ICS11.220B41備案號：DB42Enzyme-linkedimmunosobenttestforthedetectionofavianinfluenzavirus湖北省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布IDB42/T791—2012前言 12縮略詞 13實驗原理 14實驗條件 15實驗材料 16樣品處理 27實驗方法 28結(jié)果判定 39注意事項 3 4DB42/T791—2012本標(biāo)準(zhǔn)按GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)提出。本標(biāo)準(zhǔn)由湖北省農(nóng)業(yè)廳歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院、武漢科前動物生物制品有限責(zé)任公司、湖北省動物疫病預(yù)防控制中心。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：金梅林、張安定、董曉輝、鐘廣漢、徐高原、陳煥春、郭學(xué)波、孫小美、李淑云、周艷君。DB42/T791—2012高致病性禽流感（HighlyPathogenicAvianInfluenza,HPAI）是嚴(yán)重威脅養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的烈性傳染病，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的損失。禽流感病毒具有多型、易變的特點(diǎn)。近年來禽流感病毒（AvianInfluenzaVirus,AIV）跨越了中間宿主直接感染人類，對公共衛(wèi)生安全的威脅引起了廣泛的關(guān)注。本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了禽類的咽/鼻拭子、肛拭子、內(nèi)臟組織、雞胚尿囊液、細(xì)胞培養(yǎng)物中禽流感病毒的ELISA檢測方法。該方法具有良好的特異性和敏感性，準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好，適用于臨床大量樣品的快速檢測和禽流感診斷。DB42/T791—20121禽流感病毒ELISA檢測方法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了禽流感病毒ELISA檢測方法的縮略詞、實驗原理、實驗條件、實驗材料、樣品處理、實驗步驟、結(jié)果判定和注意事項等。本標(biāo)準(zhǔn)適用于禽類咽/鼻拭子、肛拭子、內(nèi)臟組織、雞胚尿囊液、細(xì)胞培養(yǎng)物中禽流感病毒的檢測。2縮略詞下列縮略詞適用于本標(biāo)準(zhǔn)。ELISA(enzyme-linkedimmunosorbentassay):酶聯(lián)免疫吸附試驗OD630nm值:630納米波長處的吸光值HRP:辣根過氧化物酶S:樣品測定孔OD630nm值3實驗原理本方法使用抗禽流感病毒核蛋白的單克隆抗體包被固相載體酶標(biāo)板。加入供試樣品后，如果樣品中含有禽流感病毒即可發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，再加入兔抗禽流感病毒的多克隆抗體，能繼續(xù)反應(yīng)形成抗原抗體復(fù)合物，并和相應(yīng)的酶結(jié)合物結(jié)合，在遇到相應(yīng)的底物時，復(fù)合物中的酶能催化底物反應(yīng)發(fā)生顯色。其顯色的深淺與相應(yīng)的抗體量成正比，可借助OD630nm值的大小進(jìn)行定性判斷。4實驗條件4.1實驗室實驗操作宜在常溫（18℃~25℃)進(jìn)行。4.2儀器臺式低溫高速離心機(jī)、微量移液器、冰箱、恒溫箱、酶標(biāo)檢測儀。4.3人員注意個人防護(hù)和環(huán)境保護(hù)。5實驗材料5.1抗禽流感病毒單克隆抗體。5.2酶標(biāo)板：96孔板，可拆。5.3兔抗禽流感病毒的多克隆抗體：由滅活的禽流感病毒免疫家兔制備。2DB42/T791—20125.4酶結(jié)合物：HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體。5.5陽性對照：含禽流感病毒的雞胚尿囊液滅活處理。5.6陰性對照：未接種禽流感病毒的雞胚尿囊液。5.7其他試劑包被液、封閉液、洗滌液、樣品處理液A、樣品處理液B、底物液A、底物液B、終止液（見附錄A）6樣品處理6.1咽/鼻拭子、肛拭子用無菌棉拭子于禽的咽喉或鼻腔、泄殖腔中沾取滲出液，然后浸泡于1mL樣品處理液B中，渦旋儀震蕩1min后擠出棉拭子中的液體，凍融3次后于37℃孵育15min，12,000r/min離心5min，取上清。6.2內(nèi)臟組織剪取組織塊約1g，置于勻漿器中，加入1mL樣品處理液A后勻漿，凍融3次后，置于37℃下15min，10,000r/min離心5min，取上清。6.3雞胚尿囊液用樣品處理液B等體積稀釋后，置于37℃15min，每隔3min～5min混勻1次，10,000r/min離心30sec～60sec，取上清。6.4細(xì)胞培養(yǎng)物細(xì)胞培養(yǎng)物可直接用于檢測或者凍融一次后檢測。7實驗方法7.1抗禽流感病毒的單克隆抗體用包被液稀釋到工作濃度（5μg/mL加入酶標(biāo)板，100μL/孔，37℃孵育2h。加入封閉液，200μL/孔，于37℃封閉2h，取出酶標(biāo)板在吸水紙上拍干，于2℃~8℃保存?zhèn)溆谩?.2取單抗包被板，先用洗滌液洗板1次，再加入處理好的待檢樣品，100μL/孔；加入陽性對照和陰性對照各1孔，100μL/孔，37℃孵育30min。7.3取出單抗包被板棄去孔中液體，在吸水紙上拍干，用洗滌液洗板3次，200μL/孔。每次靜置3min后倒掉液體，在吸水紙上拍干。7.4將兔抗禽流感病毒的多克隆抗體稀釋到工作濃度（10μg/mL），100μL/孔，37℃孵育30min。7.5重復(fù)7.3操作步驟。7.6加入酶結(jié)合物，100μL/孔，37℃孵育30min。7.7重復(fù)7.3操作步驟。7.8加入底物液A和底物液B，各50μL/孔，混勻，置室溫下（18℃~25℃)避光顯色10min。7.9加入終止液，50μL/孔，混勻。7.10用酶標(biāo)儀測定各孔的OD630nm值，應(yīng)在加入終止液后10min內(nèi)完成。8結(jié)果判定DB42/T791—201238.1ELISA試驗成立的條件為：陽性對照孔OD630nm值≥0.8；陰性對照孔OD630nm值＜0.2。8.2如果S≥0.3，判為陽性；如果S＜0.3，則判為陰性。9注意事項實驗過程中注意做好個人的生物安全防護(hù)措施，廢棄物應(yīng)做無害化處理。DB42/T791—20124（規(guī)范性附錄）試劑的配置A.1包被液碳酸鈉（Na2CO3）1.59g碳酸氫鈉（NaHCO3）2.93g加蒸餾水或去離子水定容至1000mL即可，置2℃~8℃保存?zhèn)溆?。A.2封閉液5g脫脂乳溶于100mL洗滌液。置2℃~8℃保存?zhèn)溆?。A.3洗滌液氯化鈉（NaCl）8g氯化鉀（KCl）0.2g磷酸氫二鈉（Na2HPO4?12H2O）2.9g磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.2gTween-200.5mL加蒸餾水或去離子水定容至1000mL即可，置2℃~8℃保存?zhèn)溆谩.4樣品處理液A四硼酸鈉（Na2B4O7?10H2O）13.3g硼酸（H3BO3）16.08g氯化鈉（NaCl）8.5g加蒸餾水或去離子水800mL，調(diào)pH值至8.4后定容至1000mL，置2℃~8℃保存?zhèn)溆谩.5樣品處理液BN-乙酰-L-半胱氨酸5gNP-405mL加1000mL經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌30min的樣品處理液A，置2℃~8℃保存?zhèn)溆?。A.6底物液A磷酸氫二鈉（Na2HPO4）14.6g檸檬酸9.33g過氧化氫脲0.52gDB42/T791—20125加蒸餾水或去離子水定容至1000mL，調(diào)至pH值至5.0～5.4，置2℃~8℃保存?zhèn)溆?。A.7底物液B磷酸氫二鈉（Na2HPO4?12H2O）14.2g檸檬酸