ICS65.020.30CCSB4142ColloidalgoldstripstestfordetectingofH7subtypeavianinfluenzaI前言 2規(guī)范性引用文件 3術(shù)語和定義 4檢測原理 5檢測條件 6檢測方法 7結(jié)果判定 附錄A（規(guī)范性）試劑配制 附錄B（資料性）H7亞型禽流感病毒單克隆抗體的制備 附錄C（資料性）膠體金試紙條的制備 8附錄D（資料性）樣品處理注意事項 9本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由華中農(nóng)業(yè)大學提出。本文件由湖北省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳歸口。本文件起草單位：華中農(nóng)業(yè)大學、武漢科前生物股份有限公司。本文件主要起草人：金梅林、范俊青、李冉、董俊、王園園、但漢并、鄒忠、董曉輝、徐高原。本文件實施應用中的疑問，可咨詢湖北省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳，聯(lián)系電話郵箱：hbsnab@126.com；華中農(nóng)業(yè)大學，聯(lián)系電話郵箱：xys@。對本文件的有關(guān)修改意見建議請反饋至華中農(nóng)業(yè)大學，電話郵箱：jml8328@126.com。禽流感（avianinfluenza,AI）是由甲型流感病毒感染引起的禽類急性傳染病。按照致病力的強弱可分為無致病性禽流感、低致病性禽流感、中致病性禽流感和高致病性禽流感。禽流感病毒H7亞型屬于高致病性禽流感，OIE將高致病性禽流感列為必須上報的傳染病，我國將其列為是優(yōu)先防治和重點防范的人獸共患病。目前，檢測H7亞型禽流感病毒的方法主要是熒光定量PCR方法，該方法的優(yōu)點是敏感性高，缺點是對操作人員的專業(yè)素養(yǎng)要求高，試驗條件苛刻，儀器使用昂貴。H7亞型禽流感病毒的膠體金檢測方法，是一種現(xiàn)場快速檢測H7亞型禽流感病毒的方法，該方法有利于該病的早發(fā)現(xiàn)、早報告、早處置，為防控節(jié)省時間；同時給臨床檢測提供一種簡單，便捷的檢測工具，使高通量檢測成為可能，從而切實為實際生產(chǎn)提供便利。1H7亞型禽流感病毒膠體金試紙條抗原檢測方法本文件規(guī)定了H7亞型禽流感病毒膠體金試紙條抗原檢測的術(shù)語和定義、檢測原理、檢測條件、檢測方法、結(jié)果判定。本文件適用于H7亞型禽流感病毒的檢測。2規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。4檢測原理本文件采用雙抗夾心檢測抗原的方法制備膠體金試紙條，屬于一步式固相膜反應。首先制備兩株具有夾心效果的H7亞型禽流感病毒單克隆抗體，一株單抗包被在硝酸纖維素膜上，另一株單抗進行膠體金標記，固定在金墊上。在加樣孔處（A）加入待檢樣品時，待檢樣品中的抗原先與膠體金標記的單抗進行反應，形成肉眼可見的紅色金標抗體-抗原結(jié)合物。然后，經(jīng)毛細管作用，該紅色結(jié)合物繼續(xù)層析向前移動，與硝酸纖維素膜上的單抗結(jié)合，在觀察窗口的檢測線（T）處，紅色結(jié)合物中的抗原被此處預先包被在纖維素膜上的抗體捕獲并截留下來，隨著紅色結(jié)合物截留量增多，逐漸形成一條紅線，因此根據(jù)紅色T線的出現(xiàn)即可判定樣品為陽性。如果樣品中沒有抗原，則不形成紅色金標抗體-抗原結(jié)合物，流過T線時，不發(fā)生捕獲截留，T線保持白色，判定樣品為陰性。（檢測時質(zhì)控線（C）處出現(xiàn)紅線檢測結(jié)果有效）膠體金試紙條結(jié)構(gòu)如圖1所示：SASCTCT注：A：加樣孔；S：檢測區(qū)；T：檢測線；C：質(zhì)控線圖1膠體金試紙條結(jié)構(gòu)示意圖25檢測條件5.1儀器與耗材Ⅱ級生物安全柜或者超凈工作臺、冷凍離心機（轉(zhuǎn)速12,000r/min）、電子天平（0.01g-300g）、玻璃勻漿器（5mL）、微量可調(diào)移液器（200μL、1mL）、槍頭（200μL、1mL）、離心管（1.5mL、2mL、5mL）。5.2試劑H7亞型禽流感病毒單克隆抗體、樣本處理液、生理鹽水試劑配制方法見附錄A。H7亞型禽流感病毒單克隆抗體的制備、純化及鑒定見附錄B。6檢測方法6.1樣品處理6.1.1泄殖腔拭子檢測樣本的處理將采集的泄殖腔棉拭子插入到含有處理液的離心管中，充分混合，置低溫冷凍離心機4℃、12,000r/min離心10min，取上清待檢。6.1.2內(nèi)臟組織檢測樣本的處理稱取內(nèi)臟組織塊0.5g，置于勻漿器中，加生理鹽水1mL，研磨完全后取出組織浸出液至離心管中，然后置低溫冷凍離心機4℃、12,000r/min離心10min，取上清待檢。6.1.3雞胚分離病毒尿囊液樣本的處理收集尿囊液至離心管中，置低溫冷凍離心機4℃、12,000r/min離心2min，取上清待檢。6.1.4細胞培養(yǎng)病毒樣本的處理細胞培養(yǎng)液可直接用于檢測或者凍融一次后檢測。6.1.5樣品處理過程中應防止樣品的污染，注意個人安全防護，具體注意事項見附錄D。6.2加樣取出2℃~8℃保存的膠體金試紙條，并恢復至15℃~25℃。取100μL經(jīng)樣品稀釋液處理好的上清加入加樣孔A中，水平放置15min，觀察結(jié)果。膠體金試紙條的制備過程見附錄C。7結(jié)果判定7.1陽性結(jié)果在試紙條上出現(xiàn)兩條紅色條帶（T檢測線和C質(zhì)控線）（見圖2）。7.2陰性結(jié)果在試紙條上僅出現(xiàn)一條紅色條帶（C質(zhì)控線見圖3）。7.3無效結(jié)果無紅色條帶出現(xiàn)（見圖4）。3圖2陽性結(jié)果圖3陰性結(jié)果圖4無效結(jié)果4試劑配制A.1樣本處理液Trisbase24.2g，Triton-x1000.1mL，加蒸餾水至1000mL，調(diào)pH值為9.0。A.2生理鹽水氯化鈉（NaCl）8.5g，加蒸餾水至1000mL。5（資料性）H7亞型禽流感病毒單克隆抗體的制備B.1單克隆抗體的制備B.1.1免疫原禽流感病毒H7亞型血凝抑制試驗抗原，加入pH值7.4的PBS2mL溶解，重懸后的溶液加入等體積飽和硫酸銨攪勻，置2℃~8℃作用15h后，2℃~8℃8000r/min離心40min，收集沉淀物加入原病毒液1/20體積的生理鹽水溶解，裝透析袋內(nèi)，用PBS透析15h除鹽。最后，利用超微量核酸蛋白測定儀測定濃縮抗原液的蛋白含量，加入終濃度為0.04％硫柳汞鈉，并調(diào)整病毒液的蛋白濃度至2±0.05mg/mL，同時用HA試驗檢測該病毒液的效價，當其HA效價≥28即可作為免疫原。B.1.2小鼠免疫首次免疫取免疫原與弗氏完全佐劑按照體積1:1進行乳化，6周齡～8周齡雌性BALB/c小鼠3只，皮下分點注射200μg/只，每個點約注射20μg。以后每間隔2周免疫一次，第二、三次免疫將免疫原與弗氏不完全佐劑乳化，皮下分點注射100μg/只。第三次免疫后一周后，自小鼠尾靜脈采血用ELISA法檢測血清抗體效價，選擇效價高的小鼠在融合前3天腹腔注射抗原（不含佐劑）約200μg進行加強免疫。B.1.3骨髓瘤細胞的培養(yǎng)融合前一周復蘇SP2/0骨髓瘤細胞，培養(yǎng)在含20%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中。選擇處于對數(shù)生長期的SP2/0，以RPMI1640培養(yǎng)基洗滌兩次后，用約10mLRPMI1640培養(yǎng)基將其吹下。收集于50mL離心管，1000r/min離心5min，棄上清液，輕輕敲打管底使細胞松散，加入10mLRPMI1640培養(yǎng)基重懸細胞。將細胞懸液10倍稀釋后計數(shù)，準備融合。B.1.4免疫脾細胞的制備取加強免疫4天后的小鼠，摘取眼球眼眶放血，獲得陽性血清，脫頸無菌取出脾臟，先用RPMI1640培養(yǎng)基洗滌數(shù)次，去除附著的結(jié)締組織；再將脾臟移入另一置有300目微孔濾網(wǎng)的新鮮RPMI1640培養(yǎng)基中，眼科剪刀剪開一個小口，用研磨棒輕輕擠壓，釋放脾細胞，制成脾細胞懸液，移至10mL離心管中，置37℃,含5%二氧化碳的培養(yǎng)箱內(nèi)自然沉降10min，吸取上層細胞懸液于50mL離心管中，再加入3mLRPMI1640培養(yǎng)基重復洗滌2次。以1000r/min離心10min，棄上清液。加入10mLRPMI1640培養(yǎng)基重懸細胞。將細胞懸液10倍稀釋后計數(shù)。B.1.5飼養(yǎng)細胞的制備取空白BALB/c小鼠一只，摘取眼球眼眶放血，獲得陰性血清無菌取出脾臟，先用RPMI1640培養(yǎng)基洗滌2次，去除附著的結(jié)締組織；再將脾臟移入另一置有200目微孔濾網(wǎng)的RPMI1640培養(yǎng)基中，眼科剪刀剪開一個小口，用研磨棒輕輕擠壓，釋放脾細胞，制成脾細胞懸液，移至10mL離心管中，置37℃,含5%二氧化碳的培養(yǎng)箱內(nèi)自然沉降10min，吸取上層細胞懸液于50mL離心管中，再加入3mLRPMI1640培養(yǎng)基重復洗滌2次。以1000r/min離心10min，棄上清液。加入10mLRPMI1640培養(yǎng)基重懸細胞。B.1.6細胞融合將一瓶含20%胎牛血清、1%HAT的RPMI1640培養(yǎng)基、1mL50%PEG1450、放入37℃溫箱中預熱。將重6懸后的免疫脾細胞與骨髓瘤細胞在50mL離心管中混勻，1000r/min離心10min，棄去上清液，用濾紙將管壁上殘留的液體吸干，用手指尖輕輕彈管底，使兩種細胞充分混勻。吸取預熱的PEG溶液0.8mL，向細胞沉淀（離心管置于37℃水浴中）緩緩滴加，邊滴邊輕輕攪拌，在1min內(nèi)加完。靜置30秒，之后3min內(nèi)加入預熱的RPMI1640培養(yǎng)基3mL，終止PEG的作用。余下的17mL培養(yǎng)基在2min內(nèi)加完。融合完成后，1000r/min離心10min，棄上清液。將沉淀的細胞輕輕懸浮于20%胎牛血清、1%HAT的RPMI1640培養(yǎng)基中，加入適量的飼養(yǎng)細胞后，置于96孔細胞培養(yǎng)板中，約200μL/孔，置37℃,含5%二氧化碳的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。第五天補加1滴HAT培養(yǎng)基，第8天棄去孔中液體，補加200μLHAT培養(yǎng)基，待融合集落長至孔底面積的1/4時，取上清進行抗體檢測。B.1.7陽性雜交瘤細胞篩選用禽流感病毒H7亞型HI試驗篩選陽性雜交瘤細胞。將細胞上清作為待檢樣品加入反應板中，同時設(shè)定SP2/0細胞培養(yǎng)上清作為陰性對照，免疫小鼠血清做為陽性對照。B.1.8有競爭效果的細胞株的篩選用禽流感病毒H7亞型HI試驗篩選出陽性血清1份，陰性血清1份。將篩選出的陽性血清和陰性血清用樣品稀釋液2倍稀釋，加入包被好的酶標板中，100μL/孔，37℃作用30min。棄去孔中液體，洗滌5次，每孔加入100μL，37℃作用30min。洗滌5次，拍干，每孔加底物顯色液100μL，室溫顯色15min。每孔加入50μL終止液，用酶標儀進行測定各孔OD450nm值。B.1.9雜交瘤細胞的亞克隆采用有限稀釋法對連續(xù)3次檢測均為陽性且HI抗體效價高者進行亞克隆。首先制備小鼠飼養(yǎng)細胞，鋪于96孔細胞板中，100μL/孔；將陽性孔中的雜交瘤細胞用培養(yǎng)基吹下，細胞計數(shù)，用有限稀釋法按照5:3:1的比例(即96孔板的前四排細胞數(shù)為5個/孔，中間四排細胞數(shù)為3個/孔，最后四排細胞數(shù)為1個/孔)加入96孔板，置37℃,含5%二氧化碳的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，第7日用新的培養(yǎng)基置換出96孔板中培養(yǎng)基，以后每天觀察，待上清變黃對出現(xiàn)單個細胞克隆孔用ELISA方法進行檢測；連續(xù)3次亞克隆且檢測陽性者可以定株。將定株的單克隆細胞擴大至24孔板，長滿后轉(zhuǎn)至6孔板，最后擴大培養(yǎng)至25cm2細胞培養(yǎng)瓶中，一部分凍存，每株雜交瘤細胞保存6份；一部分擴大培養(yǎng)用于制備腹水。B.1.10腹水法制備單克隆抗體選用8周齡～10周齡BALB/c雌性小鼠，腹腔注射滅菌液體石蠟，0.5mL/只；1周后腹腔注射用PBS稀釋的處于對數(shù)生長期的雜交瘤細胞，1×105個/只；7日～10日后采集腹水，1200r/min離心10min，去除脂肪組織，吸取上清，-70℃及以下保存?zhèn)溆?。B.2單克隆抗體的純化及驗證B.2.1腹水單克隆抗體的純化將上述腹水取1mL，加入4mLpH值4.5醋酸緩沖液，加入辛酸25μL，攪拌30min，靜置2h。12000r/min離心10min；棄沉淀，上清用濾紙過濾后將pH值調(diào)至7.4，緩慢逐滴加入上述液體體積45%的飽和硫酸銨溶液，繼續(xù)攪拌30min，在2℃~8℃靜置2h；以12000r/min離心30min，棄上清。用原腹水1/2體積的10mmol/LTris-HCL（pH值9.0）將沉淀重懸，轉(zhuǎn)入透析袋中，在10mmol/LTris-HCL（pH值9.0）中2℃~8℃透析15h。超微量核酸蛋白測定儀測定單克隆抗體濃度，分裝，-70℃及以下保存。B.2.2單克隆抗體的鑒定7B.2.3濃度將純化后的單克隆抗體用超微量核酸蛋白測定儀測定蛋白濃度，濃度為4.2mg/mL。B.2.4純度用SDS電泳檢測單抗純度，結(jié)果見圖B.1。電泳顯示結(jié)果應為兩條清晰的目的條帶（在50KD和25KD附近各有一條清晰的目的條帶，分別為重鏈和輕鏈），無其他雜帶。圖B.1單克隆抗體的純度鑒定8FORMTEXTDB42/T丄FO（資料性）膠體金試紙條的制備C.1膠體金的制備向潔凈的錐形瓶中加入100mL注射用水，再加入1mL1%氯金酸溶液（氯金酸1g，溶于100mL蒸餾水中放于微波爐內(nèi)，中火加熱至沸騰，快速加入1.8mL的1.05%檸檬酸三鈉溶液后繼續(xù)加熱至溶液顏色為穩(wěn)定的酒紅色，室溫下自然冷卻，最后用雙蒸水定容至100mL，即為膠體金溶液。C.2金標抗體的制備將所得的膠體金用0.2mol/L碳酸鉀調(diào)節(jié)pH值到9.0，加入單克隆抗體，每1mL膠體金溶液的最適單抗標記量為8.0ug，緩慢攪拌45min，得單克隆抗體-膠體金標記物，在攪拌下加入0.5mL5%PEG20000溶液封閉30min。將標記好的膠體金溶液8000rpm離心30min后用10mMTris-HCl（pH9.0）重懸。即獲得金標抗體。C.3膠體金結(jié)合墊的制備C.3.1配制金墊處理液10mMTris-HCl，0.45%PVP-40，0.45%Tween-20，0.5%SDS-L+SDS-F，3%海藻糖，攪拌混勻后0.22uM濾器過濾備用。C.3.2金墊制備將玻璃纖維素膜浸泡在上述處理液中30min，37℃鼓風箱中烘干。將制備的金標抗體噴