ICS11.220B41備案號：DB42MethodoftheEnzyme-linkedimmunosobentassayforthedetectionofantibodiesagainstswineinfluenzavirus(su湖北省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布IDB42/T788—2012前言 12縮略詞 13實(shí)驗(yàn)原理 14實(shí)驗(yàn)條件 15實(shí)驗(yàn)材料 16實(shí)驗(yàn)方法 27結(jié)果判定 38注意事項(xiàng) 3 4DB42/T788—2012本標(biāo)準(zhǔn)按GB/T1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫》給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)提出。本標(biāo)準(zhǔn)由湖北省農(nóng)業(yè)廳歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院、武漢科前動(dòng)物生物制品有限責(zé)任公司、湖北省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：金梅林、郭學(xué)波、楊影、陳煥春、徐高原、鐘廣漢、宋念華、田峰、董曉輝、孫小美、李淑云。DB42/T788—2012豬流感病毒(SwineInfluenzaVirus,SIV)屬正粘病毒科，可引起豬流行性感冒(SwineInfluenza,SI)。在豬群中廣泛流行的SIV主要是古典型H1N1和類禽型H1N1，可引起豬咳嗽、呼吸困難、發(fā)熱和衰竭等癥狀易暴發(fā)流行。由于SIV對呼吸道上皮的高度特異親嗜性而使呼吸道管壁上皮受損，導(dǎo)致豬鏈球菌、胸膜肺炎放線桿菌、副豬嗜血桿菌、巴氏桿菌等細(xì)菌和豬呼吸道冠狀病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒等的繼發(fā)或混合感染，使病情更為復(fù)雜。為開展豬流感的免疫監(jiān)測，了解豬群豬流感病毒抗體水平，指導(dǎo)豬流感免疫預(yù)防工作，特制定本標(biāo)準(zhǔn)。DB42/T788—20121豬流感病毒(H1亞型)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)抗體檢測方法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了豬流感病毒(H1亞型)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)抗體檢測方法的縮略詞、實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)條件、實(shí)驗(yàn)材料、實(shí)驗(yàn)方法、結(jié)果判定和注意事項(xiàng)等。本標(biāo)準(zhǔn)適用于豬血清中的流感病毒抗體的檢測。2縮略詞下列縮略詞適用于本文件。ELISA（enzyme-linkedimmunosorbentassay）：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)OD630nm值：630納米波長處的吸光值HRP：辣根過氧化物酶HI法：血凝抑制試驗(yàn)法S：樣品孔OD630nm值P：陽性對照孔OD630nm平均值3實(shí)驗(yàn)原理應(yīng)用酶聯(lián)免疫原理制成檢測豬流感病毒（H1亞型）抗體的間接ELISA方法。利用抗原抗體反應(yīng)的特異性，將特異性的豬流感病毒（H1亞型）抗原吸附到固相載體的表面后，待檢物中若含有相應(yīng)的抗體，則可與所包被的抗原相結(jié)合，并能進(jìn)一步和酶標(biāo)記抗體結(jié)合形成復(fù)合物。在遇到相應(yīng)的底物時(shí)，復(fù)合物中的酶能催化底物發(fā)生顯色反應(yīng)。其顯色的深淺與相應(yīng)的抗體量成正相關(guān)，可借助OD630nm值的大小進(jìn)行定性判斷。4實(shí)驗(yàn)條件4.1實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)操作宜在常溫（18℃~25℃)進(jìn)行。4.2儀器臺式低溫高速離心機(jī)、微量移液器、冰箱、恒溫箱、酶標(biāo)儀。4.3人員注意個(gè)人防護(hù)和環(huán)境保護(hù)。5實(shí)驗(yàn)材料2DB42/T788—20125.1豬流感病毒（H1亞型）抗原（見附錄A.8）。5.2酶標(biāo)板：96孔板，可拆。5.3酶標(biāo)記抗體（見附錄A.9）。5.4陽性對照血清（見附錄A.10）。5.5陰性對照血清（見附錄A.11）。5.6其它試劑包被液、封閉液、洗滌液、樣品稀釋液、底物液A、底物液B、終止液。試劑配方及要求見附錄A。6實(shí)驗(yàn)方法6.1樣品采集將采集的豬全血靜置30min，收集上清備用。6.2抗原包被板制備取豬流感病毒（H1亞型）抗原用包被液稀釋到工作濃度（2.5μg/mL），加入酶標(biāo)板，100μL/孔，37℃孵育2h。棄去孔中液體，拍干。加入封閉液，200μL/孔，于37℃封閉2h，取出酶標(biāo)板棄去孔中液體在吸水紙上拍干，于2℃~8℃保存，可保存7d。6.3樣品稀釋在血清稀釋板中按1:40的比例稀釋樣品（例如：195μL樣品稀釋液中加入5μL樣品，即為1:40稀釋）。稀釋好的樣品可在2℃~8℃保存7d。6.4加樣取出抗原包被板（根據(jù)樣品多少，可拆開分次使用先用洗滌液洗板1次，再將稀釋好的樣品取加入抗原包被板，100μL/孔。同時(shí)設(shè)2孔陰性對照、2孔陽性對照及1孔空白對照，輕輕振勻孔中樣品（勿溢出），置37℃下孵育30min。6.5洗滌取出抗原包被板棄去孔中液體，在吸水紙上拍干，用洗滌液洗板3次，200μL/孔。每次靜置3min后倒掉液體，在吸水紙上拍干。6.6加酶標(biāo)記抗體取酶標(biāo)記抗體用樣品稀釋液稀釋到工作濃度，加入酶標(biāo)板，100μL/孔，37℃孵育30min。按6.5中方法洗板3次。6.7加底物液每孔加底物液A和底物液B各50μL，混勻，置室溫下（18℃~25℃)避光顯色10min。6.8加終止液每孔加終止液50μL，輕輕振蕩混勻。6.9測定結(jié)果DB42/T788—20123以空白對照孔調(diào)零，用酶標(biāo)儀測定各孔的OD630nm值。測定結(jié)果必須在加入終止液后10min內(nèi)完成。7結(jié)果判定7.1試驗(yàn)成立的條件是兩個(gè)陽性對照孔的OD630nm值相差應(yīng)＜0.3；兩個(gè)陽性對照孔OD630nm值均應(yīng)≥0.8，且＜1.6。兩個(gè)陰性對照孔OD630nm值均應(yīng)＜0.2。7.2如果S≥0.3，判為陽性；如果S＜0.3，則判為陰性。8注意事項(xiàng)實(shí)驗(yàn)過程中注意做好個(gè)人的生物安全防護(hù)措施，廢棄物應(yīng)做無害化處理。DB42/T788—20124（規(guī)范性附錄）試劑的配制A.1包被液的配制碳酸鈉（Na2CO3）1.59g碳酸氫鈉（NaHCO3）2.93g加蒸餾水或去離子水定容至1000mL即可，置2℃~8℃下保存。A.2封閉液的配制5g牛血清白蛋白（BSA）溶于1000mL洗滌液。置2℃~8℃下保存。A.3洗滌液的配制氯化鈉（NaCl）8g氯化鉀（KCl）0.2g磷酸氫二鈉（Na2HPO4?12H2O）2.9g磷酸二氫鉀（KH2PO4）0.2gTween-200.5mL加蒸餾水或去離子水定容至1000mL即可。置2℃~8℃下保存。A.4樣品稀釋液的配制牛血清白蛋白（BSA）5.0g二甲基亞砜（DMSO）10mL加洗滌定容至1000mL。置2℃~8℃下保存。A.5底物液A的配制磷酸氫二鈉（Na2HPO4）檸檬酸（C6H8O7）9.33g過氧化脲（CH6N2O3）0.52g加蒸餾水至1000mL用鹽酸調(diào)pH值至5.0～5.4，置2℃~8℃下保存。A.6底物液B的配制四甲基聯(lián)苯胺（TMB）20mg無水乙醇（C2H6O）10mLDB42/T788—20125加蒸餾水至1000mL置2℃~8℃下避光保存。A.7終止液的配制40%的氫氟酸(HF)625μL加蒸餾水至100mL置2℃~8℃下保存。A.8豬流感病毒（H1亞型）抗原豬流感病毒（H1亞型）抗原由基因工程技術(shù)表達(dá)獲得。-20℃下保存?zhèn)溆?。A.9酶標(biāo)記