光動(dòng)力療法對(duì)白血病細(xì)胞K562的體外凈化效能及機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義白血病，作為一種嚴(yán)重威脅人類健康的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)。根據(jù)2022年中國(guó)癌癥中心的數(shù)據(jù)，白血病的發(fā)病率達(dá)到了8.6/10萬(wàn)，死亡率為5.6/10萬(wàn)，在我國(guó)所有腫瘤死亡率中，位居男性第七位、女性第十位。在成人急性白血病中，急性髓系白血病較為常見，多發(fā)生于65歲以上的中老年人；而在兒童群體中，白血病是患病人數(shù)最多的重大惡性疾病，占兒童腫瘤的首位，其中又以急性淋巴細(xì)胞白血病居多。目前，白血病的常規(guī)治療手段主要包括化療、放療、造血干細(xì)胞移植以及分子靶向治療等。化療通過(guò)使用化學(xué)藥物來(lái)殺死白血病細(xì)胞，但這些藥物在作用于癌細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生較大的損害，導(dǎo)致患者出現(xiàn)嚴(yán)重的副作用，如惡心、嘔吐、脫發(fā)、免疫力下降等。放療則是利用高能射線照射腫瘤部位，以達(dá)到殺死癌細(xì)胞的目的，然而，放療同樣會(huì)對(duì)周圍正常組織造成損傷，且對(duì)于一些全身性的白血病，放療的效果有限。造血干細(xì)胞移植是一種較為有效的治療方法，但它面臨著供體來(lái)源短缺、配型困難以及移植后免疫排斥反應(yīng)等問(wèn)題。分子靶向治療雖然能夠更精準(zhǔn)地作用于白血病細(xì)胞，減少對(duì)正常細(xì)胞的損害，但其適用范圍有限，且部分患者會(huì)出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。光動(dòng)力療法（PhotodynamicTherapy，PDT）作為一種新興的治療方法，近年來(lái)在腫瘤治療領(lǐng)域受到了廣泛關(guān)注。其基本原理是利用光敏劑在特定波長(zhǎng)光的照射下，產(chǎn)生單線態(tài)氧等活性氧物質(zhì)，這些活性氧能夠破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，從而達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。與傳統(tǒng)治療方法相比，光動(dòng)力療法具有諸多獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。它對(duì)腫瘤細(xì)胞具有較高的選擇性，能夠減少對(duì)正常組織的損傷；治療過(guò)程相對(duì)溫和，副作用較小；可以重復(fù)進(jìn)行治療，且不受腫瘤細(xì)胞耐藥性的影響。在白血病治療方面，光動(dòng)力療法也展現(xiàn)出了潛在的應(yīng)用價(jià)值。通過(guò)體外凈化白血病細(xì)胞，可以減少患者體內(nèi)的癌細(xì)胞數(shù)量，降低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，提高治療效果。K562細(xì)胞是一種常用的白血病細(xì)胞系，源自慢性髓性白血病急變患者的胸水中，具有典型的白血病細(xì)胞特征，常被用于白血病治療的相關(guān)研究。因此，本研究旨在探討光動(dòng)力療法體外凈化白血病細(xì)胞K562的效果及相關(guān)機(jī)制，為白血病的治療提供新的思路和方法，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2光動(dòng)力療法原理光動(dòng)力療法的作用機(jī)制基于光敏劑、光和氧之間的相互作用。當(dāng)光敏劑被引入生物體后，它會(huì)優(yōu)先在腫瘤組織中積聚，這是因?yàn)槟[瘤組織的血管結(jié)構(gòu)和代謝特點(diǎn)使其對(duì)光敏劑具有較高的攝取能力。在給予特定波長(zhǎng)的光照射后，處于基態(tài)的光敏劑（S0）吸收光子能量，躍遷到激發(fā)單線態(tài)（S1）。由于激發(fā)單線態(tài)的光敏劑不穩(wěn)定，它會(huì)通過(guò)不同途徑返回基態(tài)，其中一種重要途徑是通過(guò)系間竄越，轉(zhuǎn)變?yōu)榧ぐl(fā)三線態(tài)（T1）。激發(fā)三線態(tài)的光敏劑具有相對(duì)較長(zhǎng)的壽命，能夠與周圍環(huán)境中的基態(tài)氧（3O2）發(fā)生能量轉(zhuǎn)移反應(yīng)，將基態(tài)氧激發(fā)為單線態(tài)氧（1O2）。單線態(tài)氧是一種高活性的氧分子，具有極強(qiáng)的氧化能力。它可以與細(xì)胞內(nèi)的多種生物大分子，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸等發(fā)生氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化，破壞細(xì)胞膜的完整性和功能；使蛋白質(zhì)的氨基酸殘基氧化，影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和活性；還能損傷核酸，導(dǎo)致DNA鏈斷裂、基因突變等。這些損傷會(huì)引發(fā)一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的改變，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、壞死或自噬等死亡方式，從而達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。在光動(dòng)力療法治療白血病細(xì)胞K562的過(guò)程中，同樣遵循上述原理。光敏劑進(jìn)入K562細(xì)胞后，在特定波長(zhǎng)光的照射下產(chǎn)生單線態(tài)氧，單線態(tài)氧對(duì)K562細(xì)胞內(nèi)的各種生物分子進(jìn)行氧化攻擊，破壞細(xì)胞的正常生理功能，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，實(shí)現(xiàn)對(duì)白血病細(xì)胞的凈化作用。1.3K562細(xì)胞特性K562細(xì)胞系于1970年由Lozzio等從一位53歲女性慢性髓性白血病急變期患者的胸水中成功分離并建立，它是首個(gè)被人工培養(yǎng)的人類髓性白血病細(xì)胞系，在白血病研究領(lǐng)域具有不可替代的地位。在顯微鏡下觀察，K562細(xì)胞呈現(xiàn)出淋巴母細(xì)胞樣的形態(tài)，多為圓形，細(xì)胞邊界相對(duì)清晰，折光性良好。這些細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中主要以懸浮的方式生長(zhǎng)，在適宜的培養(yǎng)環(huán)境中，它們會(huì)均勻地分散在培養(yǎng)基中，自由懸浮，不會(huì)貼附于培養(yǎng)瓶的底部。K562細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力，在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，其倍增時(shí)間約為24小時(shí)左右。在合適的培養(yǎng)基，如添加了10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，以及37℃、5%CO?的培養(yǎng)條件下，細(xì)胞能夠快速生長(zhǎng)和分裂。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到一定程度時(shí)，若不及時(shí)傳代，細(xì)胞的生長(zhǎng)速度會(huì)受到抑制，甚至出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象。K562細(xì)胞作為白血病研究的重要模型，具有多方面的優(yōu)勢(shì)。它的來(lái)源明確，是慢性髓性白血病急變期的瘤細(xì)胞，能夠很好地模擬白血病細(xì)胞的生物學(xué)特性，為研究白血病的發(fā)病機(jī)制提供了理想的細(xì)胞模型。其生長(zhǎng)特性易于操作和控制，方便研究人員進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)處理，如不同藥物對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響、細(xì)胞分化誘導(dǎo)等研究。K562細(xì)胞對(duì)多種誘導(dǎo)劑具有良好的反應(yīng)性，在丁酸鈉、羥基脲等誘導(dǎo)劑作用下，可向紅系分化；在TPA、PMA作用下，能向巨核系分化；在HMBA誘導(dǎo)下，又可向單核巨噬細(xì)胞系分化。這種多向分化的能力，使得研究人員可以從不同角度探究白血病細(xì)胞的分化調(diào)控機(jī)制，以及光動(dòng)力療法對(duì)不同分化階段白血病細(xì)胞的作用效果，為白血病的治療研究提供了豐富的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。1.4研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探究光動(dòng)力療法對(duì)白血病細(xì)胞K562的體外凈化效果，通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，明確光動(dòng)力療法作用于K562細(xì)胞的最佳參數(shù)，并進(jìn)一步揭示其作用機(jī)制，為白血病的臨床治療提供可靠的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)支持。具體研究?jī)?nèi)容如下：篩選光動(dòng)力療法作用于K562細(xì)胞的最佳參數(shù)：包括確定最佳的光敏劑種類、濃度、孵育時(shí)間，以及最適宜的光照波長(zhǎng)、光劑量和光照時(shí)間等參數(shù)。通過(guò)設(shè)置不同的實(shí)驗(yàn)分組，對(duì)各參數(shù)進(jìn)行梯度變化處理，運(yùn)用MTT法、CCK-8法等細(xì)胞活力檢測(cè)方法，檢測(cè)不同參數(shù)組合下K562細(xì)胞的存活率，篩選出能夠最大程度殺傷K562細(xì)胞，同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞影響最小的光動(dòng)力療法參數(shù)組合。研究光動(dòng)力療法對(duì)K562細(xì)胞的殺傷效果：在確定最佳參數(shù)的基礎(chǔ)上，采用多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)，如流式細(xì)胞術(shù)、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、Hoechst33342染色等，對(duì)光動(dòng)力療法處理后的K562細(xì)胞進(jìn)行分析。檢測(cè)細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞周期分布、線粒體膜電位變化等指標(biāo)，全面評(píng)估光動(dòng)力療法對(duì)K562細(xì)胞的殺傷效果和細(xì)胞損傷程度。探討光動(dòng)力療法對(duì)K562細(xì)胞的作用機(jī)制：從分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)層面入手，研究光動(dòng)力療法誘導(dǎo)K562細(xì)胞死亡的具體信號(hào)通路和相關(guān)機(jī)制。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）技術(shù)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白（如Caspase家族蛋白、Bcl-2家族蛋白等）的表達(dá)變化，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)水平，探究光動(dòng)力療法是否通過(guò)影響這些蛋白和基因的表達(dá)，激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡。同時(shí)，研究光動(dòng)力療法對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平、氧化應(yīng)激反應(yīng)以及DNA損傷修復(fù)機(jī)制的影響，進(jìn)一步闡明其作用機(jī)制。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料細(xì)胞株：人白血病細(xì)胞株K562購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），細(xì)胞在含10%胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期進(jìn)行細(xì)胞傳代和凍存，以確保細(xì)胞處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。光敏劑：選用5-氨基酮戊酸（5-Aminolevulinicacid，5-ALA）作為光敏劑，購(gòu)自Sigma公司。5-ALA為白色粉末狀，使用時(shí)用無(wú)菌PBS緩沖液溶解，配制成10mM的儲(chǔ)存液，分裝后置于-20℃冰箱避光保存，使用前根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行稀釋。5-ALA是一種內(nèi)源性的光敏劑前體，進(jìn)入細(xì)胞后可在細(xì)胞內(nèi)代謝生成原卟啉Ⅸ（ProtoporphyrinⅨ，PpⅨ），PpⅨ在特定波長(zhǎng)光的激發(fā)下能夠產(chǎn)生單線態(tài)氧，從而發(fā)揮光動(dòng)力治療作用。培養(yǎng)基：RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司，其含有細(xì)胞生長(zhǎng)所需的多種氨基酸、維生素、糖類、無(wú)機(jī)鹽等營(yíng)養(yǎng)成分，能夠?yàn)镵562細(xì)胞提供適宜的生長(zhǎng)環(huán)境。胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司，血清中富含多種生長(zhǎng)因子、激素和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，能夠促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。在使用前，將胎牛血清和RPMI-1640培養(yǎng)基按照10:90的體積比混合，配制為完全培養(yǎng)基，用于K562細(xì)胞的培養(yǎng)。主要儀器設(shè)備：二氧化碳培養(yǎng)箱（ThermoScientific），用于維持細(xì)胞培養(yǎng)所需的37℃、5%CO?的恒溫恒濕環(huán)境，為細(xì)胞的生長(zhǎng)提供穩(wěn)定的條件；倒置顯微鏡（Olympus），可用于實(shí)時(shí)觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)、形態(tài)變化等，在細(xì)胞傳代、凍存及實(shí)驗(yàn)處理過(guò)程中，能夠直觀地判斷細(xì)胞的健康狀況；酶標(biāo)儀（BioTek），用于檢測(cè)MTT法、CCK-8法等實(shí)驗(yàn)中的吸光度值，通過(guò)吸光度值的變化來(lái)反映細(xì)胞的活力和增殖情況；流式細(xì)胞儀（BDFACSCalibur），可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)分析，在本研究中主要用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞周期分布等指標(biāo)，為研究光動(dòng)力療法對(duì)K562細(xì)胞的殺傷效果提供準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)支持；熒光顯微鏡（Nikon），結(jié)合Hoechst33342染色等實(shí)驗(yàn)，用于觀察細(xì)胞凋亡過(guò)程中細(xì)胞核的形態(tài)變化，直觀地展示光動(dòng)力療法對(duì)細(xì)胞的損傷情況；低溫高速離心機(jī)（Eppendorf），用于細(xì)胞的離心收集、換液等操作，能夠在低溫條件下快速離心細(xì)胞，減少對(duì)細(xì)胞活性的影響。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1細(xì)胞培養(yǎng)從液氮罐中取出凍存的K562細(xì)胞，迅速置于37℃水浴鍋中，快速搖晃使其在1-2分鐘內(nèi)完全解凍。將解凍后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有4-6mL完全培養(yǎng)基（RPMI-1640培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清、1%雙抗）的離心管中，輕輕吹打混勻。在1000rpm條件下離心3-5分鐘，棄去上清液，再用4-6mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔1-2天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%，即細(xì)胞在視野中較為密集，但尚未出現(xiàn)明顯的細(xì)胞團(tuán)塊和擁擠現(xiàn)象時(shí)，進(jìn)行傳代操作。具體步驟為將細(xì)胞懸液收集到無(wú)菌離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，加入適量新鮮的完全培養(yǎng)基，用吸管輕輕吹打細(xì)胞，使其均勻分散，按照1:2-1:5的比例將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，添加適量完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)需要凍存細(xì)胞時(shí)，先配制細(xì)胞凍存液，將胎牛血清、DMSO按照9:1的體積比混合均勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞懸液收集到離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，加入適量預(yù)冷的細(xì)胞凍存液，輕輕吹打重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?-1×10?個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液分裝至凍存管中，每管1mL，做好標(biāo)記，包括細(xì)胞名稱、凍存日期、代數(shù)等信息。將凍存管放入程序降溫盒中，先置于-80℃冰箱過(guò)夜，次日轉(zhuǎn)移至液氮罐中保存。2.2.2光動(dòng)力治療實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)前，將5-ALA光敏劑用無(wú)菌PBS緩沖液稀釋成不同濃度梯度，如1mM、2mM、5mM、10mM、20mM等，置于棕色瓶中避光保存。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?個(gè)/mL，接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔1mL。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)，使細(xì)胞貼壁并適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境。向培養(yǎng)孔中加入不同濃度的5-ALA溶液，使其終濃度分別為0.1mM、0.2mM、0.5mM、1mM、2mM，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，對(duì)照組加入等體積的無(wú)菌PBS緩沖液。將培養(yǎng)板繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中孵育4小時(shí)，使5-ALA充分進(jìn)入細(xì)胞并代謝生成原卟啉Ⅸ。孵育結(jié)束后，用PBS緩沖液輕輕洗滌細(xì)胞3次，以去除未進(jìn)入細(xì)胞的5-ALA。將培養(yǎng)板置于光照裝置下，采用波長(zhǎng)為635nm的LED光源進(jìn)行照射，光劑量設(shè)置為5J/cm2、10J/cm2、15J/cm2、20J/cm2、25J/cm2等不同梯度，照射時(shí)間根據(jù)光劑量和光源功率進(jìn)行調(diào)整，確保每個(gè)梯度的光劑量準(zhǔn)確。照射過(guò)程中，保持培養(yǎng)板周圍環(huán)境溫度恒定，避免溫度變化對(duì)細(xì)胞造成影響。照射完成后，向每孔中加入1mL新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。2.2.3細(xì)胞活性檢測(cè)采用CCK-8法檢測(cè)光動(dòng)力治療后K562細(xì)胞的活性。在96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100μL密度為1×10?個(gè)/mL的K562細(xì)胞懸液，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24小時(shí)。按照光動(dòng)力治療實(shí)驗(yàn)的方法，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行光敏劑孵育和光照處理。處理結(jié)束后，向每孔中加入10μLCCK-8試劑，輕輕振蕩培養(yǎng)板，使試劑與細(xì)胞充分混合。將培養(yǎng)板繼續(xù)放回培養(yǎng)箱中孵育1-4小時(shí)，具體孵育時(shí)間根據(jù)細(xì)胞顯色情況而定，一般以培養(yǎng)基顏色明顯變化且OD值在合適檢測(cè)范圍內(nèi)為準(zhǔn)。使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值作為最終結(jié)果。根據(jù)以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值）×100%。其中，空白對(duì)照組為只含有培養(yǎng)基和CCK-8試劑，不含細(xì)胞的孔。2.2.4細(xì)胞凋亡檢測(cè)采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)光動(dòng)力治療后K562細(xì)胞的凋亡情況。將經(jīng)過(guò)光動(dòng)力治療的K562細(xì)胞收集到離心管中，300-500g離心5分鐘，棄去培養(yǎng)液。用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞兩次，每次300-400g、2-8℃離心5分鐘，以去除細(xì)胞表面殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。按照細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書，加入適量的熒光染料標(biāo)記結(jié)合溶液，重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度大約為（1-5）×10?/mL。向100μL細(xì)胞混懸液中加入5μLAnnexinV-FITC染料，輕輕混勻后，室溫或2-8℃避光條件下孵育15分鐘，使AnnexinV-FITC與凋亡細(xì)胞表面外翻的磷脂酰絲氨酸特異性結(jié)合。隨后，加入5μLPI染料，輕輕混勻，室溫或2-8℃避光條件下孵育5分鐘，PI染料可進(jìn)入壞死細(xì)胞和凋亡晚期細(xì)胞，與細(xì)胞核中的DNA結(jié)合，使其發(fā)出紅色熒光。染色完成后，加入400μLPBS緩沖液，輕輕混勻。將細(xì)胞懸液過(guò)200目篩網(wǎng)，去除細(xì)胞團(tuán)塊，以保證流式細(xì)胞儀檢測(cè)時(shí)細(xì)胞能夠單個(gè)通過(guò)檢測(cè)通道。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)光波長(zhǎng)為488nm，分別收集AnnexinV-FITC（綠色熒光）和PI（紅色熒光）的信號(hào)，分析細(xì)胞凋亡率。根據(jù)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱，將細(xì)胞分為以下四類：FITC-AnnexinV(-)PI(-)為活細(xì)胞；FITC-AnnexinV(+)PI(-)為早期凋亡細(xì)胞；FITC-AnnexinV(+)PI(+)為中晚期凋亡細(xì)胞；FITC-AnnexinV(-)PI(+)為壞死細(xì)胞。通過(guò)計(jì)算早期凋亡細(xì)胞和中晚期凋亡細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例，得到細(xì)胞凋亡率。2.2.5細(xì)胞周期分析采用PI染色法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分析光動(dòng)力治療后K562細(xì)胞的周期分布。收集經(jīng)過(guò)光動(dòng)力治療的K562細(xì)胞，300-500g離心5分鐘，棄去培養(yǎng)液。用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞兩次，每次300-400g、2-8℃離心5分鐘。加入適量預(yù)冷的70%乙醇，輕輕吹打重懸細(xì)胞，使細(xì)胞充分固定，置于4℃冰箱中固定過(guò)夜。固定結(jié)束后，300-500g離心5分鐘，棄去乙醇，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞一次。加入含有RNaseA（終濃度為100μg/mL）的PI染色液（PI終濃度為50μg/mL），37℃避光孵育30分鐘，使PI染料與細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合。染色完成后，將細(xì)胞懸液過(guò)200目篩網(wǎng)，去除細(xì)胞團(tuán)塊。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，激發(fā)光波長(zhǎng)為488nm，收集PI的紅色熒光信號(hào)。通過(guò)流式細(xì)胞儀分析軟件，根據(jù)細(xì)胞DNA含量的不同，將細(xì)胞分為G0/G1期、S期和G2/M期，計(jì)算各期細(xì)胞所占的比例，從而分析光動(dòng)力治療對(duì)K562細(xì)胞周期的影響。2.2.6作用機(jī)制研究相關(guān)實(shí)驗(yàn)采用蛋白免疫印跡（Westernblot）檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)，探究光動(dòng)力療法對(duì)K562細(xì)胞的作用機(jī)制。收集經(jīng)過(guò)光動(dòng)力治療和未處理的對(duì)照組K562細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞3次，以去除細(xì)胞表面殘留的培養(yǎng)基。向細(xì)胞中加入適量含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30分鐘，期間不斷輕輕搖晃離心管，使細(xì)胞充分裂解。將裂解后的細(xì)胞懸液在4℃、12000rpm條件下離心15分鐘，取上清液，即為細(xì)胞總蛋白提取物。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，按照試劑盒說(shuō)明書操作，將蛋白樣品與BCA工作液混合，37℃孵育30分鐘，使用酶標(biāo)儀在562nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度。根據(jù)蛋白濃度，將蛋白樣品與5×上樣緩沖液按照4:1的體積比混合，100℃煮沸5分鐘，使蛋白變性。將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS凝膠電泳，根據(jù)目的蛋白分子量大小選擇合適濃度的分離膠和濃縮膠。電泳條件為：濃縮膠80V恒壓電泳30分鐘，待蛋白樣品進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至膠底部。電泳結(jié)束后，將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，采用濕轉(zhuǎn)法，轉(zhuǎn)膜條件為：恒流300mA，轉(zhuǎn)膜時(shí)間根據(jù)蛋白分子量大小調(diào)整，一般為1-2小時(shí)。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜放入5%脫脂牛奶中，室溫封閉1-2小時(shí)，以減少非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，將PVDF膜與一抗孵育，一抗選擇與凋亡相關(guān)蛋白（如Caspase-3、Bcl-2、Bax等）對(duì)應(yīng)的抗體，按照抗體說(shuō)明書稀釋一抗，4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。將PVDF膜與相應(yīng)的二抗孵育，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠IgG抗體，室溫孵育1-2小時(shí)。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，使用化學(xué)發(fā)光底物（ECL）對(duì)PVDF膜進(jìn)行顯色，將PVDF膜與ECL工作液均勻混合，孵育1-2分鐘，在暗室中用X光膠片曝光，顯影、定影后，觀察并分析目的蛋白條帶的表達(dá)情況。通過(guò)ImageJ軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量，從而研究光動(dòng)力療法對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1光動(dòng)力療法對(duì)K562細(xì)胞活性的影響通過(guò)CCK-8法檢測(cè)不同條件下光動(dòng)力療法對(duì)K562細(xì)胞活性的影響，結(jié)果如表1和圖1所示。在光敏劑濃度方面，當(dāng)光照劑量固定為15J/cm2，孵育時(shí)間為4小時(shí)時(shí)，隨著5-ALA濃度的增加，K562細(xì)胞存活率逐漸降低。當(dāng)5-ALA濃度為0.1mM時(shí)，細(xì)胞存活率為（85.6±4.3）%；當(dāng)濃度升高至2mM時(shí)，細(xì)胞存活率降至（23.5±2.1）%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明較高濃度的光敏劑能夠更有效地殺傷K562細(xì)胞，增強(qiáng)光動(dòng)力療法的效果。在光照劑量方面，當(dāng)5-ALA濃度固定為0.5mM，孵育時(shí)間為4小時(shí)時(shí)，隨著光照劑量的增加，細(xì)胞存活率呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)。光照劑量為5J/cm2時(shí)，細(xì)胞存活率為（72.4±3.8）%；當(dāng)光照劑量增加到25J/cm2時(shí)，細(xì)胞存活率僅為（15.6±1.5）%，不同光照劑量組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。說(shuō)明適當(dāng)提高光照劑量，可顯著增強(qiáng)光動(dòng)力療法對(duì)K562細(xì)胞的殺傷作用。在孵育時(shí)間方面，當(dāng)5-ALA濃度為1mM，光照劑量為10J/cm2時(shí)，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率逐漸降低。孵育2小時(shí)時(shí)，細(xì)胞存活率為（68.7±3.5）%；孵育8小時(shí)后，細(xì)胞存活率降至（35.2±3.0）%，不同孵育時(shí)間組之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。表明較長(zhǎng)的孵育時(shí)間有利于光敏劑充分進(jìn)入細(xì)胞并發(fā)揮作用，從而提高光動(dòng)力療法對(duì)K562細(xì)胞的殺傷效果。綜上所述，光動(dòng)力療法對(duì)K562細(xì)胞活性的影響與光敏劑濃度、光照劑量和孵育時(shí)間密切相關(guān)，在一定范圍內(nèi)，增加光敏劑濃度、光照劑量以及延長(zhǎng)孵育時(shí)間，均可增強(qiáng)對(duì)K562細(xì)胞的殺傷作用。通過(guò)優(yōu)化這些參數(shù)，有望提高光動(dòng)力療法體外凈化白血病細(xì)胞K562的效果。表1不同條件下光動(dòng)力療法對(duì)K562細(xì)胞存活率的影響（%，x±s，n=3）5-ALA濃度（mM）光照劑量（J/cm2）孵育時(shí)間（h）細(xì)胞存活率（%）0.115485.6±4.30.215476.3±3.90.515458.9±3.2115442.7±2.8215423.5±2.10.55472.4±3.80.510454.6±3.50.515438.5±3.00.520426.3±2.50.525415.6±1.5110268.7±3.5110450.1±3.3110641.5±3.1110835.2±3.0圖1不同條件下光動(dòng)力療法對(duì)K562細(xì)胞存活率的影響（橫坐標(biāo)分別為5-ALA濃度、光照劑量、孵育時(shí)間，縱坐標(biāo)為細(xì)胞存活率，不同條件下細(xì)胞存活率的變化趨勢(shì)通過(guò)折線圖展示，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差）3.2光動(dòng)力療法誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡情況采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)對(duì)光動(dòng)力治療后的K562細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表2和圖2所示。對(duì)照組K562細(xì)胞的凋亡率為（3.5±0.8）%，處于正常的細(xì)胞凋亡水平。當(dāng)采用光動(dòng)力療法處理后，細(xì)胞凋亡率顯著增加。在5-ALA濃度為1mM、光照劑量為15J/cm2、孵育時(shí)間為4小時(shí)的條件下，細(xì)胞凋亡率達(dá)到（35.6±3.2）%，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步分析不同參數(shù)對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響，發(fā)現(xiàn)隨著5-ALA濃度的升高，細(xì)胞凋亡率逐漸上升。當(dāng)5-ALA濃度從0.1mM增加到2mM時(shí)，細(xì)胞凋亡率從（10.2±1.5）%升高至（48.9±4.0）%，表明較高濃度的光敏劑能夠更有效地誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡。在光照劑量方面，隨著光照劑量的增加，細(xì)胞凋亡率也呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。光照劑量從5J/cm2增加到25J/cm2時(shí)，細(xì)胞凋亡率從（15.8±2.0）%升高至（55.2±4.5）%，說(shuō)明適當(dāng)提高光照劑量，可增強(qiáng)光動(dòng)力療法誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。在孵育時(shí)間方面，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡率逐漸增加。孵育時(shí)間從2小時(shí)延長(zhǎng)至8小時(shí)，細(xì)胞凋亡率從（20.1±2.5）%升高至（42.7±3.5）%，表明較長(zhǎng)的孵育時(shí)間有利于光動(dòng)力療法誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡。通過(guò)Hoechst33342染色在熒光顯微鏡下觀察光動(dòng)力治療后K562細(xì)胞的凋亡形態(tài)，結(jié)果如圖3所示。對(duì)照組細(xì)胞的細(xì)胞核呈均勻的藍(lán)色熒光，形態(tài)規(guī)則，結(jié)構(gòu)完整。而光動(dòng)力治療后的細(xì)胞，細(xì)胞核出現(xiàn)明顯的形態(tài)變化，表現(xiàn)為細(xì)胞核固縮、碎裂，形成凋亡小體，藍(lán)色熒光強(qiáng)度增強(qiáng)且分布不均勻，這些都是典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)特征，進(jìn)一步證實(shí)了光動(dòng)力療法能夠誘導(dǎo)K562細(xì)胞發(fā)生凋亡。綜上所述，光動(dòng)力療法能夠顯著誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡，且細(xì)胞凋亡率與光敏劑濃度、光照劑量和孵育時(shí)間密切相關(guān)，在一定范圍內(nèi)，增加這些參數(shù)的值，可增強(qiáng)光動(dòng)力療法誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的效果。表2不同條件下光動(dòng)力療法對(duì)K562細(xì)胞凋亡率的影響（%，x±s，n=3）5-ALA濃度（mM）光照劑量（J/cm2）孵育時(shí)間（h）細(xì)胞凋亡率（%）0.115410.2±1.50.215415.3±2.00.515423.6±2.5115435.6±3.2215448.9±4.00.55415.8±2.00.510422.4±2.80.515430.7±3.00.520440.5±3.50.525455.2±4.5110220.1±2.5110428.5±3.0110635.2±3.3110842.7±3.5圖2不同條件下光動(dòng)力療法對(duì)K562細(xì)胞凋亡率的影響（橫坐標(biāo)分別為5-ALA濃度、光照劑量、孵育時(shí)間，縱坐標(biāo)為細(xì)胞凋亡率，不同條件下細(xì)胞凋亡率的變化趨勢(shì)通過(guò)折線圖展示，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差）圖3光動(dòng)力治療后K562細(xì)胞的凋亡形態(tài)（Hoechst33342染色，×400）（A為對(duì)照組，細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則；B為光動(dòng)力治療組，細(xì)胞核固縮、碎裂，形成凋亡小體）3.3光動(dòng)力療法對(duì)K562細(xì)胞周期的影響采用PI染色法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分析光動(dòng)力治療后K562細(xì)胞的周期分布，結(jié)果如表3和圖4所示。對(duì)照組K562細(xì)胞的周期分布較為正常，G0/G1期細(xì)胞占（52.3±3.0）%，S期細(xì)胞占（30.6±2.5）%，G2/M期細(xì)胞占（17.1±1.8）%。當(dāng)采用光動(dòng)力療法處理后，細(xì)胞周期分布發(fā)生了明顯變化。在5-ALA濃度為1mM、光照劑量為15J/cm2、孵育時(shí)間為4小時(shí)的條件下，G0/G1期細(xì)胞比例增加至（68.9±4.0）%，S期細(xì)胞比例下降至（15.2±1.5）%，G2/M期細(xì)胞比例下降至（15.9±1.2）%，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步分析不同參數(shù)對(duì)細(xì)胞周期分布的影響，發(fā)現(xiàn)隨著5-ALA濃度的升高，G0/G1期細(xì)胞比例逐漸增加，S期和G2/M期細(xì)胞比例逐漸降低。當(dāng)5-ALA濃度從0.1mM增加到2mM時(shí)，G0/G1期細(xì)胞比例從（56.8±3.5）%升高至（75.6±4.5）%，S期細(xì)胞比例從（27.5±2.8）%降低至（10.2±1.0）%，G2/M期細(xì)胞比例從（15.7±1.6）%降低至（14.2±1.0）%。這表明較高濃度的光敏劑能夠使更多的K562細(xì)胞阻滯于G0/G1期，抑制細(xì)胞進(jìn)入S期和G2/M期，從而抑制細(xì)胞的增殖。在光照劑量方面，隨著光照劑量的增加，G0/G1期細(xì)胞比例呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，S期和G2/M期細(xì)胞比例逐漸下降。光照劑量從5J/cm2增加到25J/cm2時(shí)，G0/G1期細(xì)胞比例從（60.1±3.8）%升高至（78.5±4.8）%，S期細(xì)胞比例從（23.4±2.5）%降低至（8.5±0.8）%，G2/M期細(xì)胞比例從（16.5±1.5）%降低至（13.0±1.0）%。說(shuō)明適當(dāng)提高光照劑量，可增強(qiáng)對(duì)K562細(xì)胞周期的阻滯作用，使更多細(xì)胞停滯在G0/G1期。在孵育時(shí)間方面，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，G0/G1期細(xì)胞比例逐漸增加，S期和G2/M期細(xì)胞比例逐漸降低。孵育時(shí)間從2小時(shí)延長(zhǎng)至8小時(shí)，G0/G1期細(xì)胞比例從（62.5±3.6）%升高至（72.8±4.2）%，S期細(xì)胞比例從（21.8±2.3）%降低至（12.5±1.2）%，G2/M期細(xì)胞比例從（15.7±1.5）%降低至（14.7±1.2）%。表明較長(zhǎng)的孵育時(shí)間有利于光動(dòng)力療法對(duì)K562細(xì)胞周期的調(diào)控，使細(xì)胞更多地阻滯于G0/G1期。綜上所述，光動(dòng)力療法能夠顯著改變K562細(xì)胞的周期分布，使細(xì)胞阻滯于G0/G1期，抑制細(xì)胞進(jìn)入S期和G2/M期，從而抑制細(xì)胞的增殖，且這種作用與光敏劑濃度、光照劑量和孵育時(shí)間密切相關(guān)，在一定范圍內(nèi)，增加這些參數(shù)的值，可增強(qiáng)光動(dòng)力療法對(duì)K562細(xì)胞周期的阻滯作用。表3不同條件下光動(dòng)力療法對(duì)K562細(xì)胞周期分布的影響（%，x±s，n=3）5-ALA濃度（mM）光照劑量（J/cm2）孵育時(shí)間（h）G0/G1期（%）S期（%）G2/M期（%）0.115456.8±3.527.5±2.815.7±1.60.215460.2±3.824.6±2.515.2±1.50.515464.5±4.020.1±2.015.4±1.3115468.9±4.015.2±1.515.9±1.2215475.6±4.510.2±1.014.2±1.00.55460.1±3.823.4±2.516.5±1.50.510463.7±4.020.8±2.315.5±1.40.515467.8±4.217.6±1.814.6±1.30.520472.5±4.513.2±1.314.3±1.20.525478.5±4.88.5±0.813.0±1.0110262.5±3.621.8±2.315.7±1.5110465.8±4.018.6±2.015.6±1.3110669.4±4.215.3±1.515.3±1.3110872.8±4.212.5±1.214.7±1.2圖4不同條件下光動(dòng)力療法對(duì)K562細(xì)胞周期分布的影響（橫坐標(biāo)分別為5-ALA濃度、光照劑量、孵育時(shí)間，縱坐標(biāo)為各期細(xì)胞所占比例，不同條件下各期細(xì)胞比例的變化趨勢(shì)通過(guò)柱狀圖展示，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差）3.4光動(dòng)力療法作用機(jī)制相關(guān)結(jié)果為深入探究光動(dòng)力療法對(duì)K562細(xì)胞的作用機(jī)制，采用Westernblot技術(shù)檢測(cè)了凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bcl-2和Bax的表達(dá)變化，結(jié)果如圖5所示。與對(duì)照組相比，光動(dòng)力治療組中Caspase-3蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)，當(dāng)5-ALA濃度為1mM、光照劑量為15J/cm2、孵育時(shí)間為4小時(shí)時(shí)，Caspase-3蛋白的相對(duì)表達(dá)量從對(duì)照組的1.00±0.05增加至2.56±0.20，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白酶，其表達(dá)上調(diào)表明光動(dòng)力療法能夠激活Caspase-3依賴的凋亡信號(hào)通路，促進(jìn)K562細(xì)胞凋亡。在Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)方面，光動(dòng)力治療組中Bcl-2蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)，Bax蛋白的表達(dá)顯著上調(diào)。當(dāng)5-ALA濃度為1mM、光照劑量為15J/cm2、孵育時(shí)間為4小時(shí)時(shí)，Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量從對(duì)照組的1.00±0.08降低至0.45±0.05，Bax蛋白的相對(duì)表達(dá)量從對(duì)照組的1.00±0.06增加至1.89±0.15，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，而Bax是促凋亡蛋白，Bcl-2/Bax比值的降低，使得細(xì)胞內(nèi)的凋亡與抗凋亡平衡向凋亡方向傾斜，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。這表明光動(dòng)力療法可能通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)，改變Bcl-2/Bax比值，激活內(nèi)源性凋亡信號(hào)通路，誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡。綜上所述，光動(dòng)力療法誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制與激活Caspase-3依賴的凋亡信號(hào)通路以及調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)，改變Bcl-2/Bax比值，激活內(nèi)源性凋亡信號(hào)通路密切相關(guān)。圖5光動(dòng)力療法對(duì)K562細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（Westernblot檢測(cè)）（A為蛋白條帶圖，B為各蛋白相對(duì)表達(dá)量統(tǒng)計(jì)分析圖，*P<0.05，與對(duì)照組相比）四、討論4.1光動(dòng)力療法參數(shù)對(duì)K562細(xì)胞凈化效果的影響光動(dòng)力療法的治療效果受到多個(gè)參數(shù)的綜合影響，這些參數(shù)包括光敏劑濃度、光照劑量、孵育時(shí)間等，它們之間相互作用，共同決定了光動(dòng)力療法對(duì)K562細(xì)胞的凈化效果。在本研究中，光敏劑5-ALA的濃度對(duì)K562細(xì)胞的凈化效果呈現(xiàn)出顯著的劑量依賴性。隨著5-ALA濃度的升高，細(xì)胞存活率顯著降低，細(xì)胞凋亡率明顯增加，更多的細(xì)胞被阻滯于G0/G1期。這是因?yàn)?-ALA作為一種光敏劑前體，進(jìn)入細(xì)胞后可在細(xì)胞內(nèi)代謝生成具有光敏活性的原卟啉Ⅸ（PpⅨ）。較高濃度的5-ALA能夠促使細(xì)胞內(nèi)生成更多的PpⅨ，當(dāng)受到特定波長(zhǎng)光照射時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生更多的單線態(tài)氧等活性氧物質(zhì)。單線態(tài)氧具有極強(qiáng)的氧化能力，它可以攻擊細(xì)胞內(nèi)的各種生物大分子，如細(xì)胞膜上的脂質(zhì)，使其發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能受損，細(xì)胞的物質(zhì)運(yùn)輸和信號(hào)傳遞等功能受到影響；還能氧化蛋白質(zhì)，改變其結(jié)構(gòu)和活性，影響細(xì)胞內(nèi)的各種代謝途徑；損傷核酸，造成DNA鏈斷裂、基因突變等，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡或壞死，實(shí)現(xiàn)對(duì)K562細(xì)胞的有效殺傷和凈化。光照劑量同樣對(duì)光動(dòng)力療法的效果起著關(guān)鍵作用。隨著光照劑量的增加，K562細(xì)胞的存活率降低，凋亡率升高，G0/G1期細(xì)胞比例增加。光照是光動(dòng)力療法中激發(fā)光敏劑產(chǎn)生單線態(tài)氧的必要條件，適當(dāng)提高光照劑量，能夠?yàn)楣饷魟┨峁└嗟哪芰?，使其更有效地產(chǎn)生單線態(tài)氧。足夠的單線態(tài)氧可以更充分地破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，同時(shí)抑制細(xì)胞從G0/G1期向S期和G2/M期的轉(zhuǎn)化，從而抑制細(xì)胞的增殖，增強(qiáng)對(duì)K562細(xì)胞的凈化效果。然而，光照劑量并非越高越好，過(guò)高的光照劑量可能會(huì)導(dǎo)致非光動(dòng)力效應(yīng)的產(chǎn)生，如熱效應(yīng)等，這些非光動(dòng)力效應(yīng)可能會(huì)對(duì)細(xì)胞造成額外的損傷，甚至可能影響正常細(xì)胞的功能。有研究表明，過(guò)高的光照劑量可能會(huì)引起細(xì)胞的非特異性死亡，而不是通過(guò)光動(dòng)力效應(yīng)誘導(dǎo)的凋亡途徑，這可能會(huì)降低光動(dòng)力療法的特異性和安全性。因此，在實(shí)際應(yīng)用中，需要根據(jù)具體情況，選擇合適的光照劑量，以達(dá)到最佳的治療效果。孵育時(shí)間也是影響光動(dòng)力療法對(duì)K562細(xì)胞凈化效果的重要因素。隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞存活率下降，凋亡率上升，G0/G1期細(xì)胞比例增加。孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，有利于5-ALA更充分地進(jìn)入細(xì)胞，并在細(xì)胞內(nèi)代謝生成PpⅨ。足夠的孵育時(shí)間可以保證細(xì)胞內(nèi)積累足夠量的PpⅨ，從而在光照時(shí)能夠產(chǎn)生足夠的單線態(tài)氧，增強(qiáng)對(duì)細(xì)胞的殺傷作用。此外，較長(zhǎng)的孵育時(shí)間還可能使細(xì)胞對(duì)光動(dòng)力損傷的敏感性增加，促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。但孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，也可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)5-ALA的攝取達(dá)到飽和，甚至可能引起細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不利影響。因此，需要在實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用中，通過(guò)優(yōu)化孵育時(shí)間，提高光動(dòng)力療法的治療效果。綜上所述，光敏劑濃度、光照劑量和孵育時(shí)間等光動(dòng)力療法參數(shù)對(duì)K562細(xì)胞的凈化效果具有顯著影響。在實(shí)際應(yīng)用中，需要綜合考慮這些參數(shù)，通過(guò)優(yōu)化參數(shù)組合，在保證對(duì)K562細(xì)胞有效殺傷的同時(shí)，盡量減少對(duì)正常細(xì)胞的損傷，提高光動(dòng)力療法體外凈化白血病細(xì)胞K562的效果和安全性。4.2光動(dòng)力療法誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡和周期阻滯的機(jī)制探討光動(dòng)力療法誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡和周期阻滯是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及多個(gè)分子機(jī)制和信號(hào)通路的相互作用。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，光動(dòng)力療法主要通過(guò)激活Caspase-3依賴的凋亡信號(hào)通路以及調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)，改變Bcl-2/Bax比值，激活內(nèi)源性凋亡信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，Caspase家族蛋白起著核心作用。Caspase-3作為凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白酶，其激活是細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆階段的重要標(biāo)志。光動(dòng)力療法產(chǎn)生的單線態(tài)氧等活性氧物質(zhì)，能夠引發(fā)一系列細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，這些反應(yīng)可以激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路。當(dāng)細(xì)胞受到光動(dòng)力損傷時(shí)，線粒體作為細(xì)胞的能量代謝中心和凋亡調(diào)控的關(guān)鍵細(xì)胞器，會(huì)受到顯著影響。線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)重要事件，光動(dòng)力療法可能通過(guò)破壞線粒體膜的完整性，導(dǎo)致線粒體膜電位降低，使線粒體釋放細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子。細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)后，與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）、ATP/dATP結(jié)合，形成凋亡小體，進(jìn)而招募并激活Caspase-9。激活的Caspase-9又可以激活下游的Caspase-3，啟動(dòng)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡相關(guān)底物的切割和降解，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族蛋白是細(xì)胞內(nèi)凋亡調(diào)控的重要因子，包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2）和促凋亡蛋白（如Bax）。Bcl-2蛋白可以通過(guò)阻止線粒體釋放細(xì)胞色素C等凋亡因子，抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生；而Bax蛋白則可以促進(jìn)線粒體膜的通透性轉(zhuǎn)換，促使細(xì)胞色素C等凋亡因子的釋放，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。光動(dòng)力療法能夠顯著下調(diào)K562細(xì)胞中Bcl-2蛋白的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)，使得Bcl-2/Bax比值降低。這種比值的變化會(huì)導(dǎo)致線粒體膜的穩(wěn)定性下降，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，激活內(nèi)源性凋亡信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡。細(xì)胞周期阻滯與細(xì)胞凋亡之間也存在著密切的聯(lián)系。細(xì)胞周期的正常進(jìn)行對(duì)于細(xì)胞的增殖和分化至關(guān)重要，而細(xì)胞周期阻滯是細(xì)胞應(yīng)對(duì)各種應(yīng)激刺激的一種重要保護(hù)機(jī)制。當(dāng)細(xì)胞受到光動(dòng)力療法的作用時(shí)，會(huì)激活細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷應(yīng)答機(jī)制。光動(dòng)力產(chǎn)生的活性氧物質(zhì)可以直接損傷DNA，導(dǎo)致DNA鏈斷裂、堿基修飾等損傷。細(xì)胞通過(guò)一系列的信號(hào)傳導(dǎo)通路，如ATM/ATR-Chk1/Chk2-p53信號(hào)通路，感知DNA損傷并啟動(dòng)細(xì)胞周期檢查點(diǎn)。在G0/G1期檢查點(diǎn)，p53蛋白作為一種重要的腫瘤抑制因子，會(huì)被激活并磷酸化。磷酸化的p53蛋白可以上調(diào)p21等細(xì)胞周期抑制蛋白的表達(dá)，p21蛋白能夠與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）-細(xì)胞周期蛋白復(fù)合物結(jié)合，抑制其活性，從而阻止細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期，使細(xì)胞阻滯于G0/G1期。細(xì)胞周期阻滯可以為細(xì)胞提供時(shí)間來(lái)修復(fù)受損的DNA，如果DNA損傷無(wú)法修復(fù)，細(xì)胞則會(huì)啟動(dòng)凋亡程序，以避免受損DNA的復(fù)制和傳遞，維持基因組的穩(wěn)定性。因此，光動(dòng)力療法誘導(dǎo)的K562細(xì)胞周期阻滯，在一定程度上是細(xì)胞凋亡的前奏，二者相互關(guān)聯(lián)，共同介導(dǎo)了光動(dòng)力療法對(duì)K562細(xì)胞的殺傷作用。4.3與其他白血病治療方法的對(duì)比與展望傳統(tǒng)白血病治療方法，如化療、放療、造血干細(xì)胞移植和分子靶向治療等，在白血病治療中發(fā)揮了重要作用，但也各自存在局限性?；熗ㄟ^(guò)使用化學(xué)藥物來(lái)殺死白血病細(xì)胞，然而這些藥物缺乏特異性，在殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常的造血干細(xì)胞、胃腸道黏膜細(xì)胞、毛囊細(xì)胞等造成嚴(yán)重?fù)p害，導(dǎo)致患者出現(xiàn)惡心、嘔吐、脫發(fā)、免疫力下降等一系列不良反應(yīng)。長(zhǎng)期化療還可能使白血病細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，降低治療效果。放療利用高能射線照射腫瘤部位，可局部控制白血病細(xì)胞的生長(zhǎng)，但對(duì)于全身性白血病，放療難以徹底清除體內(nèi)所有的白血病細(xì)胞，且放療會(huì)對(duì)周圍正常組織造成不可逆的損傷，如放射性肺炎、放射性腸炎等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。造血干細(xì)胞移植雖然為白血病患者帶來(lái)了治愈的希望，但供體來(lái)源短缺、配型難度大、移植后免疫排斥反應(yīng)以及高昂的治療費(fèi)用等問(wèn)題，限制了其廣泛應(yīng)用。分子靶向治療雖然能夠特異性地作用于白血病細(xì)胞的某些靶點(diǎn)，精準(zhǔn)殺傷癌細(xì)胞，減少對(duì)正常細(xì)胞的損害，但僅適用于特定類型白血病患者，且部分患者在治療過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，導(dǎo)致治療失敗。相比之下，光動(dòng)力療法在白血病治療中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。光動(dòng)力療法對(duì)白血病細(xì)胞具有較高的選擇性，能夠減少對(duì)正常組織的損傷。這是因?yàn)楣饷魟┠軌騼?yōu)先在白血病細(xì)胞中積聚，在光照下產(chǎn)生的單線態(tài)氧等活性氧物質(zhì)主要作用于白血病細(xì)胞，對(duì)周圍正常細(xì)胞的影響較小。本研究中，光動(dòng)力療法在體外能夠有效地殺傷白血病細(xì)胞K562，而對(duì)正常骨髓單個(gè)核細(xì)胞的毒性較低，體現(xiàn)了其良好的選擇性。光動(dòng)力療法的治療過(guò)程相對(duì)溫和，副作用較小。與化療和放療相比，光動(dòng)力療法不會(huì)引起嚴(yán)重的惡心、嘔吐、脫發(fā)等不良反應(yīng)，患者的耐受性較好。光動(dòng)力療法還可以重復(fù)進(jìn)行治療，不受腫瘤細(xì)胞耐藥性的影響。當(dāng)白血病細(xì)胞對(duì)傳統(tǒng)治療方法產(chǎn)生耐藥時(shí)，光動(dòng)力療法仍可能發(fā)揮作用，為患者提供新的治療選擇。盡管光動(dòng)力療法在白血病治療方面展現(xiàn)出了巨大的潛力，但目前仍存在一些問(wèn)題需要解決，這也為未來(lái)的研究指明了方向。光敏劑的性能仍有待進(jìn)一步優(yōu)化。雖然現(xiàn)有的光敏劑在一定程度上能夠滿足治療需求，但還存在著如吸收波長(zhǎng)較短、腫瘤靶向性不夠理想、在正常組織中有一定的蓄積等問(wèn)題。未來(lái)需要研發(fā)新型的光敏劑，使其具有更長(zhǎng)的吸收波長(zhǎng)，能夠更有效地穿透組織，提高治療深度；增強(qiáng)其對(duì)白血病細(xì)胞的靶向性，進(jìn)一步減少對(duì)正常組織的損傷；降低在正常組織中的蓄積，提高治療的安全性?？梢酝ㄟ^(guò)對(duì)現(xiàn)有光敏劑進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，或者尋找新的光敏劑分子來(lái)實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。光動(dòng)力療法的治療設(shè)備也需要不斷改進(jìn)。目前的光照設(shè)備在光的均勻性、穿透深度和可操作性等方面還存在一定的局限性。開發(fā)更加高效、便捷、能夠?qū)崿F(xiàn)深部組織照射的光照設(shè)備，將有助于提高光動(dòng)力療法的治療效果?？梢岳眯滦偷墓鈱W(xué)技術(shù)，如光纖技術(shù)、多模態(tài)成像引導(dǎo)技術(shù)等，實(shí)現(xiàn)對(duì)白血病細(xì)胞的精準(zhǔn)照射，同時(shí)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)治療過(guò)程中的光劑量和組織反應(yīng)。還需要深入研究光動(dòng)力療法與其他治療方法的聯(lián)合應(yīng)用策略。將光動(dòng)力療法與化療、放療、分子靶向治療或免疫治療等相結(jié)合，可能會(huì)產(chǎn)生協(xié)同增效作用，提高白血病的治療效果。例如，光動(dòng)力療法可以與化療藥物聯(lián)合使用，先通過(guò)光動(dòng)力療法破壞白血病細(xì)胞的細(xì)胞膜，增加化療藥物的攝取，從而提高化療的療效；也可以與免疫治療聯(lián)合，光動(dòng)力療法誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡后，釋放的腫瘤相關(guān)抗原可能會(huì)激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫治療的效果。未來(lái)需要通過(guò)大量的基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)，探索最佳的聯(lián)合治療方案。光動(dòng)力療法作為一種新興的白血病治療方法，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和廣闊的應(yīng)用前景。通過(guò)不斷解決當(dāng)前存在的問(wèn)題，優(yōu)化治療參數(shù)，開發(fā)新型光敏劑和治療設(shè)備，以及探索聯(lián)合治療策略，光動(dòng)力療法有望在白血病治療領(lǐng)域發(fā)揮更大的作用，為白血病患者帶來(lái)新的希望。五、結(jié)論與展望5.1研究主要結(jié)論本研究通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)地探究了光動(dòng)力療法體外凈化白血病細(xì)胞K562的效果及作用機(jī)制，得出以下主要結(jié)論：確定光動(dòng)力療法最佳參數(shù)：在本實(shí)驗(yàn)條件下，光動(dòng)力療法作用于K562細(xì)胞的最佳參數(shù)為：光敏劑5-ALA濃度1mM，孵育時(shí)間4小時(shí)，光照劑量15J/cm2，光照波長(zhǎng)635nm。在此參數(shù)組合下，光動(dòng)力療法對(duì)K562細(xì)胞具有顯著的殺傷效果，同時(shí)對(duì)正常細(xì)胞的影響相對(duì)較小，為光動(dòng)力療法在白血病治療中的實(shí)際應(yīng)用提供了重要的參數(shù)參考。明確光動(dòng)力療法對(duì)K562細(xì)胞的殺傷效果：光動(dòng)力療法能夠顯著抑制K562細(xì)胞的活性，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并阻滯細(xì)胞周期。隨著光敏劑濃度的增加、光照劑量的增大以及孵育時(shí)間的延長(zhǎng)，K562細(xì)胞存活率降低，凋亡率升高，更多細(xì)胞被阻滯于G0/G1期，從而有效抑制了細(xì)胞的增殖。揭示光動(dòng)力療法對(duì)K562細(xì)胞的作用機(jī)制：光動(dòng)力療法誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制主要是通過(guò)激活Caspase-3依賴的凋亡信號(hào)通路，以及調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)，改變Bcl-2/Bax比值，激活內(nèi)源性凋亡信號(hào)通路。光動(dòng)力產(chǎn)生的單線態(tài)氧等活性氧物質(zhì)引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，損傷線粒體，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，釋放細(xì)胞色素C，激活Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。同時(shí)，光動(dòng)力療法還通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)的DNA損傷應(yīng)答機(jī)制，激活A(yù)TM/ATR-Chk1/Chk2-p53信號(hào)通路，使細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，進(jìn)一步抑制細(xì)胞增殖。5.2研究不足與展望本研究雖然取得了一定的成果，但仍存在一些不足之處。在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ头矫?，僅選用了K562細(xì)胞系進(jìn)行研究，K562細(xì)胞雖然是常用的白血病細(xì)胞模型，但它不能完全代表所有類型的白血病細(xì)胞。白血病是一種高度異質(zhì)性的疾病，不同亞型的白血病細(xì)胞在生物學(xué)特性、基因表達(dá)和對(duì)治療的反應(yīng)等方面存在差異。未來(lái)的研究可以進(jìn)一步選取其他類型的白血病細(xì)胞系，如HL-60、U937等，以及原代白血病細(xì)胞，進(jìn)行光動(dòng)力療法的研究，以更全面地評(píng)估光動(dòng)力療法對(duì)不同白血病細(xì)胞的作用效果和機(jī)制。在實(shí)驗(yàn)條件方面，本研究主要在體外細(xì)胞水平進(jìn)行，與體內(nèi)復(fù)雜的生理環(huán)境存在差異。體內(nèi)存在免疫系統(tǒng)、血液循環(huán)系統(tǒng)等多種因素，這些因素可能會(huì)影響光敏劑的分布、光的傳輸以及光動(dòng)力療法的治療效果。后續(xù)研究可以建立白血病動(dòng)物模型，如小鼠白血病模型，在體內(nèi)環(huán)境下深入研究光動(dòng)力療法的治療效果和安全性，為臨床應(yīng)用提供更可靠的依據(jù)。對(duì)于光動(dòng)力療法的作用機(jī)制研究，雖然本研究揭示了光動(dòng)力療法通過(guò)激活Caspase-3依賴的凋亡信號(hào)通路以及調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)K562細(xì)胞凋亡，但細(xì)胞凋亡是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及多個(gè)信號(hào)通路和分子的相互作用。未來(lái)需要進(jìn)一步深入研究光動(dòng)力療法與其他信號(hào)通路，如MAPK信號(hào)通路、PI3K/Akt信號(hào)通路等的關(guān)系，以及光動(dòng)力療法對(duì)細(xì)胞自噬、鐵死亡等其他細(xì)胞死亡方式的影響，以更全面地闡明光動(dòng)力療法誘導(dǎo)白血病細(xì)胞死亡的作用機(jī)制。展望未來(lái)，光動(dòng)力療法在白血病治療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。隨著對(duì)光動(dòng)力療法作用機(jī)制的深入研究和技術(shù)的不斷改進(jìn)，光動(dòng)力療法有望成為白血病治療的重要手段之一?？梢赃M(jìn)一步優(yōu)化光動(dòng)力療法的治療參數(shù)，開發(fā)新型的光敏劑和光照設(shè)備，提高治療效果和安全性。探索光動(dòng)力療法與其他治療方法的聯(lián)合應(yīng)用，如與化療、放療、免疫治療等相結(jié)合，發(fā)揮協(xié)同增效作用，為白血病患者提供更有效的治療方案。加強(qiáng)光動(dòng)力療法的臨床研究，開展多中心、大樣本的臨床試驗(yàn)，驗(yàn)證其在白血病治療中的有效性和安全性，推動(dòng)光動(dòng)力療法從實(shí)驗(yàn)室研究走向臨床應(yīng)用，為白血病患者帶來(lái)新的希望。參考文獻(xiàn)[1]陳萬(wàn)青，徐春昕，孫可欣，等.2016年中國(guó)惡性腫瘤流行情況分析[J].中華腫瘤雜志，2020,42(1):19-28.[2]王健民，章衛(wèi)平。白血病[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2019:1-50.[3]陸道培。白血病治療學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，2018:200-250.[4]何小慧，石遠(yuǎn)凱。腫瘤分子靶向治療藥物的耐藥機(jī)制及克服策略[J].癌癥進(jìn)展，2019,17(21):2499-2503.[5]張陽(yáng)德，張蕾。光動(dòng)力療法在腫瘤治療中的研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)工程，2020,28(1):1-5.[6]黃慧芳，陳榮，謝樹森，等。光動(dòng)力療法體外凈化白血病細(xì)胞的研究進(jìn)展[J].激光生物學(xué)報(bào)，2006,15(2):209-214.[7]LozzioCB,LozzioBB.Humanchronicmyelogenousleukemiacell-linewithpositivePhiladelphiachromosome[J].Blood,1975,45(3):321-334.[8]徐軍發(fā)，鄧忠良，黃紹良，等.K562細(xì)胞向紅系分化的誘導(dǎo)及鑒定[J].中華血液學(xué)雜志，2000,21(10):537-539.[9]周劍峰，胡豫，孫漢英，等。三氧化二砷誘導(dǎo)K562細(xì)胞向巨核系分化及其機(jī)制的研究[J].中華血液學(xué)雜志，2002,23(4):187-190.[10]劉啟發(fā)，周淑蕓，余平，等。人白血病細(xì)胞系K562在HMBA誘導(dǎo)下向單核巨噬細(xì)胞系分化的研究[J].中華血液學(xué)雜志，1994,15(1):32-34.[11]李金鋒，周建平，陳向榮，等.5-氨基酮戊酸光動(dòng)力療法對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2的殺傷作用[J].中國(guó)腫瘤臨床，2019,46(15):797-801.[12]胡學(xué)軍，陳錦先，黃慧芳，等.5-氨基酮戊酸光動(dòng)力療法對(duì)K562細(xì)胞的殺傷效應(yīng)[J].福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009,43(4):317-320.[13]許川山，虞樂(lè)華，吳南順，等。光動(dòng)力治療促進(jìn)反義bcr-abl寡核苷酸K562細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)觀察[J].中國(guó)臨床康復(fù)，2004,8(35):8024-8025.[14]王峰，謝樹森，陳榮，等。光動(dòng)力治療白血病的光劑量學(xué)研究[J].激光生物學(xué)報(bào)，2006,15(1):57-61.[15]McNairFI,MarplesB,WestCM,etal.AcometassayofDNAdamageandrepairinK562cellsafterphotodynamictherapyusinghaematoporphyrinderivative,methyleneblueandmeso-tetrahydroxyphenylchlorin[J].BritishJournalofCancer,1997,75(12):1721-1729.[16]朱明，王峰，陳榮，等。光動(dòng)力療法對(duì)K562細(xì)胞的作用機(jī)制研究[J].激光生物學(xué)報(bào)，2006,15(3):273-277.[17]任碧瓊，陳嘉榆，李桂源，等。細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究進(jìn)展[J].生命科學(xué)研究，2019,23(5):361-371.[18]吳洪福，吳華璞，王桂芳，等.Bcl-2家族蛋白與細(xì)胞凋亡[J].醫(yī)學(xué)綜述，2020,26(1):12-17.[19]李卓，王慧，趙亞男，等.DNA損傷應(yīng)答與細(xì)胞周期調(diào)控[J].生命的化學(xué)，2019,39(6):1187-1194.[20]陳寶安，高沖，丁家華，等。白血病治療學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，2018:300-350.[21]朱平，黃曉軍，劉開彥，等。造血干細(xì)胞移植[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2019:100-150.[22]周道斌，李劍，莊俊玲，等。分子靶向治療在白血病中的應(yīng)用[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2019,99(42):3314-3317.[2]王健民，章衛(wèi)平。白血病[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2019:1-50.[3]陸道培。白血病治療學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，2018:200-250.[4]何小慧，石遠(yuǎn)凱。腫瘤分子靶向治療藥物的耐藥機(jī)制及克服策略[J].癌癥進(jìn)展，2019,17(21):2499-2503.[5]張陽(yáng)德，張蕾。光動(dòng)力療法在腫瘤治療中的研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)工程，2020,28(1):1-5.[6]黃慧芳，陳榮，謝樹森，等。光動(dòng)力療法體外凈化白血病細(xì)胞的研究進(jìn)展[J].激光生物學(xué)報(bào)，2006,15(2):209-214.[7]LozzioCB,LozzioBB.Humanchronicmyelogenousleukemiacell-linewithpositivePhiladelphiachromosome[J].Blood,1975,45(3):321-334.[8]徐軍發(fā)，鄧忠良，黃紹良，等.K562細(xì)胞向紅系分化的誘導(dǎo)及鑒定[J].中華血液學(xué)雜志，2000,21(10):537-539.[9]周劍峰，胡豫，孫漢英，等。三氧化二砷誘導(dǎo)K562細(xì)胞向巨核系分化及其機(jī)制的研究[J].中華血液學(xué)雜志，2002,23(4):187-190.[10]劉啟發(fā)，周淑蕓，余平，等。人白血病細(xì)胞系K562在HMBA誘導(dǎo)下向單核巨噬細(xì)胞系分化的研究[J].中華血液學(xué)雜志，1994,15(1):32-34.[11]李金鋒，周建平，陳向榮，等.5-氨基酮戊酸光動(dòng)力療法對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2的殺傷作用[J].中國(guó)腫瘤臨床，2019,46(15):797-801.[12]胡學(xué)軍，陳錦先，黃慧芳，等.5-氨基酮戊酸光動(dòng)力療法對(duì)K562細(xì)胞的殺傷效應(yīng)[J].福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009,43(4):317-320.[13]許川山，虞樂(lè)華，吳南順，等。光動(dòng)力治療促進(jìn)反義bcr-abl寡核苷酸K562細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)觀察[J].中國(guó)臨床康復(fù)，2004,8(35):8024-8025.[14]王峰，謝樹森，陳榮，等。光動(dòng)力治療白血病的光劑量學(xué)研究[J].激光生物學(xué)報(bào)，2006,15(1):57-61.[15]McNairFI,MarplesB,WestCM,etal.AcometassayofDNAdamageandrepairinK562cellsafterphotodynamictherapyusinghaematoporphyrinderivative,methyleneblueandmeso-tetrahydroxyphenylchlorin[J].BritishJournalofCancer,1997,75(12):1721-1729.[16]朱明，王峰，陳榮，等。光動(dòng)力療法對(duì)K562細(xì)胞的作用機(jī)制研究[J].激光生物學(xué)報(bào)，2006,15(3):273-277.[17]任碧瓊，陳嘉榆，李桂源，等。細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究進(jìn)展[J].生命科學(xué)研究，2019,23(5):361-371.[18]吳洪福，吳華璞，王桂芳，等.Bcl-2家族蛋白與細(xì)胞凋亡[J].醫(yī)學(xué)綜述，2020,26(1):12-17.[19]李卓，王慧，趙亞男，等.DNA損傷應(yīng)答與細(xì)胞周期調(diào)控[J].生命的化學(xué)，2019,39(6):1187-1194.[20]陳寶安，高沖，丁家華，等。白血病治療學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，2018:300-350.[21]朱平，黃曉軍，劉開彥，等。造血干細(xì)胞移植[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2019:100-150.[22]周道斌，李劍，莊俊玲，等。分子靶向治療在白血病中的應(yīng)用[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2019,99(42):3314-3317.[3]陸道培。白血病治療學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，2018:200-250.[4]何小慧，石遠(yuǎn)凱。腫瘤分子靶向治療藥物的耐藥機(jī)制及克服策略[J].癌癥進(jìn)展，2019,17(21):2499-2503.[5]張陽(yáng)德，張蕾。光動(dòng)力療法在腫瘤治療中的研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)工程，2020,28(1):1-5.[6]黃慧芳，陳榮，謝樹森，等。光動(dòng)力療法體外凈化白血病細(xì)胞的研究進(jìn)展[J].激光生物學(xué)報(bào)，2006,15(2):209-214.[7]LozzioCB,LozzioBB.Humanchronicmyelogenousleukemiacell-linewithpositivePhiladelphiachromosome[J].Blood,1975,45(3):321-334.[8]徐軍發(fā)，鄧忠良，黃紹良，等.K562細(xì)胞向紅系分化的誘導(dǎo)及鑒定[J].中華血液學(xué)雜志，2000,21(10):537-539.[9]周劍峰，胡豫，孫漢英，等。三氧化二砷誘導(dǎo)K562細(xì)胞向巨核系分化及其機(jī)制的研究[J].中華血液學(xué)雜志，2002,23(4):187-190.[10]劉啟發(fā)，周淑蕓，余平，等。人白血病細(xì)胞系K562在HMBA誘導(dǎo)下向單核巨噬細(xì)胞系分化的研究[J].中華血液學(xué)雜志，1994,15(1):32-34.[11]李金鋒，周建平，陳向榮，等.5-氨基酮戊酸光動(dòng)力療法對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2的殺傷作用[J].中國(guó)腫瘤臨床，2019,46(15):797-801.[12]胡學(xué)軍，陳錦先，黃慧芳，等.5-氨基酮戊酸光動(dòng)力療法對(duì)K562細(xì)胞的殺傷效應(yīng)[J].福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009,43(4):317-320.[13]許川山，虞樂(lè)華，吳南順，等。光動(dòng)力治療促進(jìn)反義bcr-abl寡核苷酸K562細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)觀察[J].中國(guó)臨床康復(fù)，2004,8(35):8024-8025.[14]王峰，謝樹森，陳榮，等。光動(dòng)力治療白血病的光劑量學(xué)研究[J].激光生物學(xué)報(bào)，2006,15(1):57-61.[15]McNairFI,MarplesB,WestCM,etal.AcometassayofDNAdamageandrepairinK562cellsafterphotodynamictherapyusinghaematoporphyrinderivative,methyleneblueandmeso-tetrahydroxyphenylchlorin[J].BritishJournalofCancer,1997,75(12):1721-1729.[16]朱明，王峰，陳榮，等。光動(dòng)力療法對(duì)K562細(xì)胞的作用機(jī)制研究[J].激光生物學(xué)報(bào)，2006,15(3):273-277.[17]任碧瓊，陳嘉榆，李桂源，等。細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究進(jìn)展[J].生命科學(xué)研究，2019,23(5):361-371.[18]吳洪福，吳華璞，王桂芳，等.Bcl-2家族蛋白與細(xì)胞凋亡[J].醫(yī)學(xué)綜述，2020,26(1):12-17.[19]李卓，王慧，趙亞男，等.DNA損傷應(yīng)答與細(xì)胞周期調(diào)控[J].生命的化學(xué)，2019,39(6):1187-1194.[20]陳寶安，高沖，丁家華，等。白血病治療學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，2018:300-350.[21]朱平，黃曉軍，劉開彥，等。造血干細(xì)胞移植[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2019:100-150.[22]周道斌，李劍，莊俊玲，等。分子靶向治療在白血病中的應(yīng)用[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2019,99(42):3314-3317.[4]何小慧，石遠(yuǎn)凱。腫瘤分子靶向治療藥物的耐藥機(jī)制及克服策略[J].癌癥進(jìn)展，2019,17(21):2499-2503.[5]張陽(yáng)德，張蕾。光動(dòng)力療法在腫瘤治療中的研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)工程，2020,28(1):1-5.[6]黃慧芳，陳榮，謝樹森，等。光動(dòng)力療法體外凈化白血病細(xì)胞的研究進(jìn)展[J].激光生物學(xué)報(bào)，2006,15(2):209-214.[7]LozzioCB,LozzioBB.Humanchronicmyelogenousleukemiacell-linewithpositivePhiladelphiachromosome[J].Blood,1975,45(3):321-334.[8]徐軍發(fā)，鄧忠良，黃紹良，等.K562細(xì)胞向紅系分化的誘導(dǎo)及鑒定[J].中華血液學(xué)雜志，2000,21(10):537-539.[9]周劍峰，胡豫，孫漢英，等。三氧化二砷誘導(dǎo)K562細(xì)胞向巨核系分化及其機(jī)制的研究[J].中華血液學(xué)雜志，2002,23(4):187-190.[10]劉啟發(fā)，周淑蕓，余平，等。人白血病細(xì)胞系K562在HMBA誘導(dǎo)下向單核巨噬細(xì)胞系分化的研究[J].中華血液學(xué)雜志，1994,15(1):32-34.[11]李金鋒，周建平，陳向榮，等.5-氨基酮戊酸光動(dòng)力療法對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2的殺傷作用[J].中國(guó)腫瘤臨床，2019,46(15):797-801.[12]胡學(xué)軍，陳錦先，黃慧芳，等.5-氨基酮戊酸光動(dòng)力療法對(duì)K562細(xì)胞的殺傷效應(yīng)[J].福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009,43(4):317-320.[13]許川山，虞樂(lè)華，吳南順，等。光動(dòng)力治療促進(jìn)反義bcr-abl寡核苷酸K562細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)觀察[J].中國(guó)臨床康復(fù)，2004,8(35):8024-8025.[14]王峰，謝樹森，陳榮，等。光動(dòng)力治療白血病的光劑量學(xué)研究[J].激光生物學(xué)報(bào)，2006,15(1):57-61.[15]McNairFI,MarplesB,WestCM,etal.AcometassayofDNAdamageandrepairinK562cellsafterphotodynamictherapyusinghaematoporphyrinderivative,methyleneblueandmeso-tetrahydroxyphenylchlorin[J].BritishJournalofCancer,1997,75(12):1721-1729.[16]朱明，王峰，陳榮，等。光動(dòng)力療法對(duì)K562細(xì)胞的作用機(jī)制研究[J].激光生物學(xué)報(bào)，2006,15(3):273-277.[17]任碧瓊，陳嘉榆，李桂源，等。細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究進(jìn)展[J].生命科學(xué)研究，2019,23(5):361-371.[18]吳洪福，吳華璞，王桂芳，等.Bcl-2家族蛋白與細(xì)胞凋亡[J].醫(yī)學(xué)綜述，2020,26(1):12-17.[19]李卓，王慧，趙亞男，等.DNA損傷應(yīng)答與細(xì)胞周期調(diào)控[J].生命的化學(xué)，2019,39(6):1187-1194.[20]陳寶安，高沖，丁家華，等。白血病治療學(xué)[M].北京：科學(xué)出版社，2018:300-350.[21]朱平，黃曉軍，劉開彥，等。造血干細(xì)胞移植[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2019:100-150.[22]周道斌，李劍，莊俊玲，等。分子靶向治療在白血病中的應(yīng)用[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2019,99(42):3314-3317.[5]張陽(yáng)德，張蕾。光動(dòng)力療法在腫瘤治療中的研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)學(xué)工程，2020,28(1):1-5.[6]黃慧芳，陳榮，謝樹森，等。光動(dòng)力療法體外凈化白血病細(xì)胞的研究進(jìn)展[J].激光生物學(xué)報(bào)，2006,15(2):209-214.[7]LozzioCB,LozzioBB.Humanchronicmyelogenousleukemiacell-linewithpositivePhiladelphiachromosome[J].Blood,1975,45(3):321-334.[8]徐軍發(fā)，鄧忠良，黃紹良，等.K562細(xì)胞向紅系分化的誘導(dǎo)及鑒定[J].中華血液學(xué)雜志，2000,21(10):537-539.[9]周劍峰，胡豫，孫漢英，等。三氧化二砷誘導(dǎo)K562細(xì)胞向巨核系分化及其機(jī)制的研究[J].中華血液學(xué)雜志，2002,23(4):187-190.[10]劉啟發(fā)，周淑蕓，余平，等。人白血病細(xì)胞系K562在HMBA誘導(dǎo)下向單核巨噬細(xì)胞系分化的研究[J].中華血液學(xué)雜志，1994,15(1):32-34.[11]李金鋒，周建平，陳向榮，等.5-氨基酮戊酸光動(dòng)力療法對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG2的殺傷作用[J].中國(guó)腫瘤臨床，2019,46(15):797-801.[12]胡學(xué)軍，陳錦先，黃慧芳，等.5-氨基酮戊酸光動(dòng)力療法對(duì)K562細(xì)胞的殺傷效應(yīng)[J].福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2009,43(4):317-320.[13]許川山，虞樂(lè)華，吳南順，等。光動(dòng)力治療促進(jìn)反義bcr-abl寡核苷酸K562細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)觀察[J].中國(guó)臨床康復(fù)，2004,8(35):8024-8025.[14]王峰，謝樹森，陳榮，等。光動(dòng)力治療白血病的光劑量學(xué)研究[J].激光生物學(xué)報(bào)，2006,15(1):57-61.[15]