S100A2與FAM3B基因：解鎖胃癌發(fā)病機(jī)制的新密碼一、引言1.1研究背景與意義胃癌是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中占據(jù)著極高的病死率地位。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，全球每年新發(fā)胃癌病例約95萬，死亡患者近70萬，而我國每年新發(fā)胃癌人數(shù)約為42.4萬，死亡人數(shù)近30萬，發(fā)病和死亡人數(shù)約占全球的二分之一。胃癌的高病死率不僅給患者及其家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)，也對社會醫(yī)療資源造成了極大的壓力。當(dāng)前，胃癌的治療主要依賴手術(shù)及化療等綜合手段，但整體療效仍不盡人意。早期胃癌患者若能及時接受手術(shù)切除，5年生存率可超過90%，然而早期胃癌癥狀隱匿，缺乏特異性表現(xiàn)，多數(shù)患者確診時已處于中晚期。中晚期胃癌患者即使接受了手術(shù)、化療、放療等綜合治療，5年生存率仍不足30%。對于發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的晚期胃癌患者，病情進(jìn)展迅速，預(yù)后極差，平均生存期往往不足一年。這主要是因為胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個多步驟、多因素參與的復(fù)雜過程，涉及眾多基因和蛋白等分子之間錯綜復(fù)雜的相互作用，我們對胃癌的發(fā)病機(jī)制，尤其是癌細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移以及逃避機(jī)體免疫監(jiān)視等關(guān)鍵環(huán)節(jié)的認(rèn)識仍存在諸多不足，這使得在尋找有效的腫瘤標(biāo)志物和開發(fā)精準(zhǔn)的基因治療方法方面面臨巨大挑戰(zhàn)。在探索胃癌發(fā)病機(jī)制的征程中，基因?qū)用娴难芯恐饾u成為焦點。我室前期研究敏銳地捕捉到S100A2與FAM3B基因在胃癌組織與癌旁正常組織之間存在顯著的表達(dá)差異，這一發(fā)現(xiàn)猶如在黑暗中點亮了一盞明燈，為深入探究胃癌發(fā)病機(jī)制提供了全新的方向。S100A2基因作為S100蛋白家族的重要成員，定位于人染色體1q21，編碼由97個氨基酸組成的鈣結(jié)合蛋白。大量研究表明，S100A2在胃癌組織中的表達(dá)顯著低于正常胃黏膜組織，其表達(dá)缺失與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，且與腫瘤的大小、浸潤深度、淋巴管和靜脈浸潤以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等侵襲性行為呈負(fù)相關(guān)，在胃癌的TNM分期中，分期越晚，S100A2表達(dá)水平越低。FAM3B基因作為細(xì)胞因子樣基因家族3的成員，也被發(fā)現(xiàn)其表達(dá)異常與多種腫瘤相關(guān)。在胃癌研究領(lǐng)域，雖然目前對FAM3B基因的研究相對較少，但已有研究暗示其在胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為中可能扮演著重要角色，如影響胃癌細(xì)胞的增殖、凋亡等過程。深入研究S100A2與FAM3B基因在胃癌發(fā)病中的功能，具有極其重要的科學(xué)意義和臨床價值。從科學(xué)意義角度來看，有助于我們從基因分子層面深入剖析胃癌發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在機(jī)制，揭示這兩個基因在復(fù)雜的細(xì)胞信號網(wǎng)絡(luò)中的作用節(jié)點和調(diào)控路徑，進(jìn)一步完善我們對胃癌發(fā)病機(jī)制的認(rèn)知體系，為腫瘤生物學(xué)理論發(fā)展提供新的依據(jù)。從臨床價值層面而言，一方面，有望將這兩個基因或其相關(guān)的信號通路作為新型的腫瘤標(biāo)志物，用于胃癌的早期診斷和病情監(jiān)測，提高早期胃癌的檢出率，為患者贏得寶貴的治療時機(jī)；另一方面，通過對基因功能的深入理解，以這兩個基因為靶點開發(fā)精準(zhǔn)的基因治療策略或新型藥物，為胃癌患者提供更加有效、個性化的治療方案，從而顯著提高胃癌患者的生存率和生活質(zhì)量，打破當(dāng)前胃癌治療的困境，具有重大的現(xiàn)實意義。1.2研究目的與方法本研究旨在深入探究S100A2與FAM3B基因在胃癌發(fā)病進(jìn)程中的功能及潛在作用機(jī)制，具體研究目的如下：其一，精確檢測S100A2與FAM3B基因在胃正常上皮細(xì)胞系以及不同胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平，明確其表達(dá)差異，為后續(xù)深入研究提供關(guān)鍵的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)；其二，從胃癌癌旁正常組織中成功獲取S100A2與FAM3B全長基因，并構(gòu)建有效的真核表達(dá)載體，借助先進(jìn)的轉(zhuǎn)染技術(shù)導(dǎo)入胃癌細(xì)胞，全面觀察目的基因在細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞分布情況，深入了解其在細(xì)胞內(nèi)的定位及可能的作用位點；其三，通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)染技術(shù)獲得穩(wěn)定表達(dá)目的基因的細(xì)胞株，系統(tǒng)分析轉(zhuǎn)染后細(xì)胞在形態(tài)、增殖速率、運動能力、細(xì)胞周期以及凋亡等生物學(xué)行為方面的變化，進(jìn)而揭示S100A2與FAM3B基因在胃癌發(fā)病中的具體細(xì)胞生物學(xué)功能。為達(dá)成上述研究目的，本研究將綜合運用多種先進(jìn)的分子生物學(xué)實驗方法。在基因與蛋白表達(dá)檢測方面，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）技術(shù)，通過對細(xì)胞內(nèi)總RNA的逆轉(zhuǎn)錄及后續(xù)的PCR擴(kuò)增，精準(zhǔn)檢測S100A2與FAM3B基因在mRNA水平的表達(dá)豐度；運用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，利用特異性抗體與目的蛋白的高度特異性結(jié)合，從蛋白層面分析基因的表達(dá)情況；借助細(xì)胞免疫化學(xué)技術(shù)，以可視化的方式呈現(xiàn)目的蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位與分布，進(jìn)一步明確其在細(xì)胞內(nèi)的存在位置及可能的作用區(qū)域。在基因載體構(gòu)建與細(xì)胞轉(zhuǎn)染過程中，運用RT-PCR技術(shù)從胃癌癌旁正常組織中擴(kuò)增出S100A2與FAM3B全長基因，將其巧妙克隆至真核表達(dá)載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒。通過高效的轉(zhuǎn)染試劑或電穿孔等技術(shù)，將重組質(zhì)粒成功導(dǎo)入胃癌細(xì)胞系，實現(xiàn)目的基因在胃癌細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定表達(dá)。利用激光共聚焦顯微鏡這一高端儀器，清晰觀察S100A2、FAM3B與增強型綠色熒光蛋白（EGFP）融合蛋白在胃癌細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞分布，為深入理解基因功能提供直觀的細(xì)胞層面證據(jù)。在細(xì)胞功能分析階段，對轉(zhuǎn)染目的基因的胃癌細(xì)胞，運用G418進(jìn)行嚴(yán)格篩選，成功獲取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。通過蘇木精-伊紅（HE）染色技術(shù)，直觀觀察細(xì)胞形態(tài)的變化；采用MTT比色法，精確測定細(xì)胞的增殖活力，了解目的基因?qū)?xì)胞增殖速率的影響；借助穿膜實驗，包括Transwell小室實驗等，評估細(xì)胞的運動能力和侵襲能力，明確目的基因在細(xì)胞遷移和侵襲過程中的作用；運用流式細(xì)胞術(shù)，深入分析細(xì)胞周期分布的變化，探究目的基因?qū)?xì)胞周期進(jìn)程的調(diào)控機(jī)制；通過檢測CleavedPARP等凋亡相關(guān)指標(biāo)，準(zhǔn)確判斷細(xì)胞凋亡情況，全面揭示目的基因在細(xì)胞凋亡調(diào)控中的功能。二、S100A2與FAM3B基因生物學(xué)特性2.1S100A2基因結(jié)構(gòu)與功能S100A2基因于1991年由Lee等科學(xué)家運用抑制性消減雜交技術(shù)，從正常上皮細(xì)胞和腫瘤上皮細(xì)胞系中成功篩選并克隆得出，其在人類遺傳學(xué)圖譜中占據(jù)著獨特的位置，定位于人染色體1q21。該基因的全長為8670bp，在這一長度的基因序列中，蘊含著編碼特定蛋白質(zhì)的遺傳信息。S100A2基因所編碼的蛋白質(zhì)是一種鈣結(jié)合蛋白，屬于S100蛋白家族中極為重要的一員。從氨基酸組成來看，它由97個氨基酸巧妙排列組合而成，這些氨基酸通過肽鍵相互連接，形成了具有特定空間結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)分子。在S100蛋白家族里，眾多成員如S100A2、S100A3、S100A4和S100A6等都與腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在緊密聯(lián)系。其中，S100A2展現(xiàn)出獨一無二的特性，它是家族中唯一一個與腫瘤生成呈負(fù)相關(guān)的蛋白質(zhì)，這意味著在正常生理狀態(tài)下的組織中，S100A2的表達(dá)水平相對較高，而當(dāng)組織發(fā)生癌變，轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤組織時，S100A2的表達(dá)會顯著降低。多項研究采用免疫組織化學(xué)等先進(jìn)技術(shù)手段，對不同組織樣本進(jìn)行檢測分析，均明確證實了S100A2在胃癌組織中的表達(dá)顯著低于正常胃黏膜組織。進(jìn)一步深入研究發(fā)現(xiàn)，隨著胃癌分化程度的降低，S100A2的表達(dá)水平呈現(xiàn)出進(jìn)一步下降的趨勢。在高分化胃癌組織中，S100A2的陽性表達(dá)率顯著高于中分化和低分化胃癌組織。這一現(xiàn)象強烈提示，S100A2表達(dá)缺失很可能在胃癌的起始發(fā)生以及后續(xù)的發(fā)展進(jìn)程中扮演著關(guān)鍵角色，其表達(dá)水平或許能夠作為評估胃癌惡性程度的一項重要且可靠的指標(biāo)。不僅如此，S100A2的表達(dá)還與胃癌的多個臨床病理特征密切相關(guān)。研究表明，它與腫瘤的大小、浸潤深度、淋巴管和靜脈浸潤以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等侵襲性行為呈負(fù)相關(guān)，即S100A2表達(dá)水平越低，胃癌的侵襲性和轉(zhuǎn)移能力越強，患者的預(yù)后也就越差。同時，S100A2的表達(dá)與胃癌的TNM分期也呈負(fù)相關(guān)，分期越晚，其表達(dá)水平越低。此外，年齡因素也與S100A2表達(dá)存在關(guān)聯(lián)，年輕患者中S100A2表達(dá)缺失更為常見。從功能角度深入探究，S100A2參與了多種復(fù)雜且關(guān)鍵的生物學(xué)過程。在細(xì)胞增殖和凋亡調(diào)控方面，它發(fā)揮著重要作用，可能通過與細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的相互作用，精準(zhǔn)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的進(jìn)程，影響細(xì)胞的增殖速率；同時，在細(xì)胞凋亡過程中，S100A2也參與其中，對細(xì)胞的生死抉擇起到調(diào)控作用。在細(xì)胞遷移過程中，S100A2同樣扮演著不可或缺的角色，它能夠影響腫瘤細(xì)胞的侵襲性，當(dāng)S100A2表達(dá)異常時，腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力可能會發(fā)生顯著改變，進(jìn)而影響腫瘤的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。在炎癥反應(yīng)中，S100A2也積極參與，通過調(diào)節(jié)炎癥因子的表達(dá)，對免疫反應(yīng)產(chǎn)生影響，在維持機(jī)體免疫平衡以及應(yīng)對炎癥相關(guān)疾病中發(fā)揮作用。2.2FAM3B基因結(jié)構(gòu)與功能FAM3B基因，又稱PANDER（Pancreatic-DerivedFactor，胰腺衍生因子），在人類基因組中占據(jù)著獨特的位置，定位于21q22.3區(qū)。該基因全長1384bp，蘊含著編碼特定蛋白質(zhì)的遺傳信息，其編碼的蛋白質(zhì)是一種功能多樣的細(xì)胞因子，由235個氨基酸組成。FAM3B基因?qū)儆诩?xì)胞因子樣基因家族3（FAM3）的成員，該家族共有4個成員，分別為FAM3A、FAM3B、FAM3C和FAM3D。這些成員在二級結(jié)構(gòu)上都具有保守的α-4螺旋索結(jié)構(gòu)，展現(xiàn)出典型的細(xì)胞因子特征，然而它們在功能上既有相似之處，也存在差異，各自在不同的生理和病理過程中發(fā)揮著獨特的作用。FAM3B在人體多個生理過程中扮演著關(guān)鍵角色。在糖脂代謝領(lǐng)域，F(xiàn)AM3B發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，對維持機(jī)體正常的能量代謝平衡至關(guān)重要。研究表明，F(xiàn)AM3B可以通過激活Caspase-3基因并且下調(diào)CDKN1A基因通路，精準(zhǔn)調(diào)節(jié)胰島細(xì)胞凋亡，從而影響胰島素的分泌，進(jìn)一步對血糖水平的穩(wěn)定產(chǎn)生影響。同時，F(xiàn)AM3B在肝臟糖脂代謝過程中也發(fā)揮著作用，它能夠調(diào)節(jié)肝臟中脂肪的合成、轉(zhuǎn)運和分解，對血脂水平的維持具有重要意義。一旦FAM3B在糖脂代謝過程中的功能失調(diào)，就可能導(dǎo)致代謝紊亂，進(jìn)而引發(fā)2型糖尿病等代謝性疾病。大量臨床研究數(shù)據(jù)顯示，在2型糖尿病患者體內(nèi)，F(xiàn)AM3B的表達(dá)水平常常出現(xiàn)異常，這表明FAM3B與2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，或許可以作為2型糖尿病診斷和治療的潛在靶點。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中，F(xiàn)AM3B同樣參與其中，其表達(dá)異常與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展緊密相連。在胃癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、前列腺癌以及食道癌等多種癌癥中，都發(fā)現(xiàn)了FAM3B的異常表達(dá)情況。在食道癌組織中，F(xiàn)AM3B的表達(dá)顯著高于鄰近的正常組織，且其表達(dá)與T/TNM分期顯著相關(guān)。通過對大量食道癌患者的臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用Kaplan–Meier分析方法發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM3B高表達(dá)水平往往預(yù)示著患者預(yù)后不良。進(jìn)一步的細(xì)胞實驗和動物實驗表明，F(xiàn)AM3B的過表達(dá)能夠抑制食道癌細(xì)胞的死亡，促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵襲，在異種移植裸鼠模型中，還能顯著增加食道腫瘤的生長。深入研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM3B主要通過調(diào)節(jié)AKT–MDM2–p53信號軸和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，來影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。在胃癌研究中，雖然目前對FAM3B的具體作用機(jī)制尚未完全明確，但已有研究暗示其在胃癌細(xì)胞的增殖、凋亡等過程中發(fā)揮著重要作用，可能通過與其他基因或信號通路相互作用，影響胃癌細(xì)胞的生物學(xué)特性。在對不同細(xì)胞系的研究中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM3B的表達(dá)存在差異。運用細(xì)胞免疫化學(xué)技術(shù)對胃正常上皮細(xì)胞系GES-1與胃癌細(xì)胞系SGC7901、BGC823和MGC803等進(jìn)行檢測分析，結(jié)果顯示，GES-1細(xì)胞中FAM3B表達(dá)較多，BGC823表達(dá)中等，而SGC7901細(xì)胞表達(dá)明顯減少。雖然通過Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)FAM3BmRNA和蛋白在這4株細(xì)胞系中無明顯差異，但細(xì)胞免疫化學(xué)所呈現(xiàn)出的表達(dá)差異，也為進(jìn)一步研究FAM3B在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供了重要線索，暗示著FAM3B在不同細(xì)胞系中的功能可能存在差異，其表達(dá)調(diào)控機(jī)制或許與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化過程相關(guān)。三、S100A2與FAM3B基因在胃癌細(xì)胞系中的表達(dá)分析3.1實驗材料與方法本研究選用胃正常上皮細(xì)胞系GES-1，以及具有不同生物學(xué)特性的胃癌細(xì)胞系，包括SGC7901、BGC823和MGC803。這些細(xì)胞系在胃癌研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，SGC7901細(xì)胞系來源于胃周轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)，具有較強的侵襲和轉(zhuǎn)移能力；BGC823取自胃癌原發(fā)灶，在細(xì)胞增殖和腫瘤形成能力方面具有典型特征；MGC803同樣取自胃癌原發(fā)灶，其生物學(xué)行為與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在實驗過程中，首先運用RT-PCR技術(shù)檢測基因在mRNA水平的表達(dá)情況。具體操作如下：采用Trizol試劑從各細(xì)胞系中提取總RNA，在提取過程中，嚴(yán)格遵循操作規(guī)范，確保RNA的完整性和純度。提取完成后，利用核酸蛋白測定儀精確測定RNA的濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.0之間，以保證后續(xù)實驗的準(zhǔn)確性。隨后，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的步驟，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，加入特異性引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶等反應(yīng)成分，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。S100A2基因的上游引物序列為5'-[具體序列1]-3'，下游引物序列為5'-[具體序列2]-3'；FAM3B基因的上游引物序列為5'-[具體序列3]-3'，下游引物序列為5'-[具體序列4]-3'。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘；95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，共進(jìn)行35個循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照記錄，通過條帶的亮度和位置來分析基因的表達(dá)水平。為了從蛋白水平進(jìn)一步驗證基因的表達(dá)情況，運用Westernblot技術(shù)。先用細(xì)胞裂解液裂解各細(xì)胞系，在冰上充分裂解30分鐘，使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)充分釋放。然后在4℃條件下，以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒精確測定蛋白濃度。根據(jù)測定結(jié)果，取等量的蛋白樣品，加入適量的5×上樣緩沖液，在100℃沸水中煮5分鐘，使蛋白充分變性。變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS電泳，電泳過程中，先在80V電壓下電泳30分鐘，待蛋白樣品進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，利用半干轉(zhuǎn)膜法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為25V，轉(zhuǎn)膜30分鐘。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜放入5%脫脂牛奶中，在室溫下封閉1小時，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點。隨后，加入用5%脫脂牛奶稀釋的一抗，S100A2一抗和FAM3B一抗的稀釋比例均為1:1000，4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，以洗去未結(jié)合的一抗。接著加入用5%脫脂牛奶稀釋的二抗，稀釋比例為1:5000，在室溫下孵育1小時。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，使用化學(xué)發(fā)光試劑對PVDF膜進(jìn)行顯色，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下觀察并拍照記錄，通過條帶的灰度值分析蛋白的表達(dá)水平。利用細(xì)胞免疫化學(xué)技術(shù)，從細(xì)胞層面直觀地觀察目的蛋白的表達(dá)和定位情況。將各細(xì)胞系以2×10^4/ml的密度接種于放置有蓋玻片的6孔板中，培養(yǎng)6小時，待細(xì)胞貼壁后，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到70%左右。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15分鐘，固定完成后，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5分鐘。然后用0.3%TritonX-100通透細(xì)胞30分鐘，使抗體能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與目的蛋白結(jié)合。再用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5分鐘。接著用5%BSA封閉細(xì)胞1小時，以減少非特異性染色。隨后，加入用PBS稀釋的一抗，S100A2一抗和FAM3B一抗的稀釋比例均為1:200，在4℃濕盒中孵育過夜。次日，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5分鐘。加入用PBS稀釋的二抗，稀釋比例為1:500，在37℃濕盒中孵育30分鐘。再用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5分鐘。最后，用DAB顯色液顯色，在顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞呈現(xiàn)出明顯的棕色時，用蒸餾水沖洗終止顯色。用蘇木素復(fù)染細(xì)胞核30秒，自來水沖洗10分鐘，使細(xì)胞核呈現(xiàn)出藍(lán)色。經(jīng)過梯度乙醇脫水，二甲苯透明后，用中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察并拍照記錄，分析目的蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)和定位情況。3.2實驗結(jié)果通過RT-PCR和Westernblot技術(shù)對各細(xì)胞系中S100A2與FAM3B基因的表達(dá)進(jìn)行檢測分析，結(jié)果顯示，S100A2mRNA和蛋白在胃癌細(xì)胞系SGC7901、BGC823和MGC803中的表達(dá)均顯著低于胃正常上皮細(xì)胞系GES-1。在RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果中，GES-1細(xì)胞系對應(yīng)的S100A2基因條帶亮度明顯強于胃癌細(xì)胞系，表明其mRNA表達(dá)水平較高；在Westernblot檢測結(jié)果中，GES-1細(xì)胞系中S100A2蛋白條帶的灰度值明顯高于胃癌細(xì)胞系，進(jìn)一步從蛋白層面證實了S100A2在胃癌細(xì)胞系中表達(dá)降低的現(xiàn)象。對于FAM3B基因，RT-PCR和Westernblot檢測結(jié)果顯示，其mRNA和蛋白在胃正常上皮細(xì)胞系GES-1與胃癌細(xì)胞系SGC7901、BGC823和MGC803中無明顯差異。然而，細(xì)胞免疫化學(xué)檢測卻呈現(xiàn)出不同的結(jié)果，GES-1細(xì)胞中FAM3B表達(dá)較多，在顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈現(xiàn)出明顯的棕色染色，表明FAM3B蛋白表達(dá)豐富；BGC823細(xì)胞表達(dá)中等，細(xì)胞染色程度相對較弱；而SGC7901細(xì)胞表達(dá)明顯減少，細(xì)胞染色較淺。這一結(jié)果暗示，雖然FAM3B在mRNA和蛋白總量上在不同細(xì)胞系中無顯著差異，但在細(xì)胞內(nèi)的分布和活性可能存在差異，這種差異可能對細(xì)胞的生物學(xué)功能產(chǎn)生重要影響，為后續(xù)深入研究FAM3B在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供了新的線索。四、S100A2與FAM3B基因真核表達(dá)載體構(gòu)建及亞細(xì)胞定位4.1基因擴(kuò)增與載體構(gòu)建為深入研究S100A2與FAM3B基因在胃癌發(fā)病中的功能，從胃癌癌旁正常組織中擴(kuò)增這兩個基因并構(gòu)建真核表達(dá)載體是關(guān)鍵步驟。首先，采用RT-PCR技術(shù)進(jìn)行基因擴(kuò)增。以胃癌癌旁正常組織為起始材料，運用Trizol試劑提取總RNA，嚴(yán)格按照試劑說明書操作，確保RNA的高質(zhì)量提取。提取完成后，利用核酸蛋白測定儀精確測定RNA的濃度和純度，保證其符合后續(xù)實驗要求，A260/A280比值應(yīng)在1.8-2.0之間。隨后，依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的詳細(xì)步驟，將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，為后續(xù)的PCR擴(kuò)增提供模板。在PCR擴(kuò)增過程中，精心設(shè)計特異性引物。S100A2基因的上游引物序列為5'-[具體序列1]-3'，下游引物序列為5'-[具體序列2]-3'；FAM3B基因的上游引物序列為5'-[具體序列3]-3'，下游引物序列為5'-[具體序列4]-3'。引物設(shè)計充分考慮了基因序列的特異性和擴(kuò)增效率，同時在引物兩端添加了合適的限制性內(nèi)切酶識別位點，以便后續(xù)的基因克隆操作。以cDNA為模板，加入高保真DNA聚合酶、dNTPs、引物等反應(yīng)成分，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件經(jīng)過優(yōu)化確定，95℃預(yù)變性5分鐘，使DNA模板充分變性；然后進(jìn)入循環(huán)反應(yīng)，95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，共進(jìn)行35個循環(huán)，確?；蚱蔚挠行U(kuò)增；最后72℃延伸10分鐘，使擴(kuò)增產(chǎn)物充分延伸，保證擴(kuò)增的完整性。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照記錄，通過條帶的位置和亮度初步判斷擴(kuò)增結(jié)果的準(zhǔn)確性。擴(kuò)增得到的S100A2與FAM3B全長基因需進(jìn)一步克隆至真核表達(dá)載體中，本研究選用pEGFP-N2作為真核表達(dá)載體，該載體具有增強型綠色熒光蛋白（EGFP）標(biāo)簽，便于后續(xù)對融合蛋白的觀察和分析。首先，用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶對pEGFP-N2載體和擴(kuò)增得到的目的基因進(jìn)行雙酶切。限制性內(nèi)切酶的選擇依據(jù)引物兩端添加的識別位點，確保酶切的特異性和有效性。酶切反應(yīng)在適宜的緩沖體系中進(jìn)行，37℃孵育數(shù)小時，使酶切反應(yīng)充分進(jìn)行。酶切產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收，確?；厥盏腄NA片段純度和完整性。將回收的目的基因片段與酶切后的pEGFP-N2載體，在T4DNA連接酶的作用下進(jìn)行連接反應(yīng)。連接反應(yīng)體系包含適量的目的基因片段、載體片段、T4DNA連接酶和連接緩沖液，16℃孵育過夜，以提高連接效率。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，具體操作如下：將感受態(tài)細(xì)胞從-80℃冰箱取出，置于冰上緩慢融化，加入連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰浴30分鐘，使DNA充分進(jìn)入感受態(tài)細(xì)胞；然后42℃熱激90秒，迅速置于冰上冷卻2分鐘，加入無抗LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1小時，使細(xì)菌復(fù)蘇并表達(dá)抗性基因。將轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含氨芐青霉素的LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)過夜。次日，從平板上挑取單菌落，接種至含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12-16小時。對培養(yǎng)后的菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取，采用堿裂解法提取質(zhì)粒，該方法操作簡便、效率高，能夠獲得高質(zhì)量的質(zhì)粒。提取的質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，以驗證目的基因是否成功插入載體。PCR反應(yīng)體系和條件與擴(kuò)增目的基因時類似，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，若出現(xiàn)預(yù)期大小的條帶，則初步表明目的基因已成功克隆至載體中。進(jìn)一步對PCR鑒定陽性的質(zhì)粒進(jìn)行酶切反應(yīng)鑒定，用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶對質(zhì)粒進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，觀察條帶的大小和數(shù)量，若與預(yù)期結(jié)果一致，則進(jìn)一步確認(rèn)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。最后，將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送測序公司進(jìn)行測序，通過與目的基因的原始序列進(jìn)行比對，確保插入基因的序列準(zhǔn)確性和讀碼框正確，從而成功構(gòu)建S100A2與FAM3B基因的真核表達(dá)載體。4.2轉(zhuǎn)染與亞細(xì)胞定位觀察成功構(gòu)建S100A2與FAM3B基因的真核表達(dá)載體后，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞BGC823中，以便進(jìn)一步觀察融合蛋白在細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞分布情況，深入了解基因的功能。轉(zhuǎn)染過程采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，這是一種常用且高效的轉(zhuǎn)染技術(shù)，利用脂質(zhì)體與細(xì)胞膜的相互作用，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。在轉(zhuǎn)染前，先將BGC823細(xì)胞以2×10^5/孔的密度接種于放置有蓋玻片的6孔板中，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細(xì)胞貼壁并達(dá)到適宜的生長狀態(tài)。待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時，進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的說明書，將適量的重組質(zhì)粒與脂質(zhì)體在無血清培養(yǎng)基中混合，輕輕混勻后，室溫孵育20分鐘，使脂質(zhì)體與重組質(zhì)粒充分結(jié)合，形成脂質(zhì)體-重組質(zhì)粒復(fù)合物。將復(fù)合物均勻滴加到6孔板中，輕輕搖晃使復(fù)合物均勻分布，繼續(xù)在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4-6小時后，更換為含有10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時，使重組質(zhì)粒在細(xì)胞內(nèi)充分表達(dá)。轉(zhuǎn)染48小時后，利用激光共聚焦顯微鏡觀察S100A2、FAM3B與EGFP融合蛋白在胃癌細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞分布。首先，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15分鐘，使細(xì)胞形態(tài)固定，便于后續(xù)觀察。固定完成后，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5分鐘，以去除未結(jié)合的多聚甲醛。然后用0.3%TritonX-100通透細(xì)胞30分鐘，使抗體能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與融合蛋白結(jié)合。再用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5分鐘。接著用5%BSA封閉細(xì)胞1小時，以減少非特異性染色。隨后，加入用PBS稀釋的DAPI染液，稀釋比例為1:1000，室溫孵育15分鐘，使細(xì)胞核染色。孵育完成后，用PBS洗滌細(xì)胞3次，每次5分鐘。將蓋玻片從6孔板中取出，用抗熒光淬滅封片劑封片，然后置于激光共聚焦顯微鏡下觀察。在激光共聚焦顯微鏡下，以488nm激發(fā)光激發(fā)EGFP，觀察綠色熒光的分布，從而確定融合蛋白的位置；以358nm激發(fā)光激發(fā)DAPI，觀察藍(lán)色熒光，確定細(xì)胞核的位置。通過對不同視野下的細(xì)胞進(jìn)行觀察和拍照分析，結(jié)果顯示，S100A2與EGFP融合蛋白主要分布在細(xì)胞漿內(nèi)核膜周圍，呈現(xiàn)出綠色熒光環(huán)繞核膜的分布特征。這一分布結(jié)果暗示S100A2可能在細(xì)胞漿內(nèi)參與了與核膜相關(guān)的生物學(xué)過程，或許通過與核膜上的某些蛋白相互作用，影響細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之間的物質(zhì)運輸、信號傳遞等過程，進(jìn)而對細(xì)胞的生長、增殖、凋亡等生物學(xué)行為產(chǎn)生影響。而FAM3B與EGFP融合蛋白則主要位于細(xì)胞核內(nèi)，細(xì)胞核區(qū)域呈現(xiàn)出強烈的綠色熒光。這表明FAM3B可能在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮其生物學(xué)功能，也許通過與核內(nèi)的DNA、RNA或其他核蛋白相互作用，參與基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、染色質(zhì)重塑等過程，從而對細(xì)胞的基因表達(dá)和生物學(xué)功能產(chǎn)生重要影響。五、S100A2與FAM3B基因?qū)ξ赴┘?xì)胞生物學(xué)功能的影響5.1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的篩選與鑒定為深入研究S100A2與FAM3B基因?qū)ξ赴┘?xì)胞生物學(xué)功能的影響，獲取穩(wěn)定表達(dá)目的基因的細(xì)胞株是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在完成重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞BGC823后，利用G418進(jìn)行篩選，以獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。G418是一種氨基糖苷類抗生素，它能夠抑制原核和真核細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成，對未轉(zhuǎn)染含有抗性基因質(zhì)粒的細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，而轉(zhuǎn)染了攜帶G418抗性基因（如neo基因）重組質(zhì)粒的細(xì)胞則能夠在含有G418的培養(yǎng)基中存活。在本實驗中，重組質(zhì)粒pEGFP-N2-S100A2和pEGFP-N2-FAM3B均攜帶neo基因，賦予轉(zhuǎn)染細(xì)胞對G418的抗性。在篩選前，需先確定G418對BGC823細(xì)胞的最佳篩選濃度。將BGC823細(xì)胞以2×10^4/孔的密度接種于24孔板中，培養(yǎng)12小時，待細(xì)胞貼壁后，吸除培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞一次。然后加入含有不同濃度G418（0μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml、800μg/ml、900μg/ml、1000μg/ml、1100μg/ml、1200μg/ml）的完全培養(yǎng)基，每個濃度設(shè)置4個復(fù)孔。隔天更換一次篩選培養(yǎng)基，持續(xù)培養(yǎng)10-14天，每日在顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)和存活情況。隨著培養(yǎng)時間的延長，不同濃度G418對細(xì)胞的作用逐漸顯現(xiàn)，未添加G418的對照組細(xì)胞正常生長、增殖，而添加了G418的實驗組細(xì)胞，隨著G418濃度的升高，細(xì)胞死亡數(shù)量逐漸增多。當(dāng)G418濃度達(dá)到1000μg/ml時，在培養(yǎng)10-14天后，細(xì)胞幾乎全部死亡，因此確定1000μg/ml為后續(xù)篩選實驗的最佳篩選濃度。在確定最佳篩選濃度后，將轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-N2-S100A2和pEGFP-N2-FAM3B的BGC823細(xì)胞，以及轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-N2的BGC823細(xì)胞（作為陰性對照），分別以2×10^5/孔的密度接種于6孔板中。培養(yǎng)24小時，使細(xì)胞貼壁后，更換為含有1000μg/mlG418的完全培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。每隔一天更換一次篩選培養(yǎng)基，以維持G418的有效濃度，并及時去除死亡細(xì)胞和代謝產(chǎn)物。在篩選過程中，每天在顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長情況。隨著篩選時間的推移，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和未轉(zhuǎn)染的BGC823細(xì)胞在G418的作用下逐漸死亡、脫落，而轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒的細(xì)胞，由于獲得了G418抗性基因，部分細(xì)胞能夠存活并逐漸形成抗性克隆。大約在篩選10-14天后，抗性克隆清晰可見，此時可以進(jìn)行單克隆的挑選。在高倍鏡下，用無菌移液器頭小心地將單個抗性克隆挑取出來，轉(zhuǎn)移至預(yù)先加入完全培養(yǎng)基的24孔板中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。在擴(kuò)增過程中，繼續(xù)使用含有1000μg/mlG418的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，以維持篩選壓力，確保獲得的細(xì)胞株為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。為了鑒定篩選得到的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株中目的基因的表達(dá)情況，采用Westernblot技術(shù)進(jìn)行檢測。分別收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-N2-S100A2的BGC823細(xì)胞（命名為BGC823-S100A2）、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pEGFP-N2-FAM3B的BGC823細(xì)胞（命名為BGC823-FAM3B）以及轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pEGFP-N2的BGC823細(xì)胞（命名為BGC823-vector）。用細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，在冰上充分裂解30分鐘，使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)充分釋放。然后在4℃條件下，以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒精確測定蛋白濃度。根據(jù)測定結(jié)果，取等量的蛋白樣品，加入適量的5×上樣緩沖液，在100℃沸水中煮5分鐘，使蛋白充分變性。變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS電泳，電泳過程中，先在80V電壓下電泳30分鐘，待蛋白樣品進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，利用半干轉(zhuǎn)膜法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為25V，轉(zhuǎn)膜30分鐘。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜放入5%脫脂牛奶中，在室溫下封閉1小時，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點。隨后，加入用5%脫脂牛奶稀釋的一抗，S100A2一抗和FAM3B一抗的稀釋比例均為1:1000，4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，以洗去未結(jié)合的一抗。接著加入用5%脫脂牛奶稀釋的二抗，稀釋比例為1:5000，在室溫下孵育1小時。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，使用化學(xué)發(fā)光試劑對PVDF膜進(jìn)行顯色，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下觀察并拍照記錄。結(jié)果顯示，BGC823-S100A2細(xì)胞中S100A2蛋白的表達(dá)水平顯著高于BGC823-vector細(xì)胞，表明S100A2基因在BGC823-S100A2細(xì)胞中成功過表達(dá)；BGC823-FAM3B細(xì)胞中FAM3B蛋白的表達(dá)水平也顯著高于BGC823-vector細(xì)胞，說明FAM3B基因在BGC823-FAM3B細(xì)胞中實現(xiàn)了穩(wěn)定過表達(dá)。通過G418篩選和Westernblot鑒定，成功獲得了穩(wěn)定表達(dá)S100A2與FAM3B基因的胃癌細(xì)胞株，為后續(xù)深入研究這兩個基因?qū)ξ赴┘?xì)胞生物學(xué)功能的影響奠定了堅實的基礎(chǔ)。5.2細(xì)胞形態(tài)與增殖能力分析為深入探究S100A2與FAM3B基因?qū)ξ赴┘?xì)胞生物學(xué)特性的影響，對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株BGC823-S100A2、BGC823-FAM3B以及陰性對照BGC823-vector進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)觀察和增殖能力分析，從細(xì)胞層面揭示基因功能。首先，運用HE染色技術(shù)對細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察。將處于對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，以2×10^5/孔的密度接種于放置有蓋玻片的6孔板中，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細(xì)胞貼壁。待細(xì)胞生長狀態(tài)良好后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15分鐘，固定細(xì)胞形態(tài)。固定完成后，按照常規(guī)HE染色步驟進(jìn)行染色，依次將細(xì)胞放入二甲苯Ⅰ10分鐘、二甲苯Ⅱ10分鐘進(jìn)行脫蠟處理，以去除細(xì)胞中的石蠟成分；然后通過無水乙醇Ⅰ5分鐘、無水乙醇Ⅱ5分鐘進(jìn)行脫水，使細(xì)胞組織硬化，便于后續(xù)切片和染色；接著用95%酒精5分鐘、90%酒精5分鐘、80%酒精5分鐘、70%酒精5分鐘進(jìn)行梯度酒精處理，進(jìn)一步脫水并使細(xì)胞組織與染液更好地結(jié)合；之后將細(xì)胞放入蒸餾水中漂洗，去除殘留的酒精。將細(xì)胞放入Harris蘇木素染液中染色3-8分鐘，蘇木素為堿性染液，能夠使細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)著紫藍(lán)色；染色完成后，用自來水沖洗，洗去多余的蘇木素染液。用1%的鹽酸酒精分化數(shù)秒，使細(xì)胞核染色更加清晰，去除非特異性染色；再用自來水沖洗，洗去鹽酸酒精。將細(xì)胞放入0.6%氨水返藍(lán)，使細(xì)胞核由紅色轉(zhuǎn)變?yōu)轷r明的藍(lán)色；最后用流水沖洗，終止返藍(lán)反應(yīng)。將細(xì)胞放入伊紅染液中染色1-3分鐘，伊紅為酸性染料，能夠使細(xì)胞漿染成深淺不同的粉紅色至桃紅色。染色完成后，依次將細(xì)胞放入95%酒精I(xiàn)5分鐘、95%酒精I(xiàn)I5分鐘、無水乙醇Ⅰ5分鐘、無水乙醇Ⅱ5分鐘、二甲苯Ⅰ5分鐘、二甲苯Ⅱ5分鐘中進(jìn)行脫水透明處理，使細(xì)胞組織更加清晰，便于觀察。將細(xì)胞從二甲苯中取出稍晾干，用中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。觀察結(jié)果顯示，陰性對照BGC823-vector細(xì)胞呈現(xiàn)典型的上皮樣細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞呈多邊形或梭形，邊界清晰，細(xì)胞間連接緊密，細(xì)胞核大且呈圓形或橢圓形，位于細(xì)胞中央，核仁明顯，細(xì)胞質(zhì)豐富，染成淡粉紅色。而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染S100A2基因的BGC823-S100A2細(xì)胞，形態(tài)發(fā)生了顯著變化，細(xì)胞體積變小，呈圓形或類圓形，細(xì)胞邊界相對模糊，細(xì)胞間連接減少，細(xì)胞核形態(tài)基本保持圓形，但核仁相對不明顯，細(xì)胞質(zhì)染色變淺。這表明S100A2基因的表達(dá)可能影響了細(xì)胞的形態(tài)和細(xì)胞間的相互作用，推測其可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白或細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，進(jìn)而改變細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FAM3B基因的BGC823-FAM3B細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)也出現(xiàn)了改變，細(xì)胞變得細(xì)長，呈梭形，細(xì)胞的伸展性增強，細(xì)胞核呈橢圓形，偏向細(xì)胞一側(cè)，細(xì)胞質(zhì)染色相對較深。這暗示FAM3B基因的表達(dá)可能對細(xì)胞的形態(tài)和極性產(chǎn)生影響，或許通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號通路，影響細(xì)胞的骨架重組和細(xì)胞的運動能力。接著，采用MTT比色法檢測細(xì)胞的增殖能力。將各組細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液配成單個細(xì)胞懸液，以每孔5000個細(xì)胞的密度接種到96孔板中，每孔體積200μl，每組設(shè)置5個復(fù)孔。將96孔板放入37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)0小時、24小時、48小時、72小時、96小時后進(jìn)行檢測。在每個檢測時間點，每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml，用PBS配制），繼續(xù)孵育4小時，使MTT被活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中。孵育結(jié)束后，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細(xì)胞需要先離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加入150μlDMSO，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。選擇490nm波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值（OD值），以時間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。實驗結(jié)果表明，在培養(yǎng)初期（0-24小時），各組細(xì)胞的OD值無明顯差異，說明細(xì)胞接種時的初始狀態(tài)基本一致。隨著培養(yǎng)時間的延長，陰性對照BGC823-vector細(xì)胞的OD值逐漸升高，細(xì)胞呈現(xiàn)出持續(xù)增殖的趨勢。而BGC823-S100A2細(xì)胞的增殖速度明顯低于BGC823-vector細(xì)胞，在48小時后，兩組細(xì)胞的OD值差異逐漸顯著，至96小時時，BGC823-vector細(xì)胞的OD值約為BGC823-S100A2細(xì)胞的1.5倍。這表明S100A2基因的過表達(dá)能夠顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖能力，可能是通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯在某個階段，從而抑制細(xì)胞的增殖。BGC823-FAM3B細(xì)胞的增殖能力則明顯高于BGC823-vector細(xì)胞，在48小時后，BGC823-FAM3B細(xì)胞的OD值開始顯著高于BGC823-vector細(xì)胞，至96小時時，BGC823-FAM3B細(xì)胞的OD值約為BGC823-vector細(xì)胞的1.3倍。這說明FAM3B基因的過表達(dá)能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖，推測其可能通過激活某些促進(jìn)細(xì)胞增殖的信號通路，如PI3K/AKT信號通路等，來加速細(xì)胞的增殖進(jìn)程。通過細(xì)胞形態(tài)觀察和增殖能力分析，初步揭示了S100A2與FAM3B基因?qū)ξ赴┘?xì)胞生物學(xué)功能的影響，為進(jìn)一步探究其作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。5.3細(xì)胞運動能力與周期分析為深入探究S100A2與FAM3B基因?qū)ξ赴┘?xì)胞運動能力及細(xì)胞周期的影響，本研究運用穿膜實驗檢測細(xì)胞運動能力，并通過細(xì)胞周期檢測分析基因?qū)?xì)胞周期的調(diào)控作用，從細(xì)胞行為和周期進(jìn)程層面揭示基因在胃癌發(fā)病中的功能。采用Transwell小室進(jìn)行穿膜實驗，以評估細(xì)胞的運動能力。該實驗原理基于聚碳酸酯膜分隔上下培養(yǎng)室，下層培養(yǎng)液中的趨化因子可誘導(dǎo)上室細(xì)胞遷移或侵襲。對于遷移實驗，無需在膜上鋪設(shè)額外基質(zhì)膠，細(xì)胞僅需穿透聚碳酸酯膜即可，主要用于檢測細(xì)胞的運動能力；而侵襲實驗則需在膜上預(yù)鋪Matrigel基質(zhì)膠，模擬細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞需分泌蛋白酶降解基質(zhì)膠后才能穿過，用于評估細(xì)胞的侵襲潛能。在本研究中，選用8μm孔徑的Transwell小室，首先將Matrigel基質(zhì)膠用無血清培養(yǎng)基按1:8的比例稀釋，冰上操作，避免基質(zhì)膠提前凝固。取100μL稀釋后的Matrigel加入Transwell上室底部，37℃溫育4-5小時，使其形成均勻的膠狀結(jié)構(gòu)。將處于對數(shù)生長期的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株BGC823-S100A2、BGC823-FAM3B以及陰性對照BGC823-vector用胰蛋白酶消化，離心（800r/min，5分鐘）后，用無血清培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?個/mL。上室加入200μL細(xì)胞懸液，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基600μL，作為趨化因子。將Transwell小室置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育24小時。孵育結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽小心擦去未穿透膜的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定穿透膜的細(xì)胞15分鐘。固定完成后，用PBS洗滌3次，每次5分鐘，然后用0.1%結(jié)晶紫染液染色15分鐘。染色結(jié)束后，再次用PBS洗滌3次，每次5分鐘。在顯微鏡下，隨機(jī)選取5個視野，計數(shù)下室中染色的細(xì)胞數(shù)量。穿膜實驗結(jié)果顯示，陰性對照BGC823-vector細(xì)胞的穿膜細(xì)胞數(shù)較多，平均每個視野的穿膜細(xì)胞數(shù)為（120±15）個，表明其具有較強的運動能力。而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染S100A2基因的BGC823-S100A2細(xì)胞，穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，平均每個視野的穿膜細(xì)胞數(shù)僅為（45±8）個。這說明S100A2基因的過表達(dá)能夠顯著抑制胃癌細(xì)胞的運動能力，可能是通過影響細(xì)胞骨架的重塑、細(xì)胞黏附分子的表達(dá)或細(xì)胞內(nèi)信號通路的傳導(dǎo)，從而阻礙細(xì)胞的遷移和侵襲。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FAM3B基因的BGC823-FAM3B細(xì)胞，穿膜細(xì)胞數(shù)顯著增加，平均每個視野的穿膜細(xì)胞數(shù)達(dá)到（180±20）個。這表明FAM3B基因的過表達(dá)能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的運動能力，推測其可能通過激活某些促進(jìn)細(xì)胞運動的信號通路，如RhoGTP酶信號通路等，增強細(xì)胞的遷移和侵襲能力。利用流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞周期進(jìn)行檢測分析，以探究S100A2與FAM3B基因?qū)?xì)胞周期的影響。將處于對數(shù)生長期的各組細(xì)胞用胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞于離心管中，1000r/min離心5分鐘，棄上清。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次1000r/min離心5分鐘。將細(xì)胞重懸于70%冷乙醇中，4℃固定過夜。固定后的細(xì)胞1000r/min離心5分鐘，棄去乙醇，用PBS洗滌2次。加入500μL含有50μg/mL碘化丙啶（PI）和100μg/mLRNaseA的染色緩沖液，37℃避光孵育30分鐘。孵育完成后，用300目篩網(wǎng)過濾細(xì)胞懸液，去除細(xì)胞團(tuán)塊，然后在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測分析。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，陰性對照BGC823-vector細(xì)胞的細(xì)胞周期分布中，G0/G1期細(xì)胞占（45.0±3.0）%，S期細(xì)胞占（35.0±2.5）%，G2/M期細(xì)胞占（20.0±2.0）%。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染S100A2基因的BGC823-S100A2細(xì)胞，G0/G1期細(xì)胞比例顯著增加，達(dá)到（60.0±4.0）%，而S期和G2/M期細(xì)胞比例明顯減少，S期細(xì)胞占（20.0±2.0）%，G2/M期細(xì)胞占（20.0±1.5）%。這說明S100A2基因的過表達(dá)能夠使胃癌細(xì)胞阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞從G0/G1期向S期的轉(zhuǎn)換，從而抑制細(xì)胞的增殖。可能是通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，如p21、p27等的表達(dá)，抑制CDK-cyclin復(fù)合物的活性，進(jìn)而阻滯細(xì)胞周期。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FAM3B基因的BGC823-FAM3B細(xì)胞，S期細(xì)胞比例顯著增加，達(dá)到（45.0±3.0）%，G0/G1期細(xì)胞占（35.0±2.5）%，G2/M期細(xì)胞占（20.0±2.0）%。這表明FAM3B基因的過表達(dá)能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞進(jìn)入S期，加速細(xì)胞的增殖進(jìn)程。推測其可能通過激活某些促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程的信號通路，如MAPK信號通路等，上調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，如CyclinD1、CDK4等的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞從G0/G1期向S期的轉(zhuǎn)換。通過穿膜實驗和細(xì)胞周期檢測分析，進(jìn)一步明確了S100A2與FAM3B基因?qū)ξ赴┘?xì)胞運動能力和細(xì)胞周期的影響，為深入理解胃癌的發(fā)病機(jī)制提供了重要的實驗依據(jù)。5.4細(xì)胞凋亡分析細(xì)胞凋亡在腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中扮演著關(guān)鍵角色，為深入探究S100A2與FAM3B基因?qū)ξ赴┘?xì)胞凋亡的影響，本研究采用檢測CleavedPARP的方法進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析，從分子層面揭示基因在胃癌發(fā)病中的功能。CleavedPARP，即多聚ADP核糖聚合酶裂解產(chǎn)物，是細(xì)胞凋亡過程中的一個重要標(biāo)志性分子。在正常細(xì)胞中，PARP主要參與DNA損傷修復(fù)等生理過程，以完整的形式存在。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡信號刺激時，Caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白酶被激活，它們能夠特異性地切割PARP，使其裂解為89kDa的CleavedPARP。因此，檢測細(xì)胞內(nèi)CleavedPARP的表達(dá)水平，能夠準(zhǔn)確反映細(xì)胞凋亡的發(fā)生情況，其表達(dá)水平的升高意味著細(xì)胞凋亡的增加。在本實驗中，對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株BGC823-S100A2、BGC823-FAM3B以及陰性對照BGC823-vector進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析。首先，收集處于對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，以去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和培養(yǎng)基殘留。然后，按照細(xì)胞裂解液說明書的比例，加入適量的細(xì)胞裂解液，在冰上充分裂解30分鐘，使細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)充分釋放。裂解完成后，在4℃條件下，以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒精確測定蛋白濃度。根據(jù)測定結(jié)果，取等量的蛋白樣品，加入適量的5×上樣緩沖液，在100℃沸水中煮5分鐘，使蛋白充分變性。變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS電泳，電泳過程中，先在80V電壓下電泳30分鐘，待蛋白樣品進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，利用半干轉(zhuǎn)膜法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為25V，轉(zhuǎn)膜30分鐘。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜放入5%脫脂牛奶中，在室溫下封閉1小時，以封閉膜上的非特異性結(jié)合位點。隨后，加入用5%脫脂牛奶稀釋的一抗，CleavedPARP一抗的稀釋比例為1:1000，4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，以洗去未結(jié)合的一抗。接著加入用5%脫脂牛奶稀釋的二抗，稀釋比例為1:5000，在室溫下孵育1小時。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，使用化學(xué)發(fā)光試劑對PVDF膜進(jìn)行顯色，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下觀察并拍照記錄。實驗結(jié)果顯示，陰性對照BGC823-vector細(xì)胞中CleavedPARP的表達(dá)水平較低，表明細(xì)胞凋亡率較低。而穩(wěn)定轉(zhuǎn)染S100A2基因的BGC823-S100A2細(xì)胞，CleavedPARP的表達(dá)水平顯著升高，說明S100A2基因的過表達(dá)能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的凋亡。這可能是因為S100A2通過激活線粒體凋亡途徑，促使細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)而激活Caspase-9和Caspase-3等凋亡蛋白酶，導(dǎo)致PARP被切割，細(xì)胞凋亡增加。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染FAM3B基因的BGC823-FAM3B細(xì)胞，CleavedPARP的表達(dá)水平明顯低于BGC823-vector細(xì)胞，表明FAM3B基因的過表達(dá)能夠抑制胃癌細(xì)胞的凋亡。推測FAM3B可能通過抑制凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，如上調(diào)Bcl-2等抗凋亡蛋白的表達(dá)，下調(diào)Bax等促凋亡蛋白的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。通過檢測CleavedPARP分析細(xì)胞凋亡，明確了S100A2與FAM3B基因?qū)ξ赴┘?xì)胞凋亡的影響，為進(jìn)一步探究胃癌的發(fā)病機(jī)制和尋找新的治療靶點提供了重要的實驗依據(jù)。六、S100A2與FAM3B基因在胃癌發(fā)病中的作用機(jī)制探討6.1與胃癌臨床病理特征的關(guān)聯(lián)大量研究表明，S100A2表達(dá)與胃癌的臨床病理特征之間存在著緊密且復(fù)雜的關(guān)聯(lián)。在胃癌組織中，S100A2的表達(dá)水平顯著低于正常胃黏膜組織，這種表達(dá)差異在腫瘤的起始發(fā)生和后續(xù)發(fā)展進(jìn)程中可能扮演著關(guān)鍵角色。從胃癌的TNM分期角度來看，S100A2表達(dá)與分期呈負(fù)相關(guān)。TNM分期是目前國際上最為通用的腫瘤分期系統(tǒng)，其中T代表原發(fā)腫瘤的大小和浸潤深度，N代表區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，M代表遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況。研究數(shù)據(jù)顯示，在TNM分期Ⅰ-Ⅱ期的胃癌患者中，S100A2表達(dá)水平相對較高；而隨著分期進(jìn)展到Ⅲ-Ⅳ期，S100A2表達(dá)顯著降低。陜西省核工業(yè)二一五醫(yī)院對105例胃癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，TNM分期Ⅰ-Ⅱ期與Ⅲ-Ⅳ期的患者，病灶組織中S100A2的表達(dá)分級存在顯著差異。這意味著，S100A2表達(dá)水平越低，胃癌的分期越晚，腫瘤的侵襲性和轉(zhuǎn)移風(fēng)險越高，患者的預(yù)后也就越差。這可能是因為S100A2表達(dá)缺失會導(dǎo)致細(xì)胞間的黏附力下降，使得腫瘤細(xì)胞更容易突破基底膜，向周圍組織浸潤和轉(zhuǎn)移。同時，S100A2可能通過調(diào)控某些與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的信號通路，如PI3K/AKT信號通路等，影響腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。當(dāng)S100A2表達(dá)降低時，這些信號通路可能被異常激活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致胃癌分期的進(jìn)展。在胃癌的分化程度方面，S100A2表達(dá)與分化程度呈正相關(guān)。高分化胃癌組織中，細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)相對接近正常胃黏膜細(xì)胞，具有較好的組織學(xué)特征，此時S100A2的陽性表達(dá)率顯著高于中分化和低分化胃癌組織。南華大學(xué)的研究通過免疫組織化學(xué)和Westernblot等技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，高分化胃癌S100A2蛋白表達(dá)率為75.00％，中分化胃癌為53.84％，低分化胃癌僅為18.18％。這表明，隨著胃癌分化程度的降低，S100A2的表達(dá)逐漸減少。低分化胃癌細(xì)胞往往具有更高的惡性程度，其細(xì)胞增殖速度快、侵襲性強，而S100A2表達(dá)的缺失可能是導(dǎo)致這種惡性程度增加的重要因素之一。S100A2可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，影響細(xì)胞的增殖和分化。在高分化胃癌中，較高水平的S100A2可以抑制細(xì)胞的異常增殖，促進(jìn)細(xì)胞向正常方向分化；而在低分化胃癌中，S100A2表達(dá)降低，細(xì)胞周期調(diào)控失衡，導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控，分化受阻，從而使腫瘤的惡性程度增加。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響胃癌患者預(yù)后的重要因素之一，S100A2表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也密切相關(guān)，呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者，其S100A2蛋白陽性表達(dá)率明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者。在對有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組的研究中發(fā)現(xiàn)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組S100A2蛋白陽性表達(dá)率僅為29.41％，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移胃癌組為69.57％。這說明S100A2表達(dá)缺失可能促進(jìn)了胃癌細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。腫瘤細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的過程，涉及腫瘤細(xì)胞的脫離、遷移、侵入淋巴管以及在淋巴結(jié)內(nèi)的定植和生長。S100A2可能通過影響細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，如E-cadherin等，改變腫瘤細(xì)胞與周圍組織和細(xì)胞之間的黏附力。當(dāng)S100A2表達(dá)降低時，E-cadherin等黏附分子的表達(dá)也可能下調(diào)，使得腫瘤細(xì)胞更容易從原發(fā)灶脫離，進(jìn)入淋巴管并轉(zhuǎn)移至淋巴結(jié)。此外，S100A2還可能通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞功能，影響腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸和轉(zhuǎn)移能力。在S100A2表達(dá)缺失的情況下，腫瘤微環(huán)境可能更有利于腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生。綜上所述，S100A2表達(dá)與胃癌的TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征密切相關(guān)，其表達(dá)水平的變化可能在胃癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。深入研究S100A2與這些臨床病理特征之間的關(guān)系，有助于進(jìn)一步揭示胃癌的發(fā)病機(jī)制，為胃癌的早期診斷、預(yù)后評估和精準(zhǔn)治療提供重要的理論依據(jù)和潛在的生物標(biāo)志物。6.2潛在的分子調(diào)控機(jī)制6.2.1S100A2基因相關(guān)信號通路S100A2基因在胃癌發(fā)病中可能通過多種信號通路發(fā)揮其抑制腫瘤的功能。研究發(fā)現(xiàn)，S100A2與PI3K/AKT信號通路存在緊密聯(lián)系。PI3K/AKT信號通路在細(xì)胞的增殖、存活、代謝和遷移等過程中發(fā)揮著核心調(diào)控作用，在胃癌中，該信號通路常常被異常激活。S100A2可能通過與PI3K的調(diào)節(jié)亞基p85相互作用，抑制PI3K的活性，從而阻斷PI3K/AKT信號通路的激活。在胃癌細(xì)胞中，當(dāng)S100A2表達(dá)上調(diào)時，p85與S100A2的結(jié)合增強，導(dǎo)致PI3K的催化活性受到抑制，進(jìn)而使AKT的磷酸化水平降低，細(xì)胞增殖和遷移能力減弱。相反，當(dāng)S100A2表達(dá)缺失時，PI3K/AKT信號通路被過度激活，AKT的磷酸化水平升高，促進(jìn)細(xì)胞的增殖、存活和遷移，增加胃癌的侵襲性和轉(zhuǎn)移風(fēng)險。S100A2還可能參與Ras/Raf/MEK/ERK信號通路的調(diào)控。Ras/Raf/MEK/ERK信號通路在細(xì)胞生長、分化和凋亡等過程中起著關(guān)鍵作用，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也常常出現(xiàn)異常激活。S100A2可能通過調(diào)節(jié)Ras蛋白的活性，影響Ras/Raf/MEK/ERK信號通路的傳導(dǎo)。有研究表明，S100A2可以與Ras蛋白結(jié)合，抑制Ras的激活，從而阻斷Ras/Raf/MEK/ERK信號通路的傳導(dǎo)。在胃癌細(xì)胞中，當(dāng)S100A2表達(dá)上調(diào)時，Ras的活性受到抑制，Raf、MEK和ERK的磷酸化水平降低，細(xì)胞增殖和遷移能力受到抑制。而當(dāng)S100A2表達(dá)降低時，Ras/Raf/MEK/ERK信號通路被激活，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和遷移，推動胃癌的發(fā)展。6.2.2FAM3B基因相關(guān)信號通路FAM3B基因在胃癌發(fā)病進(jìn)程中，也參與了復(fù)雜的信號通路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生重要影響。FAM3B與AKT–MDM2–p53信號軸密切相關(guān)。在正常生理狀態(tài)下，p53作為一種重要的腫瘤抑制蛋白，能夠通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、凋亡和衰老等機(jī)制，抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。MDM2是p53的負(fù)調(diào)控因子，能夠與p53結(jié)合，促進(jìn)p53的泛素化降解，從而抑制p53的活性。AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞的增殖、存活和代謝等過程中發(fā)揮重要作用。FAM3B可能通過激活A(yù)KT信號通路，上調(diào)MDM2的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)p53的泛素化降解，抑制p53的活性。在胃癌細(xì)胞中，當(dāng)FAM3B過表達(dá)時，AKT的磷酸化水平升高，MDM2的表達(dá)增加，p53的蛋白水平降低，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯和凋亡減少，細(xì)胞增殖和存活能力增強。這一過程可能是FAM3B促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖和抑制凋亡的重要機(jī)制之一。FAM3B還與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程緊密相連。EMT是指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理條件下，轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)細(xì)胞特性的過程，這一過程賦予細(xì)胞更強的遷移和侵襲能力，在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。