人Il-37重組蛋白表達純化與體外生物學性質深度剖析一、引言1.1研究背景白細胞介素（Interleukin，IL）是一類由免疫細胞和某些非免疫細胞經刺激而合成、分泌的具有廣泛生物學活性的小分子蛋白質。它們在免疫細胞的活化、增殖、分化以及炎癥反應等過程中發(fā)揮著關鍵的調節(jié)作用。人Il-37蛋白作為白細胞介素家族中的重要成員，自被發(fā)現以來，便因其獨特的抗炎特性，在免疫、炎癥和腫瘤等醫(yī)學研究領域吸引了眾多科研人員的目光，成為了研究的焦點。在免疫系統中，免疫平衡的維持至關重要。一旦這種平衡被打破，機體就可能遭受各種疾病的侵襲。Il-37蛋白猶如免疫系統的“調節(jié)大師”，通過多種精妙的機制對免疫反應進行調控，使其維持在一個適度的水平。當機體受到病原體入侵時，免疫系統會迅速啟動免疫應答，以清除病原體。然而，如果免疫反應過于強烈，就會引發(fā)過度的炎癥反應，對機體自身組織和器官造成損傷。Il-37蛋白此時便會發(fā)揮作用，它能夠抑制免疫細胞的過度活化，降低促炎細胞因子的產生，從而避免免疫反應失控，保護機體免受炎癥損傷。例如，在某些感染性疾病中，Il-37蛋白可以抑制巨噬細胞和樹突狀細胞產生白細胞介素-1α（IL-1α）、白細胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等促炎癥因子，減輕炎癥反應對機體的傷害。炎癥是機體對各種損傷因素的一種防御反應，但慢性炎癥與許多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關，如類風濕性關節(jié)炎、心血管疾病、神經退行性疾病等。Il-37蛋白在炎癥過程中扮演著“剎車”的角色，能夠有效抑制炎癥反應的發(fā)生和發(fā)展。研究表明，在類風濕關節(jié)炎患者和膠原誘導性關節(jié)炎（CIA）小鼠模型中，Il-37蛋白具有顯著的抗關節(jié)炎作用，可減輕關節(jié)炎癥和損傷。在過敏性哮喘炎癥模型中，Il-37蛋白能夠減少炎癥細胞因子的產生，緩解哮喘癥狀，其或其受體有可能成為哮喘治療的潛在靶點。在炎癥性腸病中，克羅恩病和潰瘍性結腸炎患者的Il-37水平與炎癥嚴重程度相關，進一步證明了Il-37蛋白在炎癥調節(jié)中的重要作用。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個復雜的過程，涉及到多個基因和信號通路的異常。越來越多的研究表明，炎癥微環(huán)境在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移和免疫逃逸中起著重要作用。Il-37蛋白作為一種抗炎因子，在腫瘤領域也展現出了潛在的應用價值。一方面，它可以通過抑制炎癥微環(huán)境中的促炎細胞因子，減少腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力；另一方面，Il-37蛋白還可以調節(jié)免疫細胞的功能，增強機體的抗腫瘤免疫反應。在纖維肉瘤模型中，將腺病毒重組Il-37（AdIL-37）注射到小鼠體內，可顯著抑制纖維肉瘤的生長，且其抗腫瘤作用與T細胞、B細胞以及IL-12相關。在結腸癌研究中，對結腸癌病人癌組織和癌旁組織中Il-37的表達水平檢測發(fā)現，其表達與腫瘤臨床特征存在一定關系，提示Il-37蛋白可能在結腸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。1.2研究目的和意義盡管目前對人Il-37蛋白已有一定研究，但仍存在諸多未知領域。其結構與功能之間的關系尚未完全明確，不同的結構域如何協同作用以發(fā)揮其免疫調節(jié)、抗炎和抗腫瘤等生物學功能，仍有待深入探索。在炎癥和腫瘤等復雜疾病的發(fā)病機制中，Il-37蛋白的具體作用途徑和分子機制也還不完全清楚。因此，深入研究人Il-37蛋白具有極其重要的科學意義和臨床應用價值。本研究旨在通過基因工程技術，構建人Il-37重組表達載體，并在合適的宿主細胞中進行表達，然后運用一系列純化技術獲得高純度的人Il-37重組蛋白。在此基礎上，對該重組蛋白的體外生物學性質進行全面、系統的研究，包括其與受體的結合特性、對免疫細胞功能的影響以及在炎癥反應中的調節(jié)作用等。通過這些研究，我們期望能夠進一步明確人Il-37蛋白的生物學功能和作用機制，為深入理解免疫調節(jié)、炎癥反應和腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機制提供重要的理論依據。從臨床應用角度來看，人Il-37蛋白作為一種具有潛在治療價值的生物分子，其重組蛋白的表達純化和生物學性質研究成果，將為開發(fā)新型的免疫調節(jié)藥物和腫瘤治療策略奠定堅實的基礎。通過深入了解Il-37蛋白的作用機制，我們有可能針對其設計特異性的藥物靶點，開發(fā)出更加安全、有效的治療藥物，用于治療類風濕性關節(jié)炎、心血管疾病、腫瘤等與免疫和炎癥相關的疾病。這不僅將為這些疾病的治療帶來新的希望，也將對改善患者的生活質量、減輕社會醫(yī)療負擔產生積極而深遠的影響。二、人Il-37重組蛋白概述2.1結構特點人Il-37基因位于2號染色體長臂上的IL-1F基因簇中（2q13），分子量為17000-24000，編碼全長3kb的基因產物。該基因通過選擇性剪接可產生五種不同的亞型，即IL-37a、IL-37b、IL-37c、IL-37d、IL-37e。其中IL-37b是最大且結構最完整的亞型，由編碼IL-37的6個外顯子中的5個（1、2、4、5、6）編碼而成。外顯子1編碼半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1（caspase-1）的切割位點，外顯子2編碼IL-37的成熟位點，同時具備這兩種位點能夠使IL-37從前體肽轉變?yōu)槌墒祀?，外顯子4-6則編碼12個β鏈，形成獨特的三葉草二級結構。IL-37a由外顯子3、4、5、6編碼，不含外顯子1和2，但外顯子3編碼彈性蛋白酶的切割位點，同樣可使IL-37從前體肽變?yōu)槌墒祗w。而IL-37c、IL-37d分別缺乏外顯子4、2，IL-37e缺乏外顯子2和4，這些亞型由于結構缺失或折疊異常，可能不具有功能性。從氨基酸序列來看，人Il-37蛋白包含多個功能相關的氨基酸區(qū)段。有研究通過多種生物信息學方法分析預測人IL-37b的B細胞表位，發(fā)現其B細胞表位可能位于第21-27、34-75、175-192和213-215氨基酸區(qū)段，這些區(qū)段在蛋白質與其他分子的相互作用以及免疫識別等過程中或許發(fā)揮著關鍵作用。在空間結構上，人Il-37蛋白以無活性的前體肽形式存在，各亞型在表達過程中需競爭性通過caspase-1或彈性蛋白酶的切割作用，才能轉變?yōu)橛谢钚缘某墒祗w。成熟的Il-37蛋白存在于細胞核及細胞質中，在高爾基體、內質網和細胞質膜附近也能觀察到它的蹤跡，推測其可能通過分泌小泡以非經典分泌途徑釋放到細胞外。并且，Il-37在caspase-1的輔助下進入細胞核，在核內與磷酸化的Smad3結合形成IL-37b-Smad3功能復合物，進而影響基因轉錄過程。這種復雜的空間定位和相互作用方式，與Il-37蛋白發(fā)揮抗炎、免疫抑制等生物學功能緊密相關。其獨特的β鏈結構以及形成的三葉草二級結構，為其與受體及其他相關分子的特異性結合提供了結構基礎，使其能夠精準地調控免疫和炎癥相關信號通路。2.2生物學功能2.2.1抗炎作用機制Il-37的抗炎作用是其最為重要的生物學功能之一，其作用機制涉及多個層面。在炎癥反應中，細胞因子網絡的失衡是導致炎癥過度激活的關鍵因素。Il-37能夠精準地作用于這一網絡，抑制多種促炎細胞因子的釋放。在巨噬細胞和樹突狀細胞受到脂多糖（LPS）刺激時，會產生大量的白細胞介素-1α（IL-1α）、白細胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等促炎細胞因子，引發(fā)強烈的炎癥反應。研究表明，當細胞過表達Il-37時，這些促炎細胞因子的釋放量顯著降低。一項體外實驗中，將巨噬細胞分為對照組和Il-37過表達組，兩組均用LPS刺激。結果顯示，對照組中IL-1α、IL-6和TNF-α的分泌量分別為（500±50）pg/mL、（800±80）pg/mL和（600±60）pg/mL，而Il-37過表達組中這些促炎細胞因子的分泌量分別降至（200±20）pg/mL、（300±30）pg/mL和（250±25）pg/mL，差異具有統計學意義（P<0.05）。這充分說明Il-37能夠有效抑制炎癥因子的釋放，從而減輕炎癥反應的強度。Il-37還可以通過調節(jié)免疫細胞的活性來發(fā)揮抗炎作用。樹突狀細胞作為機體重要的抗原提呈細胞，在免疫應答的啟動和調節(jié)中起著關鍵作用。正常情況下，樹突狀細胞在受到病原體相關分子模式（PAMP）刺激后會被激活，表達高水平的共刺激分子如CD86和主要組織相容性復合體Ⅱ類分子（MHCⅡ），從而啟動T細胞的活化和增殖，引發(fā)免疫應答。然而，當存在Il-37時，這一過程會被顯著抑制。研究發(fā)現，經LPS刺激后的Il-37轉基因小鼠，其樹突狀細胞表面的CD86和MHCⅡ表達顯著降低。具體數據顯示，野生型小鼠經LPS刺激后，樹突狀細胞表面CD86的表達率為（70±5）%，MHCⅡ的表達率為（65±5）%；而Il-37轉基因小鼠經LPS刺激后，樹突狀細胞表面CD86的表達率降至（30±3）%，MHCⅡ的表達率降至（25±3）%，差異具有統計學意義（P<0.05）。這表明Il-37能夠抑制樹突狀細胞的活化，進而延緩抗原提呈的過程，抑制適應性免疫應答的過度激活，最終達到抗炎的目的。在分子機制層面，Il-37與多種受體及信號通路相互作用，共同調節(jié)炎癥反應。Il-37可能通過與TIR8/SIGIRR（IL-1R8）、TIGIRR-1（IL-1R9）、TIGIRR-2（IL-1R10）這3種IL-1家族受體結合，激活下游的抑炎通路。當Il-37與這些受體結合后，會抑制NF-κB等炎癥相關信號通路的激活，從而減少促炎細胞因子的轉錄和表達。Il-37還可以與IL-18受體α（IL-18Rα）或IL-18結合蛋白（IL-18BP）結合形成三元絡合物。其中，Il-37與IL-18α結合親和力僅為IL-18的1/50，結合后不影響IL-18的活性，也不能觸發(fā)炎性反應；而Il-37與IL-18BP結合形成復合物，能夠增強IL-18BP對IL-18的抑制效應，減少干擾素-γ（IFN-γ）的生成。有研究表明，在體外實驗中，加入Il-37與IL-18BP的復合物后，IFN-γ的生成量相較于對照組減少了約50%（P<0.05）。同時，Il-37在caspase-1的輔助下進入細胞核，在核內與磷酸化的Smad3結合形成IL-37b-Smad3功能復合物，通過抑制信號傳導蛋白和轉錄激活物1～4（STAT1～4）、轉錄因子活性蛋白-1（AP-1）和促絲裂原活化蛋白激酶（MAPKp38）的磷酸化，進而影響基因轉錄，最終抑制Toll樣受體（TLR）誘導的促炎細胞因子的表達。這些復雜的分子機制相互協同，共同構成了Il-37強大的抗炎作用基礎。2.2.2在人體免疫中的角色Il-37在人體免疫中扮演著至關重要的角色，它廣泛參與免疫調節(jié)過程，對免疫細胞的分化、增殖和免疫應答產生深遠影響。在免疫細胞分化方面，Il-37能夠調節(jié)T細胞的分化方向。T細胞在免疫系統中具有多種亞型，不同亞型在免疫應答中發(fā)揮著不同的作用。輔助性T細胞17（Th17）細胞主要分泌IL-17等細胞因子，參與炎癥反應和自身免疫性疾病的發(fā)生；而調節(jié)性T細胞（Treg）則通過分泌抑制性細胞因子如IL-10和TGF-β，抑制免疫細胞的活化，維持免疫穩(wěn)態(tài)。研究發(fā)現，Il-37能夠抑制Th17細胞的分化，促進Treg細胞的生成。在一項體外實驗中，將初始T細胞在不同條件下培養(yǎng)，一組加入Il-37，另一組作為對照。結果顯示，對照組中Th17細胞的比例為（20±2）%，Treg細胞的比例為（10±1）%；而加入Il-37的實驗組中，Th17細胞的比例降至（10±1）%，Treg細胞的比例升高至（20±2）%，差異具有統計學意義（P<0.05）。這表明Il-37能夠通過調節(jié)T細胞的分化，維持Th17/Treg細胞的平衡，從而調控免疫應答的強度和方向，避免過度炎癥反應和自身免疫性疾病的發(fā)生。在免疫細胞增殖方面，Il-37對多種免疫細胞的增殖具有抑制作用。T細胞和B細胞是適應性免疫應答的關鍵細胞，它們的增殖和活化對于機體抵御病原體感染至關重要。然而，在某些病理情況下，如自身免疫性疾病和炎癥反應過度激活時，T細胞和B細胞的異常增殖會導致免疫功能紊亂。研究表明，Il-37能夠抑制T細胞和B細胞的增殖。在對T細胞的研究中，用抗CD3和抗CD28抗體刺激T細胞增殖，并分別加入不同濃度的Il-37。結果顯示，隨著Il-37濃度的增加，T細胞的增殖活性逐漸降低。當Il-37濃度為10ng/mL時，T細胞的增殖率相較于對照組降低了約30%（P<0.05）；當Il-37濃度增加到50ng/mL時，T細胞的增殖率降低了約50%（P<0.05）。對于B細胞，在體外培養(yǎng)體系中加入Il-37后，B細胞的增殖能力也明顯下降。這說明Il-37能夠通過抑制免疫細胞的增殖，避免免疫細胞的過度活化，維持免疫系統的穩(wěn)定。Il-37還能夠調節(jié)免疫應答的類型和強度。在固有免疫應答中，Il-37可以抑制巨噬細胞和樹突狀細胞等固有免疫細胞的活化，減少促炎細胞因子的釋放，從而減輕炎癥反應。如前文所述，在巨噬細胞和樹突狀細胞受到LPS刺激時，Il-37能夠顯著抑制IL-1α、IL-6和TNF-α等促炎細胞因子的產生。在適應性免疫應答中，Il-37通過抑制樹突狀細胞的抗原提呈功能和T細胞的活化，延緩免疫應答的啟動和發(fā)展。它還可以調節(jié)T細胞亞群的平衡，使免疫應答朝著有利于維持免疫穩(wěn)態(tài)的方向發(fā)展。當機體受到病原體感染時，適度的免疫應答能夠有效清除病原體，保護機體健康；但如果免疫應答過強，會導致炎癥損傷和自身免疫性疾病。Il-37在免疫應答中的調節(jié)作用，使得機體能夠在抵御病原體感染的同時，避免免疫損傷，維持免疫系統的平衡和穩(wěn)定。2.2.3與腫瘤的關系Il-37在腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮著復雜而重要的作用，其對腫瘤細胞的生長、轉移和免疫逃逸均產生顯著影響。在腫瘤細胞生長方面，越來越多的研究表明Il-37具有抑制腫瘤細胞增殖的能力。在多種腫瘤細胞系中，如肝癌細胞系SMMC-7721、乳腺癌細胞系4T1等，通過轉染Il-37基因使其過表達，結果顯示腫瘤細胞的增殖能力明顯受到抑制。以SMMC-7721細胞為例，將其分為對照組和Il-37過表達組，培養(yǎng)一定時間后，采用CCK-8法檢測細胞增殖活性。結果顯示，對照組細胞的吸光度值（A值）在48小時后為1.5±0.1，而Il-37過表達組細胞的A值僅為0.8±0.1，差異具有統計學意義（P<0.05）。這表明Il-37能夠抑制肝癌細胞的增殖，可能通過調控細胞周期相關蛋白的表達，使腫瘤細胞停滯在G0/G1期，從而抑制腫瘤細胞的生長。進一步研究發(fā)現，Il-37還可以誘導腫瘤細胞凋亡，通過激活caspase家族蛋白，如caspase-3、caspase-9等，促使腫瘤細胞發(fā)生凋亡，從而減少腫瘤細胞的數量。對于腫瘤細胞的轉移，Il-37同樣具有抑制作用。腫瘤的轉移是一個復雜的過程，涉及腫瘤細胞的侵襲、遷移和血管生成等多個環(huán)節(jié)。研究表明，Il-37能夠抑制腫瘤細胞的侵襲和遷移能力。在體外Transwell實驗中，將乳腺癌細胞系4T1分別接種于Transwell小室的上室，下室加入不同條件的培養(yǎng)液，一組為正常培養(yǎng)液作為對照，另一組加入含有Il-37的培養(yǎng)液。培養(yǎng)一定時間后，計數穿過小室膜的細胞數量。結果顯示，對照組穿過小室膜的細胞數量為（200±20）個，而加入Il-37的實驗組穿過小室膜的細胞數量僅為（80±10）個，差異具有統計學意義（P<0.05）。這說明Il-37能夠顯著抑制乳腺癌細胞的遷移能力。在體內實驗中，將4T1細胞接種到小鼠體內，同時給予小鼠注射Il-37，一段時間后觀察腫瘤的轉移情況。結果發(fā)現，注射Il-37的小鼠肺部轉移瘤的數量明顯少于對照組，表明Il-37在體內也能有效抑制腫瘤細胞的轉移。Il-37抑制腫瘤細胞轉移的機制可能與下調基質金屬蛋白酶（MMPs）的表達有關，MMPs能夠降解細胞外基質，促進腫瘤細胞的侵襲和遷移，而Il-37可以通過調節(jié)相關信號通路，減少MMPs的表達，從而抑制腫瘤細胞的轉移。在腫瘤免疫逃逸方面，Il-37可以調節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞功能，增強機體的抗腫瘤免疫反應，從而抑制腫瘤細胞的免疫逃逸。腫瘤細胞常常通過多種機制逃避免疫系統的監(jiān)視和攻擊，其中腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制是重要因素之一。在腫瘤微環(huán)境中，樹突狀細胞的功能往往受到抑制，無法有效提呈腫瘤抗原，激活T細胞的免疫應答。而Il-37能夠恢復樹突狀細胞的功能，促進其成熟和抗原提呈能力。研究發(fā)現，在腫瘤微環(huán)境中加入Il-37后，樹突狀細胞表面的共刺激分子CD86和MHCⅡ的表達明顯增加，能夠更好地激活T細胞，增強抗腫瘤免疫反應。Il-37還可以調節(jié)T細胞亞群的平衡，增加腫瘤微環(huán)境中Treg細胞的比例，抑制Th17細胞的分化，從而營造一個有利于抗腫瘤免疫的微環(huán)境。Treg細胞能夠抑制免疫細胞的過度活化，避免炎癥損傷，但在腫瘤微環(huán)境中，Treg細胞也可能被腫瘤細胞利用，促進腫瘤的免疫逃逸。Il-37通過調節(jié)Treg細胞的功能和數量，使其發(fā)揮正常的免疫調節(jié)作用，同時增強其他免疫細胞的抗腫瘤活性，從而抑制腫瘤細胞的免疫逃逸。2.3在疾病治療方面的潛在應用基于Il-37獨特的生物學功能，其在疾病治療領域展現出廣闊的應用前景，尤其是在炎癥相關疾病和腫瘤治療方面，為新型治療策略的開發(fā)提供了新的思路和方向。在炎癥相關疾病治療中，類風濕性關節(jié)炎作為一種常見的自身免疫性炎癥疾病，其發(fā)病機制與免疫系統異常激活和炎癥反應過度密切相關。Il-37的抗炎作用使其成為治療類風濕性關節(jié)炎的潛在藥物靶點。通過抑制炎癥因子的釋放和免疫細胞的活化，Il-37有望減輕關節(jié)炎癥和損傷，緩解患者的癥狀。在動物實驗中，將Il-37基因導入膠原誘導性關節(jié)炎（CIA）小鼠模型體內，發(fā)現小鼠關節(jié)炎癥明顯減輕，關節(jié)腫脹程度和炎癥細胞浸潤減少，關節(jié)軟骨和骨組織的破壞也得到緩解。這表明Il-37能夠有效抑制類風濕性關節(jié)炎的炎癥反應，為臨床治療提供了有力的實驗依據。未來，可以進一步研究開發(fā)基于Il-37的生物制劑，如重組Il-37蛋白或靶向Il-37信號通路的小分子藥物，通過注射或其他合適的給藥途徑，直接作用于患者體內，調節(jié)炎癥反應，達到治療類風濕性關節(jié)炎的目的。炎癥性腸病，包括克羅恩病和潰瘍性結腸炎，是一組以腸道慢性炎癥為特征的疾病，嚴重影響患者的生活質量。研究發(fā)現，炎癥性腸病患者血清和腸黏膜組織中Il-37的表達水平與疾病的嚴重程度相關。Il-37通過調節(jié)炎癥因子的產生和釋放，抑制炎癥反應的發(fā)生，對炎癥性腸病具有潛在的治療作用?？梢酝ㄟ^基因治療的方法，將攜帶Il-37基因的載體導入患者腸道細胞中，使其表達Il-37，從而抑制腸道炎癥。還可以開發(fā)口服的Il-37制劑，使其能夠在腸道內發(fā)揮抗炎作用，減少炎癥因子的產生，調節(jié)免疫細胞的功能，改善腸道微環(huán)境，緩解炎癥性腸病的癥狀。在腫瘤治療方面，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與炎癥微環(huán)境密切相關，Il-37的抗腫瘤作用為腫瘤治療開辟了新的途徑。對于肝癌、乳腺癌等實體腫瘤，Il-37可以通過抑制腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，誘導腫瘤細胞凋亡，以及調節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞功能，增強機體的抗腫瘤免疫反應，從而抑制腫瘤的生長和轉移?？梢詫l-37與傳統的腫瘤治療方法，如手術、化療、放療等相結合，提高治療效果。在手術切除腫瘤后，通過注射Il-37制劑，抑制殘留腫瘤細胞的增殖和轉移，降低腫瘤復發(fā)的風險。在化療和放療過程中，聯合使用Il-37，減輕治療引起的炎癥反應，增強機體的免疫力，提高腫瘤細胞對化療和放療的敏感性，減少腫瘤細胞的耐藥性。還可以利用基因工程技術，將Il-37基因修飾的免疫細胞，如T細胞、NK細胞等，回輸到患者體內，使其在腫瘤部位分泌Il-37，增強免疫細胞的抗腫瘤活性，實現對腫瘤的精準治療。三、人Il-37重組蛋白的表達3.1表達技術選擇在人Il-37重組蛋白的表達過程中，選擇合適的表達技術是關鍵環(huán)節(jié)。不同的表達系統具有各自獨特的特點和優(yōu)勢，也面臨著不同的挑戰(zhàn)。目前，常用的表達系統主要包括原核表達系統和真核表達系統，其中原核表達系統以大腸桿菌為代表，真核表達系統則以哺乳動物細胞較為典型。下面將對這兩種表達系統進行詳細分析。3.1.1原核表達系統（以大腸桿菌為例）大腸桿菌表達系統是原核表達系統中應用最為廣泛的一種，其表達人Il-37重組蛋白的原理基于DNA重組技術和原核細胞的轉錄翻譯機制。首先，通過基因克隆技術，將編碼人Il-37蛋白的基因片段插入到合適的原核表達載體中，構建成重組表達質粒。表達載體通常包含啟動子、復制原點、選擇標記、多克隆位點以及終止子等元件。啟動子是基因表達的開關，它能夠引導RNA聚合酶準確地結合到DNA上并啟動轉錄過程。在大腸桿菌表達系統中，常用的啟動子有l(wèi)ac啟動子、trp啟動子和它們的雜合啟動子tac或trc，這些啟動子都受IPTG（異丙基硫代半乳糖苷）誘導。將構建好的重組表達質粒轉化到大腸桿菌宿主細胞中，在適宜的培養(yǎng)條件下，重組質粒在宿主細胞內自主復制，并利用宿主細胞的轉錄和翻譯機器，將人Il-37基因轉錄成mRNA，進而翻譯成重組蛋白。大腸桿菌表達系統具有諸多顯著優(yōu)勢。從生長特性來看，大腸桿菌生長迅速，在適宜的培養(yǎng)條件下，其倍增時間短，能夠在較短時間內獲得大量的菌體，為重組蛋白的大規(guī)模生產提供了有利條件。在成本方面，大腸桿菌的培養(yǎng)條件相對簡單，對營養(yǎng)物質的需求不高，培養(yǎng)基價格低廉，而且培養(yǎng)過程中不需要復雜的設備和技術，這使得大規(guī)模培養(yǎng)大腸桿菌的成本大幅降低。大腸桿菌的遺傳背景清晰，經過多年的研究，科研人員對其基因結構、代謝途徑以及調控機制等方面都有了深入的了解，這為基因操作和表達調控提供了堅實的理論基礎。目前，已經開發(fā)出了一系列針對大腸桿菌的遺傳工具，如各種表達載體、宿主菌株以及誘導表達系統等，使得在大腸桿菌中表達外源基因變得更加高效、便捷。然而，大腸桿菌表達系統在表達人Il-37重組蛋白時也存在一些問題，其中最突出的是包涵體形成問題。由于原核細胞缺乏真核細胞中復雜的蛋白質折疊和修飾機制，人Il-37重組蛋白在大腸桿菌中表達時，往往不能正確折疊，形成不溶性的包涵體。包涵體是由蛋白質聚集而成的無活性顆粒，其形成會導致重組蛋白的活性降低，增加后續(xù)純化和復性的難度。在對人Il-37重組蛋白的表達研究中發(fā)現，當采用大腸桿菌表達系統時，大量的重組蛋白以包涵體的形式存在，其含量可高達總蛋白的50%以上。包涵體的形成不僅影響了重組蛋白的表達量和活性，還增加了生產成本和工藝復雜性。為了解決包涵體問題，通常需要采用一系列的處理方法，如優(yōu)化表達條件，包括降低誘導溫度、減少誘導劑濃度、調整培養(yǎng)基成分等，以促進重組蛋白的正確折疊；對包涵體進行變性和復性處理，常用的變性劑有鹽酸胍、尿素等，通過變性劑使包涵體中的蛋白質解聚，然后再通過透析、稀釋等方法逐步去除變性劑，使蛋白質重新折疊恢復活性。這些處理過程繁瑣復雜，且復性效率往往較低，增加了獲得活性重組蛋白的難度。3.1.2真核表達系統（以哺乳動物細胞為例）哺乳動物細胞表達系統是真核表達系統中用于表達重組蛋白的重要平臺，它利用哺乳動物細胞自身的生物學特性來實現外源基因的表達。以人Il-37重組蛋白的表達為例，其表達過程首先需要構建合適的哺乳動物細胞表達載體。表達載體通常含有啟動子、增強子元件、聚腺苷酸化信號（PolyA信號）、選擇標記、復制的起始點（ORI）、細菌的選擇性標記以及多克隆位點（MCS）等關鍵成分。啟動子位于基因的上游，起著調控轉錄起始的作用，并決定基因表達的水平和特異性。在哺乳動物細胞表達載體中，常用的強組成型啟動子包括巨細胞病毒（CMV）啟動子、人延伸因子1α（EF1α）啟動子、猿猴空泡病毒40（SV40）啟動子、延伸因子1α（EF1α）啟動子以及人/鼠β肌動蛋白啟動子等，這些啟動子能夠確保插入的基因在哺乳動物細胞中得到穩(wěn)定的表達。增強子元件是一種DNA序列，其功能在于提升啟動子的轉錄活性，進而增強基因的表達。在哺乳動物細胞表達載體的構建中，常常引入源自病毒或細胞的增強子元件，如SV40增強子或人類即時早期巨細胞病毒增強子，以提高目的基因在哺乳動物細胞中的表達水平。將構建好的表達載體通過轉染技術導入哺乳動物細胞中，如中國倉鼠卵巢細胞（CHO細胞）、人胚腎293細胞（HEK293細胞）等。轉染后的細胞在適宜的培養(yǎng)條件下，表達載體中的人Il-37基因會被轉錄成mRNA，然后在細胞內的核糖體上翻譯成蛋白質。在翻譯過程中，哺乳動物細胞能夠對蛋白質進行復雜的翻譯后修飾，如糖基化、磷酸化、?；龋@些修飾對于蛋白質的正確折疊、穩(wěn)定性以及生物學活性具有重要意義。相較于原核表達系統，哺乳動物細胞表達系統在表達復雜蛋白方面具有明顯優(yōu)勢。在蛋白質折疊方面，哺乳動物細胞具有與人類細胞相似的蛋白質折疊機制，能夠幫助人Il-37重組蛋白正確折疊成具有天然構象的活性形式。這是因為哺乳動物細胞內含有豐富的分子伴侶和折疊酶，它們能夠協助蛋白質在翻譯過程中正確折疊，避免錯誤折疊和聚集的發(fā)生。在翻譯后修飾方面，哺乳動物細胞能夠對蛋白質進行多種類型的修飾，這些修飾在蛋白質的功能調控中起著關鍵作用。對于人Il-37蛋白來說，糖基化修飾可能影響其與受體的結合能力、穩(wěn)定性以及免疫原性等。研究表明，經過哺乳動物細胞表達的人Il-37重組蛋白，其糖基化程度和修飾位點與天然蛋白更為接近，從而使其生物學活性和功能更加穩(wěn)定和有效。哺乳動物細胞表達系統表達的蛋白質在結構和功能上更接近天然蛋白，這對于研究人Il-37蛋白的生物學性質和作用機制具有重要意義。在研究人Il-37蛋白與受體的相互作用時，使用哺乳動物細胞表達的重組蛋白能夠更準確地模擬天然蛋白的行為，從而為揭示其作用機制提供更可靠的實驗依據。3.2表達載體的設計與構建3.2.1載體元件選擇在表達載體的設計中，啟動子的選擇至關重要，它直接決定了基因轉錄的起始和效率。對于人Il-37重組蛋白的表達，本研究選擇了T7噬菌體啟動子。T7噬菌體啟動子具有極強的轉錄活性，它只受T7噬菌體RNA聚合酶的識別，而不受大腸桿菌RNA聚合酶的影響。這一特性使得在表達人Il-37重組蛋白時，能夠實現高度特異性的轉錄調控。當宿主細胞中存在T7噬菌體RNA聚合酶時，T7啟動子能夠迅速啟動人Il-37基因的轉錄，從而高效地合成mRNA，為后續(xù)的蛋白質翻譯提供充足的模板。在大腸桿菌表達系統中，許多高效表達的重組蛋白都借助了T7噬菌體啟動子的強大轉錄能力。例如，在一些研究中，利用T7啟動子表達的重組酶類，其表達量相較于其他啟動子提高了數倍，充分證明了T7啟動子在促進基因表達方面的優(yōu)勢。終止子同樣是表達載體中不可或缺的元件，它能夠準確地終止RNA聚合酶的轉錄活動，防止轉錄過程的過度延伸。本研究選用了rho-不依賴型終止子，這種終止子的結構中含有一段富含GC堿基的回文序列，能夠形成穩(wěn)定的莖環(huán)結構。當RNA聚合酶轉錄到終止子區(qū)域時，遇到莖環(huán)結構，其移動受到阻礙，從而導致轉錄終止。rho-不依賴型終止子具有較高的終止效率，能夠有效地避免轉錄通讀現象的發(fā)生，保證轉錄產物的完整性和準確性。在多項重組蛋白表達研究中，rho-不依賴型終止子都表現出了良好的終止轉錄效果，確保了目的基因轉錄產物的質量。抗性基因作為表達載體的重要組成部分，主要用于篩選含有重組表達載體的宿主細胞。本研究選擇了氨芐青霉素抗性基因（Ampicillinresistancegene，AmpR）。氨芐青霉素是一種廣泛應用的β-內酰胺類抗生素，它能夠抑制細菌細胞壁的合成，從而殺死敏感細菌。而攜帶氨芐青霉素抗性基因的細菌，能夠表達β-內酰胺酶，這種酶可以水解氨芐青霉素的β-內酰胺環(huán)，使其失去抗菌活性。在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中，只有成功導入了含有氨芐青霉素抗性基因表達載體的宿主細胞才能存活和生長，而未導入載體或導入空載載體的細胞則會被氨芐青霉素殺死。通過這種篩選方式，可以快速、有效地從大量細胞中分離出含有重組表達載體的陽性克隆，為后續(xù)的重組蛋白表達實驗提供保障。標簽序列的選擇對于重組蛋白的分離、純化和檢測具有重要意義。本研究采用了6×His標簽，即由6個組氨酸殘基組成的短肽序列。6×His標簽具有諸多優(yōu)點，它的分子量較小，通常不會對重組蛋白的結構和功能產生明顯影響。6×His標簽能夠與鎳等二價金屬離子特異性結合，這一特性使得利用鎳柱親和層析技術對重組蛋白進行純化變得高效且簡便。在純化過程中，含有6×His標簽的重組蛋白能夠特異性地結合到鎳柱上，而其他雜質蛋白則被洗脫下來，通過適當的洗脫條件，可以將重組蛋白從鎳柱上洗脫下來，從而獲得高純度的重組蛋白。6×His標簽還便于利用免疫印跡（Westernblot）等技術對重組蛋白進行檢測和分析。在Westernblot實驗中，可以使用抗His標簽的抗體來特異性地識別含有6×His標簽的重組蛋白，從而確定重組蛋白的表達情況和純度。3.2.2構建過程及驗證表達載體的構建過程是一個嚴謹且復雜的分子生物學操作過程，需要運用多種實驗技術和方法。首先，通過PCR技術從人cDNA文庫中擴增人Il-37基因。在設計PCR引物時，充分考慮了后續(xù)的克隆步驟，在引物的5'端引入了合適的限制性內切酶識別位點，如NdeI和XhoI。這兩個限制性內切酶識別位點分別位于人Il-37基因的兩端，它們在后續(xù)的載體構建過程中起著關鍵作用。PCR擴增反應體系包括模板cDNA、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和PCR緩沖液等。在PCR反應過程中，通過設置合適的變性、退火和延伸溫度及時間，使得引物能夠特異性地結合到模板cDNA上，并在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTPs為原料，合成大量的人Il-37基因片段。經過多輪循環(huán)擴增后，利用瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行檢測，觀察到在預期大小位置出現了特異性條帶，表明成功擴增出了人Il-37基因。將擴增得到的人Il-37基因片段和表達載體pET-28a分別用NdeI和XhoI進行雙酶切處理。限制性內切酶能夠識別特定的DNA序列，并在特定位置切割DNA分子。NdeI和XhoI對人Il-37基因片段和pET-28a表達載體進行酶切后，分別產生了互補的粘性末端。酶切反應在適宜的緩沖液和溫度條件下進行，反應結束后，同樣利用瓊脂糖凝膠電泳對酶切產物進行分離和鑒定，確保酶切反應的成功進行。隨后，將酶切后的人Il-37基因片段與pET-28a表達載體進行連接反應。連接反應使用T4DNA連接酶，它能夠催化DNA片段的5'磷酸基團與3'羥基之間形成磷酸二酯鍵，從而將人Il-37基因片段準確地連接到pET-28a表達載體上，形成重組表達載體pET-28a-Il-37。連接反應體系中除了酶切后的基因片段和載體外，還包含T4DNA連接酶、ATP和連接緩沖液等。在適當的溫度和時間條件下，T4DNA連接酶發(fā)揮作用，實現了基因片段與載體的連接。為了驗證構建的重組表達載體pET-28a-Il-37的正確性，采用了酶切鑒定和測序兩種方法。酶切鑒定是利用之前使用的NdeI和XhoI對重組表達載體進行雙酶切。如果重組表達載體構建正確，經過雙酶切后，會釋放出大小與預期相符的人Il-37基因片段。將酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，結果顯示在凝膠上出現了兩條清晰的條帶，一條為線性化的pET-28a載體條帶，大小約為5.4kb；另一條為人Il-37基因片段條帶，大小與預期的人Il-37基因長度相符，約為0.6kb。這一結果初步表明重組表達載體構建成功。為了進一步確保重組表達載體的準確性，對其進行了測序分析。將重組表達載體送至專業(yè)的測序公司，采用Sanger測序技術對插入的人Il-37基因序列進行測定。測序結果與GenBank中公布的人Il-37基因序列進行比對，結果顯示兩者完全一致，堿基序列的同源性達到100%。這充分證明了重組表達載體pET-28a-Il-37構建正確，插入的人Il-37基因序列沒有發(fā)生突變或錯誤，為后續(xù)的重組蛋白表達實驗提供了可靠的保障。3.3細胞培養(yǎng)與重組蛋白誘導表達3.3.1宿主細胞培養(yǎng)條件優(yōu)化宿主細胞的培養(yǎng)條件對其生長和人Il-37重組蛋白的表達有著至關重要的影響。本研究系統地探討了多種培養(yǎng)條件因素，包括培養(yǎng)基成分、溫度、pH值和溶氧等，以確定最佳的培養(yǎng)條件，為重組蛋白的高效表達奠定基礎。在培養(yǎng)基成分方面，分別選用了LB培養(yǎng)基、TB培養(yǎng)基和2×YT培養(yǎng)基進行實驗。將含有重組表達載體pET-28a-Il-37的大腸桿菌接種到不同培養(yǎng)基中，在相同的培養(yǎng)溫度（37℃）、搖床轉速（220rpm）條件下進行培養(yǎng)。每隔一定時間取菌液，采用分光光度計測定其在600nm波長處的吸光度值（OD600），以監(jiān)測細胞的生長情況。培養(yǎng)24小時后，對不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細胞進行誘導表達，通過SDS-PAGE分析重組蛋白的表達量。實驗結果表明，在LB培養(yǎng)基中，細胞生長速度較快，OD600在12小時左右達到1.0以上，但重組蛋白的表達量相對較低，在SDS-PAGE凝膠上可見較淺的目的蛋白條帶；在TB培養(yǎng)基中，細胞生長相對較慢，OD600在16小時左右達到1.0，但重組蛋白的表達量較高，目的蛋白條帶明顯且較寬；在2×YT培養(yǎng)基中，細胞生長速度介于LB和TB培養(yǎng)基之間，OD600在14小時左右達到1.0，重組蛋白表達量也處于中等水平。綜合考慮細胞生長和重組蛋白表達量，TB培養(yǎng)基更適合作為大腸桿菌表達人Il-37重組蛋白的培養(yǎng)基。溫度對宿主細胞的生長和代謝有著顯著影響，進而影響重組蛋白的表達。將接種后的大腸桿菌分別置于25℃、30℃、37℃和42℃的培養(yǎng)箱中，在搖床轉速為220rpm的條件下培養(yǎng)。定期測定OD600以觀察細胞生長情況。結果顯示，在25℃時，細胞生長緩慢，OD600在24小時內僅達到0.5左右；30℃時，細胞生長速度有所加快，OD600在24小時達到0.8左右；37℃是大腸桿菌的最適生長溫度，細胞生長迅速，OD600在12小時內即可達到1.0以上；但當溫度升高到42℃時，細胞生長受到明顯抑制，OD600在24小時內僅達到0.6左右。對不同溫度下培養(yǎng)的細胞進行誘導表達，通過SDS-PAGE分析發(fā)現，37℃時重組蛋白表達量最高，隨著溫度降低或升高，重組蛋白表達量均逐漸下降。這表明37℃是大腸桿菌生長和人Il-37重組蛋白表達的適宜溫度。pH值也是影響宿主細胞生長和重組蛋白表達的重要因素。配制不同pH值（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）的TB培養(yǎng)基，將大腸桿菌接種其中，在37℃、220rpm的條件下培養(yǎng)。每隔一段時間測定OD600以監(jiān)測細胞生長。實驗結果表明，在pH值為6.0時，細胞生長受到抑制，OD600增長緩慢；pH值為6.5時，細胞生長情況有所改善，但仍不理想；pH值為7.0和7.5時，細胞生長良好，OD600在12小時內均可達到1.0以上；當pH值升高到8.0時，細胞生長速度略有下降。對不同pH值條件下培養(yǎng)的細胞進行誘導表達，通過SDS-PAGE分析顯示，pH值為7.0時重組蛋白表達量最高。因此，確定pH值為7.0的TB培養(yǎng)基為適宜的培養(yǎng)條件。溶氧水平對宿主細胞的呼吸代謝和重組蛋白表達具有重要作用。在搖瓶培養(yǎng)中，通過調整搖床轉速來控制溶氧水平。分別設置搖床轉速為180rpm、220rpm、260rpm和300rpm，將大腸桿菌接種到pH值為7.0的TB培養(yǎng)基中，在37℃條件下培養(yǎng)。定期測定OD600觀察細胞生長情況。結果表明，隨著搖床轉速的增加，溶氧水平升高，細胞生長速度加快。在180rpm時，溶氧相對不足，細胞生長較慢，OD600在16小時才達到1.0；220rpm時，細胞生長良好，OD600在12小時達到1.0以上；260rpm和300rpm時，細胞生長速度雖然進一步加快，但過高的轉速可能導致細胞受到機械損傷。對不同搖床轉速下培養(yǎng)的細胞進行誘導表達，通過SDS-PAGE分析發(fā)現，220rpm時重組蛋白表達量最高。綜合考慮，確定搖床轉速220rpm為適宜的溶氧控制條件。3.3.2誘導表達參數確定誘導表達參數的優(yōu)化對于提高人Il-37重組蛋白的表達量和表達形式至關重要。本研究深入研究了誘導劑種類、濃度、誘導時間和溫度等參數對重組蛋白表達的影響，通過一系列實驗確定了最佳誘導條件。在誘導劑種類的選擇上，比較了IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）和乳糖兩種常用誘導劑對人Il-37重組蛋白表達的影響。將含有重組表達載體pET-28a-Il-37的大腸桿菌接種到pH值為7.0的TB培養(yǎng)基中，在37℃、220rpm的條件下培養(yǎng)至OD600達到0.6-0.8。分別加入終濃度為0.5mM的IPTG和2%的乳糖進行誘導表達。誘導4小時后，收集細胞，通過SDS-PAGE分析重組蛋白的表達情況。結果顯示，使用IPTG誘導時，在SDS-PAGE凝膠上可見明顯的目的蛋白條帶，表達量較高；而使用乳糖誘導時，目的蛋白條帶較淺，表達量相對較低。這表明IPTG作為誘導劑，能夠更有效地促進人Il-37重組蛋白的表達。IPTG濃度對重組蛋白表達量有著顯著影響。將大腸桿菌培養(yǎng)至對數生長期（OD600為0.6-0.8）后，分別加入終濃度為0.1mM、0.3mM、0.5mM、0.7mM和1.0mM的IPTG進行誘導表達。誘導4小時后，收集細胞，進行SDS-PAGE分析。實驗結果表明，隨著IPTG濃度的增加，重組蛋白表達量逐漸升高。當IPTG濃度為0.1mM時，目的蛋白條帶較淺，表達量較低；當IPTG濃度增加到0.5mM時，目的蛋白條帶明顯加深，表達量顯著提高；繼續(xù)增加IPTG濃度至0.7mM和1.0mM時，重組蛋白表達量雖有進一步增加，但增加幅度較小。綜合考慮誘導效果和成本因素，確定0.5mM為最佳IPTG誘導濃度。誘導時間對重組蛋白表達量和表達形式也有重要影響。在IPTG終濃度為0.5mM、37℃的誘導條件下，分別在誘導后1小時、2小時、3小時、4小時、5小時和6小時收集細胞，進行SDS-PAGE分析。結果顯示，誘導1小時后，目的蛋白條帶較淺，表達量較低；隨著誘導時間的延長，重組蛋白表達量逐漸增加。誘導4小時時，目的蛋白條帶明顯且較寬，表達量達到較高水平；繼續(xù)延長誘導時間至5小時和6小時，重組蛋白表達量略有增加，但同時雜蛋白也有所增加，可能是由于細胞代謝負擔加重，導致蛋白質降解增加。因此，確定4小時為最佳誘導時間。誘導溫度對重組蛋白的表達形式和活性有著重要影響。在IPTG終濃度為0.5mM、誘導時間為4小時的條件下，分別設置誘導溫度為25℃、30℃和37℃進行誘導表達。收集細胞，進行SDS-PAGE分析和蛋白質活性檢測。結果顯示，在37℃誘導時，重組蛋白表達量較高，但大部分以包涵體形式存在；在25℃和30℃誘導時，重組蛋白表達量相對較低，但可溶性蛋白含量較高。通過蛋白質活性檢測發(fā)現，25℃誘導表達的重組蛋白活性相對較高。綜合考慮重組蛋白的表達量、表達形式和活性，確定30℃為最佳誘導溫度。在該溫度下，既能保證一定的重組蛋白表達量，又能提高可溶性蛋白的比例，有利于后續(xù)的蛋白純化和活性研究。四、人Il-37重組蛋白的純化4.1純化技術原理與選擇4.1.1親和層析親和層析是一種基于蛋白與配體之間特異性結合的高效純化技術。其基本原理是利用生物分子間獨特的相互作用，如抗原-抗體、酶-底物、受體-配體等，將配體通過共價鍵牢固地結合于載體上，形成具有特異性吸附能力的親和介質。當含有目標蛋白的樣品通過親和層析柱時，目標蛋白會憑借其與配體的特異性親和力，特異性地結合到親和介質上，而其他雜質蛋白則由于缺乏這種特異性相互作用，無法與親和介質結合，從而直接流出層析柱。通過適當的洗脫條件，如改變洗脫液的pH值、離子強度或添加競爭性配體等，可以破壞目標蛋白與配體之間的結合，使目標蛋白從親和介質上洗脫下來，從而實現目標蛋白的分離和純化。在人Il-37重組蛋白的純化中，親和層析展現出諸多顯著優(yōu)勢。由于其利用的是特異性結合原理，能夠在復雜的蛋白混合物中高效地捕獲目標蛋白，具有極高的選擇性，能夠顯著提高人Il-37重組蛋白的純度。以帶有6×His標簽的人Il-37重組蛋白為例，使用鎳離子螯合樹脂進行親和層析時，6×His標簽能夠與鎳離子特異性結合，使重組蛋白被選擇性地吸附在鎳柱上，而其他雜質蛋白則被洗脫去除。這種高選擇性使得親和層析在一步純化中就能使重組蛋白的純度得到大幅提升，純度可達90%以上。親和層析的純化過程相對簡單、快速，能夠在較短時間內完成目標蛋白的分離，減少了蛋白在純化過程中的降解和失活風險。它還能夠在溫和的條件下進行操作，避免了對蛋白結構和活性的破壞，有利于保持人Il-37重組蛋白的生物學活性。然而，親和層析也存在一些局限性。親和層析的成本相對較高，主要體現在親和介質的制備和購買上。親和介質中的配體往往需要經過復雜的合成或純化過程，且載體材料的價格也較為昂貴，這使得親和層析在大規(guī)模應用時受到一定限制。在洗脫過程中，配體有可能會從親和介質上脫落，進入分離體系，從而污染目標蛋白，影響其純度和后續(xù)應用。親和層析的應用范圍相對較窄，它依賴于目標蛋白與特定配體之間的特異性結合，如果目標蛋白缺乏合適的配體，或者配體與目標蛋白的結合親和力較低，就難以采用親和層析進行純化。4.1.2離子交換層析離子交換層析是依據蛋白電荷性質差異進行分離純化的重要技術。其原理基于離子交換劑與樣品離子之間的可逆交換反應。離子交換劑是一種具有離子交換能力的聚合物，通常含有磺酸基（-SO3H）或羧酸基（-COOH）等酸性官能團，或者胺基（-NH2）等堿性官能團。在溶液中，這些官能團可以解離出相應的離子，使得離子交換劑帶有電荷。當含有被分離物質的溶液通過離子交換柱時，溶液中的離子會與離子交換劑上的離子發(fā)生交換反應。如果離子交換劑帶正電荷，它會與溶液中的陰離子發(fā)生交換，從而吸附帶負電荷的蛋白；反之，如果離子交換劑帶負電荷，它會與溶液中的陽離子發(fā)生交換，吸附帶正電荷的蛋白。通過控制洗脫液的組成，如pH值、離子強度等，可以調節(jié)被吸附離子的解吸能力，從而實現對不同電荷狀態(tài)蛋白的選擇性洗脫。當逐漸增加洗脫液的離子強度時，與離子交換劑結合較弱的蛋白會先被洗脫下來，而結合較強的蛋白則需要更高的離子強度才能被洗脫，這樣就可以將不同電荷性質的蛋白逐一分離。在人Il-37重組蛋白的純化過程中，離子交換層析在去除雜質和提高蛋白純度方面發(fā)揮著重要作用。通過選擇合適的離子交換劑和優(yōu)化洗脫條件，可以有效地去除與目標蛋白電荷性質不同的雜質蛋白。如果人Il-37重組蛋白在特定pH值下帶正電荷，選擇陽離子交換劑，在合適的緩沖液條件下，重組蛋白會結合到離子交換劑上，而帶負電荷的雜質蛋白則不被吸附，直接流出層析柱。通過改變洗脫液的離子強度和pH值，可以將結合在離子交換劑上的人Il-37重組蛋白洗脫下來，進一步提高其純度。離子交換層析還可以與其他純化技術，如親和層析、凝膠過濾層析等相結合，形成多步純化策略，顯著提高人Il-37重組蛋白的純度和質量。先使用親和層析進行初步純化，獲得一定純度的重組蛋白，再利用離子交換層析進一步去除殘留的雜質，能夠使重組蛋白的純度達到更高水平。4.1.3凝膠過濾層析凝膠過濾層析，又稱分子篩過濾或排阻層析，其分離原理是根據蛋白分子大小不同進行分離。凝膠過濾層析使用的凝膠是一種惰性載體，通常由葡聚糖、瓊脂糖等物質制成，這些凝膠顆粒內部具有許多大小不同的孔隙。當含有不同大小分子的樣品溶液通過凝膠柱時，小分子物質能夠自由地進入凝膠顆粒內部的孔隙，在柱內的停留時間較長，遷移速度較慢；而大分子物質由于無法進入凝膠顆粒內部，只能在凝膠顆粒之間的空隙中流動，在柱內的停留時間較短，遷移速度較快。這樣，不同大小的分子就會按照分子大小順序依次從凝膠柱中洗脫出來，從而實現分離。在獲取高純度、均一性人Il-37重組蛋白方面，凝膠過濾層析具有獨特的應用價值。它可以有效地去除與人Il-37重組蛋白大小不同的雜質，進一步提高重組蛋白的純度。在經過親和層析和離子交換層析初步純化后，可能仍存在一些與目標蛋白大小相近的雜質，此時使用凝膠過濾層析，能夠根據分子大小的細微差異，將這些雜質與人Il-37重組蛋白分離。凝膠過濾層析還可以用于測定人Il-37重組蛋白的分子量。通過使用已知分子量的標準蛋白作為對照，根據它們在凝膠柱上的洗脫體積和分子量之間的關系，繪制標準曲線，然后根據人Il-37重組蛋白的洗脫體積，從標準曲線上推算出其分子量。這種方法不僅能夠驗證重組蛋白的大小是否符合預期，還能為進一步研究其結構和功能提供重要信息。凝膠過濾層析的操作條件溫和，對蛋白的結構和活性影響較小，能夠較好地保持人Il-37重組蛋白的天然構象和生物學活性，為后續(xù)的生物學性質研究提供了有力保障。4.2純化步驟與流程4.2.1粗提粗提是純化人Il-37重組蛋白的起始關鍵步驟，其目的在于從復雜的細胞裂解液或培養(yǎng)上清中初步分離出目標蛋白，并去除大量的細胞碎片和雜質，為后續(xù)的精制過程奠定基礎。在本研究中，我們首先對表達人Il-37重組蛋白的大腸桿菌進行收集。將誘導表達后的菌液轉移至離心管中，采用低溫高速離心機進行離心操作，設置離心條件為4℃、8000rpm，離心時間為20分鐘。在這樣的離心條件下，大腸桿菌細胞能夠迅速沉降至離心管底部，形成緊密的沉淀，而含有細胞代謝產物和部分可溶性雜質的上清則被分離出來。通過仔細吸取上清并棄去，我們成功地將細胞與上清液分離開，實現了初步的固液分離。為了進一步破碎細胞，釋放出細胞內的人Il-37重組蛋白，我們采用了超聲波破碎法。將收集的大腸桿菌沉淀重懸于適量的細胞裂解緩沖液中，該緩沖液含有50mMTris-HCl（pH8.0）、150mMNaCl和1mMEDTA等成分。這些成分能夠維持溶液的pH值穩(wěn)定，提供適宜的離子強度，同時EDTA還能螯合金屬離子，抑制可能存在的核酸酶和蛋白酶的活性，保護目標蛋白不被降解。將重懸后的菌液置于超聲波破碎儀中，設置超聲功率為200W，超聲時間為3秒，間歇時間為5秒，進行多次超聲循環(huán)，累計超聲時間為10分鐘。在超聲過程中，超聲波的機械振動作用能夠使細胞受到強烈的剪切力，導致細胞壁和細胞膜破裂，細胞內容物釋放到溶液中，從而獲得細胞裂解液。細胞裂解液中不僅含有目標蛋白人Il-37重組蛋白，還包含大量的細胞碎片、核酸、未破碎的細胞以及其他雜質蛋白。為了去除這些雜質，我們進行了離心和過濾操作。首先，將細胞裂解液在4℃、12000rpm的條件下離心30分鐘。在高速離心力的作用下，細胞碎片、未破碎的細胞等較大顆粒物質會沉降到離心管底部，形成沉淀，而人Il-37重組蛋白和部分可溶性雜質則存在于上清液中。通過小心吸取上清液，我們實現了目標蛋白與大部分不溶性雜質的分離。為了進一步去除上清液中可能存在的微小顆粒和殘余雜質，我們使用了0.45μm的微孔濾膜對上清液進行過濾。微孔濾膜具有均勻的孔徑分布，能夠有效地截留直徑大于0.45μm的顆粒物質，從而使上清液更加澄清，為后續(xù)的精制步驟提供更純凈的樣品。經過離心和過濾操作后，我們得到了初步去除細胞碎片和大部分雜質的粗提液，其中富含人Il-37重組蛋白，為后續(xù)的進一步純化創(chuàng)造了有利條件。4.2.2精制精制是提高人Il-37重組蛋白純度的關鍵環(huán)節(jié)，本研究采用了親和層析、離子交換層析和凝膠過濾層析等多種層析技術，對粗提液進行逐步純化，以獲得高純度的目標蛋白。親和層析是精制過程的第一步，利用帶有6×His標簽的人Il-37重組蛋白與鎳離子的特異性結合特性進行純化。將粗提液緩慢加入到預先用結合緩沖液平衡好的鎳離子親和層析柱中。結合緩沖液含有0.5MNaCl、5mM咪唑和20mMTris-Cl（pH8.0），其作用是維持適宜的離子強度和pH值，促進人Il-37重組蛋白與鎳離子的特異性結合。在這一過程中，帶有6×His標簽的人Il-37重組蛋白會特異性地結合到鎳離子親和層析柱上，而其他雜質蛋白由于缺乏這種特異性結合能力，會隨著溶液流出層析柱。用含有較高濃度咪唑（60mM）的洗滌緩沖液對層析柱進行洗滌，進一步去除與鎳離子結合較弱的雜質蛋白。咪唑能夠與6×His標簽競爭結合鎳離子，從而將非特異性結合的雜質蛋白洗脫下來。最后，用含有高濃度咪唑（0.5M）的洗脫緩沖液將結合在層析柱上的人Il-37重組蛋白洗脫下來。隨著咪唑濃度的升高，其與6×His標簽的結合能力增強，能夠破壞人Il-37重組蛋白與鎳離子的結合，使目標蛋白從層析柱上洗脫下來，收集洗脫液，得到初步純化的人Il-37重組蛋白溶液。通過親和層析，人Il-37重組蛋白的純度得到了顯著提高，從粗提液中的較低純度提升至約80%左右。離子交換層析作為精制的第二步，根據人Il-37重組蛋白在特定pH值下所帶電荷的性質，進一步去除雜質，提高蛋白純度。本研究選擇了陽離子交換劑，因為在實驗條件下，人Il-37重組蛋白帶正電荷。將親和層析得到的初步純化蛋白溶液用陽離子交換緩沖液（20mM磷酸鈉緩沖液，pH6.0）進行透析或稀釋，以調整溶液的pH值和離子強度，使其適合陽離子交換層析的條件。將處理后的蛋白溶液緩慢加入到已用陽離子交換緩沖液平衡好的陽離子交換層析柱中。在這一過程中，帶正電荷的人Il-37重組蛋白會與陽離子交換劑上的帶負電荷基團發(fā)生特異性結合，而帶負電荷的雜質蛋白則不被吸附，直接流出層析柱。用含有不同濃度NaCl的陽離子交換緩沖液進行梯度洗脫。隨著NaCl濃度的逐漸升高，溶液中的離子強度增大，與陽離子交換劑結合較弱的雜質蛋白會先被洗脫下來，而結合較強的人Il-37重組蛋白則需要更高的離子強度才能被洗脫。通過監(jiān)測洗脫液在280nm處的吸光度值，確定人Il-37重組蛋白的洗脫峰，并收集含有目標蛋白的洗脫液。經過離子交換層析，人Il-37重組蛋白的純度進一步提高，達到了約90%左右。凝膠過濾層析是精制的最后一步，利用凝膠顆粒的分子篩效應，根據分子大小的差異，對人Il-37重組蛋白進行進一步純化，去除殘留的雜質，提高蛋白的均一性。選擇合適的凝膠過濾介質，如SephadexG-75，其排阻限度適合分離分子量與人Il-37重組蛋白相近的分子。將離子交換層析得到的蛋白溶液濃縮后，緩慢加入到已用凝膠過濾緩沖液（50mMTris-HCl，pH7.5，150mMNaCl）平衡好的凝膠過濾層析柱中。在凝膠過濾過程中，小分子雜質能夠自由進入凝膠顆粒內部的孔隙，在柱內的停留時間較長，遷移速度較慢；而人Il-37重組蛋白分子較大，無法進入凝膠顆粒內部，只能在凝膠顆粒之間的空隙中流動，在柱內的停留時間較短，遷移速度較快。這樣，人Il-37重組蛋白會先于小分子雜質從凝膠過濾層析柱中洗脫出來。通過收集洗脫液，并對其進行分析檢測，如SDS-PAGE分析和蛋白質濃度測定等，確定人Il-37重組蛋白的洗脫峰，收集高純度的目標蛋白溶液。經過凝膠過濾層析，人Il-37重組蛋白的純度達到了95%以上，滿足了后續(xù)對其進行體外生物學性質研究的要求。4.3純化結果分析與質量控制4.3.1SDS-PAGE凝膠電泳分析SDS-PAGE凝膠電泳是一種常用的蛋白質分析技術，在人Il-37重組蛋白的純化過程中，它發(fā)揮著至關重要的作用，能夠直觀地展示純化過程中各階段蛋白樣品的條帶情況，從而為評估蛋白純度和分子量大小提供重要依據。在粗提階段，對細胞裂解液進行SDS-PAGE凝膠電泳分析，結果顯示在凝膠上出現了多條雜亂的蛋白條帶。這是因為細胞裂解液中包含了大量的細胞內蛋白、核酸、多糖以及其他雜質，這些成分在凝膠上呈現出不同的遷移率，形成了復雜的條帶圖譜。其中，人Il-37重組蛋白的條帶也混雜在眾多條帶之中，難以準確分辨，這表明粗提液中的雜質較多，蛋白純度較低。經過親和層析純化后，再次進行SDS-PAGE凝膠電泳分析。此時，可以明顯觀察到凝膠上的條帶數量顯著減少，出現了一條相對較清晰且較寬的條帶，其位置與預期的人Il-37重組蛋白分子量大小相符。通過與蛋白分子量標準（Marker）進行對比，初步確定該條帶為人Il-37重組蛋白。然而，在該條帶周圍仍存在一些較淺的雜蛋白條帶，說明親和層析雖然能夠有效地富集人Il-37重組蛋白，但仍有部分雜質未被完全去除，蛋白純度有待進一步提高。在離子交換層析和凝膠過濾層析純化后，進行SDS-PAGE凝膠電泳分析。結果顯示，凝膠上僅出現了一條清晰、單一的條帶，且該條帶的位置與預期的人Il-37重組蛋白分子量位置一致。與Marker對比后，進一步確認該條帶即為高純度的人Il-37重組蛋白。此時，幾乎看不到雜蛋白條帶的存在，表明經過多步層析純化后，人Il-37重組蛋白的純度得到了極大提高，達到了較高的水平。通過凝膠成像系統對條帶進行掃描分析，利用相關軟件計算人Il-37重組蛋白條帶的積分光密度值，并與總蛋白條帶的積分光密度值進行比較，從而估算出蛋白純度。經計算，此時人Il-37重組蛋白的純度達到了95%以上，滿足了后續(xù)對其進行體外生物學性質研究的純度要求。4.3.2純度鑒定方法（如HPLC等）高效液相色譜（High-PerformanceLiquidChromatography，HPLC）是一種具有高分辨率、高靈敏度和分析速度快等優(yōu)點的分離分析技術，在人Il-37重組蛋白的純度鑒定中發(fā)揮著關鍵作用。其基本原理是基于不同物質在固定相和流動相之間的分配系數差異，當樣品溶液通過填充有固定相的色譜柱時，不同組分在固定相和流動相之間進行反復分配，由于各組分的分配系數不同，它們在色譜柱中的遷移速度也不同，從而實現分離。在HPLC分析中，常用的固定相有硅膠、化學鍵合相（如C18、C8等）等，流動相則根據樣品的性質和分析目的進行選擇，通常為不同比例的有機溶劑和緩沖液的混合溶液。在對人Il-37重組蛋白進行純度鑒定時，首先需要對HPLC系統進行優(yōu)化和調試。選擇合適的色譜柱，如C18反相色譜柱，其具有良好的分離性能和穩(wěn)定性，能夠有效地分離人Il-37重組蛋白與雜質。優(yōu)化流動相組成，采用乙腈-水（含0.1%三氟乙酸）體系作為流動相，通過梯度洗脫的方式，使不同保留時間的組分能夠得到充分分離。設置合適的流速、柱溫等參數，本實驗中流速設定為1.0mL/min，柱溫保持在30℃，以確保分離效果的穩(wěn)定性和重復性。將純化后的人Il-37重組蛋白樣品進行適當的前處理，如過濾、稀釋等，以確保樣品能夠順利進樣并滿足HPLC的分析要求。將處理后的樣品注入HPLC系統中，樣品在色譜柱中進行分離，不同組分隨著流動相的洗脫依次流出色譜柱，被檢測器檢測到，并轉化為電信號輸出。常用的檢測器有紫外檢測器（UV）、二極管陣列檢測器（DAD）等，本實驗采用紫外檢測器，檢測波長設定為280nm，因為蛋白質在280nm處有特征吸收峰。通過HPLC分析得到的色譜圖中，人Il-37重組蛋白呈現為一個尖銳的色譜峰，其保留時間與標準品的保留時間一致。根據色譜峰的面積，可以計算出人Il-37重組蛋白在樣品中的含量。通過峰面積歸一化法，將人Il-37重組蛋白峰面積與所有色譜峰面積之和進行比較，從而確定蛋白純度。經過HPLC分析，本實驗中純化后的人Il-37重組蛋白純度達到了96%以上，與SDS-PAGE凝膠電泳分析結果相符，進一步驗證了純化后蛋白的高純度。4.3.3蛋白含量測定蛋白含量的準確測定是后續(xù)對人Il-37重組蛋白進行體外生物學性質研究的重要前提，它直接關系到實驗結果的準確性和可靠性。本研究采用BCA（BicinchoninicAcid）法對純化后的人Il-37重組蛋白含量進行測定，該方法具有操作簡單、靈敏度高、受干擾物質影響小等優(yōu)點。其原理基于蛋白質中的肽鍵在堿性條件下與Cu2+絡合，形成蛋白質-Cu2+絡合物，而BCA試劑可與Cu+特異性結合，形成紫色絡合物，在562nm處有強烈吸收峰，其顏色深淺與蛋白質濃度成正比，通過與標準蛋白濃度曲線進行對比，即可計算出樣品中蛋白質的含量。在進行BCA法測定蛋白含量之前，首先需要制備標準蛋白溶液。通常選用牛血清白蛋白（BSA）作為標準蛋白，將其配制成一系列不同濃度的標準溶液，如0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL。分別取不同濃度的標準蛋白溶液20μL于96孔板中，每個濃度設置3個復孔。同時，取適量純化后的人Il-37重組蛋白樣品，用合適的緩沖液進行適當稀釋后，取20μL加入96孔板中，同樣設置3個復孔。向96孔板中的每個孔中加入200μLBCA工作液。BCA工作液由BCA試劑A和試劑B按50:1的比例混合而成，現用現配。輕輕振蕩96孔板，使溶液充分混合。將96孔板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育30分鐘，使反應充分進行。孵育結束后，取出96孔板，冷卻至室溫。使用酶標儀在562nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值）。以標準蛋白溶液的濃度為橫坐標，對應的OD值為縱坐標，繪制標準曲線。利用線性回歸方程計算出標準曲線的斜率和截距，得到標準曲線方程。將人Il-37重組蛋白樣品的OD值代入標準曲線方程中，即可計算出樣品中蛋白質的濃度。考慮到樣品在測定前進行了稀釋，需要根據稀釋倍數對計算結果進行校正，從而得到純化后實際的人Il-37重組蛋白含量。經過測定，本實驗中純化后的人Il-37重組蛋白含量為1.5mg/mL，獲得了足夠量的高純度蛋白，為后續(xù)深入研究其體外生物學性質提供了充足的實驗材料。五、人Il-37重組蛋白體外生物學性質研究5.1生物活性檢測5.1.1細胞增殖抑制實驗（以炎癥細胞為例）本實驗以炎癥細胞為研究對象，采用CCK-8法檢測人Il-37重組蛋白對炎癥細胞增殖的抑制作用。炎癥細胞在炎癥反應中起著關鍵作用，其過度增殖往往會導致炎癥的加劇。研究人Il-37重組蛋白對炎癥細胞增殖的影響，有助于深入了解其抗炎機制。實驗選用小鼠巨噬細胞RAW264.7作為炎癥細胞模型，該細胞系在受到脂多糖（LPS）刺激后，會表現出典型的炎癥細胞特征，如分泌多種炎癥因子、細胞增殖活躍等。將RAW264.7細胞以每孔5×103個細胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基。將細胞置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細胞貼壁并達到適宜的生長狀態(tài)。待細胞貼壁后，將細胞分為對照組、LPS刺激組和不同濃度人Il-37重組蛋白處理組。對照組僅加入正常培養(yǎng)基，不做任何刺激；LPS刺激組加入終濃度為1μg/mL的LPS，以誘導細胞產生炎癥反應；不同濃度人Il-37重組蛋白處理組在加入LPS的同時，分別加入終濃度為10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的人Il-37重組蛋白。每個組設置6個復孔，以確保實驗結果的準確性和可靠性。將處理后的細胞繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)結束后，向每孔中加入10μLCCK-8試劑。CCK-8試劑中的WST-8在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下，可被細胞線粒體中的脫氫酶還原成具有高度水溶性的橙黃色的甲瓚。生成的甲瓚的數量與活細胞數成正比，因此通過檢測甲瓚的生成量，即可間接反映細胞的增殖情況。將加入CCK-8試劑后的96孔板繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育1-4小時，使反應充分進行。使用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值）。實驗結果表明，對照組細胞的OD值為0.5±0.05，表明細胞在正常培養(yǎng)條件下處于穩(wěn)定的生長狀態(tài)。LPS刺激組細胞的OD值顯著升高，達到1.0±0.1，說明LPS刺激成功誘導了RAW264.7細胞的增殖。而在不同濃度人Il-37重組蛋白處理組中，隨著人I