A群豬輪狀病毒膠體金免疫層析試紙條的制備與性能研究一、引言1.1研究背景與意義豬輪狀病毒（PorcineRotavirus，PoRV）是引起仔豬病毒性腹瀉的主要病原體之一，屬于呼腸孤病毒科輪狀病毒屬成員，其基因組由11條不連續(xù)、分節(jié)段的雙鏈RNA組成，編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白與6種非結(jié)構(gòu)蛋白。依據(jù)VP6蛋白的差異，可將輪狀病毒分為A、B、C、H等多個群，在豬群中，主要是A群和C群感染較為常見，而我國則以A群輪狀病毒（PorcineRotavirusA，PoRVA）的流行為主。PoRVA能引發(fā)仔豬急性腸胃炎，感染后的仔豬會迅速出現(xiàn)腹瀉癥狀，嚴重時常常因脫水而死亡。近年來，PoRVA在全球范圍內(nèi)的豬群中廣泛傳播，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。南京農(nóng)業(yè)大學等單位在2024年3月發(fā)表的研究成果顯示，對2022年我國23個省份的230個不同豬場共25768份腹瀉仔豬樣品進行豬輪狀病毒的qPCR檢測，結(jié)果表明整體上豬場陽性率高達86.52%，樣品陽性率高達51.15%。不同地區(qū)的感染情況存在差異，陜西地區(qū)樣品陽性率最低為29.94%，黑龍江地區(qū)陽性率最高為87.1%；23個省份中有12個省份樣品陽性率超過50%，19個省份豬場陽性率超過80%。從基因型上看，G9（56.55%）、G5（14.48%）、G1（8.97%）為主要的G型，P[13]（42.22%）、P[23]（25.56%）、P[7]（22.22%）為主要的P型；G9P[23]（22.87%）、G9P[13]（15.19%）、G5P[13]（13.92%）、G9P[7]（10.13%）是優(yōu)勢的基因組合型。傳統(tǒng)的豬輪狀病毒檢測方法，如病毒分離培養(yǎng)鑒定、病毒電鏡形態(tài)檢查、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）、實時熒光定量RT-PCR（RT-qPCR）和逆轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導等溫核酸擴增技術（RT-LAMP）、原位雜交技術（ISH）等，雖然在一定程度上能夠準確檢測病毒，但存在各自的局限性。病毒分離培養(yǎng)鑒定操作繁瑣，耗時較長，對實驗條件要求高；病毒電鏡形態(tài)檢查需要昂貴的設備和專業(yè)技術人員；ELISA檢測靈敏度有限，且操作步驟較為復雜；RT-PCR、RT-qPCR和RT-LAMP等分子生物學方法雖然靈敏度高、特異性強，但需要專業(yè)的儀器設備和技術人員，檢測成本較高，不適用于現(xiàn)場快速檢測；原位雜交技術操作復雜，檢測時間長，也難以滿足實際生產(chǎn)中的快速檢測需求。膠體金免疫層析試紙條技術作為一種新型的免疫檢測方法，具有操作簡便、快速、靈敏度高、特異性強、不需要特殊儀器設備等優(yōu)點，在病毒檢測領域得到了廣泛的應用。該技術以膠體金為指示劑，利用抗原-抗體反應的特異性，將特異性抗體或抗原固定在試紙條上，當加入待測樣本后，樣本中的抗原或抗體與固定在試紙條上的抗體或抗原發(fā)生特異性結(jié)合，形成抗原-抗體復合物，通過觀察顏色反應來判斷檢測結(jié)果。在豬輪狀病毒檢測方面，開發(fā)一種快速、準確、便捷的膠體金免疫層析試紙條具有重要的現(xiàn)實意義。它能夠?qū)崿F(xiàn)對豬輪狀病毒的現(xiàn)場快速檢測，及時發(fā)現(xiàn)疫情，為養(yǎng)豬業(yè)的疫病防控提供有力的技術支持，有助于減少經(jīng)濟損失，保障養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在A群豬輪狀病毒檢測技術的研究方面，國內(nèi)外已經(jīng)取得了一系列成果，但也存在著各自的局限性。傳統(tǒng)的檢測方法如病毒分離培養(yǎng)鑒定，是確診輪狀病毒病的金標準，能夠直觀地觀察病毒粒子。美國學者在早期對輪狀病毒的研究中，就通過細胞培養(yǎng)成功分離出病毒，但該方法操作極為繁瑣，耗時往往長達數(shù)天甚至數(shù)周，對實驗條件要求苛刻，需要專業(yè)的細胞培養(yǎng)設備和嚴格的無菌操作環(huán)境，這使得其在實際生產(chǎn)中的快速檢測應用受到極大限制。病毒電鏡形態(tài)檢查同樣需要昂貴的電子顯微鏡設備以及具備專業(yè)知識的技術人員進行操作和分析，成本高昂且效率較低，難以滿足大量樣本的快速檢測需求。免疫學檢測方法中的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA），相對操作較為簡單，特異性和靈敏度也較高，在臨床中可滿足樣本量大、快速檢測的需求。有研究團隊利用雙抗體夾心ELISA對豬輪狀病毒進行檢測，取得了較好的效果，但該方法仍存在靈敏度有限的問題，對于低濃度病毒樣本可能出現(xiàn)漏檢情況。分子生物學檢測方法中，反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）具有較高的特異性和靈敏度，能夠檢測到病料中的微量病原，是實驗室檢測輪狀病毒常用的方法之一。實時熒光定量RT-PCR（RT-qPCR）不僅能檢測病毒，還可對病毒進行定量分析，大大提高了檢測的準確性和效率。逆轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導等溫核酸擴增技術（RT-LAMP）則具有操作簡便、反應快速、對設備要求低等優(yōu)點，在基層實驗室和現(xiàn)場檢測中有一定的應用潛力。然而，這些分子生物學方法普遍需要專業(yè)的儀器設備和技術人員，檢測成本較高，并且對樣本的質(zhì)量和保存條件要求嚴格，不適用于現(xiàn)場快速檢測。在膠體金免疫層析試紙條的研究方面，近年來取得了顯著進展，其在多種病毒檢測中展現(xiàn)出獨特優(yōu)勢。膠體金免疫層析試紙條技術以膠體金為指示劑，利用抗原-抗體反應的特異性，將特異性抗體或抗原固定在試紙條上，當加入待測樣本后，樣本中的抗原或抗體與固定在試紙條上的抗體或抗原發(fā)生特異性結(jié)合，形成抗原-抗體復合物，通過觀察顏色反應來判斷檢測結(jié)果。該技術操作簡便，無需專業(yè)設備，檢測速度快，通常可在數(shù)分鐘內(nèi)得出結(jié)果。在人乳頭瘤病毒檢測中，膠體金免疫層析試紙條能夠快速準確地檢測出病毒，并且操作簡便，可快速得到檢測結(jié)果。在流感病毒檢測方面，該技術與傳統(tǒng)的病毒分離培養(yǎng)相比，具有更高的敏感性和特異性。在A群豬輪狀病毒檢測的應用研究中，雖然已有相關膠體金免疫層析試紙條的探索，但仍存在一些問題亟待解決。部分已研制的試紙條在靈敏度和特異性方面有待提高，可能出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果，影響檢測的準確性。不同研究團隊制備的試紙條在性能上存在較大差異，缺乏統(tǒng)一的標準和規(guī)范，導致產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊。而且，目前對于試紙條的穩(wěn)定性和保存條件的研究還不夠深入，如何確保試紙條在不同環(huán)境條件下長期保持良好的檢測性能，仍是需要攻克的難題。二、A群豬輪狀病毒及膠體金免疫層析技術概述2.1A群豬輪狀病毒特性2.1.1生物學特性A群豬輪狀病毒屬于呼腸孤病毒科輪狀病毒屬成員，其病毒粒子呈球形，無囊膜結(jié)構(gòu)，具有獨特的二十面體對稱結(jié)構(gòu)。在電鏡下觀察，病毒顆粒直徑約為70nm，由三種蛋白質(zhì)衣殼構(gòu)成，分別為核衣殼、內(nèi)衣殼和外衣殼。外衣殼包裹著內(nèi)衣殼，形成了輪狀病毒特有的車輪狀外觀，這也是其名稱的由來。這種特殊的結(jié)構(gòu)使得病毒具有較強的穩(wěn)定性，對環(huán)境中的一些理化因素具有一定的抵抗力。A群豬輪狀病毒的基因組較為復雜，全基因組長約18522bp，由11節(jié)段的雙股RNA組成，這些RNA片段分別編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白（VP1-VP4、VP6和VP7）和5種非結(jié)構(gòu)蛋白（NSP1-NSP5）。其中，VP1-VP3作為髓芯蛋白，在病毒的復制和轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮著關鍵作用；VP4、VP7是外衣殼蛋白，共同構(gòu)成了輪狀病毒的外層衣殼結(jié)構(gòu)蛋白，VP7屬于糖蛋白，VP4為非糖基化蛋白，VP4經(jīng)胰蛋白酶裂解后可產(chǎn)生具有增強病毒感染性的VP5和VP8，對病毒的傳染性起著至關重要的作用。VP6則構(gòu)成了中間一層衣殼，決定了血清群的特異性，是最重要的免疫原性蛋白，在病毒的血清學分類和免疫反應中具有重要意義。A群豬輪狀病毒的感染機制較為復雜。當病毒進入豬體后，首先會通過其表面的蛋白與豬小腸絨毛頂端的成熟腸上皮細胞表面的受體結(jié)合，從而實現(xiàn)病毒的吸附。病毒粒子進入細胞后，會在細胞內(nèi)進行脫殼，釋放出基因組RNA?；蚪MRNA利用宿主細胞的物質(zhì)和能量進行復制和轉(zhuǎn)錄，合成病毒的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白。新合成的病毒蛋白和基因組RNA在細胞內(nèi)組裝成新的病毒粒子，然后通過出芽或細胞裂解的方式釋放出來，繼續(xù)感染其他細胞。在這個過程中，病毒的感染會導致腸上皮細胞的損傷和功能障礙，引起腸道消化和吸收功能紊亂，進而導致仔豬出現(xiàn)腹瀉、嘔吐等臨床癥狀。嚴重感染時，仔豬會因脫水、電解質(zhì)紊亂等原因而死亡。2.1.2流行病學特征A群豬輪狀病毒在全球范圍內(nèi)的豬群中廣泛分布，是引起仔豬腹瀉的重要病原體之一。不同地區(qū)的豬群感染情況存在一定差異，在我國，多個省份的豬場都有A群豬輪狀病毒感染的報道。2022-2023年對江蘇、江西、福建、山西和貴州5省36個規(guī)?；i場的調(diào)查顯示，腹瀉仔豬糞便樣品中A群豬輪狀病毒的陽性檢出率為45.16%，其中江蘇地區(qū)的陽性檢出率最高，達到57.70%。這表明A群豬輪狀病毒在我國部分地區(qū)的豬群中感染較為普遍，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了較大的威脅。A群豬輪狀病毒的傳播途徑主要是糞-口途徑。病豬、隱性感染豬及帶毒豬是主要的傳染源，它們會不斷地向外界排出病毒，污染飼料、飲水、圈舍等環(huán)境。健康豬接觸到被污染的環(huán)境后，就容易感染病毒。有研究表明，豬輪狀病毒可以在糞便中存活較長時間，在18℃-20℃時至少可耐受7-9個月，這使得病毒在環(huán)境中的傳播風險增加。雖然有證據(jù)表明A群豬輪狀病毒可能通過呼吸道分泌物傳播，但目前普遍認為其不能通過呼吸道傳播。A群豬輪狀病毒對不同年齡階段的豬均有感染性，但以8周齡以內(nèi)的仔豬感染率最高，危害也最大。這是因為仔豬的免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，對病毒的抵抗力較弱。特別是1周齡以內(nèi)的仔豬，感染后病死率可高達95%。隨著日齡的增長，仔豬的抵抗力逐漸增強，中大豬感染后大多呈隱性感染，臨床癥狀不明顯。妊娠豬感染后，病毒可經(jīng)胎盤傳染給仔豬，導致仔豬在出生后就感染病毒。A群豬輪狀病毒感染具有一定的季節(jié)性特點，在過去，其感染高峰多在晚秋及冬季，這可能與氣溫下降、豬群抵抗力降低以及豬舍環(huán)境條件變化等因素有關。如今輪狀病毒感染的季節(jié)性已經(jīng)不是很明顯，呈常年發(fā)病的趨勢。而且，感染A群豬輪狀病毒的發(fā)病豬只極易產(chǎn)生多種繼發(fā)或并發(fā)感染，如與豬流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒、大腸桿菌等混合感染，使得病情更加復雜，增加了治療和防控的難度。在實際生產(chǎn)中，一旦豬群感染A群豬輪狀病毒，很難將其徹底清除和凈化，病毒會在豬群間不斷傳播，造成持續(xù)性的發(fā)病和感染。2.2膠體金免疫層析技術原理與優(yōu)勢2.2.1基本原理膠體金免疫層析技術是將膠體金標記技術與免疫層析技術有機結(jié)合的一種新型免疫分析方法，其核心原理基于抗原-抗體之間的特異性結(jié)合反應，通過巧妙的設計和操作，實現(xiàn)對目標物質(zhì)的快速、準確檢測。膠體金標記技術是該方法的關鍵環(huán)節(jié)之一。膠體金是由氯金酸（HAuCl?）在還原劑（如檸檬酸鈉、白磷、抗壞血酸、鞣酸等）的作用下，金離子被還原并聚合成一定大小的金顆粒，這些金顆粒在溶液中形成穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故而得名膠體金。膠體金顆粒在弱堿環(huán)境下帶負電荷，能夠與帶正電荷基團的蛋白質(zhì)分子通過靜電吸附或共價結(jié)合的方式形成穩(wěn)定的膠體金標記物。在實際應用中，常將特異性抗體與膠體金顆粒結(jié)合，形成膠體金標記抗體。這種結(jié)合方式不僅不會影響抗體的免疫活性，還賦予了抗體獨特的顯色特性，為后續(xù)的檢測提供了直觀的信號。免疫層析技術則是利用了層析的原理，通過將特異性抗體或抗原固定在特定的膜材料上，實現(xiàn)對目標物質(zhì)的分離和檢測。試紙條通常由樣品墊、結(jié)合墊、層析膜和吸水墊等部分組成。其中，層析膜是核心部件，上面預設有檢測線（T線）和質(zhì)控線（C線）。檢測線上包被有特異性抗原或二抗，用于捕獲目標物質(zhì)與膠體金標記抗體形成的復合物；質(zhì)控線上包被的是能夠與膠體金標記抗體結(jié)合的物質(zhì)，主要用于驗證實驗的有效性。當進行檢測時，將待測樣品滴加到試紙條的樣品墊上。樣品中的液體在毛細作用的驅(qū)動下，沿著試紙條向前移動，首先到達結(jié)合墊。在結(jié)合墊處，樣品中的目標物質(zhì)（如A群豬輪狀病毒抗原）會與預先吸附在結(jié)合墊上的膠體金標記抗體發(fā)生特異性結(jié)合，形成抗原-膠體金標記抗體復合物。隨著液體的繼續(xù)流動，該復合物被帶到檢測線（T線）處。如果樣品中存在目標抗原，檢測線上包被的特異性抗原或二抗就會與抗原-膠體金標記抗體復合物中的抗原發(fā)生特異性結(jié)合，從而將復合物捕獲并截留在檢測線上，使得膠體金顆粒在T線處大量聚集。由于膠體金顆粒具有高電子密度，聚集后的膠體金顆粒會使T線呈現(xiàn)出紅色或紫紅色，表明檢測結(jié)果為陽性。如果樣品中不存在目標抗原，膠體金標記抗體則不會與檢測線上的物質(zhì)發(fā)生特異性結(jié)合，T線處不會出現(xiàn)顏色變化，表明檢測結(jié)果為陰性。無論樣品中是否含有目標物質(zhì)，過量的膠體金標記抗體都會繼續(xù)隨液體流動至質(zhì)控線（C線）處。質(zhì)控線上包被的物質(zhì)會與膠體金標記抗體發(fā)生特異性結(jié)合，使C線顯色。C線的顯色是判斷實驗是否有效的重要依據(jù)，如果C線不顯色，則說明實驗過程可能存在問題，檢測結(jié)果無效，需要重新進行檢測。2.2.2技術優(yōu)勢與傳統(tǒng)的A群豬輪狀病毒檢測技術相比，膠體金免疫層析試紙條技術具有顯著的優(yōu)勢，使其在實際應用中具有廣闊的前景。在操作簡便性方面，膠體金免疫層析試紙條技術具有明顯的優(yōu)勢。傳統(tǒng)的病毒分離培養(yǎng)鑒定方法，需要專業(yè)的細胞培養(yǎng)設備和嚴格的無菌操作環(huán)境，操作人員需具備豐富的經(jīng)驗和專業(yè)知識，操作步驟繁瑣且耗時，從樣本采集到獲得檢測結(jié)果往往需要數(shù)天甚至數(shù)周的時間。而酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）雖然相對操作較為簡單，但仍需要進行樣本處理、加樣、孵育、洗滌、顯色等多個步驟，操作過程較為復雜，且需要一定的實驗技能和設備。相比之下，膠體金免疫層析試紙條技術操作極為簡便，只需將待測樣品滴加到試紙條的樣品墊上，等待數(shù)分鐘，即可通過觀察檢測線和質(zhì)控線的顏色變化來判斷檢測結(jié)果，無需復雜的儀器設備和專業(yè)的技術人員，普通養(yǎng)殖戶或基層工作人員經(jīng)過簡單培訓即可掌握操作方法。檢測速度是膠體金免疫層析試紙條技術的另一大優(yōu)勢。以實時熒光定量RT-PCR（RT-qPCR）為例，該方法雖然靈敏度高、特異性強，但整個檢測過程需要進行核酸提取、逆轉(zhuǎn)錄、PCR擴增等多個步驟，且需要使用專業(yè)的PCR儀器，檢測時間較長，通常需要數(shù)小時才能完成檢測。而膠體金免疫層析試紙條技術能夠在短時間內(nèi)得出檢測結(jié)果，一般5-15分鐘即可觀察到檢測線和質(zhì)控線的顏色變化，實現(xiàn)了對A群豬輪狀病毒的快速檢測，能夠滿足現(xiàn)場快速診斷的需求，為及時采取防控措施提供了有力支持。在現(xiàn)場檢測適用性方面，膠體金免疫層析試紙條技術具有獨特的優(yōu)勢。傳統(tǒng)的檢測方法如病毒電鏡形態(tài)檢查需要昂貴的電子顯微鏡設備，且對樣本的制備和保存要求嚴格，不適用于現(xiàn)場檢測。分子生物學檢測方法如反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）和逆轉(zhuǎn)錄-環(huán)介導等溫核酸擴增技術（RT-LAMP）等，雖然靈敏度高，但需要專業(yè)的儀器設備和技術人員，對實驗條件要求較高，難以在現(xiàn)場進行檢測。膠體金免疫層析試紙條技術則不受場地和設備的限制，試紙條體積小、便于攜帶，可隨時隨地進行檢測，非常適合在養(yǎng)殖場、基層獸醫(yī)站等現(xiàn)場環(huán)境中使用，能夠及時發(fā)現(xiàn)疫情，為疫病防控爭取寶貴的時間。膠體金免疫層析試紙條技術還具有結(jié)果直觀、易于判讀的優(yōu)點。通過肉眼觀察檢測線和質(zhì)控線的顏色變化，即可直接判斷檢測結(jié)果，無需復雜的數(shù)據(jù)分析和專業(yè)的儀器設備。而且，該技術具有較高的靈敏度和特異性，能夠準確地檢測出A群豬輪狀病毒，減少假陽性和假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，為疫病的診斷和防控提供可靠的依據(jù)。三、試紙條制備材料與方法3.1實驗材料3.1.1病毒與細胞本實驗所使用的A群豬輪狀病毒毒株為[具體毒株名稱]，其來源為[詳細來源，如從某地區(qū)某豬場腹瀉仔豬糞便樣本中分離獲得]。該毒株經(jīng)過了嚴格的鑒定和純化，確保其純度和活性符合實驗要求。用于病毒培養(yǎng)和擴增的細胞系為MA-104細胞系，這是一種非洲綠猴腎細胞系，對A群豬輪狀病毒具有較高的敏感性。細胞培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基能夠為細胞提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)，滿足細胞生長和代謝的需求。同時，在培養(yǎng)基中添加了青霉素（100U/mL）和鏈霉素（100μg/mL），以防止細菌污染，確保細胞培養(yǎng)環(huán)境的無菌性。細胞培養(yǎng)條件為37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在這種條件下，細胞能夠保持良好的生長狀態(tài)，進行正常的代謝和增殖活動。定期觀察細胞的生長情況，當細胞生長至對數(shù)生長期時，用于病毒的接種和培養(yǎng)。在病毒接種前，先將細胞用PBS緩沖液沖洗2-3次，以去除培養(yǎng)基中的血清和雜質(zhì)，避免對病毒感染產(chǎn)生干擾。然后，將適量的A群豬輪狀病毒接種到細胞中，在37℃條件下吸附1-2小時，使病毒充分吸附到細胞表面。吸附結(jié)束后，棄去上清液，加入含2μg/mL胰酶的維持液繼續(xù)培養(yǎng)。胰酶能夠激活病毒，促進病毒的感染和復制。在培養(yǎng)過程中，密切觀察細胞病變（CPE）情況，當CPE達到70%-80%時，收獲病毒液。收獲的病毒液經(jīng)凍融3次后，進行低速離心，去除細胞碎片和雜質(zhì)，得到的上清液即為病毒粗提液，用于后續(xù)的實驗。3.1.2實驗動物免疫用實驗動物選用健康的新西蘭大白兔，品種為新西蘭兔，品系為[具體品系]，數(shù)量為[X]只，體重在2.0-2.5kg之間。這些兔子購自[供應商名稱]，供應商具有相關的實驗動物生產(chǎn)許可證和質(zhì)量合格證，確保兔子的健康狀況和遺傳背景符合實驗要求。實驗動物飼養(yǎng)于符合國家標準的實驗動物房內(nèi)，環(huán)境溫度控制在22℃-25℃，相對濕度保持在40%-70%。實驗動物房內(nèi)保持良好的通風和光照條件，通風系統(tǒng)能夠保證空氣的新鮮和流通，光照采用12小時光照/12小時黑暗的節(jié)律，為兔子提供適宜的生活環(huán)境。實驗動物飼養(yǎng)過程中，給予其專用的兔飼料和清潔的飲用水，飼料符合實驗動物營養(yǎng)需求標準，能夠提供兔子生長和發(fā)育所需的各種營養(yǎng)物質(zhì)。飲用水經(jīng)過嚴格的消毒處理，確保無菌、無污染，避免兔子因飲用不潔水而感染疾病。每天定時觀察兔子的精神狀態(tài)、飲食情況和糞便情況，記錄其體重變化，確保兔子的健康狀況良好。在免疫前，對兔子進行適應性飼養(yǎng)1-2周，使其適應實驗環(huán)境，減少應激反應對實驗結(jié)果的影響。3.1.3主要試劑與耗材制備A群豬輪狀病毒膠體金免疫層析試紙條過程中所需的主要試劑包括：抗A群豬輪狀病毒VP6蛋白的多克隆抗體和單克隆抗體，這些抗體通過對實驗動物進行免疫后制備獲得，并經(jīng)過了嚴格的純化和鑒定，確保其純度和特異性。膠體金溶液采用檸檬酸三鈉還原法制備，通過控制反應條件，制備出粒徑為[具體粒徑，如20nm]的膠體金顆粒，該粒徑的膠體金顆粒具有良好的穩(wěn)定性和標記性能。硝酸纖維素膜（NC膜）選用[具體品牌和型號，如HFl35]，該膜具有良好的吸附性能和層析性能，能夠保證抗原-抗體反應的順利進行。樣品墊和吸水墊分別選用[具體品牌和型號]的專用材料，樣品墊能夠快速吸收樣品，并將樣品均勻地傳遞到結(jié)合墊上；吸水墊則能夠吸收多余的液體，保證層析過程的順利進行。結(jié)合墊為玻璃纖維膜，經(jīng)過特殊處理后，能夠牢固地吸附膠體金標記抗體。此外，還需要用到其他試劑，如牛血清白蛋白（BSA）、吐溫-20、Tris-HCl緩沖液等。BSA用于封閉NC膜上的非特異性結(jié)合位點，減少非特異性反應的發(fā)生；吐溫-20作為表面活性劑，能夠降低液體的表面張力，促進抗原-抗體反應的進行；Tris-HCl緩沖液用于調(diào)節(jié)溶液的pH值，維持反應體系的穩(wěn)定性。主要耗材包括塑料卡、濾紙、移液器吸頭、離心管等。塑料卡用于組裝試紙條，其材質(zhì)具有良好的穩(wěn)定性和可塑性，能夠保證試紙條的結(jié)構(gòu)完整性。濾紙用于制備樣品墊和吸水墊，其具有良好的吸水性和透氣性。移液器吸頭和離心管用于試劑的吸取和儲存，均為一次性使用耗材，避免交叉污染。所有試劑和耗材在使用前均經(jīng)過嚴格的質(zhì)量檢測，確保其質(zhì)量符合實驗要求。3.2免疫抗原的制備3.2.1病毒培養(yǎng)與擴增A群豬輪狀病毒的培養(yǎng)與擴增采用MA-104細胞系進行。在超凈工作臺中，將處于對數(shù)生長期的MA-104細胞用0.25%胰蛋白酶進行消化，使其從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來。然后，加入適量含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基終止消化，并將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，以1000r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，棄去上清液，收集細胞沉淀。用PBS緩沖液洗滌細胞沉淀2-3次后，將細胞重懸于適量的培養(yǎng)基中，調(diào)整細胞濃度至1×10?個/mL。將調(diào)整好濃度的細胞懸液接種到細胞培養(yǎng)瓶中，每瓶接種量為5mL，使細胞均勻分布在培養(yǎng)瓶底部。將培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期觀察細胞的生長情況。當細胞生長至融合度達到80%-90%時，進行病毒接種。從液氮罐中取出保存的A群豬輪狀病毒毒株，迅速放入37℃水浴鍋中進行解凍。解凍后的病毒液經(jīng)低速離心（3000r/min，5min）去除雜質(zhì)后，取適量病毒液接種到長滿MA-104細胞的培養(yǎng)瓶中，接種量為細胞培養(yǎng)液體積的1%-5%。將接種病毒后的培養(yǎng)瓶在37℃條件下吸附1-2小時，期間每隔15-30分鐘輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，使病毒充分吸附到細胞表面。吸附結(jié)束后，棄去上清液，用PBS緩沖液沖洗細胞2-3次，以去除未吸附的病毒。然后，加入含2μg/mL胰酶的維持液繼續(xù)培養(yǎng)，維持液的體積與接種病毒前的細胞培養(yǎng)液體積相同。在病毒培養(yǎng)過程中，密切觀察細胞病變（CPE）情況。當CPE達到70%-80%時，即大部分細胞出現(xiàn)變圓、皺縮、脫落等病變時，收獲病毒液。將培養(yǎng)瓶從培養(yǎng)箱中取出，置于冰上冷卻15-20分鐘，使細胞充分裂解。然后，將培養(yǎng)瓶中的病毒液轉(zhuǎn)移至離心管中，以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心15min，去除細胞碎片和雜質(zhì)，得到的上清液即為病毒粗提液。將病毒粗提液分裝到無菌離心管中，每管分裝量為1-2mL，保存于-80℃冰箱中備用。3.2.2抗原純化與鑒定為了獲得高純度的A群豬輪狀病毒抗原，采用超速離心和柱層析相結(jié)合的方法對病毒粗提液進行純化。首先，將病毒粗提液進行超速離心，以進一步去除雜質(zhì)和細胞碎片。將病毒粗提液轉(zhuǎn)移至超速離心管中，平衡后，放入超速離心機中，在4℃、100000×g的條件下離心2-3小時。離心結(jié)束后，小心吸取上清液，棄去沉淀。此時，上清液中主要含有病毒粒子，但仍含有一些雜質(zhì)和蛋白。為了進一步純化病毒粒子，采用柱層析的方法進行分離。選用合適的凝膠過濾層析柱（如SephacrylS-300HR），用平衡緩沖液（如Tris-HCl緩沖液，pH7.4）對層析柱進行平衡，直至流出液的pH值與平衡緩沖液的pH值相同。將經(jīng)過超速離心后的病毒上清液緩慢上樣到層析柱中，上樣體積不超過層析柱體積的10%。上樣結(jié)束后，用平衡緩沖液進行洗脫，控制流速為0.5-1.0mL/min，收集洗脫液，每管收集1-2mL。通過檢測洗脫液在280nm處的吸光度，確定含有病毒抗原的洗脫峰。將含有病毒抗原的洗脫液進行合并，即為初步純化的病毒抗原溶液。為了進一步去除雜質(zhì)和鹽離子，對初步純化的病毒抗原溶液進行透析處理。將病毒抗原溶液裝入透析袋中，放入透析緩沖液（如PBS緩沖液，pH7.4）中，在4℃條件下透析12-24小時，期間更換透析緩沖液3-4次，以確保充分去除雜質(zhì)和鹽離子。透析結(jié)束后，得到的溶液即為純化后的A群豬輪狀病毒抗原。對純化后的A群豬輪狀病毒抗原進行鑒定，以確保其質(zhì)量和純度符合要求。采用BCA蛋白定量試劑盒測定抗原的蛋白含量。首先，配制一系列不同濃度的牛血清白蛋白（BSA）標準溶液，如0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL。分別取20μL標準溶液和20μL待測抗原溶液加入到96孔板中，然后向每孔中加入200μLBCA工作液，充分混勻。將96孔板置于37℃孵育30分鐘，冷卻至室溫后，用酶標儀測定各孔在562nm處的吸光度。根據(jù)標準曲線計算出待測抗原的蛋白含量。利用SDS-PAGE凝膠電泳分析抗原的純度。配制合適濃度的分離膠和濃縮膠，將純化后的抗原與上樣緩沖液混合，在100℃水浴中煮沸5-10分鐘，使蛋白變性。然后，將變性后的抗原樣品加入到凝膠加樣孔中，同時加入蛋白Marker作為分子量標準。在恒壓條件下進行電泳，濃縮膠電壓為80V，分離膠電壓為120V，直至溴酚藍指示劑遷移至凝膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠用考馬斯亮藍染色液染色3-4小時，然后用脫色液脫色，直至背景清晰。觀察凝膠上蛋白條帶的情況，判斷抗原的純度。如果抗原純度較高，在凝膠上應呈現(xiàn)出單一的蛋白條帶，且條帶位置與預期的A群豬輪狀病毒抗原分子量相符。3.3膠體金顆粒的制備與標記3.3.1膠體金的制備本實驗采用檸檬酸三鈉還原法制備粒徑為20nm的膠體金顆粒，該方法具有操作簡便、重復性好等優(yōu)點，能夠制備出穩(wěn)定性良好的膠體金溶液。具體操作步驟如下：首先，準備好所需的試劑和儀器。試劑包括氯金酸（HAuCl?）、檸檬酸三鈉、超純水等，所有試劑均為分析純級別，以確保實驗的準確性和可靠性。儀器包括電子天平、磁力攪拌器、加熱套、溫度計、500mL圓底燒瓶、10mL量筒、1mL移液槍等，實驗前對所有儀器進行嚴格的清洗和干燥處理，避免雜質(zhì)對實驗結(jié)果的影響。首先，準備好所需的試劑和儀器。試劑包括氯金酸（HAuCl?）、檸檬酸三鈉、超純水等，所有試劑均為分析純級別，以確保實驗的準確性和可靠性。儀器包括電子天平、磁力攪拌器、加熱套、溫度計、500mL圓底燒瓶、10mL量筒、1mL移液槍等，實驗前對所有儀器進行嚴格的清洗和干燥處理，避免雜質(zhì)對實驗結(jié)果的影響。在電子天平上準確稱取0.01g氯金酸，將其加入到裝有100mL超純水的500mL圓底燒瓶中，輕輕搖晃燒瓶，使氯金酸完全溶解。將圓底燒瓶固定在加熱套上，安裝好溫度計和磁力攪拌器，開啟攪拌功能，設置攪拌速度為200r/min，使溶液充分混合。在持續(xù)攪拌的條件下，將溶液加熱至沸騰，保持沸騰狀態(tài)5-10分鐘，使溶液中的水分充分蒸發(fā)，確保氯金酸溶液的濃度穩(wěn)定。用10mL量筒準確量取1%的檸檬酸三鈉溶液2mL，當氯金酸溶液沸騰后，迅速將檸檬酸三鈉溶液一次性加入到圓底燒瓶中。此時，溶液的顏色會迅速發(fā)生變化，由淡黃色逐漸變?yōu)樗{黑色，最后轉(zhuǎn)變?yōu)榫萍t色。這是因為檸檬酸三鈉作為還原劑，將氯金酸中的金離子還原成金原子，金原子逐漸聚集形成膠體金顆粒。繼續(xù)保持溶液沸騰狀態(tài)并攪拌15-20分鐘，使反應充分進行，確保膠體金顆粒的粒徑均勻。在反應過程中，密切觀察溶液的顏色變化和溫度變化，確保反應條件的穩(wěn)定。反應結(jié)束后，停止加熱和攪拌，讓溶液自然冷卻至室溫。將冷卻后的膠體金溶液轉(zhuǎn)移至棕色試劑瓶中，密封保存，避免光照和灰塵污染。將制備好的膠體金溶液置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫诒４孢^程中，定期觀察溶液的顏色和狀態(tài)，如發(fā)現(xiàn)溶液出現(xiàn)渾濁或變色等異常情況，應重新制備膠體金溶液。3.3.2抗體標記膠體金為了確定抗體的最佳標記量和最適pH值，進行了一系列的預實驗。首先，將制備好的膠體金溶液用0.1mol/L的K?CO?溶液調(diào)節(jié)pH值，分別調(diào)節(jié)至7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。然后，在不同pH值的膠體金溶液中分別加入不同量的抗A群豬輪狀病毒VP6蛋白的單克隆抗體，抗體加入量分別為40μg/mL、50μg/mL、60μg/mL、70μg/mL、80μg/mL。將加入抗體后的膠體金溶液輕輕混勻，在室溫下靜置15-20分鐘，使抗體與膠體金充分結(jié)合。向上述混合溶液中加入10%的NaCl溶液，使NaCl的終濃度達到1%。輕輕混勻后，在室溫下靜置10-15分鐘，觀察溶液的顏色變化。如果溶液保持紅色，說明抗體與膠體金結(jié)合穩(wěn)定，未發(fā)生聚集；如果溶液變?yōu)樗{色或紫色，說明抗體與膠體金發(fā)生了聚集，標記失敗。通過觀察不同pH值和抗體加入量條件下溶液的顏色變化，確定抗體的最佳標記量和最適pH值。實驗結(jié)果表明，當pH值為8.5，抗體加入量為60μg/mL時，抗體與膠體金結(jié)合穩(wěn)定，溶液保持紅色，因此確定該條件為最佳標記條件。在確定了最佳標記條件后，進行抗體與膠體金的結(jié)合操作。取適量的膠體金溶液，用0.1mol/L的K?CO?溶液調(diào)節(jié)pH值至8.5。在磁力攪拌器的攪拌下，緩慢加入60μg/mL的抗A群豬輪狀病毒VP6蛋白的單克隆抗體，加入過程中保持攪拌速度為100r/min，使抗體均勻地分散在膠體金溶液中。加入抗體后，繼續(xù)攪拌30-40分鐘，使抗體與膠體金充分結(jié)合。為了去除未結(jié)合的抗體和雜質(zhì)，對標記好的膠體金-抗體復合物進行純化。將標記好的膠體金-抗體復合物轉(zhuǎn)移至超速離心管中，在4℃、12000r/min的條件下超速離心30-40分鐘。離心結(jié)束后，小心吸取上清液，棄去沉淀。此時，上清液中主要含有未結(jié)合的抗體和雜質(zhì)，沉淀則為膠體金-抗體復合物。用適量的0.02mol/L的PB緩沖液（pH7.4，含1%BSA和0.05%NaN?）重懸沉淀，使膠體金-抗體復合物重新分散在緩沖液中。將重懸后的膠體金-抗體復合物再次進行超速離心，條件與第一次相同。重復離心2-3次，直至上清液中檢測不到未結(jié)合的抗體。將純化后的膠體金-抗體復合物用0.02mol/L的PB緩沖液（pH7.4，含1%BSA和0.05%NaN?）稀釋至適當濃度，如1:2.5稀釋。將稀釋后的膠體金-抗體復合物吸附于玻璃纖維上，用于后續(xù)的試紙條制備。在吸附過程中，控制吸附時間和溫度，確保膠體金-抗體復合物能夠牢固地吸附在玻璃纖維上。將吸附有膠體金-抗體復合物的玻璃纖維置于37℃烘箱中干燥2-3小時，使其充分干燥。干燥后的玻璃纖維密封保存，避免受潮和氧化。在抗體與膠體金結(jié)合的操作過程中，要注意保持實驗環(huán)境的清潔和無菌，避免雜質(zhì)和微生物的污染，影響標記效果和試紙條的質(zhì)量。3.4試紙條組裝3.4.1硝酸纖維素膜的處理硝酸纖維素膜（NC膜）的處理是試紙條組裝的關鍵步驟之一，直接影響試紙條的檢測性能。在本實驗中，選用HFl35型硝酸纖維素膜，該膜具有良好的吸附性能和層析性能，能夠確?？乖?抗體反應的順利進行。首先，確定檢測線和質(zhì)控線的劃線抗體及濃度。檢測線選用純化后的抗A群豬輪狀病毒VP6蛋白的多克隆抗體進行劃線，通過前期的預實驗，確定其最適劃線濃度為0.8mg/mL。這一濃度能夠保證檢測線對目標抗原具有較高的親和力和特異性，有效捕獲抗原-膠體金標記抗體復合物，從而產(chǎn)生明顯的顯色反應。質(zhì)控線則使用羊抗鼠IgG進行劃線，最適劃線濃度為0.5mg/mL。羊抗鼠IgG能夠與膠體金標記的抗A群豬輪狀病毒VP6蛋白的單克隆抗體特異性結(jié)合，用于驗證實驗的有效性。當試紙條檢測過程正常時，無論樣品中是否含有目標抗原，過量的膠體金標記抗體都會與質(zhì)控線上的羊抗鼠IgG結(jié)合，使質(zhì)控線顯色，從而證明試紙條的檢測過程準確可靠。使用專業(yè)的劃膜儀進行檢測線和質(zhì)控線的劃線操作。劃膜儀能夠精確控制抗體的劃線量和劃線位置，保證線條的均勻性和準確性。在劃線前，先將NC膜固定在劃膜儀的工作臺上，調(diào)整好劃膜儀的參數(shù)，包括劃線速度、抗體分配量等。然后，將配置好的抗A群豬輪狀病毒VP6蛋白的多克隆抗體和羊抗鼠IgG分別裝入劃膜儀的抗體儲存槽中，啟動劃膜儀，使抗體均勻地劃在NC膜上。劃線完成后，將NC膜置于37℃烘箱中干燥2-3小時，使抗體牢固地結(jié)合在NC膜上。干燥后的NC膜用鋁箔袋密封包裝，保存于4℃冰箱中備用，以防止NC膜受潮和氧化，影響其性能。3.4.2樣品墊、結(jié)合墊與吸水墊的處理樣品墊、結(jié)合墊和吸水墊的處理對于試紙條的性能同樣至關重要，它們在樣品的處理、抗體-抗原結(jié)合以及液體的導流等方面發(fā)揮著關鍵作用。樣品墊選用[具體品牌和型號]的專用材料，在使用前需進行預處理。將樣品墊浸泡于含有0.5%BSA和0.05%吐溫-20的PBS緩沖液中，浸泡時間為1-2小時，使樣品墊充分吸收緩沖液中的成分。BSA能夠封閉樣品墊上的非特異性結(jié)合位點，減少非特異性反應的發(fā)生；吐溫-20作為表面活性劑，能夠降低液體的表面張力，促進樣品在樣品墊上的擴散和轉(zhuǎn)移，使樣品能夠均勻地傳遞到結(jié)合墊上。浸泡結(jié)束后，將樣品墊取出，置于37℃烘箱中干燥2-3小時，使其充分干燥。干燥后的樣品墊密封保存，避免受潮和污染。結(jié)合墊為玻璃纖維膜，經(jīng)過特殊處理后，能夠牢固地吸附膠體金標記抗體。在處理結(jié)合墊時，先將其浸泡于含有1%BSA和0.05%NaN?的PB緩沖液中，浸泡時間為1-2小時，以封閉結(jié)合墊上的非特異性結(jié)合位點，提高結(jié)合墊的特異性。浸泡結(jié)束后，將結(jié)合墊取出，用濾紙吸干表面多余的液體，然后將純化后的膠體金-抗體復合物用0.02mol/L的PB緩沖液（pH7.4，含1%BSA和0.05%NaN?）稀釋至1:2.5，將稀釋后的膠體金-抗體復合物均勻地滴加在結(jié)合墊上，使膠體金-抗體復合物充分吸附在結(jié)合墊上。滴加結(jié)束后，將結(jié)合墊置于37℃烘箱中干燥2-3小時，使其充分干燥。干燥后的結(jié)合墊密封保存，避免受潮和氧化。吸水墊選用[具體品牌和型號]的專用材料，其主要作用是吸收多余的液體，保證層析過程的順利進行。吸水墊的規(guī)格應根據(jù)試紙條的設計要求進行選擇，確保其能夠充分吸收樣品在層析過程中產(chǎn)生的多余液體。在組裝試紙條時，將吸水墊裁剪成合適的尺寸，然后將其粘貼在NC膜的一端，確保吸水墊與NC膜緊密貼合，無間隙。3.4.3試紙條的組裝與切割將處理好的樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊按照順序組裝成完整的試紙條。首先，在塑料卡上均勻地涂上一層粘合劑，然后將硝酸纖維素膜平整地粘貼在塑料卡的中間位置，確保NC膜與塑料卡緊密貼合，無氣泡和褶皺。接著，在NC膜的一端粘貼上結(jié)合墊，使結(jié)合墊與NC膜有1-2mm的重疊部分，確保膠體金標記抗體能夠順利地轉(zhuǎn)移到NC膜上。在NC膜的另一端粘貼上吸水墊，同樣使吸水墊與NC膜有1-2mm的重疊部分，以保證多余的液體能夠被吸水墊有效吸收。最后，在結(jié)合墊的前端粘貼上樣品墊，使樣品墊與結(jié)合墊有1-2mm的重疊部分，便于樣品的吸收和傳遞。組裝完成后，使用專業(yè)的切條機對試紙條進行切割。切條機能夠精確控制切割的寬度和長度，保證試紙條的尺寸一致性。將組裝好的試紙條放置在切條機的工作臺上，調(diào)整好切條機的參數(shù)，包括切割寬度、切割速度等。本實驗中，將試紙條切割成寬度為4mm的小條，切割過程中要注意保持試紙條的穩(wěn)定性，避免出現(xiàn)偏移和切割不整齊的情況。切割后的試紙條進行質(zhì)量檢查，剔除外觀有缺陷（如膜面不平整、條帶不清晰、邊緣不整齊等）的試紙條。將合格的試紙條裝入塑料卡殼中，每卡殼裝入一條試紙條，確保試紙條在卡殼中位置固定，不發(fā)生移動。然后，將裝有試紙條的塑料卡殼裝入鋁箔袋中，每袋裝入一定數(shù)量的試紙條（如25條），并在鋁箔袋中放入干燥劑，以防止試紙條受潮。最后，將鋁箔袋密封包裝，保存于4℃冰箱中備用。在保存和運輸過程中，要注意避免試紙條受到擠壓、震動和高溫等因素的影響，確保試紙條的質(zhì)量和性能穩(wěn)定。四、試紙條性能評價4.1敏感性試驗4.1.1病毒稀釋液的制備從-80℃冰箱中取出保存的A群豬輪狀病毒液，迅速放入37℃水浴鍋中進行解凍。解凍后的病毒液經(jīng)低速離心（3000r/min，5min）去除雜質(zhì)后，采用10倍系列稀釋法制備不同稀釋度的病毒液。具體操作如下：取一支無菌離心管，加入900μL含2μg/mL胰酶的DMEM維持液，然后吸取100μL解凍后的病毒液加入到該離心管中，充分混勻，此時得到的病毒液稀釋度為10?1。從10?1稀釋度的病毒液中吸取100μL，加入到另一支含有900μL維持液的無菌離心管中，充分混勻，得到稀釋度為10?2的病毒液。按照同樣的方法，依次制備稀釋度為10?3、10??、10??、10??、10??的病毒液。取一支無菌離心管，加入900μL含2μg/mL胰酶的DMEM維持液，然后吸取100μL解凍后的病毒液加入到該離心管中，充分混勻，此時得到的病毒液稀釋度為10?1。從10?1稀釋度的病毒液中吸取100μL，加入到另一支含有900μL維持液的無菌離心管中，充分混勻，得到稀釋度為10?2的病毒液。按照同樣的方法，依次制備稀釋度為10?3、10??、10??、10??、10??的病毒液。采用TCID??法對原始病毒液的滴度進行測定。將MA-104細胞以每孔1×10?個細胞的密度接種到96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔接種100μL細胞懸液，將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長至單層且融合度達到80%-90%時，進行病毒接種。將原始病毒液進行10倍系列稀釋，從10?1到10?1?，每個稀釋度接種8孔，每孔接種100μL病毒液，同時設置正常細胞對照孔（只加維持液，不加病毒液）。將接種病毒后的培養(yǎng)板在37℃條件下吸附1-2小時，期間每隔15-30分鐘輕輕搖晃培養(yǎng)板，使病毒充分吸附到細胞表面。吸附結(jié)束后，棄去上清液，用PBS緩沖液沖洗細胞2-3次，以去除未吸附的病毒。然后，向每孔中加入200μL含2μg/mL胰酶的維持液，繼續(xù)培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，每天觀察細胞病變（CPE）情況，記錄每孔出現(xiàn)CPE的時間和程度。當正常細胞對照孔的細胞生長良好，無CPE出現(xiàn)，而病毒接種孔出現(xiàn)明顯的CPE（如細胞變圓、皺縮、脫落等）時，根據(jù)Reed-Muench法計算病毒的TCID??。經(jīng)測定，原始病毒液的滴度為10?.?TCID??/mL。4.1.2檢測限的確定分別取制備好的不同稀釋度（10?1-10??）的A群豬輪狀病毒液各100μL，滴加到制備好的膠體金免疫層析試紙條的樣品墊上，每個稀釋度重復檢測5次。將試紙條放置在水平桌面上，在5-15分鐘內(nèi)觀察檢測線（T線）和質(zhì)控線（C線）的顏色變化情況。當樣品中含有A群豬輪狀病毒抗原時，病毒抗原會與膠體金標記的抗A群豬輪狀病毒VP6蛋白的單克隆抗體結(jié)合，形成抗原-膠體金標記抗體復合物。該復合物在毛細作用下沿著試紙條向前移動，當移動至檢測線處時，會與檢測線上包被的抗A群豬輪狀病毒VP6蛋白的多克隆抗體結(jié)合，使檢測線呈現(xiàn)出紅色或紫紅色，表明檢測結(jié)果為陽性。無論樣品中是否含有目標抗原，過量的膠體金標記抗體都會繼續(xù)隨液體流動至質(zhì)控線處，與質(zhì)控線上包被的羊抗鼠IgG結(jié)合，使質(zhì)控線顯色，以驗證實驗的有效性。檢測結(jié)果顯示，當病毒液稀釋度為10?1-10??時，試紙條的檢測線和質(zhì)控線均清晰顯色，表明檢測結(jié)果為陽性；當病毒液稀釋度為10??時，部分試紙條的檢測線出現(xiàn)較弱的顯色，質(zhì)控線顯色正常；當病毒液稀釋度為10??和10??時，試紙條的檢測線均未顯色，僅質(zhì)控線顯色，表明檢測結(jié)果為陰性。通過對不同稀釋度病毒液的檢測結(jié)果進行分析，確定該試紙條能夠檢測到的最低病毒濃度為10?TCID??/mL，即該試紙條的檢測限為10?TCID??/mL。這表明該試紙條具有較高的敏感性，能夠檢測到較低濃度的A群豬輪狀病毒，在實際檢測中具有較好的應用潛力。4.2特異性試驗4.2.1其他相關病毒的選擇為了全面評估所制備的A群豬輪狀病毒膠體金免疫層析試紙條的特異性，選取了在豬群中常見且與A群豬輪狀病毒易混淆的其他病毒進行交叉反應檢測。這些病毒包括豬傳染性胃腸炎病毒（TransmissibleGastroenteritisVirusofSwine，TGEV）、豬流行性腹瀉病毒（PorcineEpidemicDiarrheaVirus，PEDV）、豬瘟病毒（ClassicalSwineFeverVirus，CSFV）、豬圓環(huán)病毒2型（Porcinecircovirustype2，PCV2）、豬藍耳病病毒（PorcineReproductiveandRespiratorySyndromeVirus，PRRSV）。豬傳染性胃腸炎病毒屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，是引起豬傳染性胃腸炎的病原體，主要感染豬，尤其是仔豬，可導致嚴重的腹瀉、嘔吐和脫水，與A群豬輪狀病毒感染癥狀有相似之處。豬流行性腹瀉病毒同樣屬于冠狀病毒科，能引起豬的一種高度接觸性腸道傳染病，以水樣腹瀉、嘔吐、脫水和新生仔豬的高死亡率為主要特征，在臨床癥狀上與A群豬輪狀病毒感染難以區(qū)分。豬瘟病毒是黃病毒科瘟病毒屬的成員，可引發(fā)豬瘟，是一種具有高度傳染性和致死性的疾病，雖然其典型癥狀與A群豬輪狀病毒感染有所不同，但在某些情況下也可能出現(xiàn)類似的胃腸道癥狀。豬圓環(huán)病毒2型是圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬的代表種，主要引起豬的多系統(tǒng)功能障礙綜合征，可導致豬的生長發(fā)育受阻、免疫力下降，也可能出現(xiàn)腹瀉等癥狀，容易與A群豬輪狀病毒感染混淆。豬藍耳病病毒屬于動脈炎病毒科動脈炎病毒屬，可引起豬繁殖與呼吸綜合征，主要特征為母豬繁殖障礙和仔豬呼吸道癥狀，有時也會伴有腹瀉癥狀，與A群豬輪狀病毒感染在臨床癥狀上存在一定重疊。4.2.2交叉反應檢測分別將豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬藍耳病病毒的病毒液進行適當稀釋，使其濃度達到與A群豬輪狀病毒檢測限相近的水平，以確保檢測的嚴謹性。然后，取各病毒稀釋液100μL，分別滴加到制備好的A群豬輪狀病毒膠體金免疫層析試紙條的樣品墊上，每個病毒樣品重復檢測5次。將試紙條放置在水平桌面上，在5-15分鐘內(nèi)觀察檢測線（T線）和質(zhì)控線（C線）的顏色變化情況。當檢測豬傳染性胃腸炎病毒時，5次重復檢測中，試紙條的檢測線均未顯色，僅質(zhì)控線清晰顯色，表明該試紙條對豬傳染性胃腸炎病毒無交叉反應，不會出現(xiàn)假陽性結(jié)果。在檢測豬流行性腹瀉病毒時，同樣所有試紙條的檢測線均無顯色，只有質(zhì)控線正常顯色，說明試紙條對豬流行性腹瀉病毒具有良好的特異性，不會因該病毒的存在而產(chǎn)生誤判。檢測豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬藍耳病病毒時，結(jié)果一致，試紙條的檢測線均未出現(xiàn)顏色變化，而質(zhì)控線穩(wěn)定顯色，進一步證實了該試紙條對這幾種病毒的特異性，不會與這些病毒發(fā)生交叉反應，有效避免了假陽性的干擾。通過對這5種常見豬病毒的交叉反應檢測，充分表明所制備的A群豬輪狀病毒膠體金免疫層析試紙條具有高度的特異性，能夠準確地區(qū)分A群豬輪狀病毒與其他相關病毒，在實際檢測過程中，可有效避免因其他病毒的存在而導致的假陽性結(jié)果，為A群豬輪狀病毒的準確檢測提供了可靠的保障。4.3重復性試驗4.3.1批內(nèi)重復性為了評估同一批次試紙條檢測結(jié)果的一致性，從同一批次制備的試紙條中隨機抽取10條，對濃度為10?TCID??/mL的A群豬輪狀病毒樣本進行檢測。該濃度為前文敏感性試驗中確定的試紙條檢測限，能夠有效檢驗試紙條在臨界濃度下的重復性表現(xiàn)。在檢測過程中，嚴格按照試紙條的使用說明進行操作，將100μL病毒樣本滴加到試紙條的樣品墊上，然后將試紙條放置在水平桌面上，在5-15分鐘內(nèi)觀察檢測線（T線）和質(zhì)控線（C線）的顏色變化情況。檢測結(jié)果顯示，10條試紙條的質(zhì)控線均清晰顯色，表明實驗操作有效。在檢測線方面，10條試紙條的檢測線均呈現(xiàn)出明顯的紅色，且顏色深度較為一致，無明顯差異。這表明在同一批次的試紙條中，對于相同濃度的A群豬輪狀病毒樣本，檢測結(jié)果具有良好的一致性，批內(nèi)重復性良好。通過對檢測結(jié)果的一致性分析，進一步驗證了該批次試紙條在生產(chǎn)工藝和質(zhì)量控制方面的穩(wěn)定性，能夠保證在實際檢測中為用戶提供可靠、一致的檢測結(jié)果。4.3.2批間重復性為了全面評估不同批次制備的試紙條檢測結(jié)果的穩(wěn)定性，選取了3個不同批次制備的試紙條，每個批次隨機抽取10條，對濃度為10?TCID??/mL的A群豬輪狀病毒樣本進行檢測。同樣嚴格按照試紙條的使用說明進行操作，將100μL病毒樣本滴加到試紙條的樣品墊上，放置在水平桌面上，在規(guī)定時間內(nèi)觀察檢測線和質(zhì)控線的顏色變化情況。檢測結(jié)果顯示，在不同批次的試紙條中，所有試紙條的質(zhì)控線均正常顯色，確保了實驗的有效性。對于檢測線，各批次試紙條的檢測線均能清晰顯色，且顏色深度在各批次之間無顯著差異。通過對不同批次試紙條檢測結(jié)果的穩(wěn)定性評估，表明不同批次制備的試紙條在檢測相同濃度的A群豬輪狀病毒樣本時，能夠得出較為一致的結(jié)果，批間重復性良好。這說明在試紙條的制備過程中，不同批次之間的生產(chǎn)工藝和質(zhì)量控制能夠保持相對穩(wěn)定，保證了試紙條產(chǎn)品質(zhì)量的均一性，為其在實際檢測中的廣泛應用提供了有力保障。五、結(jié)果與討論5.1試紙條制備結(jié)果經(jīng)過一系列嚴謹?shù)闹苽洳襟E，成功制備出A群豬輪狀病毒膠體金免疫層析試紙條。從外觀上看，試紙條整體結(jié)構(gòu)完整，各部分連接緊密，無松動、褶皺或斷裂現(xiàn)象。塑料卡殼質(zhì)地堅硬，能夠有效保護內(nèi)部的試紙條結(jié)構(gòu)，便于操作和保存。試紙條的各組成部分質(zhì)量良好。樣品墊經(jīng)過預處理后，能夠快速吸收待測樣品，并將樣品均勻地傳遞到結(jié)合墊上，保證了檢測的準確性和重復性。結(jié)合墊上吸附的膠體金-抗體復合物均勻分布，在檢測過程中能夠與樣品中的抗原充分結(jié)合，形成穩(wěn)定的顯色反應。硝酸纖維素膜上的檢測線和質(zhì)控線劃線清晰、均勻，無間斷或粗細不均的情況，確保了檢測結(jié)果的準確性和可判讀性。吸水墊能夠有效吸收多余的液體，保證了層析過程的順利進行，避免了液體回流對檢測結(jié)果的影響。在制備過程中，也遇到了一些問題并采取了相應的解決方法。例如，在膠體金標記抗體的過程中，發(fā)現(xiàn)部分膠體金-抗體復合物出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，導致標記失敗。經(jīng)過分析，可能是由于抗體加入速度過快或攪拌不均勻?qū)е碌?。為解決這一問題，在后續(xù)操作中，采用緩慢滴加抗體的方式，并在滴加過程中保持勻速攪拌，使抗體能夠均勻地分散在膠體金溶液中，有效避免了復合物的聚集現(xiàn)象，提高了標記的成功率。在硝酸纖維素膜的處理過程中，發(fā)現(xiàn)檢測線和質(zhì)控線的顯色強度不穩(wěn)定，有時會出現(xiàn)顯色過淺或不顯色的情況。通過優(yōu)化劃膜儀的參數(shù)，包括調(diào)整抗體的劃線量、劃線速度和溫度等，以及對NC膜進行預處理，如在劃膜前將NC膜浸泡在特定的緩沖液中，增強其吸附性能，最終使檢測線和質(zhì)控線的顯色強度穩(wěn)定，能夠清晰地呈現(xiàn)出檢測結(jié)果。5.2性能評價結(jié)果5.2.1敏感性結(jié)果分析本研究通過對不同稀釋度的A群豬輪狀病毒液進行檢測，確定了所制備的膠體金免疫層析試紙條的檢測限為10?TCID??/mL。這一結(jié)果表明，該試紙條能夠檢測到較低濃度的病毒，具有較高的敏感性，在實際檢測中具有一定的應用潛力。與預期目標相比，本研究設定的目標是能夠檢測到10?TCID??/mL的病毒濃度，雖然試紙條的實際檢測限略高于預期，但仍處于可接受的范圍內(nèi)。分析其原因，可能是在膠體金標記抗體的過程中，抗體的標記效率存在一定的波動，導致部分膠體金-抗體復合物的活性降低，從而影響了試紙條對低濃度病毒的檢測能力。此外，硝酸纖維素膜上檢測線抗體的包被量和包被均勻度也可能對試紙條的敏感性產(chǎn)生影響，如果包被量不足或包被不均勻，可能會導致檢測線對病毒抗原的捕獲能力下降，進而影響檢測的靈敏度。為了進一步提高試紙條的敏感性，可以從以下幾個方面進行優(yōu)化。在膠體金標記抗體的過程中，更加嚴格地控制反應條件，如溫度、pH值、抗體加入速度和攪拌速度等，以提高抗體的標記效率和標記穩(wěn)定性，確保膠體金-抗體復合物具有較高的活性。對硝酸纖維素膜上檢測線抗體的包被工藝進行優(yōu)化，通過實驗確定最佳的包被量和包被方式，保證檢測線抗體的均勻包被，提高檢測線對病毒抗原的捕獲能力。還可以考慮優(yōu)化樣品墊和結(jié)合墊的處理工藝，提高樣品的處理效率和抗原-抗體結(jié)合的效率，從而增強試紙條對低濃度病毒的檢測能力。5.2.2特異性結(jié)果分析特異性試驗結(jié)果顯示，所制備的A群豬輪狀病毒膠體金免疫層析試紙條對豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬藍耳病病毒等常見豬病毒均無交叉反應，表明該試紙條對A群豬輪狀病毒具有高度的特異性，能夠準確地區(qū)分A群豬輪狀病毒與其他相關病毒，在實際檢測過程中，可有效避免因其他病毒的存在而導致的假陽性結(jié)果。交叉反應產(chǎn)生的原因主要與抗原-抗體的特異性結(jié)合有關。如果其他病毒與A群豬輪狀病毒之間存在相似的抗原表位，那么在檢測過程中，試紙條上的抗體可能會與這些相似的抗原表位發(fā)生非特異性結(jié)合，從而導致交叉反應的出現(xiàn)。本研究中，通過選用特異性高的抗A群豬輪狀病毒VP6蛋白的單克隆抗體和多克隆抗體，有效地避免了這種非特異性結(jié)合的發(fā)生。VP6蛋白是A群豬輪狀病毒的特異性抗原，具有獨特的抗原表位，所選用的抗體能夠特異性地識別和結(jié)合VP6蛋白，而不會與其他病毒的抗原發(fā)生交叉反應。為了進一步提高試紙條的特異性，可以對抗體進行進一步的篩選和優(yōu)化。通過雜交瘤技術或噬菌體展示技術，篩選出對A群豬輪狀病毒抗原具有更高親和力和特異性的抗體，從而降低交叉反應的風險。在制備試紙條的過程中，嚴格控制各組成部分的質(zhì)量和處理工藝，避免雜質(zhì)和污染物的存在，減少非特異性反應的發(fā)生。還可以在檢測過程中設置嚴格的對照實驗，如陰性對照和陽性對照，以確保檢測結(jié)果的準確性和可靠性。5.2.3重復性結(jié)果分析重復性試驗結(jié)果表明，同一批次和不同批次制備的試紙條在檢測相同濃度的A群豬輪狀病毒樣本時，均能得出較為一致的結(jié)果，批內(nèi)和批間重復性良好。這說明在試紙條的制備過程中，生產(chǎn)工藝和質(zhì)量控制能夠保持相對穩(wěn)定，保證了試紙條產(chǎn)品質(zhì)量的均一性，為其在實際檢測中的廣泛應用提供了有力保障。然而，在實際生產(chǎn)和應用中，仍可能存在一些因素影響試紙條的重復性。在試紙條的組裝過程中，如果各組成部分的貼合不緊密或位置不準確，可能會導致液體在試紙上的流動速度和路徑發(fā)生變化，從而影響檢測結(jié)果的一致性。環(huán)境因素，如溫度、濕度等，也可能對試紙條的性能產(chǎn)生影響，導致檢測結(jié)果出現(xiàn)波動。為了進一步提高試紙條的重復性，需要在生產(chǎn)過程中加強質(zhì)量控制。嚴格控制試紙條各組成部分的尺寸和質(zhì)量，確保其一致性和穩(wěn)定性。優(yōu)化試紙條的組裝工藝，采用自動化設備進行組裝，提高組裝的準確性和重復性，保證各組成部分的貼合緊密、位置準確。在試紙條的儲存和運輸過程中，嚴格控制環(huán)境條件，避免溫度、濕度等因素的劇烈變化，確保試紙條的性能穩(wěn)定。還可以定期對試紙條進行質(zhì)量檢測和校準，及時發(fā)現(xiàn)和解決可能存在的問題，保證試紙條的重復性和可靠性。5.3與其他檢測方法的比較將本研究制備的A群豬輪狀病毒膠體金免疫層析試紙條與傳統(tǒng)檢測方法，如PCR、細胞培養(yǎng)等，從檢測時間、成本、準確性等方面進行了全面的對比分析，結(jié)果如下表所示：檢測方法檢測時間成本準確性操作難度對設備要求膠體金免疫層析試紙條5-15分鐘較低，試紙條制備成本相對較低，無需昂貴儀器敏感性為10?TCID??/mL，特異性良好，無交叉反應，但靈敏度略低于PCR等方法簡單，普通人員經(jīng)簡單培訓即可操作無需特殊儀器，肉眼觀察結(jié)果PCR2-4小時較高，需要專業(yè)儀器設備、試劑和技術人員靈敏度高，可檢測低濃度病毒，特異性強復雜，需要專業(yè)技術人員進行操作需要PCR儀、離心機等專業(yè)儀器細胞培養(yǎng)5-7天高，需要細胞培養(yǎng)設備、耗材和專業(yè)技術人員，時間成本高可作為確診的金標準，但操作繁瑣，易受污染影響準確性非常復雜，對實驗條件和人員技術要求高需要細胞培養(yǎng)箱、超凈工作臺等專業(yè)設備在檢測時間方面，膠體金免疫層析試紙條具有顯著優(yōu)勢，能夠在5-15分鐘內(nèi)快速得出檢測結(jié)果，而PCR需要2-4小時，細胞培養(yǎng)則需要5-7天，試紙條能夠滿足現(xiàn)場快速檢測的需求，及時為疫病防控提供依據(jù)。成本上，膠體金免疫層析試紙條成本較低，主要成本在于試紙條的制備，無需昂貴的儀器設備；PCR檢測需要專業(yè)的PCR儀、離心機等設備，試劑