傳染病病毒中和抗體檢測(cè)操作規(guī)范一、引言中和抗體（neutralizingantibody,NAb）是機(jī)體針對(duì)病毒表面抗原（如包膜蛋白）產(chǎn)生的特異性免疫球蛋白，通過(guò)與病毒結(jié)合阻止其進(jìn)入細(xì)胞或抑制其復(fù)制，是評(píng)估機(jī)體免疫保護(hù)力的核心指標(biāo)。中和抗體檢測(cè)在傳染病診斷（如隱性感染或既往感染判斷）、疫苗有效性評(píng)價(jià)（如疫苗接種后中和抗體滴度與保護(hù)力的相關(guān)性）、流行病學(xué)調(diào)查（如人群免疫水平監(jiān)測(cè)）中具有不可替代的作用。然而，中和抗體檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性高度依賴標(biāo)準(zhǔn)化操作流程。標(biāo)本采集不當(dāng)、試劑質(zhì)量不合格、檢測(cè)方法不規(guī)范等因素均可能導(dǎo)致結(jié)果偏差，影響臨床決策或疫苗研發(fā)的可靠性。因此，制定統(tǒng)一、規(guī)范的操作指南，對(duì)保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性、可比性和重復(fù)性至關(guān)重要。二、標(biāo)本采集與處理標(biāo)本的質(zhì)量直接影響中和抗體檢測(cè)結(jié)果，需嚴(yán)格遵循以下規(guī)范：（一）標(biāo)本類型優(yōu)先選擇血清（最常用）或血漿（如EDTA、肝素抗凝血漿）；全血標(biāo)本需盡快分離血清/血漿，避免溶血。（二）采集方法1.靜脈血采集：使用一次性無(wú)菌注射器采集靜脈血5-10ml，置于無(wú)抗凝劑的干燥管（血清）或含EDTA/肝素的抗凝管（血漿）中。2.注意事項(xiàng)：避免溶血：溶血會(huì)釋放血紅蛋白，干擾抗體與病毒的結(jié)合，導(dǎo)致假陰性結(jié)果；避免凝血：血清標(biāo)本需室溫靜置30-60分鐘待自然凝血，避免劇烈震蕩；避免污染：采集過(guò)程中嚴(yán)格無(wú)菌操作，防止細(xì)菌或真菌污染。（三）處理與保存1.分離血清/血漿：采集后2小時(shí)內(nèi)以3000rpm離心10分鐘，分離血清（無(wú)抗凝劑管）或血漿（抗凝管）。2.短期保存：若24小時(shí)內(nèi)檢測(cè)，可置于4℃冰箱；若需長(zhǎng)期保存，需分裝后置于-20℃（≤1個(gè)月）或-80℃（≥6個(gè)月）冰箱，避免反復(fù)凍融。3.運(yùn)輸條件：標(biāo)本運(yùn)輸需符合生物安全要求，短期運(yùn)輸（≤24小時(shí)）可置于4℃冰袋；長(zhǎng)期運(yùn)輸需置于-80℃干冰。三、試劑與設(shè)備（一）試劑選擇1.病毒株：應(yīng)使用符合國(guó)家或國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)株（如WHO推薦的新冠病毒SARS-CoV-2標(biāo)準(zhǔn)株）或當(dāng)?shù)亓餍兄辏ㄈ缃诜蛛x的優(yōu)勢(shì)毒株）。病毒株需經(jīng)過(guò)純度驗(yàn)證（無(wú)細(xì)菌、真菌或支原體污染），并保存于-80℃或液氮中。2.細(xì)胞系：選擇對(duì)目標(biāo)病毒敏感的細(xì)胞系（如新冠病毒用VeroE6細(xì)胞、乙肝病毒用HepG2細(xì)胞、流感病毒用MDCK細(xì)胞）。細(xì)胞系需經(jīng)過(guò)支原體檢測(cè)，確保無(wú)污染，且傳代次數(shù)不超過(guò)20代。3.中和抗體標(biāo)準(zhǔn)品：使用國(guó)家或國(guó)際認(rèn)可的標(biāo)準(zhǔn)品（如WHO的新冠病毒中和抗體標(biāo)準(zhǔn)品），用于校準(zhǔn)檢測(cè)系統(tǒng)，保證結(jié)果的可比性。4.檢測(cè)試劑：根據(jù)檢測(cè)方法選擇相應(yīng)試劑（如PRNT用瓊脂糖、中性紅染色液；MNT用細(xì)胞維持液；PVNT用報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒）。試劑需在有效期內(nèi)使用，外觀無(wú)渾濁、沉淀等異常。（二）設(shè)備要求1.核心設(shè)備：生物安全柜（BSL-2級(jí)及以上）、CO?培養(yǎng)箱（37℃、5%CO?）、離心機(jī)（≥3000rpm）、倒置顯微鏡（用于觀察細(xì)胞病變或蝕斑）、酶標(biāo)儀/熒光顯微鏡（用于PVNT的報(bào)告基因檢測(cè)）。2.輔助設(shè)備：移液器（10μl、100μl、1000μl，校準(zhǔn)合格）、培養(yǎng)皿（6孔/24孔/96孔，無(wú)菌）、吸頭（帶濾芯，避免交叉污染）。四、檢測(cè)方法中和抗體檢測(cè)的常用方法包括蝕斑減少中和試驗(yàn)（PRNT）、微量細(xì)胞中和試驗(yàn)（MNT）、假病毒中和試驗(yàn)（PVNT），各方法的原理、適用場(chǎng)景及操作步驟如下：（一）蝕斑減少中和試驗(yàn)（PlaqueReductionNeutralizationTest,PRNT）原理：通過(guò)檢測(cè)標(biāo)本中中和抗體對(duì)病毒蝕斑形成的抑制作用，定量中和抗體滴度（以50%蝕斑減少劑量，ND??表示）。適用場(chǎng)景：金標(biāo)準(zhǔn)方法，用于疫苗有效性評(píng)價(jià)、病毒株致病性研究等。操作步驟：1.細(xì)胞制備：將敏感細(xì)胞（如VeroE6）接種于6孔培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO?培養(yǎng)24-48小時(shí)，至細(xì)胞形成單層。2.病毒稀釋：用維持液（含2%胎牛血清的DMEM）將病毒株稀釋至____PFU/ml（蝕斑形成單位/毫升）。3.標(biāo)本稀釋：將待檢測(cè)血清用維持液進(jìn)行倍比稀釋（如1:10、1:20、1:40……1:1280），設(shè)置陰性對(duì)照（無(wú)中和抗體的血清）、陽(yáng)性對(duì)照（已知ND??的標(biāo)準(zhǔn)血清）。4.病毒-標(biāo)本孵育：將稀釋后的標(biāo)本與等量病毒液混合（如100μl標(biāo)本+100μl病毒液），37℃孵育1-2小時(shí)，使中和抗體與病毒結(jié)合。5.接種細(xì)胞：吸去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，加入病毒-標(biāo)本混合液（每孔500μl），37℃孵育1小時(shí)（期間輕輕搖晃培養(yǎng)皿，使病毒均勻吸附）。6.覆蓋瓊脂：吸去未吸附的病毒液，加入瓊脂糖維持液（1.5%瓊脂糖+維持液，45℃預(yù)熱），每孔3ml，待凝固后倒置培養(yǎng)。7.孵育與染色：37℃、5%CO?培養(yǎng)3-5天，至蝕斑形成。加入中性紅染色液（0.1%），37℃孵育1-2小時(shí)，清晰顯示蝕斑。8.計(jì)數(shù)與計(jì)算：計(jì)數(shù)每孔的蝕斑數(shù)量，計(jì)算各稀釋度的蝕斑減少率（%）：\[\text{蝕斑減少率}=\frac{\text{陰性對(duì)照蝕斑數(shù)}-\text{標(biāo)本蝕斑數(shù)}}{\text{陰性對(duì)照蝕斑數(shù)}}\times100\%\]采用Reed-Muench法計(jì)算ND??（詳見(jiàn)“五、結(jié)果判定”部分）。注意事項(xiàng)：蝕斑計(jì)數(shù)需由經(jīng)驗(yàn)豐富的技術(shù)人員完成，避免重復(fù)或遺漏；瓊脂糖維持液需保持45℃預(yù)熱，避免凝固；陰性對(duì)照的蝕斑數(shù)需與預(yù)期一致（無(wú)減少），陽(yáng)性對(duì)照的ND??需在已知范圍內(nèi)（±2倍稀釋度）。（二）微量細(xì)胞中和試驗(yàn)（MicroneutralizationTest,MNT）原理：通過(guò)觀察標(biāo)本中中和抗體對(duì)病毒引起的細(xì)胞病變效應(yīng)（CytopathicEffect,CPE）的抑制作用，判斷中和抗體的存在及滴度。適用場(chǎng)景：操作簡(jiǎn)便、適合批量檢測(cè)，用于臨床常規(guī)診斷、人群免疫水平監(jiān)測(cè)。操作步驟：1.細(xì)胞制備：將敏感細(xì)胞（如HepG2）接種于96孔培養(yǎng)板中，37℃、5%CO?培養(yǎng)24小時(shí)，至細(xì)胞形成單層。2.標(biāo)本稀釋：將待檢測(cè)血清用維持液進(jìn)行倍比稀釋（1:10至1:1280），設(shè)置陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照。3.病毒加入：每孔加入稀釋后的病毒液（100TCID??/孔，50%組織培養(yǎng)感染劑量），37℃孵育1小時(shí)。4.孵育與觀察：37℃、5%CO?培養(yǎng)48-72小時(shí)，每日用倒置顯微鏡觀察CPE（如細(xì)胞圓縮、脫落）。5.結(jié)果判定：記錄無(wú)CPE的最高標(biāo)本稀釋度，即為中和抗體滴度（如1:80表示標(biāo)本稀釋80倍時(shí)仍能完全抑制CPE）。注意事項(xiàng)：細(xì)胞濃度需調(diào)整至接種后24小時(shí)內(nèi)形成單層，避免過(guò)密或過(guò)稀；CPE判斷需在固定時(shí)間點(diǎn)（如培養(yǎng)48小時(shí)）進(jìn)行，避免延遲觀察導(dǎo)致結(jié)果偏差；陰性對(duì)照需出現(xiàn)明顯CPE，陽(yáng)性對(duì)照需無(wú)CPE（或CPE抑制率≥90%）。（三）假病毒中和試驗(yàn)（PseudovirusNeutralizationTest,PVNT）原理：用假病毒（含病毒包膜蛋白和報(bào)告基因，如luciferase）模擬野生病毒的感染過(guò)程，通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)量，判斷中和抗體對(duì)病毒進(jìn)入細(xì)胞的抑制作用。適用場(chǎng)景：安全（無(wú)野生病毒的感染性），用于高致病性病毒（如HIV、SARS-CoV-2）的中和抗體檢測(cè)。操作步驟：1.假病毒制備：將病毒包膜蛋白基因（如SARS-CoV-2的S基因）和報(bào)告基因（如luciferase）克隆至載體，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收集上清液，純化假病毒。2.標(biāo)本稀釋：將待檢測(cè)血清用維持液進(jìn)行倍比稀釋（1:10至1:1280），設(shè)置陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照。3.假病毒-標(biāo)本孵育：將稀釋后的標(biāo)本與等量假病毒液混合，37℃孵育1小時(shí)。4.感染細(xì)胞：將混合液接種至敏感細(xì)胞（如293T-ACE2細(xì)胞），37℃、5%CO?培養(yǎng)24-48小時(shí)。5.報(bào)告基因檢測(cè)：裂解細(xì)胞，加入底物（如luciferase底物），用酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度（或化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度）。6.結(jié)果計(jì)算：計(jì)算標(biāo)本對(duì)假病毒感染的抑制率（%），以50%抑制率對(duì)應(yīng)的稀釋度作為中和抗體滴度（IC??）。注意事項(xiàng)：假病毒的滴度需符合要求（如≥10?TU/ml，轉(zhuǎn)導(dǎo)單位/毫升）；報(bào)告基因檢測(cè)需嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，避免交叉污染；陰性對(duì)照的熒光強(qiáng)度需與未感染細(xì)胞一致（無(wú)明顯升高），陽(yáng)性對(duì)照的IC??需在已知范圍內(nèi)。五、結(jié)果判定（一）臨界值設(shè)定臨界值（cut-offvalue）是判斷中和抗體陽(yáng)性/陰性的閾值，需根據(jù)陰性對(duì)照和標(biāo)準(zhǔn)品確定。例如：PRNT：以陰性對(duì)照蝕斑數(shù)的50%減少率對(duì)應(yīng)的稀釋度作為臨界值（如1:40）；MNT：以陰性對(duì)照CPE的90%抑制率對(duì)應(yīng)的稀釋度作為臨界值（如1:20）；PVNT：以陰性對(duì)照熒光強(qiáng)度的50%抑制率對(duì)應(yīng)的稀釋度作為臨界值（如1:40）。（二）結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)1.陰性：中和抗體滴度<臨界值（如PRNT<1:40），提示機(jī)體無(wú)針對(duì)該病毒的中和抗體。2.陽(yáng)性：中和抗體滴度≥臨界值（如PRNT≥1:40），提示機(jī)體有針對(duì)該病毒的免疫保護(hù)力。3.可疑：中和抗體滴度接近臨界值（如1:30，臨界值為1:40），需重新采集標(biāo)本進(jìn)行復(fù)查。（三）結(jié)果解釋1.中和抗體滴度的意義：滴度越高，提示免疫保護(hù)力越強(qiáng)。例如：新冠病毒：中和抗體滴度≥1:160提示對(duì)奧密克戎變異株有一定保護(hù)力；乙肝病毒：中和抗體滴度≥1:10提示對(duì)乙肝病毒有保護(hù)力；流感病毒：中和抗體滴度≥1:40提示對(duì)相應(yīng)亞型有保護(hù)力。2.結(jié)果結(jié)合臨床：結(jié)果解釋需結(jié)合臨床癥狀（如發(fā)熱、咳嗽）、疫苗接種史（如接種時(shí)間、劑次）、流行病學(xué)背景（如是否接觸過(guò)感染者）。例如，未接種疫苗的患者中和抗體陽(yáng)性，提示既往感染；接種疫苗后中和抗體陽(yáng)性，提示疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)。六、質(zhì)量控制（一）室內(nèi)質(zhì)控1.對(duì)照設(shè)置：每次檢測(cè)必須設(shè)置以下對(duì)照：陰性對(duì)照：無(wú)中和抗體的血清（如健康人血清），用于判斷標(biāo)本是否存在非特異性反應(yīng)；陽(yáng)性對(duì)照：已知中和抗體滴度的標(biāo)準(zhǔn)血清（如WHO的新冠病毒標(biāo)準(zhǔn)品），用于校準(zhǔn)檢測(cè)系統(tǒng)；空白對(duì)照：維持液（無(wú)血清、無(wú)病毒），用于判斷細(xì)胞是否存在污染。2.質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：陰性對(duì)照：PRNT的蝕斑數(shù)≥陽(yáng)性對(duì)照的90%，MNT的CPE≥陽(yáng)性對(duì)照的90%，PVNT的熒光強(qiáng)度≥陽(yáng)性對(duì)照的90%；陽(yáng)性對(duì)照：PRNT的ND??或PVNT的IC??需在已知范圍（±2倍稀釋度）；空白對(duì)照：無(wú)細(xì)胞病變、無(wú)蝕斑形成、無(wú)熒光強(qiáng)度升高。3.異常處理：若質(zhì)控結(jié)果不符合標(biāo)準(zhǔn)，需重新檢測(cè)（更換試劑、重復(fù)操作），并記錄異常原因（如試劑過(guò)期、細(xì)胞污染）。（二）室間質(zhì)評(píng)1.參加要求：實(shí)驗(yàn)室應(yīng)定期（每年1-2次）參加國(guó)家或國(guó)際組織的室間質(zhì)評(píng)（如中國(guó)疾病預(yù)防控制中心的“傳染病病毒中和抗體檢測(cè)能力驗(yàn)證”、WHO的“ProficiencyTestingforNeutralizingAntibodyAssays”）。2.結(jié)果評(píng)估：通過(guò)與其他實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果比較，評(píng)估自身檢測(cè)能力（如結(jié)果的準(zhǔn)確性、重復(fù)性）。室間質(zhì)評(píng)結(jié)果分為“合格”（結(jié)果在允許范圍內(nèi)）、“不合格”（結(jié)果超出允許范圍）。3.改進(jìn)措施：若室間質(zhì)評(píng)結(jié)果不合格，需查找原因（如試劑選擇不當(dāng)、操作誤差），并采取糾正措施（如更換試劑、加強(qiáng)人員培訓(xùn)），重新參加室間質(zhì)評(píng)。七、生物安全中和抗體檢測(cè)涉及病毒或假病毒，需嚴(yán)格遵守生物安全規(guī)范，防止實(shí)驗(yàn)室感染：（一）實(shí)驗(yàn)室級(jí)別要求低致病性病毒（如流感病毒）：BSL-2級(jí)實(shí)驗(yàn)室；高致病性病毒（如HIV、SARS-CoV-2）：BSL-3級(jí)實(shí)驗(yàn)室（或BSL-2級(jí)實(shí)驗(yàn)室加額外防護(hù)措施）。（二）個(gè)人防護(hù)操作時(shí)需穿防護(hù)服（一次性或可消毒）、戴手套（無(wú)粉乳膠手套）、護(hù)目鏡（或面罩）、口罩（N95或以上級(jí)別）；避免直接接觸病毒液或感染性標(biāo)本，操作后立即洗手（用含酒精的免洗消毒液）。（三）廢棄物處理感染性廢棄物（如培養(yǎng)皿、吸頭、血清）：置于雙層黃色醫(yī)療廢物袋中，高壓滅菌（121℃，30分鐘）后丟棄；化學(xué)廢棄物（如染色液、裂解液）：按照化學(xué)危險(xiǎn)品處理規(guī)定（如用中和劑中和后）丟棄；銳器（如注射器、針頭）：置于銳器盒中，高壓滅菌后丟棄。八、數(shù)據(jù)記錄與報(bào)告（一）數(shù)據(jù)記錄需記錄以下信息，確保結(jié)果可追溯：1.標(biāo)本信息：標(biāo)本編號(hào)、患者姓名、性別、年齡、病歷號(hào)、采集時(shí)間、標(biāo)本類型（血清/血漿）；2.試劑與設(shè)備信息：病毒株名稱及批號(hào)、細(xì)胞系名稱及傳代次數(shù)、試劑名稱及批號(hào)、設(shè)備名稱及校準(zhǔn)日期；3.操作過(guò)程：標(biāo)本稀釋倍數(shù)、孵育時(shí)間（病毒-標(biāo)本孵育、細(xì)胞感染）、培養(yǎng)條件（溫度、CO?濃度）；4.結(jié)果數(shù)據(jù)：蝕斑數(shù)（PRNT）、CPE等級(jí)（MNT）、熒光強(qiáng)度（PVNT）、質(zhì)控結(jié)果（陰性/陽(yáng)性對(duì)照的滴度或CPE情況）；5.結(jié)果判定：中和抗體滴度（ND??/IC??）、陽(yáng)性/陰性判斷；6.操作人員信息：操作人姓名、檢測(cè)時(shí)間、審核人姓名、備注（如標(biāo)本溶血、試劑過(guò)期等異常情況）。（二）報(bào)告格式報(bào)告需簡(jiǎn)潔、明確，包含以下內(nèi)容：1.患者信息：姓名、性別、年齡、病歷號(hào)；2.檢測(cè)信息：檢測(cè)項(xiàng)目（如“新冠病毒中和抗體檢測(cè)”）、標(biāo)本類型、采集時(shí)間、檢測(cè)時(shí)間；3.結(jié)果：中和抗體滴度（如“1:160”）、陽(yáng)性/陰性判斷（如“陽(yáng)性”）；4.參考范圍：如“陰性（<1:40）、陽(yáng)性（≥1:40）”；5.結(jié)果解釋：如“中和抗體滴度陽(yáng)性，提示機(jī)體對(duì)新冠病毒有一定的免疫保護(hù)力”；6.實(shí)驗(yàn)室信息：實(shí)驗(yàn)室名稱、地址、聯(lián)系方式、檢測(cè)者姓名、審核者姓名、報(bào)告日期。九、注意事項(xiàng)與常見(jiàn)問(wèn)題處理（一）操作注意事項(xiàng)1.無(wú)菌操作：所有操作需在生物安全柜中進(jìn)行，避免細(xì)菌或真菌污染；2.避免交叉污染：使用一次性吸頭和培養(yǎng)皿，移液器需定期消毒（用75%酒精擦拭）；3.試劑保存：病毒株需保存于-80℃冰箱，避免反復(fù)凍融；試劑需按照說(shuō)明書(shū)保存（如酶標(biāo)試劑需保存于4℃冰箱）。（二）常見(jiàn)問(wèn)題處理1.標(biāo)本溶血：溶血會(huì)干擾抗體檢測(cè)，需重新采集標(biāo)本；2.試劑過(guò)期：試劑過(guò)期后，病毒活力或抗體效價(jià)下降，需更換有效期內(nèi)的試劑；3.