ICS65.020.01CCSB16 CodeofPracticeforDetectionofPepinomosaicviruscarriedbySolanaceae2022-10-10發(fā) 2022-11-10實(shí)湖北省植物保護(hù)學(xué) 范圍1規(guī)范性引用文件1術(shù)語(yǔ)和定義1鳳果花葉病毒分類信息-1儀器和試劑1儀器設(shè)備1-主要試劑1-檢測(cè)流程圖1檢測(cè)方法1樣品制備2-種子類2種苗類2RNA2--分子雜交2-結(jié)果判定3-留樣保存與結(jié)果記錄-3留樣保存3-結(jié)果記錄3-建檔3-附錄A（參考性附錄）鳳果花葉病毒基本信息4附錄B（參考性附錄）核酸提取方法-6附錄C（參考性附錄）分子雜交方法-7附錄D（規(guī)范性性附錄）鳳果花葉病毒檢測(cè)流程圖9 --PAGE1GB/T6682SN/T2964學(xué)名：Pepinomosaicvirus類病毒名及縮寫：pepinomosaic，馬鈴薯 1000μL）、常規(guī)冰箱、超低溫冰箱等。 除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純或生化試劑，實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682中一級(jí)水的規(guī)格。鳳果花葉病毒檢測(cè)流程圖見附錄D。檢測(cè)過程中防擴(kuò)散、防污染的措施按照SN/T2964中的規(guī)定執(zhí) 每份送檢樣本中選取100~200粒種子，表面消毒后，置于鋪有吸水紙的白瓷盤或培養(yǎng)皿中，20℃~25℃、12h/12h光暗交替條件下保濕培養(yǎng)直至萌發(fā)。隨機(jī)抽取葉片1g~5g，置于去RNA酶的研缽g~200g葉片置于去RNA酶的研缽中，加入液氮后迅速研磨成細(xì)粉狀，制成檢測(cè)樣品。 cDNA0.2mLPCR管中加入DEPC處理去離子水10μL、模板RNA3μL（50ng~200ng），隨機(jī)引物1U/μLRNAase抑制劑（Rnasin）0.5μL、200U/μL反轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV）0.5μL，混勻后37℃水浴1h；反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后瞬時(shí)離心，95℃（或沸水）水浴5min，冰浴3min，直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增。（均為10μmol/L）各1.0μL（見表1），5U/μLTaq酶0.5μL，模板cDNA3μL，加DEPC處理水至總體積25μL。每個(gè)樣品設(shè)置兩個(gè)平行反應(yīng)，以雙蒸水代替模板作為空白對(duì)照。1PCR反應(yīng)程序：95℃5min；9530s，56℃30s，7230s，35個(gè)循環(huán)；72℃10min 采用RochePepMVRNA-20℃ --PAGE4附錄1980年，Jones首次從秘魯海岸卡內(nèi)特河谷種植的鳳果（Solanummuricatum）中分離到希臘、意大利、荷蘭、英國(guó)、西班牙、瑞士、瑞典、烏克蘭、葡萄牙、芬蘭、匈牙利、愛爾蘭、立陶宛、馬耳他、挪威、波蘭、斯洛伐克、斯洛文尼亞、土耳其等。PepMV長(zhǎng)距離傳播主要通過受感染的種子和苗木。PepMV不侵染胚和胚乳，僅侵染種率較低，為0.005%～0.057，使用被感染的種子有傳播風(fēng)險(xiǎn)。PepMV具有高度的接觸傳染X病毒屬的病毒傳播更快，如番茄花葉病毒（Tomatomosaicvirus，ToMV）、馬鈴薯X病毒（PotatovirusXPVX）。PepMV還可通過花粉可附著在大黃蜂（Bombusimpatiens）身體上傳播，也可通過土壤生息絕對(duì)寄生菌孢子（Olpidiumvirulentus）傳播危害。PpV無(wú)論P(yáng)epV癥狀如何變化，苗期地上和地下部分生長(zhǎng)活躍期前一個(gè)月，均可檢測(cè)到PpVPeM3。功能；ORF2ORF4編碼的蛋白分子量大小分別為26kDa、14kDa和9kDa；ORF5編碼衣附錄DEPC處理超純水：取制備好的去離子水500mL，加入500μLDEPC搖床震蕩過夜，高1mol/LTris-HCl（pH8.0）：稱取12.11gTris·base，加50mLDEPC處理超純水溶解，用濃HCl調(diào)pH值至8.0，定容至100mL，高溫高壓滅菌后室溫保存；0.5mol/LEDTA（pH8.0）：稱取18.61gNa2EDTA·2H2O，加80mL處理超純水溶解，用約2gNaOH調(diào)pH值至8.0，加DEPC100μL，定容至100mL，搖床震蕩過夜，高溫高壓10×TE（pH8.0）：取1mol/LTris-HCl（pH8.0）10mL和0.5mol/LEDTA8.0）2mL，加50mLDEPC處理超純水溶解，定容至100mLTrizol，渦旋振蕩15s，室溫靜置15min；加400μL氯仿，上下顛倒混勻，室溫靜置2min，412000r/m離心15min；取上清于新的離心管中，加無(wú)加入等體積的異丙醇沉淀，輕微顛倒，-20℃沉降1h；12000r/m離心15min；棄上清，沉淀中加1mL預(yù)冷的75酒精，上下顛倒10次，12000r/m離心5min，棄上清；瞬間離心20s，吸去多余液體，室溫干燥5-10min，加30μLDEPC處理的去離子水溶解，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。附?0×Denhardt’s1gFicoll400，1gPVP-40，1gBSA80mL去離子100mL，過濾除菌及雜質(zhì)后-20℃貯存；雜交液：預(yù)雜交液中加入DIG-RNA0.73gNaCl，0.24gNa2HPO4，0.1gNaH2PO4，5gSDS80mL水中，100mL，過濾除菌后室溫保存；II0.24gTris·base，1.16gNaCl，0.4gMgCl2160mLHClMaleicacid緩沖液：100mmolMaleicacid、150mmolNaCl，pH7.5；洗膜緩沖液：100mmolMaleicacid、150mmolNaCl、0.3%v/v)Tween20，pH7.5；檢測(cè)緩沖液：100mmolTris-HCl(pH9.5)、100mmolNaCl；CSPD：25mmolCSPD（用前稀釋帶正電的尼龍膜為AmershamPharmaciaBiotech挑取PepMV目標(biāo)片段正向插入的克隆質(zhì)粒，用NdeⅠ對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切線性化處理，獲得T7RNA多聚酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄隨機(jī)標(biāo)記單鏈RNA探和2μLT7RNA聚合酶、0.5μLRNA酶抑制劑，37℃標(biāo)記反應(yīng)2h，反應(yīng)完成后保存于-20℃1）3μLRNA7μL(33%甲醛、50%2)3μL1200×100J/cm23min；6×SSC（FisherScientificInternationalInc.）68℃1h；20mL~40mL2×SSC0.1%SD