ICS11.220B41備案號：DB42Methodoftheenzyme-linkedimmunosobentassayforthedetectionofatibodies湖北省質量技術監(jiān)督局發(fā)布IDB42/T789—2011前言 12縮略詞 13實驗原理 14實驗條件 15實驗材料 16樣品處理 17實驗方法 28結果判定 29注意事項 2 3DB42/T789—2011本標準按GB/T1.1-2009《標準化工作導則第1部分：標準的結構和編寫》給出的規(guī)則起草。本標準由華中農業(yè)大學提出。本標準由湖北省農業(yè)廳歸口。本標準起草單位：華中農業(yè)大學動物醫(yī)學院、武漢科前動物生物制品有限責任公司、湖北省動物疫病預防控制中心。本標準主要起草人：金梅林、康超、張安定、鐘廣漢、周艷君、董曉輝、陳煥春、徐高原、孫小美、李淑云、宋念華。DB42/T789—2011豬鏈球菌（Streptococcussuis,SS）是一種能引起豬發(fā)病的重要致病菌，往往造成豬群感染和大量死亡，同時嚴重危害人類健康甚至導致死亡。根據(jù)莢膜多糖分型，豬鏈球菌可分為33個血清型，其中豬鏈球菌2型是毒力最強、流行最廣的血清型。為了有效地預防和控制豬鏈球菌2型病，制定了《豬鏈球菌2型ELISA抗體的檢測方法》，本方法快速、簡便，易操作，是監(jiān)測豬2型鏈球菌病的重要方法。DB42/T789—20111豬鏈球菌2型ELISA抗體檢測方法本標準規(guī)定了豬鏈球菌2型ELISA抗體的檢測方法的縮略詞、實驗原理、實驗條件、實驗材料、樣品處理、實驗方法、結果判定和注意事項等。本標準適用于檢測豬血清中的豬鏈球菌2型抗體。2縮略詞下列術語和定義適用于本文件。ELISA（enzyme-linkedimmunosorbentassay）：酶聯(lián)免疫吸附試驗OD630nm值：630納米波長處的吸光值3實驗原理酶聯(lián)免疫吸附試驗是將抗原吸附在固相載體上，加入待檢抗體，再加相應的酶標記抗體，生成抗原-待測抗體-酶標記抗體的復合物，再與該酶的底物反應生成有色產物。借助分光光度計的光吸收計算抗體的量。本方法中采用冷酚抽提法，提取并純化豬鏈球2型菌的莢膜多糖，以其作為包被抗原，建立檢測豬鏈球菌2型抗體的ELISA檢測方法。4實驗條件4.1實驗室實驗操作宜在常溫（18℃~25℃)進行。4.2儀器抗原包被板、微量移液器、移液器吸頭、酶標檢測儀、恒溫箱、冰箱。4.3人員注意個人防護和環(huán)境保護。5實驗材料20倍濃縮洗滌液、樣品稀釋液、酶標記抗體、底物液A、底物液B、終止液、陽性對照血清、陰性對照血清。配方見附錄A。6樣品處理2DB42/T789—20116.1樣品采集取動物全血，待血液凝固后，4,000r/min離心10min，收集上清。要求血清清亮，無溶血。6.2洗滌液配制使用前，將20倍濃縮洗滌液恢復至室溫（20℃~25℃),并搖動使沉淀溶解（37℃水浴鍋中加熱5min～10min然后用蒸餾水稀釋20倍，混勻，稀釋好的洗滌液在2℃~8℃貯存，7d內使用。6.3樣品和對照血清稀釋處理后的樣品按1:40的比例稀釋；陽性和陰性對照血清用樣品稀釋液按1:40稀釋。7實驗方法7.1取抗原包被板，用洗滌液洗板1次（200μL/孔）后在吸水紙上拍干。7.2加入稀釋好的樣品，每孔100μL，同時設陰、陽性對照孔，每孔100μL，置37℃作用30min。7.3棄去孔中的溶液，每孔加入稀釋好的洗滌液200μL，靜置3min后，棄去洗滌液，并在吸水紙上拍干，重復洗板5次。7.4加入酶標記抗體，100μL/孔，置37℃作用30min。7.5棄去孔中的溶液，每孔加入稀釋好的洗滌液200μL，靜置3min后，棄去洗滌液，并在吸水紙上拍干，重復洗板5次。7.6每孔加底物液A、底物液B各50μL，混勻，室溫避光顯色10min。7.7每孔加入終止液50μL，混勻后測定結果。7.8以空白對照孔調零，用酶標儀測定各孔的OD630nm值。測定結果必須在加入終止液后10min內完8結果判定試驗成立的條件是陽性對照孔OD630nm值≥0.8，陰性對照孔OD630nm值＜0.3。如果樣品OD630nm值≥0.35，判為陽性；如果樣品OD630nm值＜0.35，判為陰性。9注意事項實驗過程中注意做好個人的生物安全防護措施，廢棄物應做無害化處理。DB42/T789—20113（規(guī)范性附錄）試劑的配置A.1樣品稀釋液的配制脫脂乳50g氯化鈉（NaCl）160g氯化鉀（KCl）4g磷酸氫二鈉（Na2HPO4?12H2O）58g磷酸二氫鉀（kH2PO4）4gTween-205mL硫柳汞鈉0.1g加蒸餾水或去離子水定容至1000mL,經0.22μm濾膜過濾后，無菌分裝，50mL/瓶。A.220倍濃縮洗滌液的配制氯化鈉（NaCl）氯化鉀（KCl）4g磷酸氫二鈉（Na2HPO4?12H2O）58g磷酸二氫鉀（kH2PO4）4gTween-205mL加蒸餾水或去離子水定容至1000mL,經0.22μm濾膜過濾后，無菌分裝，50mL/瓶。A.3酶標記抗體的配制酶標記抗體0.2mL氯化鈉（NaCl）氯化鉀（KCl）4g磷酸氫二鈉（Na2HPO4?12H2O）58g磷酸二氫鉀（kH2PO4）4gTween-205mL硫柳汞鈉0.1g加蒸餾水或去離子水定容至1000mL,經0.22μm濾膜過濾后，無菌分裝，20mL/瓶。A.4底物液A的配制磷酸氫二鈉（Na2HPO4）14.6g檸檬酸9.33g過氧化氫脲0.52gDB42/T789—20114加蒸餾水或去離子水定容至1000mL，調至pH值至5.0～5.4,經0.22μm濾膜過濾后，無菌分裝，12mL/瓶。A.5底物液B的配制無水乙醇10mL聯(lián)苯二胺(TMB)