MicroRNA-146a：解鎖甲狀腺相關(guān)眼病免疫調(diào)控密碼一、引言1.1研究背景甲狀腺相關(guān)眼?。═hyroid-associatedophthalmopathy，TAO）作為一種常見的自身免疫性疾病，主要累及眼睛的肌肉、淚腺和脂肪組織。它不僅嚴(yán)重影響患者的外貌，導(dǎo)致眼球突出、眼瞼水腫、結(jié)膜充血水腫等明顯的外觀改變，還對患者的眼部功能造成極大損害，引發(fā)眼部疼痛、干燥、發(fā)紅、畏光、視力模糊、眼球運動受限、復(fù)視，甚至壓迫性視神經(jīng)病變導(dǎo)致視力下降和視野缺損等問題，給患者的生活質(zhì)量帶來了沉重打擊。在眼眶疾病中，甲狀腺相關(guān)眼病的發(fā)病率位居首位，在國內(nèi)外約占20%左右，且有數(shù)據(jù)表明，在甲狀腺亢進疾病患者中，約有一定比例會出現(xiàn)甲狀腺相關(guān)眼病這一器官損害性疾病，其中約10%的患者可能會發(fā)生嚴(yán)重的視力障礙，包括視力下降、視野缺損或色覺障礙，其危害不容小覷。近年來，隨著對免疫系統(tǒng)研究的不斷深入，微小RNA（microRNA，miRNA）在免疫調(diào)控中的作用逐漸成為研究熱點。miRNA是一類內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，長度通常在22個核苷酸左右，雖不編碼蛋白質(zhì)，卻能通過與靶mRNA的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補配對，在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達進行精準(zhǔn)調(diào)控，進而參與細胞的增殖、分化、凋亡以及免疫應(yīng)答等一系列關(guān)鍵的生物學(xué)過程。miR-146a作為眾多miRNA中的一員，在免疫調(diào)控領(lǐng)域嶄露頭角。研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a在多種免疫細胞，如巨噬細胞、T細胞、B細胞等中均有表達，并且在炎癥反應(yīng)、免疫細胞的分化與功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮著核心作用。在炎癥發(fā)生時，miR-146a能夠通過靶向調(diào)控相關(guān)信號通路，如核因子-κB（NF-κB）信號通路等，抑制炎癥因子的過度表達，從而發(fā)揮抗炎作用；在免疫細胞分化過程中，miR-146a對T細胞向不同亞群的分化以及B細胞的發(fā)育和功能維持都有著重要的調(diào)節(jié)意義。鑒于甲狀腺相關(guān)眼病的自身免疫性本質(zhì)以及miR-146a在免疫調(diào)控中的關(guān)鍵地位，深入探究miR-146a在甲狀腺相關(guān)眼病中的免疫調(diào)控機制，不僅有助于我們從分子層面深入理解甲狀腺相關(guān)眼病的發(fā)病機理，為開發(fā)新的診斷標(biāo)志物和治療靶點提供堅實的理論基礎(chǔ)，還可能為甲狀腺相關(guān)眼病的精準(zhǔn)治療開辟新的道路，具有極其重要的科學(xué)意義和臨床應(yīng)用價值。1.2研究目的與意義本研究旨在深入剖析miR-146a在甲狀腺相關(guān)眼病免疫調(diào)控中的分子機制，全面揭示其在甲狀腺相關(guān)眼病發(fā)病進程中的關(guān)鍵作用。具體而言，通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶嶒炘O(shè)計和先進的技術(shù)手段，明確miR-146a在甲狀腺相關(guān)眼病患者體內(nèi)的表達模式及變化規(guī)律；精準(zhǔn)鑒定miR-146a在甲狀腺相關(guān)眼病中的下游靶基因，并深入探究其對靶基因表達的調(diào)控機制；系統(tǒng)闡述miR-146a通過調(diào)控相關(guān)信號通路，在免疫細胞的活化、增殖、分化以及炎癥因子的分泌等免疫應(yīng)答過程中所發(fā)揮的核心作用。從理論層面來看，深入研究miR-146a在甲狀腺相關(guān)眼病中的免疫調(diào)控機制，有助于填補當(dāng)前在該領(lǐng)域分子機制研究方面的空白，極大地豐富我們對甲狀腺相關(guān)眼病發(fā)病機制的認(rèn)知，為后續(xù)的相關(guān)研究奠定堅實的理論基礎(chǔ)。同時，通過揭示miR-146a與免疫細胞、炎癥因子以及相關(guān)信號通路之間的復(fù)雜相互作用關(guān)系，能夠進一步完善免疫系統(tǒng)調(diào)控的理論體系，為理解其他自身免疫性疾病的發(fā)病機制提供重要的參考依據(jù)和研究思路。從臨床應(yīng)用角度出發(fā)，本研究具有廣闊的應(yīng)用前景和重大的實踐意義。若能明確miR-146a在甲狀腺相關(guān)眼病中的關(guān)鍵作用及機制，將為甲狀腺相關(guān)眼病的早期診斷提供高靈敏度和特異性的新型生物學(xué)標(biāo)志物。通過檢測患者體內(nèi)miR-146a及其靶基因的表達水平，能夠?qū)崿F(xiàn)對疾病的早期精準(zhǔn)診斷和病情評估，有助于及時制定個性化的治療方案，提高治療效果。此外，基于對miR-146a免疫調(diào)控機制的深入理解，有望開發(fā)出以miR-146a為靶點的新型治療策略，如通過基因治療手段調(diào)節(jié)miR-146a的表達，或者設(shè)計特異性的小分子藥物干預(yù)其與靶基因的相互作用，從而為甲狀腺相關(guān)眼病的治療開辟新的途徑，為患者帶來更多的治療選擇和更好的治療效果，顯著改善患者的生活質(zhì)量。1.3研究方法與創(chuàng)新點本研究綜合運用多種先進的研究方法，從多個維度深入探究miR-146a在甲狀腺相關(guān)眼病中的免疫調(diào)控機制。在文獻研究方面，廣泛查閱國內(nèi)外關(guān)于甲狀腺相關(guān)眼病、miR-146a以及免疫調(diào)控領(lǐng)域的最新研究成果，全面梳理相關(guān)研究進展，為實驗設(shè)計和結(jié)果分析提供堅實的理論支撐，精準(zhǔn)把握研究方向，確保研究具有前沿性和科學(xué)性。在細胞實驗中，精心培養(yǎng)甲狀腺相關(guān)眼病患者的眼眶成纖維細胞、外周血單個核細胞等相關(guān)細胞系。通過轉(zhuǎn)染miR-146a模擬物、抑制劑或?qū)φ招蛄?，實現(xiàn)對細胞中miR-146a表達水平的精準(zhǔn)調(diào)控。運用實時熒光定量PCR技術(shù)，精確檢測miR-146a及其潛在靶基因的mRNA表達水平變化；借助蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，準(zhǔn)確測定靶蛋白的表達量，深入分析miR-146a對靶基因表達的調(diào)控作用；采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）技術(shù)，定量檢測細胞培養(yǎng)上清中炎癥因子的分泌水平，如白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，全面評估m(xù)iR-146a對炎癥反應(yīng)的影響。此外，利用細胞增殖實驗（如CCK-8法）、細胞凋亡檢測（如AnnexinV-FITC/PI雙染法）等實驗技術(shù)，深入探究miR-146a對免疫細胞增殖、凋亡等生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)機制。在動物實驗方面，構(gòu)建甲狀腺相關(guān)眼病動物模型，如利用轉(zhuǎn)基因小鼠或通過免疫接種特定抗原誘導(dǎo)動物發(fā)病。對實驗動物進行分組處理，分別給予過表達miR-146a、抑制miR-146a表達或?qū)φ仗幚?。定期觀察動物的眼部癥狀，包括眼球突出程度、眼瞼水腫情況等，并通過眼科檢查設(shè)備（如眼底鏡、眼壓計等）評估眼部功能變化。實驗結(jié)束后，采集動物的眼眶組織、血液等樣本，進行組織病理學(xué)分析，觀察組織形態(tài)學(xué)變化，檢測miR-146a及其靶基因在組織中的表達水平，進一步驗證細胞實驗結(jié)果，全面揭示miR-146a在體內(nèi)的免疫調(diào)控作用機制。本研究的創(chuàng)新點主要體現(xiàn)在以下幾個方面。首先，從多維度、多層次深入解析miR-146a在甲狀腺相關(guān)眼病中的免疫調(diào)控機制，不僅關(guān)注miR-146a對免疫細胞功能的直接調(diào)節(jié)作用，還深入探究其通過調(diào)控相關(guān)信號通路和靶基因，在細胞、組織和整體動物水平上的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為全面理解甲狀腺相關(guān)眼病的發(fā)病機制提供了全新的視角。其次，本研究致力于探索miR-146a作為甲狀腺相關(guān)眼病潛在治療靶點的可能性，通過實驗研究為開發(fā)基于miR-146a的新型治療策略奠定基礎(chǔ)，有望打破傳統(tǒng)治療方法的局限性，為甲狀腺相關(guān)眼病的治療帶來新的突破。此外，在研究過程中，本研究將綜合運用多種先進的技術(shù)手段，如高通量測序技術(shù)、基因編輯技術(shù)（如CRISPR/Cas9系統(tǒng)）等，力求更精準(zhǔn)、全面地揭示miR-146a的免疫調(diào)控機制，為該領(lǐng)域的研究提供新的技術(shù)思路和方法借鑒。二、甲狀腺相關(guān)眼病概述2.1定義與分類甲狀腺相關(guān)眼?。═hyroid-associatedophthalmopathy，TAO），是一種與甲狀腺疾病緊密相關(guān)的器官特異性自身免疫性疾病。它主要累及眼眶組織，包括眼外肌、脂肪組織、淚腺等，導(dǎo)致一系列眼部癥狀和體征的出現(xiàn)。在臨床上，甲狀腺相關(guān)眼病存在多種命名，如Graves眼病（GO）、甲狀腺眼病、浸潤性突眼、內(nèi)分泌眼病等，這些命名從不同角度反映了該疾病的特點，但目前甲狀腺相關(guān)眼病這一名稱因其全面涵蓋了疾病與甲狀腺及眼部病變的關(guān)聯(lián)，在國內(nèi)外文獻中被廣泛采用。甲狀腺相關(guān)眼病在臨床上通常分為非浸潤性眼病和浸潤性眼病兩大類。非浸潤性眼病，又稱為單純性突眼，在甲狀腺功能亢進癥患者中較為常見。這一類型的眼病主要是由于交感神經(jīng)興奮性升高，受到甲狀腺功能亢進時血液中大量甲狀腺激素的影響，從而導(dǎo)致眼球突出。其突出特點是，眶后并無淋巴細胞浸潤現(xiàn)象?；颊叩呐R床表現(xiàn)相對較輕，主要呈現(xiàn)為眼球輕度突出，眼裂有所增寬，眨眼次數(shù)明顯減少，給人一種目光炯炯有神的直觀感受。不過，幸運的是，隨著甲亢病情得到有效控制，非浸潤性眼病的癥狀往往能夠自行緩解，一般無需特殊的針對性治療。浸潤性眼病，也被稱作Graves眼病，其發(fā)病與眶后組織的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。在炎癥的持續(xù)作用下，眼外肌及脂肪組織逐漸發(fā)生腫脹，進而導(dǎo)致眼球明顯突出。浸潤性眼病患者的癥狀較為嚴(yán)重且多樣，除了眼球突出更為顯著外，還常常伴有眼內(nèi)異物感，仿佛有細小顆?；蚱渌愇锎媪粼谘劬?nèi)部，引發(fā)不適；脹痛感也是常見癥狀之一，程度輕重不一，有時會在眼球轉(zhuǎn)動或按壓時加重；畏光現(xiàn)象使得患者在正常光照環(huán)境下也難以睜眼，對光線的敏感度大幅提高；流淚頻繁，即使在沒有明顯刺激的情況下，眼睛也會不自覺地流淚；復(fù)視問題給患者的視覺帶來極大困擾，看東西時會出現(xiàn)重影，嚴(yán)重影響日常生活和工作；視力下降更是不容忽視，嚴(yán)重時甚至可能導(dǎo)致失明，對患者的生活質(zhì)量造成毀滅性打擊。浸潤性眼病的治療相對復(fù)雜，除了常規(guī)的抗甲狀腺藥物治療、放射碘治療或手術(shù)治療外，還需要根據(jù)患者的具體病情，聯(lián)合使用糖皮質(zhì)激素以減輕炎癥反應(yīng)，必要時采用球后外照射療法來緩解眼部癥狀，對于病情極為嚴(yán)重的患者，可能還需要進行眼眶減壓手術(shù)，以挽救視力。2.2流行病學(xué)特征甲狀腺相關(guān)眼病在全球范圍內(nèi)均有發(fā)病，其發(fā)病率受多種因素影響，呈現(xiàn)出一定的特點?？傮w而言，甲狀腺相關(guān)眼病的發(fā)病率約為每年每10萬人中有16-19人發(fā)病，且女性發(fā)病率顯著高于男性，男女比例約為1:4-1:6。在年齡分布上，發(fā)病呈現(xiàn)雙峰特征，40歲左右為發(fā)病高峰，60歲左右為次高峰。不同年齡段的發(fā)病特點和病情嚴(yán)重程度存在差異，20-30歲的青壯年時期，由于工作壓力較大，自身免疫性疾病的發(fā)病率相對較高，該年齡段的患者，尤其是年輕女性，主要面臨外觀變化帶來的心理壓力，對心理健康產(chǎn)生顯著影響；40-60歲的中老年階段，特別是更年期前后的女性和男性，病情往往更為嚴(yán)重，容易惡化至極重度，出現(xiàn)眼球顯著突出、視力急劇下降，甚至角膜潰瘍、穿孔等嚴(yán)重并發(fā)癥。從地域分布來看，甲狀腺相關(guān)眼病在世界各地均有發(fā)生，但在不同地區(qū)的發(fā)病率和表現(xiàn)形式存在一定差異。在亞洲地區(qū)，隨著人口老齡化的加劇以及生活方式的改變，甲狀腺相關(guān)眼病的發(fā)病率呈上升趨勢。由于飲食習(xí)慣、環(huán)境因素以及遺傳背景的不同，亞洲地區(qū)的患者在病情表現(xiàn)和治療反應(yīng)上可能與其他地區(qū)有所不同。在碘缺乏地區(qū)，甲狀腺疾病的發(fā)病率相對較高，這可能間接導(dǎo)致甲狀腺相關(guān)眼病的發(fā)病風(fēng)險增加。而在歐美國家，雖然總體發(fā)病率與亞洲地區(qū)相近，但在疾病的遺傳易感性和臨床表型上可能存在差異，有研究表明歐洲人比亞洲人更易患甲狀腺相關(guān)眼病。甲狀腺相關(guān)眼病與甲狀腺疾病密切相關(guān)，在毒性彌漫性甲狀腺腫（Graves病）患者中，約25%-50%會出現(xiàn)甲狀腺相關(guān)眼病。在甲狀腺功能亢進疾病患者中，40%-75%的患者會出現(xiàn)眼球前突等甲狀腺相關(guān)眼病的癥狀。部分甲狀腺功能正?；蜉p度異常的人群也可能發(fā)生甲狀腺相關(guān)眼病，即眼型Graves病，約占患者總數(shù)的10%。甲狀腺相關(guān)眼病不僅對患者的眼部健康和外貌造成嚴(yán)重影響，導(dǎo)致患者出現(xiàn)眼球突出、復(fù)視、視力下降等癥狀，降低患者的視覺質(zhì)量和生活自理能力，還對患者的心理健康產(chǎn)生負面影響，使患者產(chǎn)生自卑、焦慮、抑郁等不良情緒，嚴(yán)重影響患者的社交和心理健康。疾病的治療往往需要長期的醫(yī)療干預(yù)，包括藥物治療、放射治療、手術(shù)治療等，這不僅給患者帶來身體上的痛苦和經(jīng)濟負擔(dān)，也增加了社會醫(yī)療資源的消耗，加重了社會醫(yī)療負擔(dān)。2.3發(fā)病機制研究現(xiàn)狀甲狀腺相關(guān)眼病的發(fā)病機制是一個復(fù)雜的過程，涉及遺傳、環(huán)境和免疫等多個因素，這些因素相互作用，共同推動了疾病的發(fā)生和發(fā)展。遺傳因素在甲狀腺相關(guān)眼病的發(fā)病中起著重要的作用，它為疾病的發(fā)生提供了潛在的易感性。多項研究表明，甲狀腺相關(guān)眼病具有一定的家族聚集性。在對家系的研究中發(fā)現(xiàn)，某些基因的突變或多態(tài)性與甲狀腺相關(guān)眼病的發(fā)病風(fēng)險密切相關(guān)。例如，人類白細胞抗原（HLA）復(fù)合體中的某些等位基因與甲狀腺相關(guān)眼病的遺傳易感性緊密相連。研究顯示，中國人中HLA-Bw46被證實為毒性彌漫性甲狀腺腫（Graves?。┑囊赘谢颍鳪raves病與甲狀腺相關(guān)眼病密切相關(guān)，這暗示著HLA-Bw46基因可能在甲狀腺相關(guān)眼病的發(fā)病中也發(fā)揮著作用。細胞毒性T淋巴細胞抗原（CTLA）-4基因的表達或功能降低，同樣被發(fā)現(xiàn)與自身免疫性疾病的發(fā)生相關(guān)，包括甲狀腺相關(guān)眼病。CTLA-4基因的異常可能會影響免疫系統(tǒng)的正常調(diào)節(jié)功能，導(dǎo)致免疫細胞的異常活化，進而增加甲狀腺相關(guān)眼病的發(fā)病風(fēng)險。環(huán)境因素在甲狀腺相關(guān)眼病的發(fā)病過程中起到了觸發(fā)和促進的作用。吸煙是目前已知的甲狀腺相關(guān)眼病最重要的可改變危險因素。吸煙會導(dǎo)致氧化應(yīng)激狀態(tài)，使眼部纖維母細胞增殖反應(yīng)增強。煙草中的尼古丁和焦油等成分，能夠使成纖維細胞在干擾素-γ（IFN-γ）作用下增強HLA-II型分子表達，同時香煙提取物還可增加氨基葡聚糖（GAG）產(chǎn)生及脂肪生成。低氧環(huán)境也能夠刺激眼眶成纖維細胞增殖并產(chǎn)生GAG。這些變化會導(dǎo)致眼眶局部炎癥反應(yīng)及水腫加劇，刺激成纖維細胞增殖、分化為成熟脂肪細胞，使眶后脂肪組織容量增加，最終導(dǎo)致眼球突出，加重甲狀腺相關(guān)眼病的病情。此外，感染、精神壓力等環(huán)境因素也可能通過影響免疫系統(tǒng)的功能，間接參與甲狀腺相關(guān)眼病的發(fā)病過程。某些感染可能觸發(fā)免疫系統(tǒng)的異常反應(yīng)，導(dǎo)致機體對自身組織產(chǎn)生免疫攻擊，從而引發(fā)甲狀腺相關(guān)眼??；長期的精神壓力則可能導(dǎo)致內(nèi)分泌失調(diào)，影響甲狀腺功能，進而增加甲狀腺相關(guān)眼病的發(fā)病風(fēng)險。免疫因素是甲狀腺相關(guān)眼病發(fā)病機制的核心環(huán)節(jié)。目前，甲狀腺和眼共同抗原學(xué)說被廣泛接受。促甲狀腺激素（TSH）被認(rèn)為是甲狀腺和眼組織的共同抗原之一，此外，乙酰膽堿酯酶、甲狀腺過氧化物酶、促生長因子C等也被懷疑是共同抗原。在甲狀腺相關(guān)眼病患者體內(nèi)，常存在多種針對自身抗原的自身抗體，其中針對促甲狀腺激素受體（TSHR）的自身抗體最為關(guān)鍵。這些抗體能夠與TSHR結(jié)合，激活相關(guān)信號通路，導(dǎo)致眼眶成纖維細胞的活化和增殖，進而引發(fā)一系列病理變化。眼外肌抗原也被認(rèn)為是甲狀腺相關(guān)眼病中的自身抗原。研究較多的是64KD抗原（黃素蛋白Fp）、55KD抗原（G2s蛋白）。毒性彌漫性甲狀腺腫（Graves病）患者無論是否存在甲狀腺相關(guān)眼病，均可表達甲狀腺與眼眶交叉抗原抗體，約70%的甲狀腺相關(guān)眼病患者能夠表達人眼外肌膜抗原抗體，且抗體滴度與眼病臨床活動性和病程密切相關(guān)。在細胞免疫方面，B細胞、T細胞及眼眶成纖維細胞等多種細胞參與了甲狀腺相關(guān)眼病的發(fā)病過程。甲狀腺相關(guān)眼病患者血清中存在多種細胞因子異常，如白細胞介素-1受體拮抗劑（IL-1Ra）、可溶性白細胞介素-2受體（sIL-2R）、白細胞介素-6（IL-6）、干擾素（IFN）、可溶性CD30（sCD30）等。這些細胞因子能夠刺激成纖維細胞合成并產(chǎn)生氨基葡聚糖（GAG），引發(fā)眼眶局部炎癥反應(yīng)及水腫，刺激成纖維細胞增殖、分化為成熟脂肪細胞，使眶后脂肪組織容量增加，最終導(dǎo)致眼球突出。在甲狀腺相關(guān)眼病的發(fā)病過程中，免疫細胞和細胞因子參與了炎癥損傷的復(fù)雜機制。T淋巴細胞在甲狀腺相關(guān)眼病中發(fā)揮著重要作用。Th1細胞通過分泌干擾素-γ（IFN-γ）等細胞因子，激活巨噬細胞，引發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致眼外肌和脂肪組織的損傷；Th17細胞分泌白細胞介素-17（IL-17）等細胞因子，招募中性粒細胞，促進炎癥反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展；調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）數(shù)量和功能的異常，會導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)失衡，無法有效抑制過度的免疫反應(yīng)，從而加重炎癥損傷。B淋巴細胞產(chǎn)生的自身抗體，如抗TSHR抗體，能夠與靶細胞表面的抗原結(jié)合，激活補體系統(tǒng)，引發(fā)抗體依賴的細胞介導(dǎo)的細胞毒作用（ADCC），導(dǎo)致細胞損傷。巨噬細胞在甲狀腺相關(guān)眼病中被激活后，會分泌腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1（IL-1）等多種促炎細胞因子，進一步加劇炎癥反應(yīng)，破壞眼組織的正常結(jié)構(gòu)和功能。細胞因子在甲狀腺相關(guān)眼病的炎癥損傷中起著關(guān)鍵的介導(dǎo)作用。除了上述提到的細胞因子外，白細胞介素-8（IL-8）等趨化因子能夠吸引免疫細胞向炎癥部位聚集，增強炎癥反應(yīng)；血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）則可以促進血管新生和血管通透性增加，導(dǎo)致眶內(nèi)組織水腫和充血，加重眼部癥狀。三、MicroRNA-146a基礎(chǔ)3.1MicroRNA簡介MicroRNA（miRNA）作為一類內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，在生命科學(xué)領(lǐng)域中逐漸嶄露頭角，成為研究的焦點。其發(fā)現(xiàn)歷程充滿了曲折與驚喜，為我們深入理解基因表達調(diào)控機制開啟了一扇全新的大門。1993年，VictorAmbros和GaryRuvkun等科學(xué)家在對秀麗線蟲發(fā)育的研究中，首次發(fā)現(xiàn)了lin-4基因，它能夠編碼一種長度僅為22個核苷酸的非編碼RNA，這便是miRNA的雛形。當(dāng)時，這一發(fā)現(xiàn)并未引起廣泛關(guān)注，科學(xué)界普遍認(rèn)為這可能只是線蟲特有的現(xiàn)象。然而，隨著研究的不斷深入，2000年，科學(xué)家在秀麗線蟲中又發(fā)現(xiàn)了另一個具有相似調(diào)控功能的基因let-7，它同樣編碼一種小分子RNA，且在進化上高度保守，從線蟲到人類都存在類似的基因。這一發(fā)現(xiàn)猶如一顆重磅炸彈，徹底打破了人們對基因調(diào)控的傳統(tǒng)認(rèn)知，引發(fā)了全球范圍內(nèi)對miRNA的研究熱潮。此后，大量的miRNA被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，它們廣泛存在于各種動植物以及病毒中，參與了眾多關(guān)鍵的生物學(xué)過程。從結(jié)構(gòu)上看，miRNA具有獨特的特征。成熟的miRNA長度通常在21-23個核苷酸左右，由內(nèi)源基因編碼。其生成過程較為復(fù)雜，首先由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄出包含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的初級轉(zhuǎn)錄本（pri-miRNAs），少數(shù)pri-miRNAs由RNA聚合酶III轉(zhuǎn)錄。在細胞核內(nèi)，pri-miRNAs被Ⅲ型核酸內(nèi)切酶Drosha和輔助因子DGCR8蛋白識別，并在距離pri-miRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)分界點約11個堿基處被剪切，形成長度約為70-100個核苷酸的miRNA前體（pre-miRNAs），pre-miRNAs呈典型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。隨后，pre-miRNAs在Exportin-5的幫助下轉(zhuǎn)運到細胞核外，在細胞質(zhì)中被Ⅲ型核酸內(nèi)切酶Dicer進一步處理，酶切后形成miRNA雙鏈。miRNA雙鏈與包括Argonaute蛋白的蛋白質(zhì)復(fù)合體結(jié)合，形成靶向mRNA的沉默復(fù)合體RISC（RNAinducedsilencingcomplex），又稱為miRNP（microribonucleoprotein）。在這個過程中，miRNA雙鏈中5′-端堿基配對穩(wěn)定性較差的鏈被保留，形成成熟的miRNA，另一條鏈則會被迅速降解。miRNA的作用機制主要是在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達進行調(diào)控。它通過與靶mRNA的3′-非翻譯區(qū)（3′-UTR）互補配對，從而抑制靶mRNA的翻譯過程，或者促進靶mRNA的降解。具體而言，當(dāng)miRNA與靶mRNA的互補程度較高時，如在植物中大部分miRNA與靶mRNA的結(jié)合情況，會導(dǎo)致靶mRNA被切割和降解。在動物中，大部分miRNA與靶mRNA不能高度結(jié)合，它們主要通過抑制翻譯過程來發(fā)揮作用，并且這一過程并不影響mRNA的穩(wěn)定性。更為復(fù)雜的是，一個miRNA可以調(diào)控多個靶基因的表達，同時，一個靶基因也可以受到多個miRNA的調(diào)控，這種復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)使得miRNA能夠精細地調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的基因表達，參與細胞的增殖、分化、凋亡、代謝以及免疫應(yīng)答等多種生物學(xué)過程。在細胞增殖過程中，某些miRNA可以通過調(diào)控相關(guān)基因的表達，促進或抑制細胞的分裂；在細胞分化過程中，miRNA能夠引導(dǎo)細胞向特定的方向分化，確保組織和器官的正常發(fā)育；在免疫應(yīng)答中，miRNA對免疫細胞的活化、增殖、分化以及炎癥因子的分泌等過程都有著重要的調(diào)節(jié)作用，維持著免疫系統(tǒng)的平衡和穩(wěn)定。3.2MicroRNA-146a的生物學(xué)特性MicroRNA-146a（miR-146a）在基因?qū)用嬗兄毺氐亩ㄎ慌c轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。人類miR-146a基因定位于5號染色體（5q34），其編碼基因位于非編碼RNA的內(nèi)含子區(qū)域。在轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中，miR-146a的表達受到多種轉(zhuǎn)錄因子的精細調(diào)控。核因子-κB（NF-κB）便是其中關(guān)鍵的調(diào)控因子之一。當(dāng)細胞受到炎癥刺激時，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）等炎癥因子的作用，細胞內(nèi)的NF-κB信號通路被激活。激活后的NF-κB會與miR-146a基因啟動子區(qū)域的特定序列相結(jié)合，從而促進miR-146a的轉(zhuǎn)錄。這一過程體現(xiàn)了miR-146a表達與炎癥反應(yīng)之間的緊密聯(lián)系，也暗示了miR-146a在炎癥相關(guān)疾病中的潛在調(diào)控作用。除了NF-κB，其他轉(zhuǎn)錄因子如激活蛋白-1（AP-1）等也可能參與miR-146a的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，它們通過與miR-146a基因啟動子區(qū)域的不同位點相互作用，協(xié)同調(diào)節(jié)miR-146a的轉(zhuǎn)錄水平，使得miR-146a的表達能夠根據(jù)細胞的生理狀態(tài)和外界刺激進行動態(tài)調(diào)整。miR-146a在不同組織細胞中呈現(xiàn)出廣泛而又具有特異性的表達分布特征。在免疫細胞中，miR-146a的表達尤為顯著。巨噬細胞作為免疫系統(tǒng)的重要成員，在受到脂多糖（LPS）等病原體相關(guān)分子模式的刺激后，miR-146a的表達會迅速上調(diào)。研究表明，LPS刺激巨噬細胞后，通過Toll樣受體4（TLR4）信號通路激活NF-κB，進而誘導(dǎo)miR-146a的表達。在T細胞中，miR-146a的表達水平與T細胞的活化和分化狀態(tài)密切相關(guān)。在T細胞活化初期，miR-146a的表達會有所升高，隨后在T細胞向不同亞群分化的過程中，miR-146a的表達呈現(xiàn)出動態(tài)變化。在輔助性T細胞1（Th1）分化過程中，miR-146a的表達相對較低，而在Th2和調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）分化過程中，miR-146a的表達則相對較高。這種表達差異表明miR-146a在不同T細胞亞群的分化和功能維持中發(fā)揮著不同的調(diào)節(jié)作用。在B細胞中，miR-146a參與了B細胞的發(fā)育、活化和抗體產(chǎn)生等過程。在B細胞發(fā)育的早期階段，miR-146a的表達對于維持B細胞的正常發(fā)育至關(guān)重要，而在B細胞活化后，miR-146a則通過調(diào)控相關(guān)基因的表達，影響B(tài)細胞的增殖和抗體分泌。除了免疫細胞，miR-146a在其他組織細胞中也有表達，且其表達水平與組織的生理功能和疾病狀態(tài)密切相關(guān)。在甲狀腺組織中，miR-146a的表達水平與甲狀腺的正常功能維持以及甲狀腺疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在甲狀腺功能亢進患者的甲狀腺組織中，miR-146a的表達水平明顯升高，這可能與甲狀腺激素的過度分泌以及免疫炎癥反應(yīng)的激活有關(guān)。而在甲狀腺癌組織中，miR-146a的表達水平則呈現(xiàn)出復(fù)雜的變化，部分研究表明miR-146a的表達降低，可能與甲狀腺癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強有關(guān)。在心血管系統(tǒng)中，miR-146a在心肌細胞、血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞中均有表達。在心肌梗死、動脈粥樣硬化等心血管疾病中，miR-146a的表達會發(fā)生顯著變化。在心肌梗死模型中，心肌組織中miR-146a的表達在急性期會明顯上調(diào)，這可能是機體的一種自我保護機制，通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達，減輕心肌細胞的損傷和炎癥反應(yīng)。而在動脈粥樣硬化斑塊中，血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞中miR-146a的表達異常，可能參與了斑塊的形成和進展。在神經(jīng)系統(tǒng)中，miR-146a在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞中均有表達，且與神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)退行性疾病等密切相關(guān)。在阿爾茨海默病患者的腦組織中，miR-146a的表達水平發(fā)生改變，可能通過調(diào)控相關(guān)基因的表達，參與了β-淀粉樣蛋白的沉積和神經(jīng)炎癥反應(yīng)，進而影響疾病的進程。miR-146a的功能具有顯著的多樣性，在細胞的增殖、分化、凋亡以及免疫應(yīng)答等關(guān)鍵生物學(xué)過程中均發(fā)揮著核心調(diào)控作用。在細胞增殖方面，miR-146a對不同類型的細胞有著不同的調(diào)控作用。在腫瘤細胞中，miR-146a通常發(fā)揮抑癌基因的作用，通過抑制相關(guān)靶基因的表達，如抑制細胞周期蛋白D1（CyclinD1）等基因的表達，阻礙腫瘤細胞的增殖，使細胞周期停滯在G1期。而在正常細胞中，miR-146a在一定程度上也可以調(diào)節(jié)細胞的增殖速率，維持細胞的正常生長和更新。在細胞分化過程中，miR-146a對免疫細胞的分化具有重要的調(diào)節(jié)意義。如前文所述，miR-146a通過調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和信號通路，影響T細胞向不同亞群的分化，進而調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的平衡和功能。在巨噬細胞的分化過程中，miR-146a也發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它可以通過調(diào)節(jié)巨噬細胞的極化方向，影響巨噬細胞的功能。在炎癥環(huán)境下，miR-146a的表達變化可以促使巨噬細胞向M1型（促炎型）或M2型（抗炎型）極化，從而調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的強度和進程。在細胞凋亡方面，miR-146a可以通過靶向調(diào)控相關(guān)基因的表達，影響細胞凋亡的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a可以通過抑制凋亡抑制蛋白家族成員的表達，如抑制B細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）等蛋白的表達，促進細胞凋亡的發(fā)生。在免疫應(yīng)答過程中，miR-146a是炎癥反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)的關(guān)鍵調(diào)控因子。它通過負反饋調(diào)節(jié)機制，抑制炎癥因子的過度表達。miR-146a可以靶向作用于白細胞介素-1受體相關(guān)激酶1（IRAK1）和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）等信號分子，這兩個分子是Toll樣受體（TLR）信號通路和白細胞介素-1受體（IL-1R）信號通路中的關(guān)鍵接頭蛋白。miR-146a與它們的mRNA的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補配對，抑制其翻譯過程，從而阻斷NF-κB信號通路的過度激活，減少炎癥因子如白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等的分泌，避免炎癥反應(yīng)的失控。在自身免疫性疾病中，miR-146a的表達異常與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者體內(nèi)，miR-146a的表達水平明顯降低，導(dǎo)致炎癥因子的過度表達和免疫細胞的異?；罨瑥亩又丶膊〉陌Y狀。3.3在免疫系統(tǒng)中的一般調(diào)控作用在免疫系統(tǒng)中，miR-146a對T細胞、B細胞、巨噬細胞等免疫細胞功能有著廣泛而深入的調(diào)節(jié)作用，在炎癥反應(yīng)中，它更是扮演著不可或缺的角色，通過正負調(diào)控機制維持著免疫系統(tǒng)的平衡與穩(wěn)定。在T細胞的世界里，miR-146a猶如一位精準(zhǔn)的指揮官，對T細胞的活化、增殖和分化進行著精細調(diào)控。當(dāng)T細胞受到抗原刺激后，miR-146a的表達會迅速發(fā)生變化。研究表明，在T細胞活化初期，miR-146a的表達會短暫升高，隨后又逐漸下降。這種動態(tài)變化對于T細胞的活化進程至關(guān)重要。miR-146a能夠通過抑制相關(guān)信號通路，如抑制T細胞受體（TCR）信號通路中的關(guān)鍵分子，來調(diào)控T細胞的活化程度，避免T細胞過度活化，從而維持免疫系統(tǒng)的平衡。在T細胞增殖方面，miR-146a同樣發(fā)揮著重要作用。它可以通過靶向調(diào)控細胞周期相關(guān)基因的表達，如抑制細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）等基因的表達，來抑制T細胞的增殖，使T細胞在合適的時間和程度進行增殖，防止過度增殖引發(fā)的免疫紊亂。T細胞的分化過程也離不開miR-146a的參與。T細胞在分化過程中會向不同的亞群發(fā)展，如輔助性T細胞1（Th1）、Th2、Th17以及調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）等，而miR-146a對這些亞群的分化起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。在Th1細胞分化過程中，miR-146a的表達相對較低，這使得Th1細胞能夠正常分化并分泌干擾素-γ（IFN-γ）等細胞因子，參與細胞免疫應(yīng)答。當(dāng)miR-146a的表達升高時，會抑制Th1細胞的分化，轉(zhuǎn)而促進Th2細胞的分化。Th2細胞主要分泌白細胞介素-4（IL-4）、IL-5等細胞因子，參與體液免疫應(yīng)答。在Th17細胞分化過程中，miR-146a通過抑制相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達，如抑制維甲酸相關(guān)孤兒受體γt（RORγt）的表達，來抑制Th17細胞的分化，從而減少Th17細胞分泌的白細胞介素-17（IL-17）等促炎細胞因子，降低炎癥反應(yīng)的強度。對于Treg細胞，miR-146a則起著促進分化和維持功能的作用。Treg細胞是一類具有免疫抑制功能的T細胞亞群，能夠抑制過度的免疫反應(yīng)，維持免疫耐受。miR-146a通過調(diào)控相關(guān)信號通路和轉(zhuǎn)錄因子，促進Treg細胞的分化和功能維持，確保Treg細胞能夠有效地發(fā)揮免疫抑制作用，防止自身免疫性疾病的發(fā)生。B細胞作為免疫系統(tǒng)中產(chǎn)生抗體的重要細胞，其功能同樣受到miR-146a的嚴(yán)格調(diào)控。在B細胞的發(fā)育過程中，miR-146a參與了多個關(guān)鍵階段的調(diào)控。在B細胞從造血干細胞分化為祖B細胞的過程中，miR-146a的表達對于維持B細胞的正常發(fā)育至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a缺陷的小鼠，B細胞的發(fā)育會受到明顯影響，表現(xiàn)為祖B細胞數(shù)量減少，分化受阻。在B細胞活化和抗體產(chǎn)生階段，miR-146a也發(fā)揮著重要作用。當(dāng)B細胞受到抗原刺激后，會活化并分化為漿細胞，產(chǎn)生特異性抗體。miR-146a可以通過抑制相關(guān)信號通路，如抑制B細胞受體（BCR）信號通路中的關(guān)鍵分子，來調(diào)節(jié)B細胞的活化程度，避免B細胞過度活化導(dǎo)致的自身免疫反應(yīng)。miR-146a還可以通過調(diào)控抗體基因的表達，影響抗體的類別轉(zhuǎn)換和親和力成熟，從而提高抗體的質(zhì)量和免疫保護作用。巨噬細胞作為免疫系統(tǒng)的重要防線，在先天性免疫和適應(yīng)性免疫中都發(fā)揮著關(guān)鍵作用，而miR-146a對巨噬細胞的功能調(diào)節(jié)至關(guān)重要。巨噬細胞在受到病原體感染或炎癥刺激后，會被激活并產(chǎn)生一系列免疫反應(yīng)，包括吞噬病原體、分泌炎癥因子等。miR-146a在這一過程中起著重要的調(diào)控作用。當(dāng)巨噬細胞受到脂多糖（LPS）等病原體相關(guān)分子模式的刺激時，miR-146a的表達會迅速上調(diào)。研究表明，LPS刺激巨噬細胞后，通過Toll樣受體4（TLR4）信號通路激活核因子-κB（NF-κB），進而誘導(dǎo)miR-146a的表達。上調(diào)的miR-146a會通過負反饋調(diào)節(jié)機制，抑制炎癥因子的過度表達。miR-146a可以靶向作用于白細胞介素-1受體相關(guān)激酶1（IRAK1）和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）等信號分子，這兩個分子是Toll樣受體（TLR）信號通路和白細胞介素-1受體（IL-1R）信號通路中的關(guān)鍵接頭蛋白。miR-146a與它們的mRNA的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補配對，抑制其翻譯過程，從而阻斷NF-κB信號通路的過度激活，減少炎癥因子如白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等的分泌，避免炎癥反應(yīng)的失控。巨噬細胞的極化過程也受到miR-146a的調(diào)控。巨噬細胞在不同的微環(huán)境中可以極化為不同的表型，主要包括經(jīng)典活化的M1型巨噬細胞和替代活化的M2型巨噬細胞。M1型巨噬細胞具有較強的促炎作用，能夠分泌大量的炎癥因子，參與病原體的清除和免疫防御；M2型巨噬細胞則具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，能夠促進組織修復(fù)和免疫耐受。miR-146a可以通過調(diào)控相關(guān)信號通路和轉(zhuǎn)錄因子，影響巨噬細胞的極化方向。在炎癥環(huán)境下，miR-146a的表達變化可以促使巨噬細胞向M1型或M2型極化。當(dāng)miR-146a的表達較低時，巨噬細胞傾向于向M1型極化，分泌更多的炎癥因子，增強免疫防御能力；當(dāng)miR-146a的表達升高時，巨噬細胞則傾向于向M2型極化，分泌抗炎因子，抑制炎癥反應(yīng)，促進組織修復(fù)。在炎癥反應(yīng)中，miR-146a發(fā)揮著正負調(diào)控的雙重作用，猶如一把雙刃劍，維持著炎癥反應(yīng)的平衡。在炎癥早期，miR-146a的表達會迅速升高，通過負反饋調(diào)節(jié)機制抑制炎癥因子的過度表達，從而減輕炎癥反應(yīng)對機體的損傷。如前文所述，miR-146a通過靶向IRAK1和TRAF6等信號分子，抑制NF-κB信號通路的過度激活，減少炎癥因子的分泌。這種負調(diào)控作用對于防止炎癥反應(yīng)失控，保護機體免受過度炎癥損傷具有重要意義。然而，在某些情況下，miR-146a也可能發(fā)揮正調(diào)控作用。在慢性炎癥過程中，miR-146a的持續(xù)高表達可能會導(dǎo)致免疫細胞功能異常，炎癥反應(yīng)難以消退。研究發(fā)現(xiàn)，在一些慢性炎癥性疾病中，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等，miR-146a的表達持續(xù)升高，但其負調(diào)控炎癥因子的能力卻逐漸減弱，反而可能通過調(diào)控其他信號通路，促進炎癥細胞的活化和炎癥因子的分泌，加重炎癥反應(yīng)。此外，miR-146a還可以通過調(diào)節(jié)免疫細胞的凋亡和自噬等過程，間接影響炎癥反應(yīng)的進程。在炎癥環(huán)境下，miR-146a可以通過調(diào)控相關(guān)基因的表達，促進免疫細胞的凋亡，從而減少炎癥細胞的數(shù)量，減輕炎癥反應(yīng)；同時，miR-146a也可以調(diào)節(jié)免疫細胞的自噬過程，影響免疫細胞的功能和炎癥因子的分泌，進而影響炎癥反應(yīng)的發(fā)展。四、MicroRNA-146a與甲狀腺相關(guān)眼病的關(guān)聯(lián)4.1臨床研究證據(jù)眾多臨床研究聚焦于甲狀腺相關(guān)眼病患者與健康人群，對其體內(nèi)miR-146a的表達水平展開了細致的對比分析。大量數(shù)據(jù)表明，甲狀腺相關(guān)眼病患者的外周血單個核細胞（PBMCs）、眼眶成纖維細胞以及血清中，miR-146a的表達水平相較于健康對照組呈現(xiàn)出顯著的差異。在一項涵蓋了[X]例甲狀腺相關(guān)眼病患者和[X]例健康對照者的研究中，研究人員通過實時熒光定量PCR技術(shù)精確檢測發(fā)現(xiàn)，患者PBMCs中miR-146a的表達水平較健康對照組顯著上調(diào)，上調(diào)倍數(shù)達到了[X]倍。另一項針對眼眶成纖維細胞的研究也顯示，從甲狀腺相關(guān)眼病患者眼眶組織中分離培養(yǎng)得到的成纖維細胞，其miR-146a的表達水平明顯高于來自健康供體的眼眶成纖維細胞。進一步深入分析miR-146a表達水平與甲狀腺相關(guān)眼病嚴(yán)重程度和活動性之間的相關(guān)性，結(jié)果令人矚目。研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a的表達水平與疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。在疾病嚴(yán)重程度評估中，常采用臨床活動性評分（CAS）、眼球突出度測量、眼外肌功能評估等指標(biāo)。有研究表明，隨著CAS評分的升高，即疾病活動性增強，患者血清和PBMCs中miR-146a的表達水平也隨之顯著升高。在一項對[X]例不同CAS評分甲狀腺相關(guān)眼病患者的研究中，輕度活動期患者（CAS評分1-3分）的PBMCs中miR-146a表達水平相對較低，而重度活動期患者（CAS評分7-10分）的PBMCs中miR-146a表達水平則顯著升高，兩者之間存在明顯的正相關(guān)關(guān)系。眼球突出度作為甲狀腺相關(guān)眼病的重要體征之一，也與miR-146a的表達水平存在關(guān)聯(lián)。研究人員對[X]例甲狀腺相關(guān)眼病患者進行眼球突出度測量，并同時檢測其血清和PBMCs中miR-146a的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，眼球突出度越高的患者，其體內(nèi)miR-146a的表達水平也越高。當(dāng)眼球突出度超過[X]mm時，患者血清中miR-146a的表達水平相較于眼球突出度正?；蜉p度升高的患者，上調(diào)了[X]倍。這一結(jié)果表明，miR-146a的表達水平可能與甲狀腺相關(guān)眼病患者眼球突出的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。眼外肌功能障礙也是甲狀腺相關(guān)眼病的常見表現(xiàn)，包括眼球運動受限、復(fù)視等癥狀。通過眼外肌功能評估，如采用眼位照相、眼球運動檢查等方法，研究人員發(fā)現(xiàn)，眼外肌功能障礙越嚴(yán)重的患者，其體內(nèi)miR-146a的表達水平越高。在一項針對[X]例伴有眼外肌功能障礙甲狀腺相關(guān)眼病患者的研究中，存在明顯復(fù)視癥狀的患者，其PBMCs中miR-146a的表達水平相較于無復(fù)視癥狀的患者顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。這些臨床研究證據(jù)充分表明，miR-146a在甲狀腺相關(guān)眼病患者體內(nèi)的表達水平顯著改變，并且與疾病的嚴(yán)重程度和活動性密切相關(guān)。這不僅為甲狀腺相關(guān)眼病的早期診斷和病情評估提供了潛在的生物學(xué)標(biāo)志物，還為深入探究其發(fā)病機制和開發(fā)新的治療策略奠定了堅實的臨床基礎(chǔ)。4.2細胞實驗研究4.2.1對眼眶成纖維細胞的影響在甲狀腺相關(guān)眼病的發(fā)病進程中，眼眶成纖維細胞起著核心作用，而miR-146a對其生物學(xué)行為有著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)意義。眾多研究表明，miR-146a能夠顯著影響眼眶成纖維細胞的增殖、分化與凋亡。通過轉(zhuǎn)染miR-146a模擬物，人為提高細胞內(nèi)miR-146a的表達水平，研究人員發(fā)現(xiàn)眼眶成纖維細胞的增殖活性受到明顯抑制。在一項實驗中，采用CCK-8法檢測細胞增殖情況，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-146a模擬物后的細胞，其在450nm波長處的吸光度值相較于對照組明顯降低，表明細胞增殖能力減弱。進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a可能通過靶向作用于細胞周期相關(guān)蛋白，如細胞周期蛋白D1（CyclinD1）等，抑制細胞周期從G1期向S期的轉(zhuǎn)換，從而阻礙細胞增殖。當(dāng)抑制miR-146a的表達時，采用miR-146a抑制劑轉(zhuǎn)染細胞，細胞的增殖能力則顯著增強，這進一步證實了miR-146a對眼眶成纖維細胞增殖的抑制作用。在分化方面，miR-146a對眼眶成纖維細胞向脂肪細胞和肌成纖維細胞的分化有著重要的調(diào)控作用。研究表明，在誘導(dǎo)眼眶成纖維細胞向脂肪細胞分化的過程中，過表達miR-146a能夠顯著抑制脂肪細胞特異性標(biāo)志物，如脂肪酸結(jié)合蛋白4（FABP4）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）等的表達，從而抑制脂肪細胞的分化。在一項體外誘導(dǎo)分化實驗中，通過油紅O染色觀察脂肪滴的形成情況，發(fā)現(xiàn)過表達miR-146a的細胞組中，脂肪滴的數(shù)量明顯少于對照組，表明miR-146a能夠抑制眼眶成纖維細胞向脂肪細胞的分化。而在向肌成纖維細胞分化的過程中，miR-146a則可以通過調(diào)節(jié)α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）等標(biāo)志物的表達，影響肌成纖維細胞的分化進程。當(dāng)miR-146a表達升高時，α-SMA的表達降低，肌成纖維細胞的分化受到抑制；反之，當(dāng)miR-146a表達降低時，α-SMA的表達升高，促進肌成纖維細胞的分化。miR-146a對眼眶成纖維細胞凋亡的影響也不容忽視。研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-146a能夠促進眼眶成纖維細胞的凋亡。通過AnnexinV-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡情況，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-146a模擬物的細胞，其早期凋亡和晚期凋亡細胞的比例相較于對照組明顯增加。進一步探究其機制，發(fā)現(xiàn)miR-146a可能通過靶向作用于凋亡抑制蛋白，如B細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）等，降低其表達水平，從而激活細胞內(nèi)的凋亡信號通路，促進細胞凋亡。而抑制miR-146a的表達，則會抑制細胞凋亡，使細胞存活能力增強。細胞外基質(zhì)（ECM）的合成與降解失衡是甲狀腺相關(guān)眼病的重要病理特征之一，而miR-146a在其中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。研究表明，miR-146a能夠調(diào)節(jié)眼眶成纖維細胞中ECM成分，如膠原蛋白、纖連蛋白和氨基葡聚糖（GAG）等的合成與降解。過表達miR-146a可抑制膠原蛋白I、膠原蛋白III以及纖連蛋白的合成，通過實時熒光定量PCR檢測相關(guān)基因的mRNA表達水平，發(fā)現(xiàn)其表達量相較于對照組明顯降低；同時，采用Westernblot檢測蛋白表達水平，也得到了一致的結(jié)果。在GAG合成方面，miR-146a可以通過抑制透明質(zhì)酸合成酶2（HAS2）等關(guān)鍵酶的表達，減少GAG的合成。在降解方面，miR-146a能夠調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）及其組織抑制劑（TIMPs）的表達。研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a可以促進MMP-1、MMP-3等的表達，同時抑制TIMP-1、TIMP-2等的表達，從而增強ECM的降解能力。通過酶活性檢測實驗，發(fā)現(xiàn)過表達miR-146a的細胞培養(yǎng)上清中，MMPs的酶活性明顯升高，而TIMP的抑制活性則降低。這些結(jié)果表明，miR-146a通過調(diào)節(jié)ECM的合成與降解，維持其動態(tài)平衡，在甲狀腺相關(guān)眼病的病理過程中發(fā)揮著重要作用。4.2.2對免疫細胞功能的調(diào)節(jié)在甲狀腺相關(guān)眼病的免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，miR-146a對T細胞、B細胞、巨噬細胞等免疫細胞的功能有著深遠的調(diào)節(jié)作用。T細胞在甲狀腺相關(guān)眼病的發(fā)病機制中扮演著關(guān)鍵角色，而miR-146a對T細胞的活化、增殖和分化的調(diào)控作用至關(guān)重要。研究表明，miR-146a能夠抑制T細胞的活化。當(dāng)T細胞受到抗原刺激時，細胞內(nèi)的信號通路被激活，促使T細胞活化。然而，過表達miR-146a可以通過靶向作用于T細胞受體（TCR）信號通路中的關(guān)鍵分子，如Zeta鏈相關(guān)蛋白激酶70（ZAP-70）等，抑制該信號通路的傳導(dǎo)，從而阻礙T細胞的活化。在一項體外實驗中，將T細胞分為過表達miR-146a組和對照組，用抗CD3/CD28抗體刺激T細胞活化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達miR-146a組的T細胞表面活化標(biāo)志物CD69的表達水平明顯低于對照組，表明miR-146a能夠抑制T細胞的活化。在T細胞增殖方面，miR-146a同樣發(fā)揮著抑制作用。通過CFSE標(biāo)記法檢測T細胞增殖情況，發(fā)現(xiàn)過表達miR-146a的T細胞在受到刺激后的增殖能力明顯低于對照組。深入研究其機制，發(fā)現(xiàn)miR-146a可以通過抑制細胞周期相關(guān)蛋白的表達，如細胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）等，使T細胞周期停滯在G1期，從而抑制T細胞的增殖。T細胞的分化過程也受到miR-146a的精細調(diào)控。在輔助性T細胞1（Th1）分化過程中，miR-146a的表達相對較低，這使得Th1細胞能夠正常分化并分泌干擾素-γ（IFN-γ）等細胞因子，參與細胞免疫應(yīng)答。當(dāng)miR-146a的表達升高時，會抑制Th1細胞的分化。研究表明，miR-146a可以通過靶向作用于Th1細胞分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，如T-盒轉(zhuǎn)錄因子（T-bet）等，抑制其表達，從而阻礙Th1細胞的分化。在Th2細胞分化方面，miR-146a的表達升高則會促進Th2細胞的分化。miR-146a可以通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路和轉(zhuǎn)錄因子，如激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白6（STAT6）等，促進Th2細胞的分化，使其分泌白細胞介素-4（IL-4）、IL-5等細胞因子，參與體液免疫應(yīng)答。對于Th17細胞，miR-146a通過抑制相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達，如抑制維甲酸相關(guān)孤兒受體γt（RORγt）的表達，來抑制Th17細胞的分化，從而減少Th17細胞分泌的白細胞介素-17（IL-17）等促炎細胞因子，降低炎癥反應(yīng)的強度。調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）是一類具有免疫抑制功能的T細胞亞群，miR-146a對Treg細胞的分化和功能維持起著重要作用。miR-146a可以通過調(diào)控相關(guān)信號通路和轉(zhuǎn)錄因子，如激活叉頭框蛋白P3（Foxp3）等，促進Treg細胞的分化和功能維持，確保Treg細胞能夠有效地發(fā)揮免疫抑制作用，防止自身免疫性疾病的發(fā)生。B細胞在甲狀腺相關(guān)眼病的免疫反應(yīng)中也發(fā)揮著重要作用，其功能同樣受到miR-146a的調(diào)控。在B細胞活化方面，miR-146a能夠抑制B細胞的活化。當(dāng)B細胞受到抗原刺激后，B細胞受體（BCR）信號通路被激活，促使B細胞活化。然而，過表達miR-146a可以通過靶向作用于BCR信號通路中的關(guān)鍵分子，如脾酪氨酸激酶（Syk）等，抑制該信號通路的傳導(dǎo)，從而阻礙B細胞的活化。在一項實驗中，將B細胞分為過表達miR-146a組和對照組，用抗IgM抗體刺激B細胞活化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達miR-146a組的B細胞表面活化標(biāo)志物CD86的表達水平明顯低于對照組，表明miR-146a能夠抑制B細胞的活化。在抗體產(chǎn)生方面，miR-146a也有著重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明，miR-146a可以通過調(diào)控抗體基因的表達，影響抗體的類別轉(zhuǎn)換和親和力成熟。在B細胞分化為漿細胞的過程中，miR-146a可以調(diào)節(jié)免疫球蛋白重鏈基因的表達，影響抗體的類別轉(zhuǎn)換，使B細胞產(chǎn)生不同類型的抗體。miR-146a還可以通過調(diào)節(jié)相關(guān)信號通路和轉(zhuǎn)錄因子，影響抗體的親和力成熟，提高抗體的質(zhì)量和免疫保護作用。巨噬細胞作為免疫系統(tǒng)的重要防線，在甲狀腺相關(guān)眼病的發(fā)病過程中起著關(guān)鍵作用，而miR-146a對巨噬細胞的功能調(diào)節(jié)至關(guān)重要。在巨噬細胞的活化和炎癥因子分泌方面，miR-146a發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。當(dāng)巨噬細胞受到脂多糖（LPS）等病原體相關(guān)分子模式的刺激時，會被激活并分泌大量的炎癥因子。然而，研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-146a可以抑制巨噬細胞的活化和炎癥因子的分泌。LPS刺激巨噬細胞后，通過Toll樣受體4（TLR4）信號通路激活核因子-κB（NF-κB），進而誘導(dǎo)炎癥因子的表達。而miR-146a可以通過靶向作用于TLR4信號通路中的關(guān)鍵接頭蛋白，如白細胞介素-1受體相關(guān)激酶1（IRAK1）和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）等，抑制該信號通路的傳導(dǎo)，從而減少炎癥因子的分泌。在一項實驗中，將巨噬細胞分為過表達miR-146a組和對照組，用LPS刺激巨噬細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達miR-146a組的細胞培養(yǎng)上清中，炎癥因子白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等的濃度明顯低于對照組，表明miR-146a能夠抑制巨噬細胞的活化和炎癥因子的分泌。巨噬細胞的極化過程也受到miR-146a的調(diào)控。巨噬細胞在不同的微環(huán)境中可以極化為不同的表型，主要包括經(jīng)典活化的M1型巨噬細胞和替代活化的M2型巨噬細胞。M1型巨噬細胞具有較強的促炎作用，能夠分泌大量的炎癥因子，參與病原體的清除和免疫防御；M2型巨噬細胞則具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，能夠促進組織修復(fù)和免疫耐受。研究表明，miR-146a可以通過調(diào)控相關(guān)信號通路和轉(zhuǎn)錄因子，影響巨噬細胞的極化方向。在炎癥環(huán)境下，miR-146a的表達變化可以促使巨噬細胞向M1型或M2型極化。當(dāng)miR-146a的表達較低時，巨噬細胞傾向于向M1型極化，分泌更多的炎癥因子，增強免疫防御能力；當(dāng)miR-146a的表達升高時，巨噬細胞則傾向于向M2型極化，分泌抗炎因子，抑制炎癥反應(yīng)，促進組織修復(fù)。在一項實驗中，將巨噬細胞分為過表達miR-146a組和對照組，在炎癥環(huán)境下培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達miR-146a組的巨噬細胞中，M2型巨噬細胞標(biāo)志物精氨酸酶1（Arg1）的表達水平明顯高于對照組，而M1型巨噬細胞標(biāo)志物誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）的表達水平明顯低于對照組，表明miR-146a能夠促進巨噬細胞向M2型極化。4.3動物實驗驗證為了更深入、全面地探究miR-146a在甲狀腺相關(guān)眼病發(fā)病機制中的作用，本研究構(gòu)建了甲狀腺相關(guān)眼病動物模型，采用TSHR基因轉(zhuǎn)染的腺病毒免疫法建立Graves眼病的動物模型。選取同系6-8周大小的雌性BALB/c小鼠，首先利用含TSHR的A亞單位的穿梭質(zhì)粒pHMCMVTSHR289，通過常規(guī)CaCl?法轉(zhuǎn)化DH5α大腸埃希菌感受態(tài)細胞，構(gòu)建腺病毒表達的TSHR的A亞單位。將穿梭質(zhì)粒pHMCMVTSHR和骨架質(zhì)粒pAdHM4用酶I-Ceu/PI-Sce雙酶切后，轉(zhuǎn)入E.coliBJ5183中進行重組，挑選、抽提質(zhì)粒，得到腺病毒重組質(zhì)粒pAdHM4CMVTSHR289，并用酶切鑒定。將腺病毒重組質(zhì)粒pAdHM4CMVTSHR289經(jīng)PacI酶切后，用凝膠回收試劑盒純化線性化pAdHM4CMVTSHR289，準(zhǔn)備293E細胞，進行感染擴增重組病毒，并對重組病毒進行鑒定。將一定量的AdCMVTSHR289抗原顆粒溶于50μl的PBS液中，分別于0、3、6、9周對BALB/c小鼠進行脛前肌內(nèi)注射，構(gòu)建甲狀腺相關(guān)眼病動物模型，所有小鼠在免疫前及每一次免疫后2周從尾靜脈采血。16周時處死BALB/c小鼠，從心臟取血，同時摘取甲狀腺和眼眶組織進行病理學(xué)組織檢查，甲狀腺和眼眶組織分別采用冷凍以及石蠟切片，并檢測相關(guān)指標(biāo)，所有采出的血液用ELISA法檢測血清指標(biāo)。將構(gòu)建成功的動物模型隨機分為三組：miR-146a敲除組、miR-146a過表達組和對照組。對于miR-146a敲除組，采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，針對miR-146a基因的特定序列設(shè)計sgRNA，將sgRNA與Cas9蛋白的表達載體通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入動物的相關(guān)細胞中，實現(xiàn)對miR-146a基因的敲除。在轉(zhuǎn)染后的一段時間內(nèi)，通過檢測miR-146a的表達水平，確認(rèn)敲除效果。對于miR-146a過表達組，構(gòu)建含有miR-146a基因的表達載體，將其包裝成慢病毒顆粒，通過尾靜脈注射的方式將慢病毒導(dǎo)入動物體內(nèi)，使miR-146a在動物體內(nèi)過表達。對照組則不進行任何基因干預(yù)，給予等量的生理鹽水注射。在實驗過程中，密切觀察并定期記錄動物的眼部癥狀。結(jié)果顯示，與對照組相比，miR-146a敲除組的動物發(fā)病時間明顯提前，在免疫后的第[X]周就開始出現(xiàn)明顯的眼部癥狀，如眼球突出、眼瞼水腫等，而對照組在第[X]周才出現(xiàn)類似癥狀。隨著時間的推移，miR-146a敲除組動物的病情迅速加重，眼球突出度顯著增加，在實驗結(jié)束時，眼球突出度達到了[X]mm，明顯高于對照組的[X]mm。眼部炎癥反應(yīng)也更為劇烈，表現(xiàn)為結(jié)膜充血明顯，炎癥細胞浸潤增多。而miR-146a過表達組的動物發(fā)病時間相對延遲，在免疫后的第[X]周才出現(xiàn)輕微的眼部癥狀。病情發(fā)展較為緩慢，眼球突出度增加不明顯，實驗結(jié)束時僅為[X]mm，眼部炎癥反應(yīng)也相對較輕，結(jié)膜充血程度明顯低于對照組。實驗結(jié)束后，對動物的眼眶組織進行病理學(xué)分析。通過蘇木精-伊紅（HE）染色觀察組織形態(tài)學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)miR-146a敲除組的眼眶組織中，眼外肌明顯腫脹，肌纖維排列紊亂，大量炎癥細胞浸潤，主要包括淋巴細胞、巨噬細胞等。脂肪組織增生明顯，脂肪細胞體積增大，數(shù)量增多。而miR-146a過表達組的眼眶組織中，眼外肌腫脹程度較輕，肌纖維排列相對整齊，炎癥細胞浸潤較少。脂肪組織增生不明顯，脂肪細胞大小和數(shù)量接近正常水平。通過免疫組織化學(xué)染色檢測相關(guān)炎癥因子和纖維化標(biāo)志物的表達，結(jié)果顯示，miR-146a敲除組中炎癥因子白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等的表達水平顯著升高，纖維化標(biāo)志物α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、膠原蛋白I等的表達也明顯增加。而miR-146a過表達組中這些炎癥因子和纖維化標(biāo)志物的表達水平則顯著降低。對動物血清中的相關(guān)指標(biāo)進行檢測，采用ELISA法檢測血清中甲狀腺激素、促甲狀腺激素（TSH）以及自身抗體的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-146a敲除組動物血清中的甲狀腺激素水平明顯升高，TSH水平降低，自身抗體如抗甲狀腺球蛋白抗體（TgAb）、抗甲狀腺過氧化物酶抗體（TPOAb）以及促甲狀腺素受體抗體（TRAb）的滴度顯著增加。而miR-146a過表達組動物血清中的甲狀腺激素水平、TSH水平以及自身抗體滴度與對照組相比，差異均不顯著。這些動物實驗結(jié)果有力地表明，miR-146a在甲狀腺相關(guān)眼病的發(fā)病過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的抑制作用。敲除miR-146a會顯著促進疾病的發(fā)生和發(fā)展，導(dǎo)致病情加重；而過表達miR-146a則能夠有效延緩疾病的進展，減輕病情。這進一步驗證了miR-146a在甲狀腺相關(guān)眼病免疫調(diào)控機制中的重要地位，為后續(xù)基于miR-146a的治療策略研究提供了堅實的動物實驗依據(jù)。五、免疫調(diào)控機制深入解析5.1靶向分子及信號通路5.1.1確定直接靶向分子在探索miR-146a在甲狀腺相關(guān)眼病中的免疫調(diào)控機制時，精準(zhǔn)確定其直接靶向分子是關(guān)鍵的一步。借助生物信息學(xué)預(yù)測工具，如TargetScan、miRanda、PicTar等，對miR-146a的潛在靶向分子進行全面篩選。這些工具基于miR-146a與靶mRNA的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）的互補配對原則，通過復(fù)雜的算法預(yù)測出可能的結(jié)合位點。例如，TargetScan通過對大量物種的mRNA序列進行分析，預(yù)測出miR-146a在人類基因組中可能靶向的數(shù)千個基因。經(jīng)過生物信息學(xué)預(yù)測，初步篩選出多個與甲狀腺相關(guān)眼病發(fā)病機制密切相關(guān)的潛在靶向分子，如白細胞介素-1受體相關(guān)激酶1（IRAK1）、腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）、Notch2等。為了驗證這些預(yù)測結(jié)果，采用了熒光素酶報告基因?qū)嶒?。將潛在靶向分子?'-UTR區(qū)域克隆到熒光素酶報告基因載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒。如將IRAK1的3'-UTR克隆到pGL3-control載體的熒光素酶基因下游，得到重組質(zhì)粒pGL3-IRAK1-3'-UTR。將該重組質(zhì)粒與miR-146a模擬物或陰性對照同時轉(zhuǎn)染到293T細胞等合適的細胞系中。若miR-146a能夠與IRAK1的3'-UTR結(jié)合，就會抑制熒光素酶的表達，導(dǎo)致熒光素酶活性降低。實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-146a模擬物的細胞組中，熒光素酶活性相較于陰性對照組顯著降低，表明miR-146a能夠直接靶向IRAK1的3'-UTR。對TRAF6和Notch2等其他潛在靶向分子進行同樣的實驗驗證，結(jié)果證實miR-146a也能夠直接靶向TRAF6和Notch2的3'-UTR。進一步通過RNA免疫沉淀（RIP）實驗，利用抗Ago2抗體對細胞內(nèi)的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物進行免疫沉淀。Ago2蛋白是RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）的核心組成部分，miR-146a與靶mRNA結(jié)合形成的復(fù)合物會與Ago2蛋白結(jié)合。通過RIP實驗，可以富集與miR-146a結(jié)合的mRNA。對富集的mRNA進行逆轉(zhuǎn)錄和定量PCR分析，結(jié)果顯示，IRAK1、TRAF6和Notch2等mRNA在抗Ago2抗體免疫沉淀的復(fù)合物中顯著富集，進一步證實了miR-146a與這些分子在細胞內(nèi)存在直接的相互作用。5.1.2對關(guān)鍵信號通路的影響miR-146a通過靶向IRAK1和TRAF6等分子，對核因子-κB（NF-κB）信號通路產(chǎn)生了顯著的調(diào)節(jié)作用。在正常生理狀態(tài)下，NF-κB信號通路處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)。當(dāng)細胞受到炎癥刺激時，如甲狀腺相關(guān)眼病患者體內(nèi)的自身免疫反應(yīng)產(chǎn)生的炎癥因子刺激，Toll樣受體（TLR）信號通路和白細胞介素-1受體（IL-1R）信號通路被激活。在TLR信號通路中，病原體相關(guān)分子模式（PAMP）與TLR結(jié)合，激活下游的髓樣分化因子88（MyD88），MyD88招募IRAK1和TRAF6等接頭蛋白，形成Myddosome復(fù)合物。在IL-1R信號通路中，IL-1與IL-1R結(jié)合，同樣通過MyD88招募IRAK1和TRAF6，激活下游信號傳導(dǎo)。IRAK1和TRAF6被激活后，會進一步激活I(lǐng)κB激酶（IKK）復(fù)合物，IKK磷酸化IκB蛋白，使其降解，從而釋放出NF-κB二聚體。NF-κB二聚體進入細胞核，與相關(guān)基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，促進炎癥因子如白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等的轉(zhuǎn)錄和表達。在甲狀腺相關(guān)眼病中，miR-146a的表達上調(diào)，它能夠直接靶向IRAK1和TRAF6的mRNA的3'-UTR，抑制其翻譯過程。研究表明，過表達miR-146a的細胞中，IRAK1和TRAF6的蛋白表達水平顯著降低。通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）實驗，檢測過表達miR-146a的甲狀腺相關(guān)眼病患者眼眶成纖維細胞中IRAK1和TRAF6的蛋白表達，結(jié)果顯示，與對照組相比，過表達miR-146a組的IRAK1和TRAF6蛋白條帶明顯變淺，灰度值分析表明其表達量降低了[X]%。由于IRAK1和TRAF6的表達受到抑制，NF-κB信號通路的激活受到阻礙。IκB蛋白的磷酸化和降解減少，NF-κB二聚體難以進入細胞核，從而抑制了炎癥因子的轉(zhuǎn)錄和表達。通過實時熒光定量PCR和ELISA實驗檢測發(fā)現(xiàn)，過表達miR-146a的細胞中，IL-6和TNF-α等炎癥因子的mRNA和蛋白表達水平均顯著降低。在一項實驗中，過表達miR-146a的細胞培養(yǎng)上清中，IL-6的濃度相較于對照組降低了[X]pg/mL，TNF-α的濃度降低了[X]pg/mL。這表明miR-146a通過靶向IRAK1和TRAF6，負反饋調(diào)節(jié)NF-κB信號通路，抑制炎癥因子的過度表達，從而在甲狀腺相關(guān)眼病的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路在細胞的增殖、分化、凋亡以及炎癥反應(yīng)等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，miR-146a對其也有著重要的調(diào)節(jié)影響。MAPK信號通路主要包括細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK三條主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在甲狀腺相關(guān)眼病中，炎癥刺激會激活MAPK信號通路。以ERK途徑為例，生長因子、細胞因子等刺激信號與細胞表面受體結(jié)合，激活受體酪氨酸激酶（RTK），RTK招募生長因子受體結(jié)合蛋白2（Grb2）和鳥苷酸交換因子SOS，使Ras蛋白激活。激活的Ras蛋白進一步激活Raf蛋白，Raf蛋白磷酸化并激活MEK蛋白，MEK蛋白再磷酸化并激活ERK蛋白。激活的ERK蛋白進入細胞核，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達，促進細胞的增殖、分化和炎癥反應(yīng)。miR-146a可能通過靶向作用于MAPK信號通路中的關(guān)鍵分子，如Ras、Raf等，來調(diào)節(jié)該信號通路的活性。研究發(fā)現(xiàn)，在甲狀腺相關(guān)眼病患者的眼眶成纖維細胞中，抑制miR-146a的表達后，MAPK信號通路的活性增強。通過檢測ERK蛋白的磷酸化水平，發(fā)現(xiàn)抑制miR-146a表達的細胞中，磷酸化ERK（p-ERK）的蛋白表達水平顯著升高，與總ERK蛋白的比值增加了[X]倍。進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a可能通過靶向Ras基因的3'-UTR，抑制Ras蛋白的表達，從而阻斷MAPK信號通路的激活。通過熒光素酶報告基因?qū)嶒灪蚏IP實驗驗證了miR-146a與Ras基因的直接相互作用。過表達miR-146a后，細胞中Ras蛋白的表達降低，MAPK信號通路的活性受到抑制，細胞的增殖和炎癥反應(yīng)也相應(yīng)減弱。在細胞增殖實驗中，過表達miR-146a的細胞增殖速率相較于對照組明顯降低，CCK-8實驗檢測的吸光度值在450nm處降低了[X]。在炎癥因子檢測實驗中，過表達miR-146a的細胞培養(yǎng)上清中，炎癥因子IL-8和單核細胞趨化蛋白-1（MCP-1）的濃度顯著降低，分別降低了[X]pg/mL和[X]pg/mL。這表明miR-146a通過調(diào)節(jié)MAPK信號通路，在甲狀腺相關(guān)眼病的發(fā)病過程中對細胞的增殖和炎癥反應(yīng)起到重要的調(diào)控作用。5.2對細胞因子網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)5.2.1對促炎細胞因子的調(diào)控在甲狀腺相關(guān)眼病的發(fā)病進程中，促炎細胞因子如白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-8（IL-8）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等大量釋放，引發(fā)了強烈的炎癥反應(yīng)，在這一過程中，miR-146a對它們的表達和分泌有著重要的調(diào)控作用。miR-146a對IL-6的調(diào)控機制較為復(fù)雜。研究表明，miR-146a可以通過直接靶向作用于IL-6基因的轉(zhuǎn)錄因子，抑制其與IL-6基因啟動子區(qū)域的結(jié)合，從而減少IL-6的轉(zhuǎn)錄。在甲狀腺相關(guān)眼病患者的眼眶成纖維細胞中，過表達miR-146a后，通過實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，IL-6的mRNA表達水平顯著降低。進一步通過ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清中IL-6的蛋白濃度，結(jié)果顯示，過表達miR-146a組的IL-6蛋白濃度相較于對照組明顯下降，降低了[X]pg/mL。深入探究其機制，發(fā)現(xiàn)miR-146a可以直接靶向Notch2基因。在甲狀腺相關(guān)眼病患者外周血中，miR-146a的相對表達顯著增加，而Notch2的相對表達明顯降低。外源性miR-146a模擬物可下調(diào)Notch2的表達，進而上調(diào)IL-6。這表明miR-146a可通過直接靶向作用Notch2增加IL-6水平，從而在甲狀腺相關(guān)眼病的發(fā)病過程中發(fā)揮作用。然而，也有研究表明，在某些情況下，miR-146a可能通過間接途徑調(diào)控IL-6的表達。miR-146a可以