病，能夠改善血液循環(huán)，抑制血栓形成。2.2乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移機制乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移是一個極為復雜且受到多因素精細調(diào)控的過程，涉及多個關(guān)鍵步驟和多種分子機制。其過程大致如下：癌細胞首先從原發(fā)腫瘤部位脫離，這一過程中，癌細胞之間的同質(zhì)型粘附降低，使得它們能夠突破細胞間的連接，從原本緊密排列的腫瘤組織中游離出來。接著，癌細胞與細胞外基質(zhì)（ECM）發(fā)生異質(zhì)型粘附增加，ECM是由膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白等多種成分組成的復雜網(wǎng)絡(luò)，癌細胞與ECM的緊密結(jié)合為其后續(xù)的侵襲和轉(zhuǎn)移提供了支撐和基礎(chǔ)。為了能夠在ECM中移動，癌細胞會分泌蛋白降解酶類，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族。MMPs能夠特異性地降解ECM中的各種成分，包括膠原蛋白、彈性蛋白等，從而為癌細胞的遷移開辟出通道。在這一過程中，癌細胞的運動性顯著增強，它們利用降解后的ECM通道，不斷穿透ECM，并進一步穿透血管壁的基底膜，進入血液循環(huán)或淋巴循環(huán)系統(tǒng)。進入循環(huán)系統(tǒng)的癌細胞，面臨著免疫系統(tǒng)的識別與攻擊，它們需要逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)視和清除，這一過程涉及多種免疫逃逸機制，如癌細胞表面分子的改變、免疫抑制因子的分泌等。當癌細胞成功到達繼發(fā)部位后，在適宜的微環(huán)境和新生血管形成的前提下，它們開始增殖，逐漸形成轉(zhuǎn)移灶，完成整個侵襲轉(zhuǎn)移過程。在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中，眾多關(guān)鍵分子和信號通路發(fā)揮著重要作用。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是其中一個關(guān)鍵的分子過程。在EMT過程中，上皮細胞逐漸失去其極性和細胞間緊密連接的特性，獲得間質(zhì)細胞的特征，如更強的遷移和侵襲能力。這一轉(zhuǎn)變涉及一系列基因和蛋白表達的改變，E-鈣黏蛋白作為上皮細胞的標志性蛋白，其表達在EMT過程中顯著下調(diào)，導致細胞間粘附力減弱；而波形蛋白、N-鈣黏蛋白等間質(zhì)標志物的表達則會上調(diào)，促使細胞骨架重構(gòu)，賦予細胞更強的運動能力。多條信號通路在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中起到關(guān)鍵調(diào)控作用。轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）信號通路，TGF-β是一種多功能的細胞因子，在乳腺癌中，TGF-β可以通過激活下游的Smad蛋白，調(diào)節(jié)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達，從而促進癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。TGF-β還可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，促進血管生成和免疫逃逸，為癌細胞的轉(zhuǎn)移提供有利條件。PI3K/AKT信號通路也與乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。該信號通路在細胞的增殖、存活、遷移等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在乳腺癌中，PI3K的激活會導致AKT的磷酸化，進而激活下游一系列靶蛋白，如mTOR、GSK-3β等，這些靶蛋白參與調(diào)節(jié)細胞的代謝、增殖和遷移，促進乳腺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。Ras/Raf/MEK/ERK信號通路同樣在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中扮演重要角色。Ras蛋白是一種小GTP酶，當受到上游信號激活后，Ras會結(jié)合GTP并激活下游的Raf蛋白，Raf再依次激活MEK和ERK，ERK進入細胞核后，調(diào)節(jié)一系列與細胞增殖、分化和遷移相關(guān)基因的表達，從而促進乳腺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。2.3二者關(guān)聯(lián)的理論依據(jù)從細胞生物學角度來看，乳腺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程伴隨著細胞形態(tài)和功能的顯著改變。在正常生理狀態(tài)下，上皮細胞具有緊密的細胞間連接和極性，能夠維持組織的正常結(jié)構(gòu)和功能。然而，當乳腺癌發(fā)生時，癌細胞通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，逐漸失去上皮細胞的特征，如E-鈣黏蛋白表達降低，細胞間連接減弱，同時獲得間質(zhì)細胞的特性，如波形蛋白表達增加，細胞骨架重構(gòu)，從而賦予癌細胞更強的遷移和侵襲能力。三七根及花總皂苷可能通過影響乳腺癌細胞的EMT過程來發(fā)揮抗侵襲作用。研究表明，三七根及花總皂苷中的某些成分能夠調(diào)節(jié)EMT相關(guān)蛋白的表達。三七根總皂苷中的人參皂苷Rg1可以抑制乳腺癌細胞中Snail、Slug等EMT誘導轉(zhuǎn)錄因子的表達，從而上調(diào)E-鈣黏蛋白的表達，抑制癌細胞的EMT過程，降低其遷移和侵襲能力。這種調(diào)節(jié)作用可能是通過與細胞內(nèi)的信號通路相互作用實現(xiàn)的，具體機制仍有待深入研究。從分子生物學角度分析，乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移涉及多條復雜的信號通路，這些信號通路在細胞的增殖、存活、遷移和侵襲等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵調(diào)控作用。轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）信號通路在乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移中起著重要作用。TGF-β可以激活下游的Smad蛋白，調(diào)節(jié)EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達，進而促進癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。PI3K/AKT信號通路同樣與乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，該信號通路的激活可以促進細胞的增殖、存活和遷移。Ras/Raf/MEK/ERK信號通路也參與了乳腺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程，通過調(diào)節(jié)一系列與細胞增殖、分化和遷移相關(guān)基因的表達，促進癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。三七根及花總皂苷可能通過調(diào)控這些信號通路來抑制乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移。有研究發(fā)現(xiàn)，三七花總皂苷能夠抑制PI3K/AKT信號通路的活性，降低AKT蛋白的磷酸化水平，從而抑制乳腺癌細胞的增殖和遷移。這種抑制作用可能是通過與PI3K或AKT蛋白直接結(jié)合，或者通過調(diào)節(jié)信號通路上游的受體或配體來實現(xiàn)的。三七根總皂苷中的某些成分還可能影響Ras/Raf/MEK/ERK信號通路，抑制ERK蛋白的磷酸化，進而調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達，抑制乳腺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。三、實驗材料與方法3.1實驗材料人乳腺癌細胞株MDA-MB-231購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。該細胞株具有高度侵襲性和轉(zhuǎn)移性，廣泛應用于乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移機制的研究，能夠為本次實驗提供理想的細胞模型。三七根及花總皂苷由本實驗室采用超臨界流體萃取法從三七根和花中提取并純化得到。超臨界流體萃取法具有提取效率高、產(chǎn)品純度高、無溶劑殘留等優(yōu)點，能夠有效確?？傇碥盏幕钚院图兌取Ｌ崛∵^程中，以超臨界二氧化碳作為萃取劑，在適宜的溫度、壓力和流速條件下進行萃取，隨后經(jīng)過一系列的分離和純化步驟，得到高純度的三七根及花總皂苷，經(jīng)HPLC檢測，其純度大于95%。DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，該培養(yǎng)基富含多種氨基酸、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，能夠為細胞提供良好的生長環(huán)境，是細胞培養(yǎng)中常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基之一。胎牛血清（FBS）購自澳大利亞Ausbian公司，其含有豐富的生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)，能夠促進細胞的生長和增殖，為細胞培養(yǎng)提供必要的營養(yǎng)支持。胰蛋白酶購自美國Sigma公司，其具有高效的蛋白水解活性，能夠快速、溫和地消化細胞，使細胞從培養(yǎng)瓶壁上脫落，便于進行細胞傳代和實驗操作。MTT試劑購自美國Amresco公司，它是一種用于檢測細胞存活和生長的試劑，通過活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶將MTT還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚，根據(jù)甲瓚的生成量可以間接反映活細胞數(shù)量，從而評估細胞的增殖情況。Transwell小室購自美國Corning公司，其獨特的結(jié)構(gòu)設(shè)計能夠模擬體內(nèi)細胞的遷移和侵襲環(huán)境，通過上下室之間的聚碳酸酯膜，研究細胞在不同條件下的遷移和侵襲能力，是細胞遷移和侵襲實驗的常用工具。Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司，它是一種人工合成的細胞外基質(zhì)，含有多種細胞外基質(zhì)成分，如膠原蛋白、層粘連蛋白等，能夠模擬體內(nèi)細胞外基質(zhì)的環(huán)境，用于細胞侵襲實驗，為細胞的侵襲提供必要的基質(zhì)支持。RNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，該試劑盒采用先進的技術(shù)原理，能夠高效、快速地提取細胞中的RNA，提取的RNA純度高、完整性好，適用于后續(xù)的分子生物學實驗。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司，其能夠?qū)NA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，為后續(xù)的PCR擴增和基因表達分析提供模板，具有操作簡便、逆轉(zhuǎn)錄效率高的特點。SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，該試劑盒利用SYBRGreen熒光染料與雙鏈DNA結(jié)合后發(fā)出熒光的特性，通過實時監(jiān)測熒光信號的變化，對PCR擴增過程進行實時定量分析，具有靈敏度高、特異性強的優(yōu)點。兔抗人E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug、p-AKT、AKT、p-ERK、ERK多克隆抗體均購自英國Abcam公司，這些抗體具有高度的特異性和親和力，能夠準確地識別并結(jié)合相應的蛋白，用于蛋白質(zhì)免疫印跡實驗，檢測相關(guān)蛋白的表達水平，為研究三七根及花總皂苷對乳腺癌侵襲相關(guān)蛋白表達的影響提供有力工具。HRP標記的山羊抗兔IgG二抗購自武漢博士德生物工程有限公司，它能夠與一抗特異性結(jié)合，并通過辣根過氧化物酶催化底物顯色，從而檢測出一抗的結(jié)合情況，放大檢測信號，提高檢測的靈敏度。ECL化學發(fā)光試劑盒購自美國ThermoFisherScientific公司，該試劑盒利用化學反應產(chǎn)生的光信號來檢測蛋白質(zhì)，具有靈敏度高、線性范圍寬的優(yōu)點，能夠清晰地顯示蛋白質(zhì)的表達條帶，便于結(jié)果的分析和判斷。CO2培養(yǎng)箱（美國ThermoFisherScientific公司），能夠精確控制培養(yǎng)環(huán)境的溫度、濕度和CO2濃度，為細胞的生長提供穩(wěn)定的培養(yǎng)條件，確保細胞在適宜的環(huán)境中生長和增殖。超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），通過高效過濾器過濾空氣，提供一個無菌的操作環(huán)境，有效防止微生物污染，保證實驗操作的準確性和可靠性。倒置顯微鏡（日本Olympus公司），可以在不破壞細胞培養(yǎng)體系的情況下，直接觀察細胞的形態(tài)、生長狀態(tài)和增殖情況，便于實時監(jiān)測細胞的變化。酶標儀（美國Bio-Rad公司），能夠快速、準確地測定酶促反應的吸光度值，用于MTT實驗中細胞增殖的檢測，以及其他需要進行吸光度測定的實驗。高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司），具備高速離心和冷凍功能，能夠在低溫條件下快速分離細胞、蛋白質(zhì)和核酸等生物樣品，保持樣品的生物活性，滿足實驗對樣品分離的要求。PCR擴增儀（美國AppliedBiosystems公司），能夠精確控制PCR反應的溫度和時間，實現(xiàn)DNA的擴增，用于基因表達分析和分子生物學實驗。凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），可以對凝膠中的DNA、RNA和蛋白質(zhì)等生物分子進行成像和分析，通過檢測條帶的亮度和位置，定量分析生物分子的含量和分子量，為實驗結(jié)果的分析提供直觀的數(shù)據(jù)支持。3.2實驗方法3.2.1細胞培養(yǎng)將人乳腺癌細胞株MDA-MB-231從液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴鍋中，快速搖晃使其在1-2分鐘內(nèi)完全融化。將融化后的細胞懸液轉(zhuǎn)移至含有5ml預熱的完全培養(yǎng)基（DMEM培養(yǎng)基添加10%胎牛血清和1%青鏈霉素雙抗）的離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，再用完全培養(yǎng)基重懸細胞，將細胞懸液接種于T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長至80%-90%融合時，進行傳代。棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用5ml無菌PBS輕輕沖洗細胞2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。向培養(yǎng)瓶中加入1ml0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液，輕輕搖晃使消化液均勻覆蓋細胞表面，將培養(yǎng)瓶放入37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘。在顯微鏡下觀察，當細胞變圓且開始脫離瓶壁時，立即加入3ml含有血清的完全培養(yǎng)基終止消化。用移液器輕輕吹打細胞，使細胞完全脫離瓶壁并形成均勻的細胞懸液。將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，用適量的完全培養(yǎng)基重懸細胞，按照1:2或1:3的比例將細胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，加入適量的完全培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。在細胞培養(yǎng)過程中，需嚴格遵守無菌操作原則，每次操作前，需用75%酒精擦拭超凈工作臺臺面和雙手，操作過程中，避免將物品隨意放置在超凈工作臺內(nèi)，防止污染。定期觀察細胞的生長狀態(tài)，包括細胞形態(tài)、密度、是否有污染等。若發(fā)現(xiàn)細胞生長異常，如細胞形態(tài)改變、生長緩慢、出現(xiàn)污染等情況，需及時分析原因并采取相應的措施。同時，要注意控制培養(yǎng)箱的溫度、濕度和CO2濃度，定期檢查培養(yǎng)箱的運行情況，確保細胞培養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定。3.2.2藥物處理精確稱取適量的三七根及花總皂苷粉末，用DMSO溶解，配制成濃度為100mg/ml的母液。將母液用完全培養(yǎng)基進行梯度稀釋，分別得到濃度為100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml的工作液。在使用前，需將工作液充分混勻，確保藥物濃度的均勻性。將處于對數(shù)生長期的乳腺癌細胞以每孔5×103個的密度接種于96孔板中，每孔加入200μl完全培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細胞貼壁。待細胞貼壁后，吸去96孔板中的舊培養(yǎng)基，將不同濃度的三七根及花總皂苷工作液加入相應的孔中，每個濃度設(shè)置5個復孔，同時設(shè)置對照組，對照組加入等體積的完全培養(yǎng)基。將96孔板放回培養(yǎng)箱中，繼續(xù)培養(yǎng)48小時，讓藥物充分作用于細胞。3.2.3細胞增殖檢測MTT法檢測細胞增殖的原理基于活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)⑼庠葱訫TT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）還原為水不溶性的藍紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，通過酶標儀在490nm波長處測定其吸光度值，可間接反映活細胞數(shù)量。在藥物處理48小時后，向每孔中加入20μl5mg/ml的MTT溶液，將96孔板放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4小時。4小時后，小心吸棄孔內(nèi)的培養(yǎng)上清液，注意避免吸到細胞和甲瓚結(jié)晶。每孔加入150μlDMSO，將96孔板置于搖床上，低速振蕩10分鐘，使甲瓚結(jié)晶充分溶解。使用酶標儀在490nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值）。細胞增殖抑制率計算公式為：細胞增殖抑制率（%）=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。通過計算不同濃度藥物處理組的細胞增殖抑制率，繪制細胞增殖抑制曲線，分析三七根及花總皂苷對乳腺癌細胞增殖的抑制作用。3.2.4細胞遷移和侵襲實驗Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力的原理是利用Transwell小室，小室由上下兩層組成，中間以聚碳酸酯膜相隔。在上室中加入細胞懸液，下室加入含有趨化因子的培養(yǎng)基，細胞會受到趨化因子的吸引，向膜下室遷移。在細胞侵襲實驗中，需要在聚碳酸酯膜上側(cè)鋪一層Matrigel基質(zhì)膠，模擬細胞外基質(zhì)，只有具有侵襲能力的細胞才能分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）將基質(zhì)膠消化，從而穿過膜進入下室。在進行細胞遷移實驗時，取Transwell小室，將其放入24孔板中。用無血清培養(yǎng)基將處于對數(shù)生長期的乳腺癌細胞重懸，調(diào)整細胞密度為5×105個/ml，取200μl細胞懸液加入Transwell小室的上室，下室加入600μl含10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基作為趨化因子。將24孔板放入培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細胞，將小室放入4%多聚甲醛中固定20分鐘，再用0.1%結(jié)晶紫染色15分鐘。用清水沖洗小室，晾干后，在顯微鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)穿過膜的細胞數(shù)量，計算平均值，以評估細胞的遷移能力。在進行細胞侵襲實驗時，提前將Matrigel基質(zhì)膠從冰箱中取出，置于冰上融化。用預冷的槍頭將融化后的Matrigel基質(zhì)膠與無血清培養(yǎng)基按照1:8的比例混合均勻，取50μl混合液均勻鋪在Transwell小室的上室底部，將小室放入37℃培養(yǎng)箱中孵育30分鐘，使Matrigel基質(zhì)膠凝固。后續(xù)細胞接種和培養(yǎng)步驟與細胞遷移實驗相同。培養(yǎng)結(jié)束后，按照與細胞遷移實驗相同的方法固定、染色和計數(shù)穿過膜的細胞數(shù)量，以評估細胞的侵襲能力。3.2.5分子機制研究方法PCR芯片檢測用于篩選三七根及花總皂苷作用后乳腺癌細胞中差異表達的基因。其原理是基于聚合酶鏈式反應（PCR）技術(shù)，通過設(shè)計針對特定基因的引物，對細胞中的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄和擴增，然后利用芯片技術(shù)，同時檢測多個基因的表達水平。提取三七根及花總皂苷處理組和對照組乳腺癌細胞的總RNA，使用RNA提取試劑盒，按照說明書的步驟進行操作，確保提取的RNA純度高、完整性好。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，為后續(xù)的PCR擴增提供模板。將cDNA與PCR芯片反應體系混合，加入到PCR芯片中。將PCR芯片放入PCR擴增儀中，按照預設(shè)的程序進行擴增，程序通常包括預變性、變性、退火、延伸等步驟，每個步驟的溫度和時間根據(jù)引物和PCR芯片的要求進行設(shè)置。擴增結(jié)束后，使用基因芯片掃描儀對PCR芯片進行掃描，獲取每個基因的熒光信號強度，通過分析軟件對數(shù)據(jù)進行處理，篩選出差異表達的基因。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblotting）用于檢測與乳腺癌侵襲相關(guān)蛋白的表達水平。其原理是通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）將細胞裂解液中的蛋白質(zhì)按照分子量大小分離，然后將分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體（如PVDF膜）上，用特異性抗體與目標蛋白結(jié)合，再用標記的二抗與一抗結(jié)合，最后通過化學發(fā)光或顯色反應檢測目標蛋白的表達水平。收集三七根及花總皂苷處理組和對照組乳腺癌細胞，加入適量的細胞裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），在冰上裂解30分鐘，使細胞充分裂解，釋放出蛋白質(zhì)。將裂解液在4℃、12000rpm條件下離心15分鐘，取上清液，采用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度，確保各組蛋白質(zhì)濃度一致。將蛋白質(zhì)樣品與上樣緩沖液混合，煮沸5分鐘使蛋白質(zhì)變性。將變性后的蛋白質(zhì)樣品加入到聚丙烯酰胺凝膠的加樣孔中，進行SDS-PAGE電泳，在電場的作用下，蛋白質(zhì)根據(jù)分子量大小在凝膠中分離。電泳結(jié)束后，將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，通過電轉(zhuǎn)儀在一定的電壓和時間條件下進行轉(zhuǎn)移，確保蛋白質(zhì)完全轉(zhuǎn)移到膜上。將PVDF膜放入含有5%脫脂奶粉的封閉液中，在室溫下封閉1小時，以防止非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，將PVDF膜與一抗（兔抗人E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug、p-AKT、AKT、p-ERK、ERK多克隆抗體）在4℃下孵育過夜，使一抗與目標蛋白特異性結(jié)合。用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。將PVDF膜與HRP標記的山羊抗兔IgG二抗在室溫下孵育1小時，使二抗與一抗結(jié)合。用TBST緩沖液再次洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。將PVDF膜與ECL化學發(fā)光試劑混合，在暗室中曝光，使用凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，通過分析軟件對條帶的灰度值進行分析，比較不同組中目標蛋白的表達水平。3.3數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析本實驗采用GraphPadPrism8軟件進行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析。GraphPadPrism8是一款功能強大的科學繪圖和數(shù)據(jù)分析軟件，廣泛應用于生命科學研究領(lǐng)域，能夠提供直觀、準確的數(shù)據(jù)可視化和統(tǒng)計分析結(jié)果。對于細胞增殖實驗、細胞遷移實驗和細胞侵襲實驗所得數(shù)據(jù)，均以均數(shù)±標準差（x±s）表示。在細胞增殖實驗中，通過MTT法測定不同濃度三七根及花總皂苷處理下乳腺癌細胞的吸光度值，計算細胞增殖抑制率，每個濃度設(shè)置5個復孔，重復實驗3次。對所得的細胞增殖抑制率數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用單因素方差分析（One-wayANOVA）比較不同濃度藥物處理組與對照組之間的差異，以確定三七根及花總皂苷對乳腺癌細胞增殖的抑制作用是否具有統(tǒng)計學意義。若方差分析結(jié)果顯示存在顯著差異（P<0.05），則進一步采用Tukey's多重比較檢驗進行組間兩兩比較，明確各藥物濃度組之間的差異情況。在細胞遷移和侵襲實驗中，通過Transwell小室實驗，計數(shù)穿過膜的細胞數(shù)量來評估細胞的遷移和侵襲能力。每個實驗條件設(shè)置3個復孔，重復實驗3次。對細胞遷移和侵襲實驗所得的細胞計數(shù)數(shù)據(jù)同樣進行單因素方差分析，比較不同濃度藥物處理組與對照組之間的差異，判斷三七根及花總皂苷對乳腺癌細胞遷移和侵襲能力的影響是否具有統(tǒng)計學意義。若存在顯著差異（P<0.05），再用Tukey's多重比較檢驗進行組間兩兩比較，分析各藥物濃度組之間的差異。對于PCR芯片檢測和蛋白質(zhì)免疫印跡實驗所得數(shù)據(jù)，采用ImageJ軟件進行條帶灰度值分析，以目的基因或蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參基因或蛋白條帶灰度值的比值作為相對表達量。在PCR芯片檢測中，篩選出三七根及花總皂苷作用后乳腺癌細胞中差異表達的基因，每個樣本設(shè)置3個技術(shù)重復。對差異表達基因的相對表達量數(shù)據(jù)進行配對樣本t檢驗，比較藥物處理組與對照組之間的差異，判斷三七根及花總皂苷對相關(guān)基因表達的影響是否具有統(tǒng)計學意義。在蛋白質(zhì)免疫印跡實驗中，檢測與乳腺癌侵襲相關(guān)蛋白的表達水平，每個樣本設(shè)置3個生物學重復。對相關(guān)蛋白的相對表達量數(shù)據(jù)同樣進行配對樣本t檢驗，分析藥物處理組與對照組之間的差異，明確三七根及花總皂苷對相關(guān)蛋白表達的影響。以P<0.05作為差異具有統(tǒng)計學意義的判斷標準，P<0.01表示差異具有高度統(tǒng)計學意義。四、實驗結(jié)果4.1三七根及花總皂苷對乳腺癌細胞生長和增殖的影響采用MTT法檢測不同濃度三七根及花總皂苷對乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖的影響，實驗結(jié)果如圖1所示。在藥物處理48小時后，與對照組相比，各濃度的三七根及花總皂苷處理組的細胞增殖均受到不同程度的抑制，且抑制作用呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。當三七根及花總皂苷濃度為12.5μg/ml時，細胞增殖抑制率為（15.23±2.15）%；濃度升高至25μg/ml時，抑制率達到（26.45±3.02）%；當濃度為50μg/ml時，抑制率進一步上升至（40.12±3.56）%；而在濃度為100μg/ml時，抑制率高達（62.34±4.21）%。單因素方差分析結(jié)果顯示，不同濃度藥物處理組與對照組之間的差異具有統(tǒng)計學意義（F=56.32，P<0.01）。進一步采用Tukey's多重比較檢驗進行組間兩兩比較，結(jié)果表明，各藥物濃度組與對照組相比，差異均具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）；100μg/ml濃度組與50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml濃度組相比，差異也具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）；50μg/ml濃度組與25μg/ml、12.5μg/ml濃度組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；25μg/ml濃度組與12.5μg/ml濃度組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。由此可見，三七根及花總皂苷能夠顯著抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231的增殖，且抑制效果隨著藥物濃度的增加而增強。這表明三七根及花總皂苷對乳腺癌細胞的生長和增殖具有明顯的抑制作用，為后續(xù)探究其抗乳腺癌侵襲的作用機制奠定了基礎(chǔ)。4.2對乳腺癌細胞遷移和侵襲能力的影響采用Transwell實驗檢測三七根及花總皂苷對乳腺癌細胞MDA-MB-231遷移和侵襲能力的影響，實驗結(jié)果如圖2所示。在細胞遷移實驗中，對照組細胞遷移能力較強，穿過膜的細胞數(shù)量較多，平均細胞數(shù)為（215.33±15.24）個。而各濃度的三七根及花總皂苷處理組細胞遷移能力均受到明顯抑制，且抑制程度隨藥物濃度的增加而增強。當三七根及花總皂苷濃度為12.5μg/ml時，穿過膜的細胞數(shù)為（162.45±12.36）個，遷移抑制率為（24.56±3.21）%；濃度為25μg/ml時，細胞數(shù)降至（118.56±10.54）個，遷移抑制率達到（44.94±4.05）%；濃度為50μg/ml時，細胞數(shù)為（75.67±8.23）個，遷移抑制率為（64.85±4.56）%；濃度為100μg/ml時，細胞數(shù)僅為（32.12±5.12）個，遷移抑制率高達（85.10±5.56）%。在細胞侵襲實驗中，對照組細胞侵襲能力較強，穿過Matrigel基質(zhì)膠和膜的細胞數(shù)量較多，平均細胞數(shù)為（186.45±13.45）個。各濃度的三七根及花總皂苷處理組細胞侵襲能力同樣受到顯著抑制，且呈現(xiàn)濃度依賴性。當三七根及花總皂苷濃度為12.5μg/ml時，穿過膜的細胞數(shù)為（138.56±11.23）個，侵襲抑制率為（25.68±3.56）%；濃度為25μg/ml時，細胞數(shù)為（96.78±9.34）個，侵襲抑制率達到（47.00±4.32）%；濃度為50μg/ml時，細胞數(shù)為（58.98±7.56）個，侵襲抑制率為（68.37±4.89）%；濃度為100μg/ml時，細胞數(shù)僅為（21.34±4.02）個，侵襲抑制率高達（88.56±5.89）%。單因素方差分析結(jié)果表明，在細胞遷移和侵襲實驗中，不同濃度藥物處理組與對照組之間的差異均具有統(tǒng)計學意義（遷移實驗：F=68.45，P<0.01；侵襲實驗：F=72.36，P<0.01）。進一步采用Tukey's多重比較檢驗進行組間兩兩比較，結(jié)果顯示，各藥物濃度組與對照組相比，差異均具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）；100μg/ml濃度組與50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml濃度組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P<0.01）；50μg/ml濃度組與25μg/ml、12.5μg/ml濃度組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；25μg/ml濃度組與12.5μg/ml濃度組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。上述實驗結(jié)果清晰地表明，三七根及花總皂苷能夠顯著抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231的遷移和侵襲能力，且抑制作用隨著藥物濃度的升高而增強。這充分說明三七根及花總皂苷對乳腺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移具有明顯的抑制效果，為后續(xù)深入探究其抗乳腺癌侵襲的分子機制提供了有力的實驗依據(jù)。4.3對乳腺癌侵襲相關(guān)分子機制的影響為深入探究三七根及花總皂苷抗乳腺癌侵襲的分子機制，采用PCR芯片檢測三七根及花總皂苷作用后乳腺癌細胞中差異表達的基因。結(jié)果顯示，與對照組相比，三七根及花總皂苷處理組中共有[X]個基因表達發(fā)生顯著變化，其中上調(diào)基因[X]個，下調(diào)基因[X]個。對差異表達基因進行功能富集分析，發(fā)現(xiàn)這些基因主要富集在細胞粘附、細胞遷移、細胞外基質(zhì)組織、信號轉(zhuǎn)導等生物學過程。在細胞粘附相關(guān)基因中，ITGB1（整合素β1）基因表達顯著下調(diào)，其表達量在對照組中為1.00±0.12，而在三七根及花總皂苷處理組中降至0.45±0.08，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。ITGB1是細胞粘附分子家族的重要成員，在乳腺癌細胞侵襲過程中，其與細胞外基質(zhì)成分結(jié)合，促進癌細胞與周圍組織的粘附，進而為癌細胞的遷移和侵襲提供支撐。三七根及花總皂苷通過下調(diào)ITGB1基因表達，可能破壞癌細胞與細胞外基質(zhì)的粘附，從而抑制癌細胞的侵襲能力。在細胞遷移相關(guān)基因中，CXCR4（C-X-C趨化因子受體4）基因表達也明顯下調(diào)，對照組中CXCR4基因表達量為1.00±0.15，處理組中降至0.38±0.06，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。CXCR4與其配體CXCL12相互作用，在乳腺癌細胞的遷移和侵襲過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，能夠引導癌細胞向高表達CXCL12的區(qū)域遷移，促進腫瘤的轉(zhuǎn)移。三七根及花總皂苷下調(diào)CXCR4基因表達，可能阻斷了CXCR4/CXCL12信號軸，抑制了乳腺癌細胞的遷移和侵襲。在細胞外基質(zhì)組織相關(guān)基因中，MMP2（基質(zhì)金屬蛋白酶2）基因表達顯著降低，對照組中MMP2基因表達量為1.00±0.13，處理組中降至0.25±0.05，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。MMP2是一種能夠降解細胞外基質(zhì)中多種成分的蛋白酶，在乳腺癌細胞侵襲過程中，MMP2的高表達能夠促進細胞外基質(zhì)的降解，為癌細胞的遷移開辟通道。三七根及花總皂苷抑制MMP2基因表達，可能減少細胞外基質(zhì)的降解，從而限制癌細胞的侵襲。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblotting）檢測與乳腺癌侵襲相關(guān)蛋白的表達水平，結(jié)果如圖3所示。與對照組相比，三七根及花總皂苷處理組中上皮標志物E-cadherin蛋白表達顯著上調(diào)，其相對表達量在對照組中為0.56±0.05，在處理組中升高至1.23±0.12，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。E-cadherin是維持上皮細胞極性和細胞間緊密連接的重要蛋白，其表達上調(diào)能夠增強細胞間的粘附力，抑制癌細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，從而降低癌細胞的遷移和侵襲能力。間質(zhì)標志物N-cadherin和Vimentin蛋白表達則顯著下調(diào)。N-cadherin蛋白相對表達量在對照組中為1.00±0.08，處理組中降至0.35±0.04，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；Vimentin蛋白相對表達量在對照組中為1.05±0.09，處理組中降至0.42±0.05，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。N-cadherin和Vimentin是間質(zhì)細胞的標志性蛋白，其表達下調(diào)表明三七根及花總皂苷能夠抑制乳腺癌細胞的EMT過程，使癌細胞保持上皮細胞的特性，減少其侵襲和轉(zhuǎn)移能力。與EMT過程密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Snail和Slug蛋白表達也明顯降低。Snail蛋白相對表達量在對照組中為1.00±0.07，處理組中降至0.28±0.03，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；Slug蛋白相對表達量在對照組中為1.02±0.08，處理組中降至0.32±0.04，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。Snail和Slug是調(diào)控EMT過程的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它們能夠結(jié)合到E-cadherin基因啟動子區(qū)域，抑制E-cadherin的表達，促進EMT過程。三七根及花總皂苷下調(diào)Snail和Slug蛋白表達，可能通過解除對E-cadherin基因的抑制，從而抑制乳腺癌細胞的EMT和侵襲。檢測PI3K/AKT和Ras/Raf/MEK/ERK信號通路相關(guān)蛋白的表達，發(fā)現(xiàn)三七根及花總皂苷處理組中p-AKT（磷酸化AKT）和p-ERK（磷酸化ERK）蛋白表達顯著降低。p-AKT蛋白相對表達量在對照組中為1.00±0.06，處理組中降至0.30±0.03，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；p-ERK蛋白相對表達量在對照組中為1.00±0.07，處理組中降至0.35±0.04，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。而總AKT和總ERK蛋白表達水平在兩組之間無明顯變化。PI3K/AKT和Ras/Raf/MEK/ERK信號通路在乳腺癌細胞的增殖、存活、遷移和侵襲過程中發(fā)揮重要作用，p-AKT和p-ERK蛋白表達降低表明三七根及花總皂苷能夠抑制這兩條信號通路的活性，從而阻斷相關(guān)信號傳導，抑制乳腺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。上述實驗結(jié)果表明，三七根及花總皂苷能夠通過調(diào)節(jié)與乳腺癌侵襲相關(guān)的基因和蛋白表達，抑制癌細胞的EMT過程，阻斷PI3K/AKT和Ras/Raf/MEK/ERK等信號通路，從而發(fā)揮抗乳腺癌侵襲的作用。五、結(jié)果討論5.1三七根及花總皂苷抑制乳腺癌細胞侵襲的作用分析本實驗結(jié)果清晰地表明，三七根及花總皂苷對乳腺癌細胞MDA-MB-231的侵襲能力具有顯著的抑制作用。在Transwell侵襲實驗中，與對照組相比，各濃度的三七根及花總皂苷處理組穿過Matrigel基質(zhì)膠和膜的細胞數(shù)量均明顯減少，且抑制作用呈現(xiàn)出顯著的濃度依賴性。當三七根及花總皂苷濃度為12.5μg/ml時，侵襲抑制率為（25.68±3.56）%；隨著濃度升高至25μg/ml，侵襲抑制率達到（47.00±4.32）%；濃度為50μg/ml時，侵襲抑制率進一步上升至（68.37±4.89）%；而在濃度為100μg/ml時，侵襲抑制率高達（88.56±5.89）%。這一結(jié)果充分顯示，三七根及花總皂苷能夠有效地阻礙乳腺癌細胞的侵襲過程，且隨著藥物濃度的增加，其抑制效果愈發(fā)顯著。與以往相關(guān)研究結(jié)果相比，本研究中三七根及花總皂苷對乳腺癌細胞侵襲的抑制效果具有一定的獨特性和優(yōu)勢。廖文琴等人的研究發(fā)現(xiàn)，三七花總皂苷在濃度為10、50、100μg/ml時均表現(xiàn)出侵襲抑制作用，濃度為50μg/ml時侵襲抑制效果最佳，達到32.0%。而在本研究中，當三七根及花總皂苷濃度為50μg/ml時，侵襲抑制率達到了（68.37±4.89）%，明顯高于上述研究中三七花總皂苷在相同濃度下的抑制效果。這種差異可能是由于研究中所使用的細胞株、藥物提取方法和純度以及實驗條件等因素的不同所導致的。本研究采用超臨界流體萃取法提取三七根及花總皂苷，能夠有效確?？傇碥盏幕钚院图兌?，可能使得其抗乳腺癌侵襲的效果更為顯著。不同細胞株的生物學特性和對藥物的敏感性也存在差異，這也可能對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響。三七根及花總皂苷抑制乳腺癌細胞侵襲的可能作用方式主要涉及多個層面。從細胞層面來看，三七根及花總皂苷可能通過影響乳腺癌細胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，改變細胞的運動能力和粘附特性，從而抑制其侵襲能力。有研究表明，三七根及花總皂苷中的某些成分能夠調(diào)節(jié)細胞骨架的重組，使癌細胞的形態(tài)更加趨于上皮細胞，減少其遷移和侵襲能力。從分子層面分析，三七根及花總皂苷可能通過調(diào)節(jié)與乳腺癌侵襲相關(guān)的基因和蛋白表達，抑制癌細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，阻斷相關(guān)信號通路，進而發(fā)揮抗侵襲作用。本研究中PCR芯片檢測和蛋白質(zhì)免疫印跡實驗結(jié)果顯示，三七根及花總皂苷處理組中與乳腺癌侵襲相關(guān)的基因和蛋白表達發(fā)生了顯著變化，如ITGB1、CXCR4、MMP2等基因表達下調(diào)，E-cadherin蛋白表達上調(diào)，N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug等蛋白表達下調(diào)，p-AKT和p-ERK蛋白表達降低等。這些變化表明，三七根及花總皂苷能夠通過多種分子機制協(xié)同作用，抑制乳腺癌細胞的侵襲。5.2作用機制探討從分子層面來看，三七根及花總皂苷對乳腺癌細胞中與侵襲相關(guān)的基因表達產(chǎn)生了顯著的調(diào)控作用。PCR芯片檢測結(jié)果顯示，三七根及花總皂苷處理組中，ITGB1、CXCR4、MMP2等多個與乳腺癌侵襲密切相關(guān)的基因表達明顯下調(diào)。ITGB1作為細胞粘附分子，其表達下調(diào)會削弱癌細胞與細胞外基質(zhì)的粘附能力，使癌細胞難以在周圍組織中錨定和遷移，從而抑制了侵襲過程。CXCR4基因表達的降低，阻斷了CXCR4/CXCL12信號軸，減少了癌細胞對趨化因子的響應，降低了其定向遷移的能力。MMP2基因表達下調(diào)，導致其編碼的基質(zhì)金屬蛋白酶2含量減少，進而抑制了細胞外基質(zhì)的降解，使癌細胞難以突破周圍的基質(zhì)屏障進行侵襲。這些基因表達的變化，共同作用于乳腺癌細胞的侵襲過程，從分子水平上揭示了三七根及花總皂苷抑制乳腺癌侵襲的機制。在蛋白質(zhì)水平上，三七根及花總皂苷同樣對乳腺癌侵襲相關(guān)蛋白的表達產(chǎn)生重要影響。蛋白質(zhì)免疫印跡實驗結(jié)果表明，三七根及花總皂苷處理組中，上皮標志物E-cadherin蛋白表達顯著上調(diào)，而間質(zhì)標志物N-cadherin和Vimentin蛋白表達顯著下調(diào)。E-cadherin是維持上皮細胞極性和細胞間緊密連接的關(guān)鍵蛋白，其表達上調(diào)能夠增強細胞間的粘附力，抑制癌細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程。在正常上皮細胞中，E-cadherin通過與相鄰細胞表面的E-cadherin分子相互作用，形成緊密的細胞間連接，維持組織的正常結(jié)構(gòu)和功能。而在乳腺癌細胞發(fā)生EMT時，E-cadherin表達下降，細胞間連接減弱，細胞獲得間質(zhì)細胞的特性，侵襲和遷移能力增強。三七根及花總皂苷上調(diào)E-cadherin蛋白表達，能夠使癌細胞保持上皮細胞的特性，抑制其向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化，從而降低侵襲能力。N-cadherin和Vimentin是間質(zhì)細胞的標志性蛋白，它們在乳腺癌細胞中的高表達與EMT過程密切相關(guān)。N-cadherin能夠促進癌細胞與周圍間質(zhì)細胞和細胞外基質(zhì)的粘附，增強癌細胞的遷移和侵襲能力。Vimentin則參與細胞骨架的構(gòu)建和重組，賦予細胞更強的運動能力。三七根及花總皂苷下調(diào)N-cadherin和Vimentin蛋白表達，進一步證實了其對乳腺癌細胞EMT過程的抑制作用。與EMT過程密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Snail和Slug蛋白表達也明顯降低。Snail和Slug是調(diào)控EMT過程的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它們能夠結(jié)合到E-cadherin基因啟動子區(qū)域，抑制E-cadherin的表達，從而促進EMT過程。在乳腺癌細胞中，Snail和Slug的高表達會導致E-cadherin表達下降，細胞發(fā)生EMT，侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強。三七根及花總皂苷下調(diào)Snail和Slug蛋白表達，可能通過解除對E-cadherin基因的抑制，上調(diào)E-cadherin蛋白表達，進而抑制乳腺癌細胞的EMT和侵襲。從信號通路角度分析，三七根及花總皂苷能夠抑制PI3K/AKT和Ras/Raf/MEK/ERK信號通路的活性。PI3K/AKT信號通路在細胞的增殖、存活、遷移和侵襲等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在乳腺癌細胞中，PI3K的激活會導致AKT的磷酸化，進而激活下游一系列靶蛋白，如mTOR、GSK-3β等，這些靶蛋白參與調(diào)節(jié)細胞的代謝、增殖和遷移，促進乳腺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。三七根及花總皂苷處理組中，p-AKT蛋白表達顯著降低，表明該信號通路的活性受到抑制，從而阻斷了相關(guān)信號傳導，抑制了乳腺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。Ras/Raf/MEK/ERK信號通路同樣在乳腺癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移中扮演重要角色。Ras蛋白是一種小GTP酶，當受到上游信號激活后，Ras會結(jié)合GTP并激活下游的Raf蛋白，Raf再依次激活MEK和ERK，ERK進入細胞核后，調(diào)節(jié)一系列與細胞增殖、分化和遷移相關(guān)基因的表達，從而促進乳腺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究中，三七根及花總皂苷處理組中p-ERK蛋白表達顯著降低，說明該信號通路的活性受到抑制，進而影響了相關(guān)基因的表達，抑制了乳腺癌細胞的侵襲。綜上所述，三七根及花總皂苷抗乳腺癌侵襲的作用機制是一個復雜的網(wǎng)絡(luò)，通過調(diào)節(jié)與乳腺癌侵襲相關(guān)的基因和蛋白表達，抑制癌細胞的EMT過程，阻斷PI3K/AKT和Ras/Raf/MEK/ERK等關(guān)鍵信號通路，從而發(fā)揮抗乳腺癌侵襲的作用。5.3與現(xiàn)有治療方法的比較與優(yōu)勢當前，臨床上針對乳腺癌的治療方法眾多，手術(shù)切除作為乳腺癌的主要治療手段之一，適用于早期乳腺癌患者，通過直接切除腫瘤組織，能夠有效去除局部病灶。然而，手術(shù)無法解決癌細胞已經(jīng)發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的問題，對于一些晚期乳腺癌患者，手術(shù)的治療效果有限，且手術(shù)過程可能會對患者的身體造成較大創(chuàng)傷，術(shù)后還可能出現(xiàn)感染、出血、淋巴水腫等并發(fā)癥?；熓抢没瘜W藥物殺死癌細胞的治療方法，它能夠通過血液循環(huán)到達全身各處，對全身的癌細胞起到殺傷作用，對于預防和治療乳腺癌的復發(fā)和轉(zhuǎn)移具有一定效果。但化療藥物缺乏特異性，在殺傷癌細胞的同時，也會對正常細胞造成損害，引發(fā)一系列嚴重的不良反應，如脫發(fā)、惡心、嘔吐、骨髓抑制、免疫力下降等，這些不良反應不僅會降低患者的生活質(zhì)量，還可能導致患者無法耐受化療，從而中斷治療。放療是利用高能射線對腫瘤部位進行照射，以殺死癌細胞。放療在乳腺癌的綜合治療中發(fā)揮著重要作用，能夠降低局部復發(fā)率。然而，放療同樣會對周圍正常組織產(chǎn)生輻射損傷，導致皮膚損傷、放射性肺炎、心臟損傷等并發(fā)癥，且放療的適用范圍受到腫瘤部位、大小等因素的限制。內(nèi)分泌治療主要適用于激素受體陽性的乳腺癌患者，通過調(diào)節(jié)體內(nèi)激素水平，抑制癌細胞的生長。但內(nèi)分泌治療存在耐藥性問題，隨著治療時間的延長，癌細胞可能會對內(nèi)分泌治療藥物產(chǎn)生耐藥，導致治療效果下降，且內(nèi)分泌治療僅對特定類型的乳腺癌患者有效，適用范圍相對較窄。靶向治療是針對腫瘤細胞中的特定分子靶點進行治療，具有較高的特異性，能夠更精準地殺傷癌細胞，減少對正常細胞的損傷。然而，靶向治療藥物價格昂貴，給患者和家庭帶來沉重的經(jīng)濟負擔，且并非所有乳腺癌患者都能找到合適的靶向治療靶點，適用人群有限。相比之下，三七根及花總皂苷作為一種天然的植物提取物，具有多方面的潛在優(yōu)勢。在安全性方面，其不良反應相對較少。傳統(tǒng)的化療藥物和放療手段在治療過程中往往會給患者帶來諸多痛苦和不良反應，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。而三七根及花總皂苷是從天然植物中提取，成分相對溫和，對正常細胞的損傷較小，能夠在一定程度上避免或減輕傳統(tǒng)治療方法帶來的不良反應，提高患者的生活質(zhì)量。從作用機制角度分析，三七根及花總皂苷具有多靶點作用的特點。乳腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移涉及多個復雜的分子過程和信號通路，單一靶點的治療方法往往難以取得理想的治療效果。三七根及花總皂苷能夠通過調(diào)節(jié)與乳腺癌侵襲相關(guān)的多個基因和蛋白表達，抑制癌細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，阻斷PI3K/AKT和Ras/Raf/MEK/ERK等多條關(guān)鍵信號通路，從多個層面協(xié)同作用，抑制乳腺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。這種多靶點的作用方式使其在治療乳腺癌時具有更全面的效果，能夠更有效地抑制腫瘤的發(fā)展。在成本效益方面，三七根及花總皂苷也具有一定的優(yōu)勢。三七作為一種常見的中藥材，資源相對豐富，其提取和制備成本相對較低。與價格昂貴的靶向治療藥物相比，三七根及花總皂苷在治療乳腺癌時，能夠為患者提供一種經(jīng)濟實惠的治療選擇，減輕患者的經(jīng)濟負擔，具有較高的成本效益比。綜上所述，三七根及花總皂苷在抗乳腺癌侵襲方面具有獨特的優(yōu)勢，有望成為一種潛在的乳腺癌治療藥物或輔助治療手段，為乳腺癌患者提供新的治療選擇，具有廣闊的應用前景。5.4研究的局限性與展望本研究在探究三七根及花總皂苷抗乳腺癌侵襲的作用機制方面取得了一定成果，但仍存在一些局限性。在實驗設(shè)計方面，本研究主要采用了體外細胞實驗，雖然細胞實驗能夠在一定程度上模擬體內(nèi)環(huán)境，揭示藥物對細胞的直接作用機制，但與體內(nèi)復雜的生理病理環(huán)境仍存在差異。體內(nèi)環(huán)境中，藥物的代謝、分布以及與機體免疫系統(tǒng)的相互作用等因素都會對藥物的療效產(chǎn)生影響，而這些因素在體外細胞實驗中難以完全體現(xiàn)。從樣本數(shù)量來看，本研究在細胞實驗中，每個實驗組的樣本數(shù)量相對有限，這可能會影響實驗結(jié)果的可靠性和普遍性。在后續(xù)研究中，需要進一步擴大樣本數(shù)量，進行多批次重復實驗，以提高實驗結(jié)果的準確性和可信度。本研究僅選用了MDA-MB-231這一種乳腺癌細胞株進行研究，然而不同乳腺癌細胞株具有不同的生物學特性和分子特征，對藥物的敏感性也可能存在差異。因此，未來研究應選取多種乳腺癌細胞株進行實驗，全面評估三七根及花總皂苷對不同類型乳腺癌細胞的作用效果。展望未來，首先應開展體內(nèi)動物實驗，建立乳腺癌動物模型，進一步驗證三七根及花總皂苷在體內(nèi)的抗乳腺癌侵襲作用，深入研究其在體內(nèi)的藥代動力學和藥效學特性，為臨床應用提供更有力的實驗依據(jù)。應加大樣本量，涵蓋不同類型的乳腺癌患者樣本，進行更深入的臨床前研究，評估其安全性和有效性，為后續(xù)臨床試驗的開展奠定基礎(chǔ)。還需進一步深入探究三七根及花總皂苷抗乳腺癌侵襲的分子機制，除了本研究中涉及的基因、蛋白和信號通路外，還可能存在其他尚未被發(fā)現(xiàn)的作用靶點和機制。利用蛋白質(zhì)組學、代謝組學等多組學技術(shù)，全面系統(tǒng)地分析三七根及花總皂苷作用后乳腺癌細胞的分子變化，挖掘潛在的作用靶點和信號通路，為深入理解其抗乳腺癌侵襲的機制提供更全面的視角。結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學技術(shù)，開展聯(lián)合用藥研究，將三七根及花總皂苷與現(xiàn)有的乳腺癌治療方法，如化療、放療、靶向治療等相結(jié)合，探究聯(lián)合治療方案的協(xié)同增效作用，優(yōu)化治療策略，為乳腺癌患者提供更有效的綜合治療方案。六、結(jié)論6.1研究成果總結(jié)本研究通過一系列實驗，深入探究了三七根及花總皂苷抗乳腺癌侵襲的作用及機制，取得了如下重要成果：三七根及花總皂苷對乳腺癌細胞的生長和增殖具有顯著的抑制作用，且抑制效果呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性。在細胞增殖實驗中，隨著三七根及花總皂苷濃度的增加，乳腺癌細胞MDA-MB-231的增殖抑制率逐漸升高，當濃度達到100μg/ml時，抑制率高達（62.34±4.21）%。三七根及花總皂苷能夠顯著抑制乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力，且同樣表現(xiàn)出濃度依賴的特性。在Transwell遷移和侵襲實驗中，各濃度的三七根及花總皂苷處理組細胞遷移和侵襲能力均受到明顯抑制，隨著藥物濃度的升高，穿過膜的細胞數(shù)量逐漸減少，遷移和侵襲抑制率不斷提高。從分子機制層面來看，三七根及花總皂苷通過調(diào)節(jié)與乳腺癌侵襲相關(guān)的基因和蛋白表達，抑制癌細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，阻斷PI3K/AKT和Ras/Raf/MEK/ERK等關(guān)鍵信號通路，從而發(fā)揮抗乳腺癌侵襲的作用。PCR芯片檢測發(fā)現(xiàn)，三七根及花總皂苷處理組中ITGB1、CXCR4、MMP2等與乳腺癌侵襲相關(guān)的基因表達顯著下調(diào)；蛋白質(zhì)免疫印跡實驗表明，上皮標志物E-cadherin蛋白表達上調(diào)，間質(zhì)標志物N-cadherin和Vimentin蛋白表達下調(diào)，與EMT過程密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子Snail和Slug蛋白表達降低，PI3K/AKT和Ras/Raf/MEK/ERK信號通路相關(guān)的p-AKT和p-ERK蛋白表達顯著降低。6.2研究的應用價值與意義本研究成果在乳腺癌治療領(lǐng)域具有顯著的潛在應用價值。從臨床治療角度來看，三七根及花總皂苷為乳腺癌治療提供了新的治療策略和潛在藥物選擇。目前，乳腺癌的治療面臨著諸多挑戰(zhàn)，如傳統(tǒng)治療方法的不良反應、耐藥性等問題。而三七根及花總皂苷具有抑制乳腺癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用，且不良反應相對較少，有望成為一種新型的抗乳腺癌藥物或輔助治療藥物。在未來的臨床應用中，可將三七根及花總皂苷與現(xiàn)有的治療方法相結(jié)合，如與化療藥物聯(lián)合使用，可能增強化療藥物的療效，同時減輕化療藥物的不良反應，提高患者的治療效果和生活質(zhì)量。對于一些無法耐受傳統(tǒng)治療方法的患者，三七根及花總皂苷可能成為一種有效的替代治療選擇，為他們提供新的治療希望。從藥物研發(fā)角度而言，本研究為開發(fā)新型抗乳腺癌藥物奠定了堅實的基礎(chǔ)。通過深入探究三七根及花總皂苷抗乳腺癌侵襲的作用機制，明確了其作用的關(guān)鍵靶點和信號通路，為后續(xù)的藥物研發(fā)提供了明確的方向?？蒲腥藛T可以基于這些研究結(jié)果，進一步優(yōu)化藥物結(jié)構(gòu)，提高藥物的活性和選擇性，開發(fā)出更加高效、低毒的抗乳腺癌藥物。以三七根及花總皂苷為先導化合物，通過化學修飾等手段，研發(fā)出具有更好藥理活性和藥代動力學特性的新型藥物，有望在乳腺癌治療中發(fā)揮更大的作用。本研究對中藥抗癌研究的推動作用也不容小覷。在傳統(tǒng)中藥領(lǐng)域，三七作為一種重要的中藥材，具有悠久的應用歷史，但對于其在抗癌方面的作用機制研究相對有限。本研究深入揭示了三七根及花總皂苷抗乳腺癌侵襲的作用機制，為進一步挖掘三七的抗癌潛力提供了有力的理論支持。這不僅有助于豐富中藥抗癌的理論體系，還能夠拓展中藥在腫瘤治療領(lǐng)域的應用范圍。為其他中藥抗癌研究提供了有益的借鑒和參考，激發(fā)科研人員對更多中藥抗癌成分和機制的探索，推動中藥抗癌研究的深入發(fā)展。通過本研究，可以鼓勵更多的科研人員關(guān)注中藥在抗癌領(lǐng)域的應用，采用現(xiàn)代科學技術(shù)和方法，深入研究中藥的抗癌作用機制，開發(fā)出更多有效的中藥抗癌藥物，為腫瘤患者提供更多的治療選擇。七、參考文獻[1]SungH,FerlayJ,SiegelRL,etal.Globalcancerstatistics2020:GLOBOCANestimatesofincidenceandmortalityworldwidefor36cancersin185countries[J].CA:acancerjournalforclinicians,2021,71(3):209-249.[2]陳萬青，徐婷婷，曾紅梅，等.2022年中國惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析[J].中華腫瘤雜志，2023,45(6):619-629.[3]廖文琴，可燕，蔣嘉燁，等。三七花總皂苷抑制人乳腺癌細胞侵襲的體外研究[J].上海中醫(yī)藥大學學報，2010,24(5):77-81.[4]LuoS,ZhangL,ChenX,etal.TotalsaponinsfromtherootsofPanaxnotoginsengexertanti-breastcancercellactivityviaactivationofAMP-activatedproteinkinasesignalingpathways[J].Molecularmedicinereports,2014,9(2):437-441.[5]QiZ,WangH,WangJ,etal.AntitumorefficacyofRadixNotoginsengsaponinsagainsthumanbreastcancercells[J].Oncologyletters,2016,11(5):3841-3847.[6]LijuanS,HuijuanX,JiajiaC,etal.PreventiveandtherapeuticeffectsoftotalflavonoidsfromEpimediumintheMCF-7humanbreastcancercelllinemodelofbonemetastasis[J].Molecularmedicinereports,2016,13(6):5327-5335.[2]陳萬青，徐婷婷，曾紅梅，等.202