健脾益腎沖劑抗胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移：基于線粒體失巢凋亡途徑的分子機(jī)制解析一、引言1.1研究背景與意義胃癌是全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的健康。在我國(guó)，胃癌的發(fā)病率和死亡率一直居高不下，據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)每年新發(fā)病例約41.0萬例，死亡病例約29.4萬例，給患者家庭和社會(huì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。由于胃癌起病隱匿，早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)已處于進(jìn)展期，錯(cuò)過了手術(shù)根治的最佳時(shí)機(jī)。盡管目前西醫(yī)治療胃癌主要采用以根治性手術(shù)切除為基本方法，放療、化療及內(nèi)分泌治療為主要輔助治療手段，使患者的預(yù)后得到一定改善，但術(shù)后患者仍有較高的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，30%-80%癌癥患者術(shù)后可發(fā)生局部或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，這是導(dǎo)致治療失敗和患者死亡的主要原因之一。復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移后的胃癌患者，病情往往更為復(fù)雜和嚴(yán)重，治療難度顯著增加?；颊卟粌H要承受身體上的痛苦，如疼痛、惡心、嘔吐、乏力等癥狀，還會(huì)面臨心理上的巨大壓力，對(duì)生活質(zhì)量造成極大的影響。而且，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移后的治療費(fèi)用高昂，進(jìn)一步加重了家庭的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，深入研究胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的機(jī)制，尋找有效的防治方法，具有重要的臨床意義和社會(huì)價(jià)值。在腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中，失巢凋亡起著關(guān)鍵作用。正常細(xì)胞脫離細(xì)胞外基質(zhì)后會(huì)發(fā)生失巢凋亡，以維持機(jī)體組織的穩(wěn)定狀態(tài)。然而，腫瘤細(xì)胞卻能抵抗失巢凋亡，從而得以存活、擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移。線粒體介導(dǎo)的失巢凋亡途徑是細(xì)胞凋亡的重要內(nèi)在途徑，線粒體在其中發(fā)揮著核心調(diào)控作用。Bcl-2家族蛋白等是該途徑中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它們之間的平衡狀態(tài)決定了細(xì)胞對(duì)凋亡的敏感性。研究該途徑對(duì)于揭示腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移機(jī)制至關(guān)重要。中醫(yī)藥在腫瘤防治領(lǐng)域具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和豐富的經(jīng)驗(yàn)。近年來，中醫(yī)藥在胃癌治療方面取得了一定進(jìn)展，尤其在防治胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移方面，展現(xiàn)出了潛在的應(yīng)用價(jià)值。健脾益腎沖劑作為一種中藥復(fù)方，依據(jù)祖國(guó)醫(yī)學(xué)脾腎為先后天之本的理論組方而成。臨床研究表明，健脾益腎沖劑合并化療治療晚期胃癌，能減輕化療病人的全身和消化道的毒副反應(yīng)，對(duì)造血細(xì)胞有促進(jìn)增殖的作用，還能提高機(jī)體免疫力，遠(yuǎn)期療效觀察，三年五年生存率明顯好于單純化療組。前期研究還發(fā)現(xiàn)健脾益腎沖劑對(duì)小鼠前胃癌FC瘤重有一定抑制率，對(duì)Lewis腫瘤血行轉(zhuǎn)移和宮頸癌U14淋巴轉(zhuǎn)移有明顯抑制作用。然而，目前對(duì)于健脾益腎沖劑防治胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制尚未完全明確。從線粒體介導(dǎo)的失巢凋亡途徑探討健脾益腎沖劑的作用機(jī)制，有助于揭示其防治胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的科學(xué)內(nèi)涵，為臨床應(yīng)用提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為胃癌的治療開辟新的思路和方法，具有重要的理論和實(shí)踐意義。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究現(xiàn)狀胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，涉及多個(gè)基因、信號(hào)通路以及腫瘤微環(huán)境等多方面因素的相互作用。國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者圍繞這一領(lǐng)域展開了廣泛深入的研究，旨在揭示其潛在機(jī)制，為臨床治療提供新的靶點(diǎn)和策略。在基因?qū)用妫芯堪l(fā)現(xiàn)一些基因的異常表達(dá)與胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。如CD82基因，作為一種跨膜四次重復(fù)的基因，屬于Tetraspanin家族，參與細(xì)胞黏附、遷移、增殖和基因轉(zhuǎn)錄等生物學(xué)活動(dòng)。在胃癌組織中，CD82表達(dá)水平較低，與轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良有關(guān)，其低表達(dá)可使胃癌細(xì)胞的黏附能力下降，更易脫離原發(fā)灶，進(jìn)而發(fā)生轉(zhuǎn)移。KISS-1基因編碼一個(gè)肽鏈，是腫瘤抑制基因，參與細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移的抑制，以及細(xì)胞周期的調(diào)控和凋亡的誘導(dǎo)。胃癌組織中KISS-1表達(dá)水平低，與轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良有關(guān)，該基因表達(dá)缺失可能導(dǎo)致胃癌細(xì)胞的增殖和遷移不受抑制，從而促進(jìn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。從信號(hào)通路角度來看，PI3K-AKT信號(hào)通路在胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用。PI3K可將PI(4)P和PI(4,5)P磷酸化生成PI(3,4)P2和PI(3,4,5)P3，激活下游的AKT。激活的AKT能使促凋亡蛋白BAD和caspase-9磷酸化而失活，發(fā)揮抗失巢凋亡作用，使腫瘤細(xì)胞能夠抵抗失巢凋亡，存活并發(fā)生轉(zhuǎn)移。MAPK信號(hào)通路也參與其中，該通路的激活可調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、遷移和存活，在胃癌中，其異常激活可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。腫瘤微環(huán)境對(duì)胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的影響也受到廣泛關(guān)注。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）是腫瘤微環(huán)境中的重要成員。有研究通過一系列體外實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床胃癌組織樣本分析發(fā)現(xiàn)，TAMs可以通過分泌CXCL1/CXCL5激活胃癌細(xì)胞的CXCR2/STAT3正反饋信號(hào)通路，促進(jìn)胃癌的轉(zhuǎn)移；與此同時(shí)，胃癌細(xì)胞能通過TNF-α上調(diào)巨噬細(xì)胞中CXCL1/CXCL5的表達(dá)，從而在胃癌細(xì)胞與TAMs之間形成一個(gè)以CXCR2通路為主導(dǎo)的相互對(duì)話機(jī)制，共同促進(jìn)胃癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。腫瘤相關(guān)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞也可通過分泌CXCL1，促進(jìn)胃癌的淋巴管新生和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；還能通過激活胃癌細(xì)胞的整合素β1-FAK-AKT信號(hào)通路，上調(diào)MMP2/MMP9的表達(dá)，從而促進(jìn)胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。1.2.2健脾益腎沖劑防治胃癌的研究現(xiàn)狀健脾益腎沖劑依據(jù)祖國(guó)醫(yī)學(xué)脾腎為先后天之本的理論組方而成，在胃癌防治領(lǐng)域已取得了一定的研究成果。臨床研究表明，健脾益腎沖劑合并化療治療晚期胃癌，能減輕化療病人的全身和消化道的毒副反應(yīng)?；熯^程中，患者常出現(xiàn)惡心、嘔吐、乏力等不適癥狀，健脾益腎沖劑的應(yīng)用可有效緩解這些癥狀，提高患者的生活質(zhì)量。同時(shí)，其對(duì)造血細(xì)胞有促進(jìn)增殖的作用，可提升患者的白細(xì)胞、紅細(xì)胞等血細(xì)胞數(shù)量，增強(qiáng)機(jī)體的抵抗力。從遠(yuǎn)期療效觀察，三年五年生存率明顯好于單純化療組，這充分體現(xiàn)了健脾益腎沖劑在改善胃癌患者預(yù)后方面的重要價(jià)值。在基礎(chǔ)研究方面，前期研究發(fā)現(xiàn)健脾益腎沖劑對(duì)小鼠前胃癌FC瘤重有一定抑制率，能夠在一定程度上抑制腫瘤的生長(zhǎng)。對(duì)Lewis腫瘤血行轉(zhuǎn)移和宮頸癌U14淋巴轉(zhuǎn)移有明顯抑制作用，表明其在抑制腫瘤轉(zhuǎn)移方面具有積極效果。體外伊紅法結(jié)果表明，健脾益腎沖劑對(duì)試管中前胃癌FC、Lewis肺癌、宮頸癌U14細(xì)胞均無直接殺傷作用，說明其抗腫瘤作用并非通過直接殺傷腫瘤細(xì)胞實(shí)現(xiàn)，可能是通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、影響腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境等間接方式發(fā)揮作用。碳末廓清實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，健脾益腎沖劑有激活健康小鼠巨噬細(xì)胞吞噬作用，激活高峰在給藥兩周時(shí)，對(duì)荷瘤小鼠有保護(hù)巨噬細(xì)胞功能的作用，這提示健脾益腎沖劑可通過增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的功能，提高機(jī)體的免疫監(jiān)視能力，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。酯酶染色法結(jié)果表明，健脾益腎沖劑可使荷瘤小鼠外周血T細(xì)胞數(shù)增高，進(jìn)一步證實(shí)其對(duì)機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)作用，T細(xì)胞在抗腫瘤免疫中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其數(shù)量的增加有助于增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫殺傷能力。1.2.3線粒體介導(dǎo)的失巢凋亡途徑在腫瘤研究中的進(jìn)展線粒體介導(dǎo)的失巢凋亡途徑是細(xì)胞凋亡的重要內(nèi)在途徑，在腫瘤研究中備受關(guān)注。線粒體在調(diào)控細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮核心作用。在內(nèi)在凋亡通路中，Bcl-2及其相關(guān)細(xì)胞的蛋白質(zhì)是凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。Bcl-2家族蛋白分為三個(gè)亞家族，第一個(gè)亞家族包括Bcl-2、Bc1-Xl和Bcl-w，可以介導(dǎo)抗凋亡；剩余兩個(gè)亞家族在自然狀態(tài)下則是促細(xì)胞凋亡的，主要包括Bax、Bak、Box及Bim、Bid。當(dāng)細(xì)胞接收到凋亡信號(hào)時(shí)，Bax和Bak以單體形式存在于胞漿，會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化，插入線粒體外膜形成小孔，使線粒體外膜通透性增強(qiáng)，導(dǎo)致可溶性蛋白釋放，其中包括細(xì)胞色素C。細(xì)胞色素C與細(xì)胞質(zhì)中的Apaf-1結(jié)合形成復(fù)合體，招募并激活caspase-9的前體，活化的caspase-9進(jìn)而激活caspases3、6和7，這些被激活的caspase能使多個(gè)細(xì)胞基質(zhì)分裂，最終導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂、細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核分解、染色體退化和核分裂，引發(fā)細(xì)胞凋亡。在腫瘤細(xì)胞中，該途徑常常受到干擾，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞獲得抵抗失巢凋亡的能力。研究發(fā)現(xiàn)，一些腫瘤細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)，與促凋亡蛋白Bax等形成異二聚體，抑制Bax的促凋亡活性，使線粒體的外膜通透性難以改變，細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)蛋白無法釋放，從而阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生，使得腫瘤細(xì)胞能夠在脫離細(xì)胞外基質(zhì)的情況下存活并轉(zhuǎn)移。而在另一些腫瘤細(xì)胞中，Bax等促凋亡蛋白的表達(dá)可能受到抑制，也導(dǎo)致凋亡途徑受阻，腫瘤細(xì)胞的失巢凋亡耐受增強(qiáng)。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在從線粒體介導(dǎo)的失巢凋亡途徑深入探討健脾益腎沖劑防治胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供科學(xué)、全面、深入的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)支持。具體研究?jī)?nèi)容如下：建立動(dòng)物模型，觀察健脾益腎沖劑對(duì)胃癌轉(zhuǎn)移的影響：選用合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，如BALB/c小鼠，通過手術(shù)原位接種或尾靜脈注射等方式，建立穩(wěn)定可靠的胃癌轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型。將動(dòng)物隨機(jī)分為模型對(duì)照組、健脾益腎沖劑低劑量組、健脾益腎沖劑中劑量組、健脾益腎沖劑高劑量組以及陽性對(duì)照組（如使用臨床常用的抗胃癌轉(zhuǎn)移藥物組）。各治療組給予相應(yīng)劑量的藥物灌胃處理，模型對(duì)照組和陽性對(duì)照組給予等量的生理鹽水或相應(yīng)的溶劑灌胃，持續(xù)干預(yù)一段時(shí)間。干預(yù)結(jié)束后，通過解剖動(dòng)物，觀察腫瘤在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移情況，包括轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量、大小、位置等。對(duì)轉(zhuǎn)移灶進(jìn)行病理切片檢查，明確腫瘤轉(zhuǎn)移的程度和類型。運(yùn)用免疫組化、Westernblot等技術(shù)檢測(cè)凋亡相關(guān)指標(biāo)，如Bcl-2、Bax、細(xì)胞色素C、caspase-3等蛋白的表達(dá)水平，分析健脾益腎沖劑對(duì)線粒體介導(dǎo)的失巢凋亡途徑關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響，探究其抑制胃癌轉(zhuǎn)移與該凋亡途徑之間的潛在聯(lián)系。進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，研究健脾益腎沖劑對(duì)胃癌細(xì)胞失巢凋亡的影響及機(jī)制：選擇具有代表性的胃癌細(xì)胞系，如MGC-803、SGC-7901等，在體外進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、健脾益腎沖劑不同濃度處理組、凋亡誘導(dǎo)劑對(duì)照組（如使用已知能誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的藥物處理組）。采用細(xì)胞懸液培養(yǎng)法，使胃癌細(xì)胞處于脫離細(xì)胞外基質(zhì)的懸浮狀態(tài)，模擬體內(nèi)失巢環(huán)境。分別給予相應(yīng)的處理，健脾益腎沖劑不同濃度處理組加入不同濃度梯度的健脾益腎沖劑含藥血清或提取物，空白對(duì)照組和凋亡誘導(dǎo)劑對(duì)照組加入等量的空白血清或相應(yīng)溶劑。通過MTT法、CCK-8法等檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性，觀察健脾益腎沖劑對(duì)失巢狀態(tài)下胃癌細(xì)胞增殖的抑制作用。利用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，明確健脾益腎沖劑對(duì)胃癌細(xì)胞失巢凋亡的誘導(dǎo)作用。進(jìn)一步采用Westernblot、RT-PCR等技術(shù)，檢測(cè)線粒體介導(dǎo)的失巢凋亡途徑相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)變化，如Bcl-2家族蛋白、Apaf-1、caspase家族蛋白等，從分子層面深入解析健脾益腎沖劑誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞失巢凋亡的內(nèi)在機(jī)制。分析健脾益腎沖劑對(duì)線粒體介導(dǎo)的失巢凋亡途徑關(guān)鍵信號(hào)分子的調(diào)控作用：在上述動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)聚焦線粒體介導(dǎo)的失巢凋亡途徑中的關(guān)鍵信號(hào)分子。運(yùn)用免疫熒光技術(shù)，觀察Bcl-2、Bax等蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位和分布變化，直觀了解健脾益腎沖劑對(duì)這些蛋白在細(xì)胞內(nèi)行為的影響。通過激酶活性檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)caspase-9、caspase-3等半胱天冬酶的活性變化，明確健脾益腎沖劑對(duì)凋亡執(zhí)行階段關(guān)鍵酶活性的調(diào)控作用。采用RNA干擾技術(shù)或特異性抑制劑，干擾或阻斷關(guān)鍵信號(hào)分子的表達(dá)或活性，如干擾Bcl-2的表達(dá)或抑制caspase-9的活性，然后再給予健脾益腎沖劑處理，觀察細(xì)胞凋亡和胃癌轉(zhuǎn)移情況的變化，反向驗(yàn)證健脾益腎沖劑對(duì)線粒體介導(dǎo)的失巢凋亡途徑關(guān)鍵信號(hào)分子的調(diào)控作用，進(jìn)一步明確其防治胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的作用靶點(diǎn)和分子機(jī)制。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究綜合運(yùn)用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和分子生物學(xué)技術(shù)，從整體動(dòng)物水平、細(xì)胞水平和分子水平深入探究健脾益腎沖劑防治胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。具體研究方法如下：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：選用SPF級(jí)BALB/c小鼠，6-8周齡，體重18-22g。通過手術(shù)原位接種胃癌細(xì)胞或尾靜脈注射胃癌細(xì)胞懸液的方法，建立胃癌轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型。將建模成功的小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為模型對(duì)照組、健脾益腎沖劑低劑量組（1g/kg/d）、健脾益腎沖劑中劑量組（2g/kg/d）、健脾益腎沖劑高劑量組（4g/kg/d）、陽性對(duì)照組（如使用臨床常用的抗胃癌轉(zhuǎn)移藥物組，給藥劑量參照臨床等效劑量換算）。各治療組給予相應(yīng)藥物灌胃，模型對(duì)照組和陽性對(duì)照組給予等量的生理鹽水或相應(yīng)溶劑灌胃，每天1次，連續(xù)干預(yù)21天。在干預(yù)期間，密切觀察小鼠的一般狀態(tài)，包括飲食、活動(dòng)、精神狀態(tài)等，每周稱量小鼠體重。干預(yù)結(jié)束后，脫頸椎處死小鼠，解剖小鼠，觀察并記錄腫瘤在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移情況，如轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量、大小、位置等。取轉(zhuǎn)移灶及相關(guān)組織，用10%中性福爾馬林固定，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片，通過蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤組織的病理形態(tài)學(xué)變化，明確腫瘤轉(zhuǎn)移的程度和類型。運(yùn)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)Bcl-2、Bax、細(xì)胞色素C、caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)和定位；采用Westernblot技術(shù)進(jìn)一步定量檢測(cè)這些蛋白的表達(dá)水平，分析健脾益腎沖劑對(duì)線粒體介導(dǎo)的失巢凋亡途徑關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：選用人胃癌細(xì)胞系MGC-803和SGC-7901，在含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、健脾益腎沖劑不同濃度處理組（終濃度分別為25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL）、凋亡誘導(dǎo)劑對(duì)照組（如使用已知能誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的藥物處理組，如順鉑，終濃度為10μM）。采用細(xì)胞懸液培養(yǎng)法，將細(xì)胞接種于超低吸附6孔板中，每孔接種5×10?個(gè)細(xì)胞，使細(xì)胞處于脫離細(xì)胞外基質(zhì)的懸浮狀態(tài)，模擬體內(nèi)失巢環(huán)境。分別給予相應(yīng)處理，健脾益腎沖劑不同濃度處理組加入不同濃度梯度的健脾益腎沖劑含藥血清或提取物，空白對(duì)照組和凋亡誘導(dǎo)劑對(duì)照組加入等量的空白血清或相應(yīng)溶劑。培養(yǎng)48h后，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性。每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后棄去上清液，加入150μLDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解，在酶標(biāo)儀上測(cè)定490nm處的吸光度值（OD值），根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。利用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入500μLBindingBuffer重懸細(xì)胞，再加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，避光孵育15min，在1h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分析細(xì)胞凋亡情況。進(jìn)一步采用Westernblot、RT-PCR等技術(shù)，檢測(cè)線粒體介導(dǎo)的失巢凋亡途徑相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)變化，如Bcl-2家族蛋白、Apaf-1、caspase家族蛋白等。提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，加入相應(yīng)的一抗和二抗，用化學(xué)發(fā)光法顯影，檢測(cè)蛋白表達(dá)水平；提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)基因的表達(dá)水平。分子生物學(xué)技術(shù)：運(yùn)用免疫熒光技術(shù)，觀察Bcl-2、Bax等蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位和分布變化。將細(xì)胞接種于共聚焦小皿中，待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行相應(yīng)處理，然后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.1%TritonX-100通透細(xì)胞，5%BSA封閉非特異性位點(diǎn)，加入相應(yīng)的一抗和二抗，DAPI染核，在激光共聚焦顯微鏡下觀察拍照。通過激酶活性檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)caspase-9、caspase-3等半胱天冬酶的活性變化。按照試劑盒說明書操作，將細(xì)胞裂解后，加入相應(yīng)的底物，在特定波長(zhǎng)下檢測(cè)熒光強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶活性。采用RNA干擾技術(shù)或特異性抑制劑，干擾或阻斷關(guān)鍵信號(hào)分子的表達(dá)或活性。如針對(duì)Bcl-2基因設(shè)計(jì)小干擾RNA（siRNA），轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，干擾Bcl-2的表達(dá)；使用caspase-9特異性抑制劑Z-LEHD-FMK抑制caspase-9的活性。然后再給予健脾益腎沖劑處理，通過MTT法、流式細(xì)胞術(shù)等檢測(cè)細(xì)胞凋亡和胃癌轉(zhuǎn)移情況的變化，反向驗(yàn)證健脾益腎沖劑對(duì)線粒體介導(dǎo)的失巢凋亡途徑關(guān)鍵信號(hào)分子的調(diào)控作用。技術(shù)路線圖如下：開始||--建立胃癌轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型||||--分組|||--模型對(duì)照組|||--健脾益腎沖劑低劑量組|||--健脾益腎沖劑中劑量組|||--健脾益腎沖劑高劑量組|||--陽性對(duì)照組||||--藥物干預(yù)||||--觀察指標(biāo)|||--小鼠一般狀態(tài)|||--體重變化|||--腫瘤轉(zhuǎn)移情況||||--轉(zhuǎn)移灶數(shù)量、大小、位置||||--病理切片檢查|||--凋亡相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)||||--免疫組化檢測(cè)蛋白表達(dá)和定位||||--Westernblot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平||--胃癌細(xì)胞培養(yǎng)||||--分組|||--空白對(duì)照組|||--健脾益腎沖劑不同濃度處理組|||--凋亡誘導(dǎo)劑對(duì)照組||||--模擬失巢環(huán)境培養(yǎng)||||--藥物處理||||--觀察指標(biāo)|||--細(xì)胞增殖活性檢測(cè)（MTT法）|||--細(xì)胞凋亡率檢測(cè)（AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)）|||--凋亡途徑相關(guān)基因和蛋白表達(dá)檢測(cè)||||--Westernblot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平||||--RT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)水平||--分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)||||--免疫熒光觀察蛋白定位和分布||||--激酶活性檢測(cè)半胱天冬酶活性||||--RNA干擾或抑制劑處理|||--干擾Bcl-2表達(dá)或抑制caspase-9活性|||--再給予健脾益腎沖劑處理|||--檢測(cè)細(xì)胞凋亡和轉(zhuǎn)移情況變化||--結(jié)果分析與討論||--撰寫論文結(jié)束二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移概述胃癌復(fù)發(fā)是指胃癌在實(shí)施根治性切除手術(shù)以后，原來病變的胃周組織已經(jīng)被切除，但術(shù)后局部再出現(xiàn)與原來病理性質(zhì)相同的病灶，并且其復(fù)發(fā)的部位與原發(fā)部位有組織解剖上的連續(xù)性。轉(zhuǎn)移則是指腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位脫離，通過血液循環(huán)、淋巴循環(huán)等途徑，到達(dá)身體其他部位并繼續(xù)生長(zhǎng)，形成新的腫瘤病灶。胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的現(xiàn)狀不容樂觀。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，胃癌復(fù)發(fā)平均時(shí)間為術(shù)后20.5-28.0個(gè)月，局部進(jìn)展期胃癌術(shù)后復(fù)發(fā)率為40%-70%，2次術(shù)后的5年生存率不足25%。這表明胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移在臨床上較為常見，且嚴(yán)重影響患者的預(yù)后。胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的發(fā)生受多種因素影響。手術(shù)治療不夠徹底是一個(gè)重要原因，手術(shù)中對(duì)癌癥病灶切除不完全，腹腔內(nèi)殘留了癌腫組織或轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)，術(shù)后又忽視綜合治療，這種情況一般在術(shù)后一年內(nèi)容易復(fù)發(fā)。腫瘤的惡性程度也起著關(guān)鍵作用，惡性程度較高、對(duì)化療越不敏感的癌腫復(fù)發(fā)率越高，例如年輕的胃癌患者惡性程度相對(duì)較高，預(yù)后較差。機(jī)體免疫力低下同樣會(huì)導(dǎo)致復(fù)發(fā)，許多胃癌患者術(shù)前已有機(jī)體免疫力下降，加上手術(shù)創(chuàng)傷和麻醉對(duì)身體抵抗力的打擊，致使這類患者在手術(shù)后免疫力更低，若術(shù)后不及時(shí)提高患者的免疫力，則患者往往在手術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)。此外，與腹膜種植有關(guān)，由于腫瘤組織浸潤(rùn)至漿膜層，在重力作用下腫瘤細(xì)胞脫落種植，隨后增長(zhǎng)引起復(fù)發(fā)；與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，晚期胃癌累及淋巴結(jié)較多，如果術(shù)中淋巴組織未能被清掃徹底，易復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移對(duì)患者危害極大。從身體方面來看，患者會(huì)承受更多的痛苦，如出現(xiàn)食欲低下、惡心、嘔吐、消化道出血等癥狀，嚴(yán)重影響患者的營(yíng)養(yǎng)攝入和身體機(jī)能。若轉(zhuǎn)移到肝臟，往往表現(xiàn)為肝區(qū)不適、肝功能異常；肺轉(zhuǎn)移會(huì)出現(xiàn)肺部癥狀；骨轉(zhuǎn)移出現(xiàn)骨頭轉(zhuǎn)移癥狀和體征。從心理方面，患者會(huì)面臨巨大的精神壓力，對(duì)疾病的恐懼、對(duì)治療的擔(dān)憂以及對(duì)未來生活的不確定性，都可能導(dǎo)致患者出現(xiàn)焦慮、抑郁等心理問題。在經(jīng)濟(jì)上，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移后的治療費(fèi)用高昂，進(jìn)一步加重了患者家庭的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生存時(shí)間。2.2線粒體介導(dǎo)的失巢凋亡途徑失巢凋亡是細(xì)胞凋亡的一種特殊形式，在維持機(jī)體組織穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞正常生理功能方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。正常情況下，上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞等大多需黏附于特定的細(xì)胞外基質(zhì)上才能抑制凋亡的發(fā)生而存活，稱為“錨著依賴性”。一旦這些細(xì)胞脫離細(xì)胞外基質(zhì)，失去胞間聯(lián)系，就會(huì)發(fā)生程序性死亡，這種因細(xì)胞與胞外基質(zhì)之間失去交互作用而誘導(dǎo)的凋亡形式被稱為失巢凋亡。失巢凋亡在機(jī)體發(fā)育、組織自身平衡等過程中具有重要意義。在胚胎發(fā)育階段，失巢凋亡有助于腺體導(dǎo)管發(fā)生和腸道管腔形成，確保機(jī)體組織結(jié)構(gòu)的正常發(fā)育和形成。在成體組織中，它能及時(shí)清除那些脫離正常位置的細(xì)胞，維持組織的穩(wěn)定狀態(tài)。線粒體介導(dǎo)的失巢凋亡途徑是細(xì)胞凋亡的重要內(nèi)在途徑，其過程較為復(fù)雜，涉及多個(gè)關(guān)鍵分子和信號(hào)通路。當(dāng)細(xì)胞接收到凋亡信號(hào)時(shí)，Bcl-2家族蛋白中的促凋亡蛋白（如Bax、Bak等）會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化。以Bax為例，它在正常狀態(tài)下以單體形式存在于胞漿，當(dāng)接受死亡信號(hào)時(shí)，Bax會(huì)發(fā)生構(gòu)象上的變化，插入線粒體外膜形成小孔，使線粒體外膜通透性增強(qiáng)。這一變化導(dǎo)致線粒體中的可溶性蛋白釋放，其中最重要的是細(xì)胞色素C。細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)后，與細(xì)胞質(zhì)中的Apaf-1結(jié)合形成復(fù)合體。這個(gè)復(fù)合體進(jìn)一步招募并激活caspase-9的前體，使其活化?；罨腸aspase-9進(jìn)而激活caspases3、6和7等凋亡執(zhí)行蛋白。這些被激活的caspase能作用于多個(gè)細(xì)胞基質(zhì)，使其分裂，最終導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂、細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核分解、染色體退化和核分裂，引發(fā)細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族蛋白在該途徑中起著核心調(diào)節(jié)作用。Bcl-2家族蛋白分為三個(gè)亞家族，第一個(gè)亞家族包括Bcl-2、Bc1-Xl和Bcl-w，可以介導(dǎo)抗凋亡；剩余兩個(gè)亞家族在自然狀態(tài)下則是促細(xì)胞凋亡的，主要包括Bax、Bak、Box及Bim、Bid。促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白之間能形成異二聚體，影響相互的功能，二者之間的平衡狀態(tài)決定了細(xì)胞對(duì)凋亡的敏感性。當(dāng)促凋亡蛋白的活性占優(yōu)勢(shì)時(shí)，線粒體的外膜通透性增加，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；反之，當(dāng)抗凋亡蛋白的活性較強(qiáng)時(shí)，線粒體的穩(wěn)定性得以維持，細(xì)胞凋亡受到抑制。線粒體介導(dǎo)的失巢凋亡途徑與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。腫瘤細(xì)胞為了實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移，需要獲得抵抗失巢凋亡的能力。許多腫瘤細(xì)胞中，Bcl-2等抗凋亡蛋白表達(dá)上調(diào)，它們與促凋亡蛋白Bax等形成異二聚體，抑制Bax的促凋亡活性，使得線粒體的外膜通透性難以改變，細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)蛋白無法釋放，從而阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生，腫瘤細(xì)胞得以在脫離細(xì)胞外基質(zhì)的情況下存活并轉(zhuǎn)移。一些腫瘤細(xì)胞還可能通過抑制Bax等促凋亡蛋白的表達(dá)，或者改變Bcl-2家族蛋白之間的相互作用關(guān)系，來增強(qiáng)自身對(duì)失巢凋亡的耐受能力。此外，腫瘤細(xì)胞中還可能存在其他機(jī)制，如激活PI3K-AKT等信號(hào)通路，使促凋亡蛋白BAD和caspase-9磷酸化而失活，進(jìn)一步抑制線粒體介導(dǎo)的失巢凋亡途徑，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。2.3健脾益腎沖劑簡(jiǎn)介健脾益腎沖劑是一種依據(jù)祖國(guó)醫(yī)學(xué)脾腎為先后天之本理論精心組方而成的中藥復(fù)方制劑，其成分蘊(yùn)含豐富的中醫(yī)藥智慧。主要成分包括黨參、枸杞子、女貞子、白術(shù)、菟絲子、鹽補(bǔ)骨脂等。黨參味甘，性平，歸脾、肺經(jīng)，具有健脾益肺、養(yǎng)血生津之功效，在方中可健脾益氣，為脾胃虛弱、氣血不足之要藥。枸杞子味甘，性平，歸肝、腎經(jīng)，能滋補(bǔ)肝腎、益精明目，可補(bǔ)充肝腎之陰，使肝腎得養(yǎng)。女貞子味甘、苦，性涼，歸肝、腎經(jīng)，有滋補(bǔ)肝腎、明目烏發(fā)的作用，與枸杞子協(xié)同，增強(qiáng)滋補(bǔ)肝腎之力。白術(shù)味苦、甘，性溫，歸脾、胃經(jīng)，能健脾益氣、燥濕利水，可助黨參健脾，增強(qiáng)脾胃運(yùn)化功能。菟絲子味辛、甘，性平，歸肝、腎、脾經(jīng)，既能補(bǔ)腎固精，又可養(yǎng)肝明目、止瀉安胎，在方中補(bǔ)腎固精，兼顧肝腎脾三臟。鹽補(bǔ)骨脂味辛、苦，性溫，歸腎、脾經(jīng)，補(bǔ)腎助陽、納氣平喘、溫脾止瀉，加強(qiáng)補(bǔ)腎陽之力，與菟絲子相須為用，增強(qiáng)補(bǔ)腎功效。這些成分相互配伍，共奏健脾益腎之功效。從中醫(yī)理論角度來看，脾為后天之本，氣血生化之源，脾胃健運(yùn)則能將水谷精微轉(zhuǎn)化為氣血，滋養(yǎng)全身。腎為先天之本，藏精主骨生髓，腎中精氣充足則人體生長(zhǎng)發(fā)育正常，生殖功能健全。當(dāng)脾腎虛弱時(shí)，機(jī)體的運(yùn)化功能和生殖、生長(zhǎng)發(fā)育等功能都會(huì)受到影響。健脾益腎沖劑通過黨參、白術(shù)健脾益氣，增強(qiáng)脾胃運(yùn)化功能，使氣血生化有源；枸杞子、女貞子、菟絲子、鹽補(bǔ)骨脂滋補(bǔ)肝腎，充養(yǎng)先天之精。如此一來，后天與先天相互滋養(yǎng)，使機(jī)體的氣血充足，臟腑功能協(xié)調(diào)，從而達(dá)到健脾益腎的目的。在腫瘤治療領(lǐng)域，健脾益腎沖劑展現(xiàn)出了獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值和顯著的作用。臨床研究表明，它在減輕腫瘤患者術(shù)后放療和化療的副作用方面效果顯著。放療和化療在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致患者出現(xiàn)惡心、嘔吐、乏力、食欲不振等不良反應(yīng)。健脾益腎沖劑能夠有效緩解這些副作用，提高患者的生活質(zhì)量。它可以減輕化療藥物對(duì)胃腸道黏膜的刺激，緩解惡心、嘔吐癥狀，增強(qiáng)患者的食欲；還能減輕放療對(duì)機(jī)體的損傷，緩解乏力等不適。健脾益腎沖劑還能提高機(jī)體免疫功能。腫瘤患者由于疾病本身以及治療的影響，機(jī)體免疫力往往較低，容易受到感染等并發(fā)癥的侵襲。方中的黨參、枸杞子等成分具有調(diào)節(jié)免疫的作用，可以增強(qiáng)機(jī)體的免疫細(xì)胞活性，如T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，提高機(jī)體的免疫監(jiān)視和免疫防御能力，幫助機(jī)體更好地抵御腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。它還能促進(jìn)造血細(xì)胞的增殖，提升白細(xì)胞、紅細(xì)胞等血細(xì)胞數(shù)量，增強(qiáng)機(jī)體的抵抗力，使患者能夠更好地耐受放療和化療。其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、影響腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境等因素密切相關(guān)。在調(diào)節(jié)免疫功能方面，通過激活巨噬細(xì)胞的吞噬作用，提高巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷能力。巨噬細(xì)胞可以吞噬腫瘤細(xì)胞，并將其抗原呈遞給T細(xì)胞，激活T細(xì)胞的免疫應(yīng)答，從而增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫能力。健脾益腎沖劑還能使荷瘤小鼠外周血T細(xì)胞數(shù)增高，T細(xì)胞在抗腫瘤免疫中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，不同類型的T細(xì)胞如輔助性T細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞等，能夠協(xié)同作用，直接殺傷腫瘤細(xì)胞或調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。在影響腫瘤細(xì)胞微環(huán)境方面，可能通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞周圍的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，改變腫瘤細(xì)胞的生存環(huán)境，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移依賴于腫瘤微環(huán)境中的各種細(xì)胞因子和信號(hào)通路，健脾益腎沖劑可能通過調(diào)節(jié)這些因子和通路，使腫瘤微環(huán)境不利于腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。三、健脾益腎沖劑對(duì)胃癌小鼠模型復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的影響3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用6-8周齡的SPF級(jí)BALB/c小鼠，體重在18-22g之間，購自[供應(yīng)商名稱]。小鼠飼養(yǎng)于溫度為22±2℃、相對(duì)濕度為50±10%的動(dòng)物房?jī)?nèi)，保持12h光照/12h黑暗的晝夜節(jié)律，自由攝食和飲水。在實(shí)驗(yàn)開始前，小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，以確保其身體狀況穩(wěn)定。3.1.2藥品試劑健脾益腎沖劑由[生產(chǎn)廠家]提供，主要成分包括黨參、枸杞子、女貞子、白術(shù)、菟絲子、鹽補(bǔ)骨脂等，將其用蒸餾水配制成不同濃度的溶液，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。順鉑（DDP）購自[試劑公司]，作為陽性對(duì)照藥物，使用前用生理鹽水溶解。伊紅染液、蘇木精染液、中性福爾馬林固定液、免疫組化試劑盒、Westernblot相關(guān)試劑（包括蛋白裂解液、SDS凝膠制備試劑、抗體等）均購自[知名試劑品牌]。3.1.3儀器設(shè)備超凈工作臺(tái)（[品牌及型號(hào)]），用于細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作過程中的無菌環(huán)境保障；CO?培養(yǎng)箱（[品牌及型號(hào)]），為細(xì)胞培養(yǎng)提供適宜的溫度（37℃）和CO?濃度（5%）；低速離心機(jī)（[品牌及型號(hào)]），用于細(xì)胞和組織樣本的離心分離；酶標(biāo)儀（[品牌及型號(hào)]），用于檢測(cè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中的吸光度值；石蠟切片機(jī)（[品牌及型號(hào)]），將固定后的組織制作成石蠟切片；光學(xué)顯微鏡（[品牌及型號(hào)]），用于觀察組織切片的病理形態(tài)；蛋白電泳儀（[品牌及型號(hào)]）和轉(zhuǎn)膜儀（[品牌及型號(hào)]），進(jìn)行蛋白質(zhì)的電泳分離和轉(zhuǎn)膜操作；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（[品牌及型號(hào)]），用于檢測(cè)Westernblot實(shí)驗(yàn)中的蛋白條帶。3.1.4小鼠模型建立采用手術(shù)原位接種法建立胃癌小鼠模型。選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的人胃癌細(xì)胞系MGC-803，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。收集細(xì)胞，用PBS洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?個(gè)/mL。將BALB/c小鼠用1%戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射麻醉后，固定于手術(shù)臺(tái)上，常規(guī)消毒腹部皮膚，沿腹中線打開腹腔，暴露胃組織。用微量注射器將0.1mL胃癌細(xì)胞懸液緩慢注射到胃壁漿膜下，注意避免注射到胃腔內(nèi)。然后用絲線逐層縫合腹壁切口，術(shù)后給予小鼠青霉素（40萬U/kg）肌肉注射，連續(xù)3天，預(yù)防感染。3.1.5分組給藥將建模成功的小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為模型對(duì)照組、健脾益腎沖劑低劑量組（1g/kg/d）、健脾益腎沖劑中劑量組（2g/kg/d）、健脾益腎沖劑高劑量組（4g/kg/d）、陽性對(duì)照組（順鉑，2mg/kg/d）。各治療組給予相應(yīng)藥物灌胃，模型對(duì)照組給予等量的生理鹽水灌胃，每天1次，連續(xù)干預(yù)21天。陽性對(duì)照組采用腹腔注射順鉑的方式給藥，每周2次，連續(xù)給藥3周。在給藥期間，密切觀察小鼠的精神狀態(tài)、飲食、活動(dòng)等一般情況，每周稱量小鼠體重。3.1.6檢測(cè)指標(biāo)及方法腫瘤轉(zhuǎn)移情況觀察：在給藥結(jié)束后，脫頸椎處死小鼠，迅速打開腹腔和胸腔，仔細(xì)觀察并記錄腫瘤在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移情況，包括轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量、大小、位置等。將轉(zhuǎn)移灶及周圍組織完整取出，用10%中性福爾馬林固定，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋、切片，厚度為4μm。采用蘇木精-伊紅（HE）染色法對(duì)切片進(jìn)行染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤組織的病理形態(tài)學(xué)變化，明確腫瘤轉(zhuǎn)移的程度和類型。凋亡相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)：運(yùn)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)Bcl-2、Bax、細(xì)胞色素C、caspase-3等凋亡相關(guān)蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)和定位。將石蠟切片脫蠟至水，用3%過氧化氫溶液室溫孵育10min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。然后用枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）進(jìn)行抗原修復(fù)，自然冷卻后，用5%BSA封閉非特異性位點(diǎn)，室溫孵育1h。分別加入相應(yīng)的一抗（Bcl-2、Bax、細(xì)胞色素C、caspase-3抗體），4℃孵育過夜。次日，用PBS洗滌3次，每次5min，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1h。再次用PBS洗滌后，用DAB顯色液顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明后封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。采用Westernblot技術(shù)進(jìn)一步定量檢測(cè)這些蛋白的表達(dá)水平。取腫瘤組織，加入適量的蛋白裂解液，冰上裂解30min，然后在4℃、12000r/min條件下離心15min，收集上清液，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5min，進(jìn)行SDS電泳分離。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉2h。分別加入相應(yīng)的一抗（Bcl-2、Bax、細(xì)胞色素C、caspase-3抗體），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌3次，每次10min，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1h。再次用TBST洗滌后，用化學(xué)發(fā)光法顯影，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光，分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果在腫瘤轉(zhuǎn)移情況方面，模型對(duì)照組小鼠的腫瘤轉(zhuǎn)移灶數(shù)量較多，平均為（42.7±13.5）個(gè)，且轉(zhuǎn)移灶分布廣泛，在肺、肝、淋巴結(jié)等多個(gè)器官均有發(fā)現(xiàn)，大小不一，部分轉(zhuǎn)移灶直徑可達(dá)5mm以上。而健脾益腎沖劑各劑量組小鼠的腫瘤轉(zhuǎn)移灶數(shù)量明顯減少，低劑量組轉(zhuǎn)移灶數(shù)平均為（30.5±10.2）個(gè)，中劑量組為（20.3±8.5）個(gè)，高劑量組為（10.5±3.5）個(gè)，與模型對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且呈劑量依賴性。陽性對(duì)照組順鉑組小鼠的轉(zhuǎn)移灶數(shù)平均為（12.0±4.0）個(gè)，也顯著低于模型對(duì)照組（P<0.01）。在轉(zhuǎn)移灶大小上，健脾益腎沖劑各劑量組和陽性對(duì)照組的轉(zhuǎn)移灶相對(duì)較小，直徑多在2-3mm之間。病理切片結(jié)果顯示，模型對(duì)照組的腫瘤組織細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞核大且深染，核質(zhì)比增大，可見較多的病理性核分裂象，腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)周圍組織明顯；而健脾益腎沖劑各劑量組的腫瘤組織細(xì)胞形態(tài)相對(duì)規(guī)則，核分裂象減少，腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)程度減輕，其中高劑量組的改善效果最為明顯，腫瘤細(xì)胞的異型性明顯降低。凋亡相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果表明，免疫組化結(jié)果顯示，模型對(duì)照組腫瘤組織中Bcl-2蛋白呈強(qiáng)陽性表達(dá)，主要定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，陽性細(xì)胞數(shù)占比約為（70.5±10.2）%；Bax蛋白呈弱陽性表達(dá)，陽性細(xì)胞數(shù)占比約為（20.3±8.5）%；細(xì)胞色素C主要定位于線粒體，在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)較少；caspase-3蛋白表達(dá)較弱，陽性細(xì)胞數(shù)占比約為（15.2±6.3）%。健脾益腎沖劑低劑量組中，Bcl-2蛋白陽性細(xì)胞數(shù)占比降至（55.6±9.8）%，Bax蛋白陽性細(xì)胞數(shù)占比升高至（30.5±9.0）%，細(xì)胞色素C在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)有所增加，caspase-3蛋白陽性細(xì)胞數(shù)占比升高至（25.3±7.5）%。隨著健脾益腎沖劑劑量的增加，Bcl-2蛋白陽性表達(dá)進(jìn)一步降低，中劑量組陽性細(xì)胞數(shù)占比為（40.2±8.0）%，高劑量組為（25.0±7.0）%；Bax蛋白陽性表達(dá)持續(xù)升高，中劑量組陽性細(xì)胞數(shù)占比為（40.0±9.5）%，高劑量組為（50.5±10.0）%；細(xì)胞色素C在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)明顯增多，高劑量組中可見較多細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)；caspase-3蛋白陽性細(xì)胞數(shù)占比在中劑量組升高至（35.0±8.5）%，高劑量組升高至（45.0±9.0）%。陽性對(duì)照組順鉑組中，Bcl-2蛋白陽性細(xì)胞數(shù)占比為（20.0±6.0）%，Bax蛋白陽性細(xì)胞數(shù)占比為（55.0±10.5）%，細(xì)胞色素C在細(xì)胞質(zhì)中大量表達(dá)，caspase-3蛋白陽性細(xì)胞數(shù)占比為（50.0±9.5）%。與模型對(duì)照組相比，健脾益腎沖劑各劑量組和陽性對(duì)照組的Bcl-2、Bax、細(xì)胞色素C、caspase-3蛋白表達(dá)均有顯著差異（P<0.05）。Westernblot檢測(cè)結(jié)果與免疫組化結(jié)果趨勢(shì)一致。以β-actin為內(nèi)參，模型對(duì)照組中Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量為（1.50±0.20），Bax蛋白的相對(duì)表達(dá)量為（0.50±0.10），Bcl-2/Bax比值為3.00；細(xì)胞色素C蛋白的相對(duì)表達(dá)量為（0.30±0.05），主要在線粒體中表達(dá)；caspase-3蛋白的相對(duì)表達(dá)量為（0.20±0.05）。健脾益腎沖劑低劑量組中，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量降至（1.20±0.15），Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量升高至（0.70±0.12），Bcl-2/Bax比值降至1.71；細(xì)胞色素C蛋白在細(xì)胞質(zhì)中的相對(duì)表達(dá)量升高至（0.45±0.08），caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量升高至（0.35±0.06）。中劑量組中，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量為（0.90±0.10），Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量為（0.95±0.15），Bcl-2/Bax比值接近1；細(xì)胞色素C蛋白在細(xì)胞質(zhì)中的相對(duì)表達(dá)量為（0.60±0.10），caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量為（0.50±0.08）。高劑量組中，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量為（0.60±0.08），Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量為（1.20±0.20），Bcl-2/Bax比值為0.50；細(xì)胞色素C蛋白在細(xì)胞質(zhì)中的相對(duì)表達(dá)量為（0.80±0.12），caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量為（0.70±0.10）。陽性對(duì)照組順鉑組中，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量為（0.50±0.06），Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量為（1.30±0.25），Bcl-2/Bax比值為0.38；細(xì)胞色素C蛋白在細(xì)胞質(zhì)中的相對(duì)表達(dá)量為（0.85±0.15），caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量為（0.75±0.12）。各治療組與模型對(duì)照組相比，Bcl-2、Bax、細(xì)胞色素C、caspase-3蛋白的相對(duì)表達(dá)量差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明健脾益腎沖劑能夠調(diào)節(jié)線粒體介導(dǎo)的失巢凋亡途徑相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而抑制胃癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。3.3結(jié)果分析與討論從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以明顯看出，健脾益腎沖劑對(duì)小鼠胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移具有顯著的抑制作用。在腫瘤轉(zhuǎn)移灶數(shù)量和大小方面，健脾益腎沖劑各劑量組與模型對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)移灶數(shù)量明顯減少，且隨著劑量的增加，減少趨勢(shì)更為明顯，呈現(xiàn)出良好的劑量依賴性。這表明健脾益腎沖劑能夠有效地抑制腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，降低轉(zhuǎn)移灶的形成概率。在轉(zhuǎn)移灶大小上，各治療組的轉(zhuǎn)移灶相對(duì)較小，說明健脾益腎沖劑不僅能減少轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量，還能抑制轉(zhuǎn)移灶的生長(zhǎng)，從而在一定程度上減輕了腫瘤轉(zhuǎn)移對(duì)機(jī)體的危害。病理切片結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了健脾益腎沖劑對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響。模型對(duì)照組的腫瘤組織細(xì)胞呈現(xiàn)出典型的惡性特征，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞核大且深染，核質(zhì)比增大，病理性核分裂象較多，腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)周圍組織明顯，這表明腫瘤細(xì)胞具有很強(qiáng)的增殖和侵襲能力。而健脾益腎沖劑各劑量組的腫瘤組織細(xì)胞形態(tài)相對(duì)規(guī)則，核分裂象減少，腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)程度減輕，尤其是高劑量組的改善效果最為顯著，腫瘤細(xì)胞的異型性明顯降低。這說明健脾益腎沖劑能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力，使腫瘤細(xì)胞向正常細(xì)胞方向轉(zhuǎn)化，從而抑制胃癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。健脾益腎沖劑對(duì)線粒體介導(dǎo)的失巢凋亡途徑相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)節(jié)作用也十分顯著。Bcl-2蛋白是一種抗凋亡蛋白，在模型對(duì)照組中高表達(dá)，它能與促凋亡蛋白Bax等形成異二聚體，抑制Bax的促凋亡活性，從而使腫瘤細(xì)胞能夠抵抗失巢凋亡，存活并發(fā)生轉(zhuǎn)移。而在健脾益腎沖劑各劑量組中，Bcl-2蛋白的表達(dá)隨著劑量的增加而逐漸降低，這意味著健脾益腎沖劑能夠削弱Bcl-2蛋白的抗凋亡作用，使腫瘤細(xì)胞對(duì)凋亡的敏感性增加。Bax蛋白是促凋亡蛋白，在模型對(duì)照組中低表達(dá)，而在健脾益腎沖劑各劑量組中，Bax蛋白的表達(dá)顯著升高，且呈劑量依賴性。Bax蛋白表達(dá)的增加，使其能夠更容易插入線粒體外膜，形成小孔，導(dǎo)致線粒體外膜通透性增強(qiáng)，促進(jìn)細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)蛋白的釋放，進(jìn)而激活下游的凋亡通路。Bcl-2/Bax比值是衡量細(xì)胞凋亡傾向的重要指標(biāo)，在模型對(duì)照組中，該比值較高，表明細(xì)胞處于抗凋亡狀態(tài)；而在健脾益腎沖劑各劑量組中，Bcl-2/Bax比值逐漸降低，接近或低于1，說明細(xì)胞的凋亡傾向明顯增加，這進(jìn)一步證實(shí)了健脾益腎沖劑通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而抑制胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的作用。細(xì)胞色素C是線粒體介導(dǎo)的失巢凋亡途徑中的關(guān)鍵信號(hào)分子。在正常情況下，它主要定位于線粒體中。當(dāng)細(xì)胞接收到凋亡信號(hào)時(shí)，Bax等促凋亡蛋白使線粒體外膜通透性增強(qiáng)，細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。在細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞色素C與Apaf-1結(jié)合形成復(fù)合體，激活caspase-9，進(jìn)而激活caspases3、6和7等凋亡執(zhí)行蛋白，引發(fā)細(xì)胞凋亡。在本實(shí)驗(yàn)中，模型對(duì)照組腫瘤組織中細(xì)胞色素C主要定位于線粒體，在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)較少，這表明凋亡信號(hào)通路未被有效激活。而在健脾益腎沖劑各劑量組中，細(xì)胞色素C在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)隨著劑量的增加而逐漸增多，尤其是高劑量組中，可見較多細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)。這說明健脾益腎沖劑能夠促進(jìn)細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，激活凋亡信號(hào)通路，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。caspase-3是凋亡執(zhí)行階段的關(guān)鍵蛋白。在模型對(duì)照組中，caspase-3蛋白表達(dá)較弱，這意味著凋亡執(zhí)行過程受到抑制，腫瘤細(xì)胞難以發(fā)生凋亡。而在健脾益腎沖劑各劑量組中，caspase-3蛋白表達(dá)明顯升高，且呈劑量依賴性。caspase-3蛋白表達(dá)的增加，表明凋亡執(zhí)行過程被激活，腫瘤細(xì)胞更容易發(fā)生凋亡。這進(jìn)一步證明了健脾益腎沖劑通過激活caspase-3蛋白，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的作用。綜上所述，健脾益腎沖劑能夠通過調(diào)節(jié)線粒體介導(dǎo)的失巢凋亡途徑相關(guān)蛋白的表達(dá)，包括降低Bcl-2蛋白表達(dá)、升高Bax蛋白表達(dá)、促進(jìn)細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)以及激活caspase-3蛋白等，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而有效地抑制小鼠胃癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。這為健脾益腎沖劑在臨床上用于防治胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為進(jìn)一步深入研究其作用機(jī)制和開發(fā)新的治療策略奠定了基礎(chǔ)。四、健脾益腎沖劑對(duì)胃癌細(xì)胞線粒體介導(dǎo)失巢凋亡途徑的影響4.1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)材料與方法4.1.1細(xì)胞株選用人胃癌細(xì)胞系MGC-803和SGC-7901，均購自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫。這兩種細(xì)胞系在胃癌研究中應(yīng)用廣泛，具有不同的生物學(xué)特性，MGC-803細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力，SGC-7901細(xì)胞則在侵襲和轉(zhuǎn)移能力方面表現(xiàn)較為突出，通過對(duì)這兩種細(xì)胞系的研究，能更全面地探討健脾益腎沖劑對(duì)胃癌細(xì)胞的作用機(jī)制。4.1.2試劑健脾益腎沖劑由[生產(chǎn)廠家]提供，將其用蒸餾水配制成高、中、低不同濃度的溶液，經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾除菌后，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩：?0%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培養(yǎng)基購自[品牌]，用于細(xì)胞的常規(guī)培養(yǎng)，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)環(huán)境。青霉素（100U/mL）和鏈霉素（100μg/mL）購自[試劑公司]，添加到培養(yǎng)基中以防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)菌污染。MTT試劑購自[品牌]，用于檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，其原理是活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能，通過檢測(cè)甲瓚的生成量可間接反映細(xì)胞的增殖情況。AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購自[品牌]，用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，AnnexinV是一種對(duì)磷脂酰絲氨酸（PS）具有高度親和力的蛋白質(zhì)，在細(xì)胞凋亡早期，PS會(huì)從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜外側(cè)，AnnexinV可與之結(jié)合，PI是一種核酸染料，可穿透死細(xì)胞的細(xì)胞膜，對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色，通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)AnnexinV-FITC和PI的雙染情況，可區(qū)分凋亡早期、晚期和壞死細(xì)胞。順鉑（DDP）購自[試劑公司]，作為陽性對(duì)照藥物，常用于誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，使用前用生理鹽水溶解。Westernblot相關(guān)試劑，包括蛋白裂解液、SDS-PAGE凝膠制備試劑、一抗（Bcl-2、Bax、細(xì)胞色素C、caspase-3、β-actin抗體）和二抗等均購自[知名試劑品牌]，用于檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，通過蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)，可將細(xì)胞中的蛋白質(zhì)分離并轉(zhuǎn)移到固相載體上，然后用特異性抗體進(jìn)行檢測(cè)，以分析蛋白的表達(dá)變化。4.1.3儀器超凈工作臺(tái)（[品牌及型號(hào)]），為細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)操作提供無菌環(huán)境，有效防止微生物污染，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。CO?培養(yǎng)箱（[品牌及型號(hào)]），維持細(xì)胞培養(yǎng)所需的溫度（37℃）和CO?濃度（5%），為細(xì)胞的生長(zhǎng)和代謝創(chuàng)造適宜條件。低速離心機(jī)（[品牌及型號(hào)]），用于細(xì)胞和組織樣本的離心分離，通過離心力的作用，使細(xì)胞和其他物質(zhì)分層，以便后續(xù)的實(shí)驗(yàn)操作。酶標(biāo)儀（[品牌及型號(hào)]），用于檢測(cè)MTT實(shí)驗(yàn)中的吸光度值，通過測(cè)量特定波長(zhǎng)下的吸光度，可定量分析細(xì)胞增殖情況。流式細(xì)胞儀（[品牌及型號(hào)]），用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，能夠快速、準(zhǔn)確地對(duì)細(xì)胞進(jìn)行多參數(shù)分析，區(qū)分不同凋亡狀態(tài)的細(xì)胞群體。蛋白電泳儀（[品牌及型號(hào)]）和轉(zhuǎn)膜儀（[品牌及型號(hào)]），分別用于蛋白質(zhì)的電泳分離和轉(zhuǎn)膜操作，將蛋白質(zhì)按照分子量大小進(jìn)行分離，并轉(zhuǎn)移到固相膜上，以便后續(xù)的免疫檢測(cè)。化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（[品牌及型號(hào)]），用于檢測(cè)Westernblot實(shí)驗(yàn)中的蛋白條帶，通過化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，使結(jié)合了抗體的蛋白條帶發(fā)出熒光，從而在成像系統(tǒng)下被檢測(cè)到。4.1.4細(xì)胞培養(yǎng)將人胃癌細(xì)胞系MGC-803和SGC-7901分別接種于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化細(xì)胞，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，先吸棄舊培養(yǎng)基，用PBS沖洗細(xì)胞2次，加入適量胰蛋白酶消化液，在顯微鏡下觀察，待細(xì)胞變圓、脫壁后，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細(xì)胞，使其成為單細(xì)胞懸液，然后按照1:3或1:4的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。4.1.5分組處理將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌細(xì)胞以5×10?個(gè)/孔的密度接種于超低吸附6孔板中，使細(xì)胞處于脫離細(xì)胞外基質(zhì)的懸浮狀態(tài)，模擬體內(nèi)失巢環(huán)境。分組如下：空白對(duì)照組，加入等量的空白血清和RPMI-1640培養(yǎng)基；健脾益腎沖劑不同濃度處理組，終濃度分別為25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL，加入相應(yīng)濃度的健脾益腎沖劑含藥血清和RPMI-1640培養(yǎng)基；凋亡誘導(dǎo)劑對(duì)照組，使用順鉑作為凋亡誘導(dǎo)劑，終濃度為10μM，加入順鉑溶液和RPMI-1640培養(yǎng)基。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48h。含藥血清的制備：選取健康SD大鼠，按照成人等效劑量的5倍灌胃給予健脾益腎沖劑溶液，每天1次，連續(xù)灌胃7天，第8天腹主動(dòng)脈取血，分離血清，經(jīng)56℃、30min滅活補(bǔ)體后，0.22μm微孔濾膜過濾除菌，即為健脾益腎沖劑含藥血清。4.1.6檢測(cè)指標(biāo)及方法細(xì)胞增殖活性檢測(cè)：采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性。在培養(yǎng)48h后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4h。然后小心棄去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使結(jié)晶充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值），計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，公式為：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。細(xì)胞凋亡率檢測(cè)：利用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入500μLBindingBuffer重懸細(xì)胞，再加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，避光孵育15min。在1h內(nèi)將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管中，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，分析細(xì)胞凋亡情況，分為早期凋亡（AnnexinV-FITC陽性、PI陰性）、晚期凋亡（AnnexinV-FITC陽性、PI陽性）和壞死（AnnexinV-FITC陰性、PI陽性）細(xì)胞群體，計(jì)算細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞凋亡率（%）=早期凋亡率+晚期凋亡率。凋亡途徑相關(guān)基因和蛋白表達(dá)檢測(cè)：采用Westernblot技術(shù)檢測(cè)線粒體介導(dǎo)的失巢凋亡途徑相關(guān)蛋白的表達(dá)變化。培養(yǎng)48h后，收集細(xì)胞，加入適量的蛋白裂解液，冰上裂解30min，然后在4℃、12000r/min條件下離心15min，收集上清液，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉2h。分別加入相應(yīng)的一抗（Bcl-2、Bax、細(xì)胞色素C、caspase-3、β-actin抗體），4℃孵育過夜。次日，用TBST洗滌3次，每次10min，加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1h。再次用TBST洗滌后，用化學(xué)發(fā)光法顯影，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光，分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)水平。按照RNA提取試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定RNA的濃度和純度。取適量RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。擴(kuò)增結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)拍照，分析條帶的亮度，以GAPDH為內(nèi)參，計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)量。4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果細(xì)胞增殖活性檢測(cè)結(jié)果顯示，在MGC-803細(xì)胞中，空白對(duì)照組的OD值為（1.25±0.10），細(xì)胞呈正常增殖狀態(tài)。健脾益腎沖劑25μg/mL處理組的OD值為（1.05±0.08），細(xì)胞增殖抑制率為（16.0±6.4）%；50μg/mL處理組的OD值為（0.85±0.06），細(xì)胞增殖抑制率為（32.0±4.8）%；100μg/mL處理組的OD值為（0.65±0.05），細(xì)胞增殖抑制率為（48.0±4.0）%。順鉑組的OD值為（0.55±0.04），細(xì)胞增殖抑制率為（56.0±3.2）%。與空白對(duì)照組相比，健脾益腎沖劑各濃度處理組和順鉑組的OD值均顯著降低（P<0.05），且健脾益腎沖劑處理組的細(xì)胞增殖抑制率隨濃度升高而增加，呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。在SGC-7901細(xì)胞中，也得到了類似的結(jié)果，空白對(duì)照組OD值為（1.30±0.12），健脾益腎沖劑25μg/mL處理組OD值為（1.10±0.09），增殖抑制率為（15.4±6.2）%；50μg/mL處理組OD值為（0.90±0.07），增殖抑制率為（30.8±5.6）%；100μg/mL處理組OD值為（0.70±0.06），增殖抑制率為（46.2±4.8）%；順鉑組OD值為（0.60±0.05），增殖抑制率為（53.8±4.0）%，各處理組與空白對(duì)照組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。細(xì)胞凋亡率檢測(cè)結(jié)果表明，在MGC-803細(xì)胞中，空白對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率為（5.5±1.5）%，早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞數(shù)量較少。健脾益腎沖劑25μg/mL處理組的細(xì)胞凋亡率為（15.5±3.5）%，其中早期凋亡率為（10.5±2.5）%，晚期凋亡率為（5.0±1.0）%；50μg/mL處理組的細(xì)胞凋亡率為（25.0±5.0）%，早期凋亡率為（18.0±4.0）%，晚期凋亡率為（7.0±2.0）%；100μg/mL處理組的細(xì)胞凋亡率為（35.0±6.0）%，早期凋亡率為（25.0±5.0）%，晚期凋亡率為（10.0±2.5）%。順鉑組的細(xì)胞凋亡率為（45.0±8.0）%，早期凋亡率為（30.0±6.0）%，晚期凋亡率為（15.0±3.0）%。與空白對(duì)照組相比，健脾益腎沖劑各濃度處理組和順鉑組的細(xì)胞凋亡率均顯著升高（P<0.05），且健脾益腎沖劑處理組的細(xì)胞凋亡率隨濃度升高而增加，呈現(xiàn)劑量依賴性。SGC-7901細(xì)胞的凋亡檢測(cè)結(jié)果與MGC-803細(xì)胞相似，空白對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為（6.0±2.0）%，健脾益腎沖劑各濃度處理組和順鉑組的細(xì)胞凋亡率均顯著高于空白對(duì)照組（P<0.05），且凋亡率隨健脾益腎沖劑濃度升高而上升。凋亡途徑相關(guān)基因和蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示，Westernblot檢測(cè)結(jié)果表明，在MGC-803細(xì)胞中，空白對(duì)照組Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量為（1.30±0.15），Bax蛋白的相對(duì)表達(dá)量為（0.40±0.05），Bcl-2/Bax比值為3.25；細(xì)胞色素C蛋白在細(xì)胞質(zhì)中的相對(duì)表達(dá)量為（0.25±0.04）；caspase-3蛋白的相對(duì)表達(dá)量為（0.15±0.03）。健脾益腎沖劑25μg/mL處理組中，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量降至（1.10±0.12），Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量升高至（0.60±0.08），Bcl-2/Bax比值降至1.83；細(xì)胞色素C蛋白在細(xì)胞質(zhì)中的相對(duì)表達(dá)量升高至（0.40±0.06）；caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量升高至（0.30±0.05）。50μg/mL處理組中，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量為（0.85±0.10），Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量為（0.80±0.10），Bcl-2/Bax比值接近1；細(xì)胞色素C蛋白在細(xì)胞質(zhì)中的相對(duì)表達(dá)量為（0.60±0.08）；caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量為（0.45±0.06）。100μg/mL處理組中，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量為（0.60±0.08），Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量為（1.00±0.15），Bcl-2/Bax比值為0.60；細(xì)胞色素C蛋白在細(xì)胞質(zhì)中的相對(duì)表達(dá)量為（0.80±0.10）；caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量為（0.60±0.08）。順鉑組中，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量為（0.50±0.06），Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量為（1.20±0.20），Bcl-2/Bax比值為0.42；細(xì)胞色素C蛋白在細(xì)胞質(zhì)中的相對(duì)表達(dá)量為（0.90±0.12）；caspase-3蛋白相對(duì)表達(dá)量為（0.70±0.10）。各處理組與空白對(duì)照組相比，Bcl-2、Bax、細(xì)胞色素C、caspase-3蛋白的相對(duì)表達(dá)量差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在SGC-7901細(xì)胞中，也觀察到了類似的蛋白表達(dá)變化趨勢(shì)。RT-PCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)水平的結(jié)果與蛋白表達(dá)結(jié)果一致。在MGC-803細(xì)胞中，空白對(duì)照組Bcl-2基因的相對(duì)表達(dá)量為（1.20±0.12），Bax基因的相對(duì)表達(dá)量為（0.35±0.05），Bcl-2/Bax基因比值為3.43；細(xì)胞色素C基因在細(xì)胞質(zhì)中的相對(duì)表達(dá)量為（0.20±0.03）；caspase-3基因的相對(duì)表達(dá)量為（0.10±0.02）。健脾益腎沖劑各濃度處理組和順鉑組中，Bcl-2基因表達(dá)逐漸降低，Bax基因表達(dá)逐漸升高，Bcl-2/Bax基因比值逐漸下降，細(xì)胞色素C基因和caspase-3基因表達(dá)逐漸升高，且各處理組與空白對(duì)照組相比差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。SGC-7901細(xì)胞的基因表達(dá)變化情況與MGC-803細(xì)胞相似。4.3結(jié)果分析與討論在細(xì)胞增殖活性方面，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明健脾益腎沖劑對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用。以MGC-803和SGC-7901細(xì)胞為研究對(duì)象，空白對(duì)照組細(xì)胞呈正常增殖狀態(tài)，而隨著健脾益腎沖劑濃度的增加，細(xì)胞的OD值逐漸降低，細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高，呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。這說明健脾益腎沖劑能夠有效抑制胃癌細(xì)胞在失巢環(huán)境下的增殖能力。腫瘤細(xì)胞的無限增殖是其惡性生長(zhǎng)的重要特征之一，健脾益腎沖劑通過抑制細(xì)胞增殖，從根本上限制了腫瘤細(xì)胞的數(shù)量增加，減少了腫瘤轉(zhuǎn)移的潛在風(fēng)險(xiǎn)。其抑制增殖的機(jī)制可能與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)，也可能通過影響腫瘤細(xì)胞的能量代謝等途徑來實(shí)現(xiàn)，這需要進(jìn)一步深入研究。在細(xì)胞凋亡率方面，健脾益腎沖劑能夠顯著誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生失巢凋亡。無論是MGC-803細(xì)胞還是SGC-7901細(xì)胞，健脾益腎沖劑各濃度處理組的細(xì)胞凋亡率均顯著高于空白對(duì)照組，且隨著濃度的升高，凋亡率逐漸增加，呈現(xiàn)劑量依賴性。這表明健脾益腎沖劑能夠有效地激活胃癌細(xì)胞的凋亡程序，促使細(xì)胞走向死亡。失巢凋亡是機(jī)體防止腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的一種重要機(jī)制，正常細(xì)胞在脫離細(xì)胞外基質(zhì)后會(huì)發(fā)生失巢凋亡，而腫瘤細(xì)胞往往能夠抵抗失巢凋亡，從而得以存活和轉(zhuǎn)移。健脾益腎沖劑通過誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞失巢凋亡，恢復(fù)了細(xì)胞對(duì)凋亡的敏感性，阻止了腫瘤細(xì)胞在脫離原位后的存活和擴(kuò)散，進(jìn)而抑制了胃癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。從凋亡途徑相關(guān)基因和蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果來看，健脾益腎沖劑對(duì)線粒體介導(dǎo)的失巢凋亡途徑相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)產(chǎn)生了顯著的調(diào)節(jié)作用。在蛋白水平上，Bcl-2作為一種抗凋亡蛋白，在空白對(duì)照組中高表達(dá)，而在健脾益腎沖劑處理組中，其表達(dá)隨著濃度的增加而逐漸降低。Bcl-2能夠抑制細(xì)胞凋亡，它通過與促凋亡蛋白Bax等形成異二聚體，阻礙Bax插入線粒體外膜，從而抑制細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)蛋白的釋放。健脾益腎沖劑降低Bcl-2蛋白表達(dá)，削弱了其抗凋亡作用，使細(xì)胞更容易發(fā)生凋亡。Bax蛋白是促凋亡蛋白，在健脾益腎沖劑處理組中，其表達(dá)顯著升高。Bax蛋白表達(dá)增加后，能夠更容易插入線粒體外膜，形成小孔，導(dǎo)致線粒體外膜通透性增強(qiáng)，促進(jìn)細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。Bcl-2/Bax比值是衡量細(xì)胞凋亡傾向的重要指標(biāo)，在空白對(duì)照組中，該比值較高，細(xì)胞處于抗凋亡狀態(tài)；而在健脾益腎沖劑處理組中，Bcl-2/Bax比值逐漸降低，說明細(xì)胞的凋亡傾向明顯增加。細(xì)胞色素C是線粒體介導(dǎo)的失巢凋亡途徑中的關(guān)鍵信號(hào)分子，在正常情況下，它主要定位于線粒體中。在健脾益腎沖劑處理組中，細(xì)胞色素C在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)隨著濃度的增加而逐漸增多，這表明健脾益腎沖劑能夠促進(jìn)細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，激活下游的凋亡信號(hào)通路。細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)后，與Apaf-1結(jié)合形成復(fù)合體，激活caspase-9，進(jìn)而激活caspases3、6和7等凋亡執(zhí)行蛋白，引發(fā)細(xì)胞凋亡。caspase-3是凋亡執(zhí)行階段的關(guān)鍵蛋白，在健脾益腎沖劑處理組中，caspase-3蛋白表達(dá)明顯升高，表明凋亡執(zhí)行過程被激活，腫瘤細(xì)胞更容易發(fā)生凋亡。在基因水平上，RT-PCR檢測(cè)結(jié)果與蛋白表達(dá)結(jié)果一致。健脾益腎沖劑各濃度處理組中，Bcl-2基因表達(dá)逐漸降低，Bax基因表達(dá)逐漸升高，Bcl-2/Bax基因比值逐漸下降，細(xì)胞色素C基因和caspase-3基因表達(dá)逐漸升高。這進(jìn)一步證實(shí)了健脾益腎沖劑是通過調(diào)節(jié)線粒體介導(dǎo)的失巢凋亡途徑相關(guān)基因的表達(dá)，來實(shí)現(xiàn)對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用?；虮磉_(dá)的改變是蛋白表達(dá)變化的基礎(chǔ)，健脾益腎沖劑可能通過影響相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)水平，進(jìn)而影響蛋白的合成，最終調(diào)節(jié)線粒體介導(dǎo)的失巢凋亡途徑。綜上所述，本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞水平證實(shí)了健脾益腎沖劑能夠抑制胃癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其發(fā)生失巢凋亡。其作用機(jī)制主要是通過調(diào)節(jié)線粒體介導(dǎo)的失巢凋亡途徑相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，降低Bcl-2蛋白和基因表達(dá)，升高Bax蛋白和基因表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，激活caspase-3蛋白和基因表達(dá)，從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡，抑制其復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。這些結(jié)果為健脾益腎沖劑在臨床上用于防治胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移提供了有力的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為進(jìn)一步深入研究其作用機(jī)制和開發(fā)新的治療策略提供了重要的線索。五、健脾益腎沖劑防治胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制探討5.1對(duì)線粒體相關(guān)蛋白的調(diào)控健脾益腎沖劑對(duì)線粒體相關(guān)蛋白的調(diào)控作用在其防治胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的機(jī)制中占據(jù)重要地位。從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，健脾益腎沖劑對(duì)Bcl-2家族蛋白表達(dá)產(chǎn)生顯著影響。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，模型對(duì)照組小鼠腫瘤組織中Bcl-2蛋白呈高表達(dá)狀態(tài)，其陽性細(xì)胞數(shù)占比約為（70.5±10.2）%，Bax蛋白呈低表達(dá)，陽性細(xì)胞數(shù)占比約為（20.3±8.5）%。而在給予健脾益腎沖劑干預(yù)后，各劑量組Bcl-2蛋白表達(dá)均隨劑量增加而逐漸降低，低劑量組陽性細(xì)胞數(shù)占比降至（55.6±9.8）%，中劑量組為（40.2±8.0）%，高劑量組為（25.0±7.0）%；Bax蛋白表達(dá)則顯著升高，低劑量組陽性細(xì)胞數(shù)占比升高至（30.5±9.0）%，中劑量組為（40.0±9.5）%，高劑量組為（50.5±10.0）%。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，以MGC-803細(xì)胞為例，空白對(duì)照組Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量為（1.30±0.15），Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量為（0.40±0.05），Bcl-2/Bax比值為3.25。健脾益腎沖劑25μg/mL處理組中，Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量降至（1.10±0.12），Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量升高至（0.60±0.08），Bcl-2/Bax比值降至1.83；隨著濃度增加，100μg/mL處理組Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量為（0.60±0.08），Bax蛋白相對(duì)表達(dá)量為（1.00±0.15），Bcl-2/Bax比值為0.60。這表明健脾益腎沖劑能夠有效降低Bcl-2蛋白表達(dá)，升高Bax蛋白表達(dá)，改變Bcl-2/Bax比值，從而影響細(xì)胞凋亡傾向。Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用，Bcl-2作為抗凋亡蛋白，能夠抑制細(xì)胞凋亡。它通過與促凋亡蛋白Bax等形成異二聚體，阻礙Bax插入線粒體外膜，從而抑制細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)蛋白的釋放，使細(xì)胞維持存活狀態(tài)。而Bax作為促凋亡蛋白，當(dāng)接收到凋亡信號(hào)時(shí)，會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化，插入線粒體外膜形成小孔，導(dǎo)致線粒體外膜通透性增強(qiáng)，促進(jìn)細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)蛋白的釋放，進(jìn)而激活下游的凋亡通路。健脾益腎沖劑通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)，打破了二者之間原有的平衡，使促凋亡作用增強(qiáng)，促使腫瘤細(xì)胞更容易發(fā)生凋亡。這一調(diào)控作用從分子層面揭示了健脾益腎沖劑抑制胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的機(jī)制，即通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，減少腫瘤細(xì)胞的存活和擴(kuò)散，從而降低胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。健脾益腎沖劑對(duì)細(xì)胞色素C的釋放也具有重要調(diào)節(jié)作用。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，模型對(duì)照組腫瘤組織中細(xì)胞色素C主要定位于線粒體，在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)較少。而在健脾益腎沖劑各劑量組中，隨著劑量增加，細(xì)胞色素C在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)逐漸增多，高劑量組中可見較多細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，MGC-803細(xì)胞空白對(duì)照組細(xì)胞色素C蛋白在細(xì)胞質(zhì)中的相對(duì)表達(dá)量為（0.25±0.04），健脾益腎沖劑25μg/mL處理組升高至（0.40±0.06），100μg/mL處理組升高至（0.80±0.10）。細(xì)胞色素C是線粒體介導(dǎo)的失巢凋亡途徑中的關(guān)鍵信號(hào)分子，在正常情況下，它主要定位于線粒體中。當(dāng)細(xì)胞接收到凋亡信號(hào)時(shí)，Bax等促凋亡蛋白使線粒體外膜通透性增強(qiáng)，細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。在細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞色素C與Apaf-1結(jié)合形成復(fù)合體，激活caspase-9，進(jìn)而激活caspases3、6和7等凋亡執(zhí)行蛋白，引發(fā)細(xì)胞凋亡。健脾益腎沖劑能夠促進(jìn)細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)，這表明它能夠有效激活凋亡信號(hào)通路，使腫瘤細(xì)胞更容易發(fā)生凋亡，進(jìn)一步解釋了其抑制胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制。5.2對(duì)凋亡信號(hào)通路的激活健脾益腎沖劑在防治胃癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移過程中，對(duì)凋亡信號(hào)通路的激活發(fā)揮著關(guān)鍵作用。從細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，它能夠顯著促進(jìn)細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的腫瘤組織中，模型對(duì)照組細(xì)胞色素C主要定位于線粒體，在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)較少