IGF-1R與u-PA：揭示喉咽癌奧秘的分子鑰匙一、引言1.1研究背景與目的喉咽癌作為一種常見的頭頸部惡性腫瘤，嚴重威脅著人類的健康。在我國，其發(fā)病率呈現(xiàn)出不容忽視的態(tài)勢，給患者及其家庭帶來了沉重的負擔。據(jù)相關研究統(tǒng)計，近年來喉咽癌的發(fā)病率有逐漸上升的趨勢，且患者的五年生存率較低，這使得對喉咽癌的深入研究顯得尤為迫切。喉咽癌的發(fā)生發(fā)展是一個復雜的多階段過程，涉及多個基因和信號通路的異常改變。目前，雖然臨床上對于喉咽癌的診斷和治療手段在不斷進步，但仍存在諸多局限性。例如，早期診斷困難，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，錯過了最佳治療時機；治療方法的選擇有限，且常伴有嚴重的并發(fā)癥，影響患者的生活質量。因此，深入探討喉咽癌的病理生理機制，尋找有效的早期診斷標志物和治療靶點，對于提高喉咽癌的診療水平具有重要意義。胰島素樣生長因子1受體（IGF-1R）和尿激酶型纖溶酶原激活劑（u-PA）在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉移過程中發(fā)揮著關鍵作用。IGF-1R是一種跨膜受體酪氨酸激酶，屬于胰島素受體家族，其主要通過與胰島素樣生長因子1（IGF-1）或胰島素樣生長因子2（IGF-2）結合而被激活，進而啟動一系列下游信號通路，如PI3K/AKT和Ras/Raf/MEK/ERK等，這些信號通路參與調控細胞的增殖、分化、存活、遷移和侵襲等生物學過程。在多種惡性腫瘤中，IGF-1R的表達水平明顯升高，且與腫瘤的惡性程度、預后不良密切相關。u-PA是一種絲氨酸蛋白酶，能夠將無活性的纖溶酶原轉化為有活性的纖溶酶，從而降解細胞外基質和基底膜成分，促進腫瘤細胞的浸潤和轉移。同時，u-PA還可以通過與細胞表面的u-PAR結合，激活細胞內的信號傳導通路，進一步促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲。已有研究表明，u-PA在多種腫瘤組織中高表達，且其表達水平與腫瘤的分期、淋巴結轉移及患者的預后密切相關。然而，目前關于IGF-1R和u-PA在喉咽癌中的表達及其臨床意義的研究尚顯不足。本研究旨在通過檢測IGF-1R和u-PA在喉咽癌組織及癌旁喉咽黏膜組織中的表達情況，并對其表達進行相關性分析，深入探討IGF-1R和u-PA在喉咽癌發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉移中的作用以及它們在喉咽癌浸潤轉移中的相互關系，為喉咽癌的早期診斷、治療和預后判斷提供重要的參考依據(jù)，以期為臨床實踐提供新的思路和方法，改善喉咽癌患者的預后。1.2國內外研究現(xiàn)狀在國外，對IGF-1R和u-PA與腫瘤關系的研究起步較早。早在20世紀80年代，就有研究發(fā)現(xiàn)IGF-1R在多種腫瘤細胞中過度表達，如乳腺癌、前列腺癌等。后續(xù)大量研究表明，IGF-1R通過激活下游的PI3K/AKT和Ras/Raf/MEK/ERK等信號通路，促進腫瘤細胞的增殖、抑制凋亡，增強腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。例如，在乳腺癌的研究中，發(fā)現(xiàn)IGF-1R高表達的患者預后較差，腫瘤更容易復發(fā)和轉移。對于u-PA，國外學者也進行了深入研究，證實其在腫瘤的浸潤和轉移過程中發(fā)揮關鍵作用。u-PA不僅能夠降解細胞外基質，為腫瘤細胞的遷移開辟道路，還能通過與u-PAR結合，激活一系列細胞內信號傳導通路，促進腫瘤細胞的運動和侵襲。在結直腸癌的研究中，發(fā)現(xiàn)u-PA的表達水平與腫瘤的分期、淋巴結轉移密切相關，高表達u-PA的患者預后不良。然而，關于IGF-1R和u-PA在喉咽癌中的研究相對較少。部分國外研究通過免疫組化等技術檢測了IGF-1R和u-PA在喉咽癌組織中的表達情況，發(fā)現(xiàn)二者在喉咽癌組織中的表達水平明顯高于正常組織，且與腫瘤的分期、淋巴結轉移等臨床病理參數(shù)相關。但這些研究樣本量相對較小，研究內容也不夠全面，對于IGF-1R和u-PA在喉咽癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用機制尚未完全明確。在國內，隨著對腫瘤研究的重視，近年來關于IGF-1R和u-PA與喉咽癌關系的研究逐漸增多。一些研究團隊采用免疫組織化學、實時熒光定量PCR等技術，對IGF-1R和u-PA在喉咽癌組織及癌旁組織中的表達進行了檢測，并分析了其與喉咽癌患者臨床特征和預后的關系。結果顯示，IGF-1R和u-PA在喉咽癌組織中的陽性表達率顯著高于癌旁組織，且其高表達與喉咽癌的淋巴結轉移、臨床分期密切相關。李武杰等人的研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1R和u-PA在喉咽癌有淋巴結轉移組的強陽性表達率分別為82.61％和78.26％，與無淋巴結轉移組相比差異有統(tǒng)計學意義。這表明檢測IGF-1R和u-PA的表達可能有助于評估喉咽癌的淋巴結轉移情況。同時，國內研究還發(fā)現(xiàn)IGF-1R和u-PA在喉咽癌組織中的表達呈正相關，推測兩者可能在喉咽癌的發(fā)生、發(fā)展以及淋巴結轉移中起協(xié)同作用。但目前國內研究也存在一些局限性，如研究方法和標準不夠統(tǒng)一，對IGF-1R和u-PA在喉咽癌中的作用機制研究還不夠深入，缺乏大規(guī)模的臨床研究來驗證相關結論。1.3研究意義與創(chuàng)新點本研究具有重要的理論和臨床實踐意義。在理論方面，深入探討IGF-1R和u-PA在喉咽癌發(fā)生、發(fā)展、浸潤和轉移中的作用及其相互關系，有助于進一步揭示喉咽癌的發(fā)病機制，豐富腫瘤分子生物學理論，為后續(xù)相關研究提供新的思路和方向。通過研究二者在喉咽癌組織中的表達情況，能夠從分子層面深入理解喉咽癌的生物學行為，為開發(fā)針對喉咽癌的新型治療靶點提供理論依據(jù)。在臨床實踐方面，本研究結果對于喉咽癌的早期診斷具有潛在價值。由于IGF-1R和u-PA在喉咽癌組織中的表達與腫瘤的淋巴結轉移等臨床病理參數(shù)密切相關，檢測它們在喉咽癌組織中的表達，有望成為評估喉咽癌淋巴結轉移風險的重要指標，從而幫助醫(yī)生更準確地判斷患者的病情，制定個性化的治療方案。對于那些IGF-1R和u-PA高表達的患者，可加強監(jiān)測和早期干預，提高治療效果。在治療方面，以IGF-1R和u-PA為靶點的治療策略可能為喉咽癌患者帶來新的希望。針對IGF-1R和u-PA及其相關信號通路開發(fā)特異性的抑制劑或拮抗劑，有可能阻斷腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲過程，為喉咽癌的治療開辟新的途徑。本研究的創(chuàng)新點主要體現(xiàn)在以下幾個方面。在研究內容上，首次將IGF-1R和u-PA這兩個在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用的因子結合起來，系統(tǒng)地研究它們在喉咽癌中的表達、相互關系及其與臨床病理參數(shù)的關聯(lián)。以往的研究多單獨關注IGF-1R或u-PA在喉咽癌中的作用，本研究從二者的協(xié)同作用角度出發(fā)，為喉咽癌的研究提供了新的視角，更全面地揭示了喉咽癌發(fā)生發(fā)展的分子機制。在研究方法上，采用免疫組織化學和實時熒光定量PCR等多種技術相結合的方法，對IGF-1R和u-PA在喉咽癌組織及癌旁喉咽黏膜組織中的表達進行檢測，確保了實驗結果的準確性和可靠性。同時，運用統(tǒng)計學方法對大量臨床樣本的數(shù)據(jù)進行深入分析，使研究結果更具說服力，能夠更準確地反映IGF-1R和u-PA在喉咽癌中的臨床意義。二、IGF-1R與u-PA的相關理論基礎2.1IGF-1R概述2.1.1IGF-1R的結構與功能胰島素樣生長因子1受體（IGF-1R）屬于受體酪氨酸激酶家族，是一種跨膜蛋白。其結構較為復雜，由兩個α亞基和兩個β亞基通過二硫鍵連接而成，形成一個α?β?的四聚體結構。α亞基完全位于細胞外，主要負責與配體胰島素樣生長因子1（IGF-1）或胰島素樣生長因子2（IGF-2）的結合，識別并特異性地結合相應的配體，從而啟動受體的激活過程。β亞基則包含一個細胞外結構域、一個跨膜結構域以及一個位于細胞內的酪氨酸激酶結構域。當IGF-1或IGF-2與α亞基結合后，會引起β亞基的構象變化，進而激活β亞基胞內段的酪氨酸激酶活性，使受體自身磷酸化，為下游信號分子提供結合位點，從而啟動一系列細胞內信號傳導通路。IGF-1R在細胞的生長、分化、增殖和存活等過程中發(fā)揮著關鍵作用。在正常生理狀態(tài)下，它參與調節(jié)機體的生長發(fā)育，特別是對骨骼、肌肉等組織的生長具有重要意義。在胚胎發(fā)育階段，IGF-1R介導的信號通路對于細胞的分化和組織器官的形成至關重要，缺乏IGF-1R的小鼠在發(fā)育晚期死亡，并顯示體重顯著減少，證明該受體的強烈生長促進作用。在成人中，IGF-1R繼續(xù)發(fā)揮合成代謝作用，能夠誘導骨骼肌和其他靶組織的肥大，促進細胞對氨基酸的攝取和蛋白質的合成，維持組織的正常功能和修復。僅攜帶IGF-1R的一個功能性拷貝的小鼠是正常的，但體重減少約15％。在細胞水平上，IGF-1R可以促進多種細胞的增殖，如成纖維細胞、軟骨細胞、神經(jīng)元等，它能夠刺激細胞周期蛋白的表達，加速細胞從G1期進入S期，促進DNA的合成和細胞分裂。IGF-1R還可以抑制細胞凋亡，通過激活下游的抗凋亡信號通路，如PI3K/AKT通路，抑制半胱氨酸蛋白酶（Caspase）等凋亡相關蛋白的活性，從而維持細胞的存活。2.1.2IGF-1R在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機制IGF-1R在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色，其作用機制涉及多個方面。在腫瘤細胞增殖方面，IGF-1R被激活后，主要通過兩條經(jīng)典的下游信號通路來促進細胞增殖。PI3K/AKT信號通路，IGF-1與IGF-1R結合后，使受體的β亞基酪氨酸激酶結構域磷酸化，進而招募并激活磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）。PI3K將磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）磷酸化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），PIP3作為第二信使，能夠招募并激活蛋白激酶B（AKT）。AKT被激活后，可通過多種途徑促進細胞增殖，它可以磷酸化并抑制糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的活性，從而穩(wěn)定細胞周期蛋白D1，促進細胞周期從G1期向S期進展；AKT還能激活雷帕霉素靶蛋白（mTOR），調節(jié)蛋白質合成和細胞生長相關基因的表達，促進細胞的生長和增殖。另一條是Ras/Raf/MEK/ERK信號通路，IGF-1R激活后，通過接頭蛋白將信號傳遞給Ras蛋白，使Ras蛋白從無活性的GDP結合形式轉變?yōu)橛谢钚缘腉TP結合形式。激活的Ras蛋白進而招募并激活Raf激酶，Raf激酶磷酸化并激活絲裂原活化蛋白激酶激酶（MEK），MEK再磷酸化并激活細胞外信號調節(jié)激酶（ERK）。ERK被激活后，可進入細胞核，調節(jié)一系列轉錄因子的活性，如c-fos、c-jun等，這些轉錄因子參與調控與細胞增殖、分化相關基因的表達，從而促進腫瘤細胞的增殖。在抑制腫瘤細胞凋亡方面，IGF-1R通過激活PI3K/AKT信號通路發(fā)揮關鍵作用。AKT可以磷酸化多種與凋亡相關的蛋白，如Bad、Caspase-9等，使其失去促凋亡活性。AKT還能激活核因子-κB（NF-κB），NF-κB是一種重要的轉錄因子，它可以上調抗凋亡基因的表達，如Bcl-2、Bcl-XL等，同時下調促凋亡基因的表達，從而抑制腫瘤細胞的凋亡，使腫瘤細胞能夠逃避機體的凋亡機制，得以持續(xù)存活和增殖。IGF-1R在腫瘤細胞的遷移和侵襲過程中也發(fā)揮著重要作用。一方面，IGF-1R激活后可以上調基質金屬蛋白酶（MMPs）的表達，如MMP-2、MMP-9等。這些基質金屬蛋白酶能夠降解細胞外基質和基底膜的成分，如膠原蛋白、層粘連蛋白等，為腫瘤細胞的遷移和侵襲開辟道路。另一方面，IGF-1R通過激活PI3K/AKT和Ras/Raf/MEK/ERK等信號通路，調節(jié)細胞骨架的重組和細胞粘附分子的表達，增強腫瘤細胞的運動能力。AKT可以調節(jié)肌動蛋白結合蛋白的活性，促進細胞骨架的重塑，使腫瘤細胞能夠伸出偽足，實現(xiàn)遷移和侵襲；ERK可以調節(jié)細胞粘附分子如E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白等的表達，改變腫瘤細胞與周圍細胞和細胞外基質的粘附特性，促進腫瘤細胞脫離原發(fā)灶，發(fā)生侵襲和轉移。2.2u-PA概述2.2.1u-PA的結構與功能尿激酶型纖溶酶原激活劑（u-PA）是一種絲氨酸蛋白酶，其編碼基因位于10號染色體長臂（10q24）上。u-PA前體由411個氨基酸殘基組成，相對分子質量約為54kDa，在被激活過程中，其氨基末端的一段多肽被水解去除，從而形成具有活性的u-PA。u-PA主要包含三個結構域：氨基末端的生長因子樣結構域（GF）、kringle結構域以及羧基末端的絲氨酸蛋白酶結構域（SP）。GF結構域與表皮生長因子具有同源性，它可以介導u-PA與細胞表面的u-PAR結合，從而使u-PA定位于細胞表面，增強其局部活性。kringle結構域含有一個由二硫鍵形成的環(huán)狀結構，它能夠與纖維蛋白及其他細胞外基質成分結合，參與u-PA對底物的特異性識別和結合。SP結構域則是u-PA發(fā)揮蛋白酶活性的關鍵區(qū)域，它具有典型的絲氨酸蛋白酶催化三聯(lián)體結構，能夠特異性地水解肽鍵，將無活性的纖溶酶原轉化為有活性的纖溶酶。u-PA在體內的主要功能是激活纖溶酶原，使其轉化為纖溶酶，從而啟動纖維蛋白溶解系統(tǒng)。纖溶酶是一種活性很強的蛋白水解酶，它不僅能夠降解纖維蛋白凝塊，還可以降解細胞外基質中的多種成分，如膠原蛋白、層粘連蛋白、纖連蛋白等，在維持血管通暢、組織修復和再生等生理過程中發(fā)揮著重要作用。在正常生理狀態(tài)下，u-PA的表達和活性受到嚴格調控，以確保纖維蛋白溶解系統(tǒng)的平衡，防止過度纖溶導致出血或纖溶不足導致血栓形成。在傷口愈合過程中，u-PA在損傷部位的表達增加，它激活纖溶酶原產生纖溶酶，纖溶酶降解傷口處的纖維蛋白凝塊，為細胞的遷移和組織的修復創(chuàng)造條件。u-PA還參與細胞遷移過程，它通過降解細胞外基質，為細胞的運動提供空間，同時激活的纖溶酶還可以水解一些細胞粘附分子，使細胞能夠脫離原有的粘附位點，實現(xiàn)遷移。在胚胎發(fā)育過程中，u-PA對于細胞的遷移和組織器官的形成至關重要，它幫助細胞在胚胎中正確定位，促進組織的形態(tài)發(fā)生和分化。2.2.2u-PA在腫瘤侵襲轉移中的作用機制u-PA在腫瘤侵襲轉移過程中發(fā)揮著關鍵作用，其作用機制主要包括以下幾個方面。u-PA能夠激活纖溶酶原，生成纖溶酶，纖溶酶具有廣泛的蛋白水解活性，它可以直接降解細胞外基質和基底膜的主要成分，如膠原蛋白、層粘連蛋白、纖維連接蛋白等。這些成分構成了腫瘤細胞遷移的物理屏障，纖溶酶的降解作用使得腫瘤細胞能夠突破這些屏障，向周圍組織浸潤。在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，高表達u-PA的腫瘤細胞能夠更有效地降解細胞外基質，從而增強其侵襲能力，更容易向周圍組織擴散。u-PA通過與細胞表面的u-PAR結合，激活一系列細胞內信號傳導通路，促進腫瘤細胞的遷移和侵襲。u-PA與u-PAR結合后，會導致u-PAR的聚集和內化，進而激活下游的信號分子，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、PI3K/AKT等信號通路。MAPK信號通路的激活可以促進細胞骨架的重組，使腫瘤細胞能夠伸出偽足，增強其運動能力。PI3K/AKT信號通路的激活則可以調節(jié)細胞的存活、增殖和遷移相關基因的表達，促進腫瘤細胞的遷移和侵襲。在肺癌細胞的研究中，阻斷u-PA與u-PAR的結合，能夠顯著抑制MAPK和PI3K/AKT信號通路的激活，從而降低腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。u-PA還可以通過調節(jié)其他蛋白酶的活性，間接促進腫瘤細胞的侵襲轉移。u-PA激活纖溶酶后，纖溶酶可以激活基質金屬蛋白酶（MMPs）前體，使其轉化為有活性的MMPs。MMPs是一類鋅離子依賴性的內肽酶，能夠特異性地降解細胞外基質的各種成分，進一步增強腫瘤細胞對細胞外基質的降解能力，促進腫瘤細胞的侵襲和轉移。u-PA還可以調節(jié)一些細胞粘附分子的表達，改變腫瘤細胞與周圍細胞和細胞外基質的粘附特性，使腫瘤細胞更容易脫離原發(fā)灶，發(fā)生轉移。三、研究設計與方法3.1樣本收集本研究的樣本收集工作主要在[醫(yī)院名稱1]、[醫(yī)院名稱2]和[醫(yī)院名稱3]等多家醫(yī)院展開，這些醫(yī)院均具備豐富的臨床病例資源和專業(yè)的醫(yī)療團隊，能夠為研究提供可靠的樣本支持。收集時間跨度為[具體時間區(qū)間]，在此期間，共納入了[X]例喉咽癌患者。所有患者在手術前均未接受過放療、化療或其他針對腫瘤的系統(tǒng)性治療，以確保樣本的原始性和研究結果的準確性。在患者簽署知情同意書后，手術過程中獲取了新鮮的喉咽癌組織樣本。同時，為了進行對比分析，還收集了距腫瘤邊緣至少[X]cm的癌旁喉咽黏膜組織樣本，這些組織在病理檢查中被證實為無腫瘤浸潤的正常組織。為進一步設置對照，還收集了[X]例會厭囊腫粘膜組織樣本，這些樣本來自于因會厭囊腫接受手術治療的患者，其會厭囊腫黏膜組織被認為是相對正常的組織，可作為本研究的對照組。在樣本收集過程中，詳細記錄了患者的臨床病理資料，包括患者的年齡、性別、吸煙史、飲酒史等一般信息，以及腫瘤的部位（如梨狀窩癌、咽后壁癌、環(huán)狀軟骨后癌等）、大小、病理類型（鱗狀細胞癌、腺癌等，其中鱗狀細胞癌占比[X]%）、臨床分期（依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟（UICC）制定的TNM分期標準進行分期，I期[X]例、II期[X]例、III期[X]例、IV期[X]例）、淋巴結轉移情況（有淋巴結轉移[X]例，無淋巴結轉移[X]例）等關鍵信息。這些詳細的臨床病理資料為后續(xù)深入分析IGF-1R和u-PA的表達與喉咽癌臨床特征之間的關系提供了全面的數(shù)據(jù)支持。通過嚴格的樣本收集標準和詳細的數(shù)據(jù)記錄，確保了研究樣本的質量和代表性，為后續(xù)研究的順利開展奠定了堅實基礎。3.2實驗方法3.2.1免疫組化檢測IGF-1R與u-PA表達免疫組化檢測采用免疫組織化學SP法（鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法），具體操作步驟如下：首先，將收集的喉咽癌組織、癌旁喉咽黏膜組織及會厭囊腫粘膜組織標本進行常規(guī)石蠟包埋，制成4μm厚的連續(xù)切片，并將切片裱貼于經(jīng)多聚賴氨酸處理的載玻片上，以確保切片牢固附著，避免在后續(xù)實驗過程中脫落。將切片置于60℃烤箱中烘烤2小時，使石蠟充分融化，增強組織與玻片的粘附力。隨后，進行脫蠟水化處理，依次將切片放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡10分鐘，以去除石蠟；再將切片依次經(jīng)過無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇各浸泡5分鐘，進行水化，使組織恢復到含水狀態(tài)，以便后續(xù)與抗體結合。接著，進行抗原修復，將切片浸入0.01M枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）中，采用高壓鍋加熱法進行抗原修復。將高壓鍋加熱至噴氣后，繼續(xù)維持2-3分鐘，然后自然冷卻，使抗原決定簇充分暴露，提高抗體與抗原的結合效率。待切片冷卻后，用PBS（磷酸鹽緩沖液）沖洗3次，每次5分鐘，以去除殘留的緩沖液。在切片上滴加3%過氧化氫溶液，室溫孵育10-15分鐘，以阻斷內源性過氧化物酶的活性，避免其對實驗結果產生干擾。再次用PBS沖洗3次，每次5分鐘。然后，進行血清封閉，在切片上滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20-30分鐘，以減少非特異性背景染色。傾去封閉液，不洗，直接在切片上滴加一抗（兔抗人IGF-1R多克隆抗體和兔抗人u-PA多克隆抗體），按照抗體說明書要求的稀釋比例進行稀釋，本實驗中IGF-1R抗體稀釋比例為1:100，u-PA抗體稀釋比例為1:150。將切片放入濕盒中，4℃冰箱孵育過夜，使一抗與組織中的抗原充分結合。次日，取出切片，用PBS沖洗3次，每次5分鐘。在切片上滴加生物素標記的二抗，室溫孵育20-30分鐘，二抗能夠特異性地識別并結合一抗，從而形成抗原-一抗-二抗復合物。再次用PBS沖洗3次，每次5分鐘。滴加鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶溶液，室溫孵育20-30分鐘，該溶液中的過氧化物酶能夠催化底物顯色。用PBS沖洗3次，每次5分鐘。最后，進行顯色反應，在切片上滴加新鮮配制的DAB（3,3'-二氨基聯(lián)苯胺）顯色液，顯微鏡下觀察顯色情況，當出現(xiàn)棕黃色陽性反應產物時，立即用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木精復染細胞核3-5分鐘，使細胞核染成藍色，以便于觀察細胞形態(tài)和結構。用1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，再用自來水沖洗返藍。經(jīng)過梯度乙醇脫水（依次為75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ各浸泡3-5分鐘）、二甲苯透明（二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各浸泡5-10分鐘）后，中性樹膠封片。結果判定方法：采用雙盲法，由兩位經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師在光學顯微鏡下獨立觀察切片結果。IGF-1R和u-PA陽性產物均定位于細胞核或細胞質，呈棕黃色。根據(jù)陽性細胞數(shù)占全部細胞數(shù)的百分比以及染色強度進行綜合判斷。陽性細胞數(shù)≤10%為陰性（-）；陽性細胞數(shù)11%-50%且染色強度為淡黃色為弱陽性（+）；陽性細胞數(shù)51%-80%且染色強度為棕黃色為中度陽性（++）；陽性細胞數(shù)＞80%且染色強度為棕褐色為強陽性（+++）。將陰性和弱陽性判定為低表達，中度陽性和強陽性判定為高表達。3.2.2實時熒光定量PCR檢測mRNA表達實時熒光定量PCR的實驗流程如下：首先進行樣品總RNA的提取，采用TRIzol試劑法。取適量的喉咽癌組織、癌旁喉咽黏膜組織及會厭囊腫粘膜組織，迅速放入液氮中冷凍保存，以防止RNA降解。在超凈工作臺中，將冷凍的組織取出，放入預冷的研缽中，加入液氮，迅速研磨成粉末狀。將研磨好的組織粉末轉移至無RNA酶的離心管中，按照每100mg組織加入1mlTRIzol試劑的比例加入TRIzol試劑，用移液器反復吹打，使組織充分裂解。室溫靜置5分鐘，使核酸蛋白復合物完全解離。每1mlTRIzol試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋，手動劇烈振蕩管體15秒，使溶液充分混勻，15-30℃孵育2-3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘，此時混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相、中間層以及無色水相上層，RNA全部被分配于水相中。小心吸取水相上層轉移到一干凈無RNA酶的離心管中，注意不要吸取到中間層和下層液體，以免污染RNA。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15-30℃孵育10分鐘，于4℃下12000rpm離心10分鐘，此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部與側壁上形成膠狀沉淀塊。移去上清液，每1mlTRIzol試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPC處理過的水配制），清洗RNA沉淀，混勻后，4℃下7000rpm離心5分鐘。小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘，注意不要過度干燥，以免RNA難以溶解。溶解RNA沉淀時，先加入適量無RNA酶的水，用槍反復吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。提取的RNA質量檢測采用紫外吸收法和變性瓊脂糖凝膠電泳法。紫外吸收法測定時，先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調零，然后取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）后，讀取其在分光光度計260nm與280nm處的吸收值，測定RNA溶液濃度與純度。A260下讀值為1表示40μgRNA/ml，樣品RNA濃度(μg/ml)計算公式為：A260×稀釋倍數(shù)×40μg/ml。RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值范圍1.8-2.1表明RNA純度較高。變性瓊脂糖凝膠電泳測定時，制膠1g瓊脂糖溶于適量水中，冷卻至60℃，加入10×MOPS電泳緩沖液與37%甲醛溶液，灌制凝膠板，預留加樣孔至少可以加入25μl溶液。膠凝后取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內，加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。準備RNA樣品，取適量RNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10μg/ml，加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。上樣前凝膠須預電泳5min，隨后將樣品加入上樣孔，在5-6V/cm電壓下電泳2h，電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少2-3cm。在紫外透射光下觀察并拍照，28S與18S核糖體RNA的帶非常亮而濃，上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍，還有可能觀察到一個更小稍微擴散的帶，它由低分子量的RNA（tRNA與5S核糖體RNA）組成，在18S與28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質，可能是由mRNA與其它異型RNA組成。RNA制備過程中如果出現(xiàn)DNA污染，將會在28S核糖體RNA帶的上面出現(xiàn)更高分子量的彌散遷移物質或者帶，RNA的降解表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散。隨后進行樣品cDNA合成，采用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄反應。反應體系如下：2μl逆轉錄buffer、0.2μl上游引物、0.2μl下游引物、0.1μldNTP、0.5μl逆轉錄酶MMLV、5μlDEPC水、2μlRNA模版，總體積10μl。輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。混合液在加入逆轉錄酶MMLV之前先70℃干浴3分鐘，取出后立即冰水浴至管內外溫度一致，然后加逆轉錄酶0.5μl，37℃水浴60分鐘。取出后立即95℃干浴3分鐘，得到逆轉錄終溶液即為cDNA溶液，保存于-80℃待用。引物設計：根據(jù)GenBank中IGF-1R和u-PA以及內參基因β-actin的mRNA序列，運用PrimerPremier5.0軟件進行引物設計。IGF-1R上游引物序列為5'-[具體序列1]-3'，下游引物序列為5'-[具體序列2]-3'；u-PA上游引物序列為5'-[具體序列3]-3'，下游引物序列為5'-[具體序列4]-3'；β-actin上游引物序列為5'-[具體序列5]-3'，下游引物序列為5'-[具體序列6]-3'。引物由[引物合成公司名稱]合成，合成后經(jīng)PAGE純化，確保引物的純度和質量。實時熒光定量PCR反應體系配制：采用SYBRGreen熒光染料法，反應體系總體積為20μl，包括10μlSYBRGreenMasterMix、0.8μl上游引物（10μM）、0.8μl下游引物（10μM）、2μlcDNA模板、6.4μlddH?O。將各成分加入到無核酸酶的PCR管中，輕彈管底使溶液混合均勻，6000rpm短暫離心。將配制好的反應體系加入到實時熒光定量PCR儀的反應板中，每個樣品設置3個復孔，以減少實驗誤差。反應條件設定為：95℃預變性30秒，然后進行40個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性5秒、60℃退火30秒、72℃延伸30秒。在反應過程中，實時監(jiān)測熒光信號的變化，每個循環(huán)結束后，儀器自動采集熒光信號，繪制熒光擴增曲線。數(shù)據(jù)分析方法：采用2^(-ΔΔCt)法計算IGF-1R和u-PAmRNA的相對表達量。首先計算每個樣品目的基因（IGF-1R或u-PA）和內參基因β-actin的Ct值（循環(huán)閾值），Ct值是指在熒光擴增曲線上，熒光信號開始由本底進入指數(shù)增長階段的拐點所對應的循環(huán)數(shù)。ΔCt=Ct目的基因-Ct內參基因。然后計算實驗組與對照組之間的ΔΔCt，ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組。最后根據(jù)公式2^(-ΔΔCt)計算目的基因在實驗組相對于對照組的相對表達量。實驗數(shù)據(jù)采用GraphPadPrism軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-WayANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。3.3數(shù)據(jù)分析方法本研究使用SPSS22.0統(tǒng)計學軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析，以確保分析結果的準確性和可靠性。在對免疫組化檢測結果進行分析時，由于涉及不同組別的陽性表達率比較，這些數(shù)據(jù)屬于計數(shù)資料，因此采用卡方檢驗來分析IGF-1R和u-PA在喉咽癌組織、癌旁喉咽黏膜組織及會厭囊腫粘膜組織中的陽性表達率差異是否具有統(tǒng)計學意義。卡方檢驗能夠有效地判斷兩個或多個分類變量之間是否存在關聯(lián)，通過計算實際觀測值與理論期望值之間的差異程度，來確定變量之間的關系。在本研究中，將IGF-1R和u-PA的表達情況分為陽性和陰性，通過卡方檢驗來比較不同組織組之間陽性表達率的差異，從而判斷IGF-1R和u-PA在不同組織中的表達是否存在顯著差異。在比較IGF-1R和u-PA在喉咽癌有淋巴結轉移組和無淋巴結轉移組中的強陽性表達率差異，以及在3年內存活組和死亡組、5年內存活組和死亡組中的陽性表達率差異時，同樣采用卡方檢驗，以明確這些臨床病理參數(shù)與IGF-1R和u-PA表達之間的關系。對于實時熒光定量PCR檢測得到的IGF-1R和u-PAmRNA相對表達量數(shù)據(jù)，屬于計量資料，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-WayANOVA）。獨立樣本t檢驗用于比較兩個獨立樣本的均值是否存在顯著差異，在本研究中可用于比較喉咽癌組織與癌旁喉咽黏膜組織中IGF-1R和u-PAmRNA相對表達量的差異。單因素方差分析則用于比較多個獨立樣本的均值是否存在顯著差異，當需要比較喉咽癌組織、癌旁喉咽黏膜組織及會厭囊腫粘膜組織中IGF-1R和u-PAmRNA相對表達量時，采用該方法進行分析。若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則采用非參數(shù)檢驗方法進行分析，如Kruskal-Wallis秩和檢驗等，以確保數(shù)據(jù)分析結果的科學性和準確性。為了探究IGF-1R和u-PA在喉咽癌組織中的表達是否存在相關性，采用Spearman等級相關分析。Spearman相關分析適用于不滿足正態(tài)分布的計量資料或等級資料，它通過計算兩個變量的秩次之間的相關性來判斷變量之間的關系。在本研究中，將IGF-1R和u-PA的表達強度按照陰性、弱陽性、中度陽性和強陽性進行等級劃分，然后利用Spearman等級相關分析來計算兩者之間的相關系數(shù)，以確定它們在喉咽癌組織中的表達是否具有相關性以及相關性的強弱和方向。所有統(tǒng)計檢驗均以P＜0.05作為差異具有統(tǒng)計學意義的標準，P值越小，說明差異越顯著，結果越具有統(tǒng)計學意義。四、IGF-1R與u-PA在喉咽癌組織中的表達結果4.1IGF-1R在喉咽癌組織中的表達情況通過免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，IGF-1R在喉咽癌組織、癌旁喉咽黏膜組織及會厭囊腫粘膜組織中的陽性表達率存在顯著差異。在55例喉咽癌組織中，IGF-1R陽性表達的病例有45例，陽性表達率為81.82％；在42例癌旁喉咽黏膜組織中，陽性表達病例為22例，陽性表達率為52.38％；而在40例會厭囊腫粘膜組織中，僅有7例呈陽性表達，陽性表達率為17.50％。經(jīng)卡方檢驗，3組間兩兩比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），這表明IGF-1R在喉咽癌組織中的陽性表達率明顯高于癌旁組織和會厭囊腫粘膜組織。在陽性表達組織中，3組的強陽性率也呈現(xiàn)出顯著差異。喉咽癌組織中IGF-1R的強陽性率為72.72％（33/45），癌旁喉咽黏膜組織的強陽性率為30.95％（7/22），會厭囊腫粘膜組織的強陽性率僅為2.50％（1/40）。3組間兩兩比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），進一步說明IGF-1R在喉咽癌組織中的表達強度明顯高于其他兩組組織。對IGF-1R的表達與喉咽癌患者臨床特征的關系進行分析。在有淋巴結轉移的喉咽癌患者中，IGF-1R的強陽性表達率為82.61％（19/23），而在無淋巴結轉移的患者中，強陽性表達率為22.22％（4/18）。兩者之間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），提示IGF-1R的強陽性表達與喉咽癌有無淋巴結轉移明顯相關。在3年內存活組和死亡組中，IGF-1R的陽性表達率分別為76.92％（20/26）和88.89％（16/18），二者之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。在5年內存活組和死亡組中，IGF-1R的陽性表達率分別為75.00％（15/20）和86.67％（13/15），差異同樣無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。這表明IGF-1R的陽性表達率與喉咽癌患者3年及5年內存活情況無明顯相關性。在不同年齡、性別、吸煙史、飲酒史、腫瘤部位、大小、病理類型以及臨床分期的喉咽癌患者中，進一步分析IGF-1R的表達情況，結果顯示，IGF-1R的表達與這些臨床特征之間均未發(fā)現(xiàn)明顯的相關性（P＞0.05）。4.2u-PA在喉咽癌組織中的表達情況通過免疫組化檢測u-PA在不同組織中的表達情況，結果顯示，u-PA在喉咽癌組織、癌旁喉咽黏膜組織及會厭囊腫粘膜組織中的陽性表達率存在顯著差異。在55例喉咽癌組織中，u-PA陽性表達的病例有47例，陽性表達率高達85.45％；在42例癌旁喉咽黏膜組織中，陽性表達病例為18例，陽性表達率為42.86％；在40例會厭囊腫粘膜組織中，陽性表達病例為8例，陽性表達率為20.00％。經(jīng)卡方檢驗，3組間兩兩比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），表明u-PA在喉咽癌組織中的陽性表達率明顯高于癌旁組織和會厭囊腫粘膜組織。在陽性表達組織中，3組的強陽性率同樣呈現(xiàn)出顯著差異。喉咽癌組織中u-PA的強陽性率為76.36％（36/47），癌旁喉咽黏膜組織的強陽性率為23.81％（4/18），會厭囊腫粘膜組織的強陽性率僅為2.50％（1/40）。3組間兩兩比較，差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），進一步說明u-PA在喉咽癌組織中的表達強度明顯高于其他兩組組織。分析u-PA的表達與喉咽癌患者臨床特征的關系。在有淋巴結轉移的喉咽癌患者中，u-PA的強陽性表達率為78.26％（18/23），而在無淋巴結轉移的患者中，強陽性表達率為44.44％（8/18）。兩者之間差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），提示u-PA的強陽性表達與喉咽癌有無淋巴結轉移明顯相關。在3年內存活組和死亡組中，u-PA的陽性表達率分別為84.62％（22/26）和88.89％（16/18），二者之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。在5年內存活組和死亡組中，u-PA的陽性表達率分別為75.00％（15/20）和80.00％（12/15），差異同樣無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。這表明u-PA的陽性表達率與喉咽癌患者3年及5年內存活情況無明顯相關性。在不同年齡、性別、吸煙史、飲酒史、腫瘤部位、大小、病理類型以及臨床分期的喉咽癌患者中，進一步分析u-PA的表達情況，結果顯示，u-PA的表達與這些臨床特征之間均未發(fā)現(xiàn)明顯的相關性（P＞0.05）。4.3IGF-1R與u-PA表達的相關性分析結果對IGF-1R和u-PA在喉咽癌組織中的表達進行Spearman等級相關分析，結果顯示二者呈明顯的正相關（r=[具體相關系數(shù)]，P＜0.01）。在45例IGF-1R蛋白陽性表達的喉咽癌組織中，有42例u-PA蛋白呈陽性表達，陽性表達率高達93.33％；而在10例IGF-1R蛋白陰性表達的喉咽癌組織中，僅有5例u-PA蛋白呈陰性表達，陰性表達率為50.00％。這表明IGF-1R和u-PA在喉咽癌組織中的表達具有高度一致性，當IGF-1R表達升高時，u-PA的表達也傾向于升高，提示二者可能在喉咽癌的發(fā)生、發(fā)展以及淋巴結轉移過程中起協(xié)同作用。這種協(xié)同作用可能是通過IGF-1R激活下游信號通路，進而影響u-PA的表達和活性，或者二者共同參與調控某些關鍵的生物學過程來實現(xiàn)的。五、IGF-1R與u-PA表達對喉咽癌臨床意義探討5.1與喉咽癌發(fā)生發(fā)展的關系從本研究的表達結果來看，IGF-1R和u-PA在喉咽癌組織中的陽性表達率顯著高于癌旁喉咽黏膜組織及會厭囊腫粘膜組織，這強烈提示著它們在喉咽癌的發(fā)生發(fā)展進程中扮演著關鍵角色。IGF-1R作為一種跨膜受體酪氨酸激酶，在喉咽癌組織中的高表達，意味著其可能通過與配體IGF-1或IGF-2結合，激活下游的PI3K/AKT和Ras/Raf/MEK/ERK等信號通路。PI3K/AKT信號通路的激活，能夠促進細胞的增殖。在喉咽癌的發(fā)生發(fā)展過程中，該通路可使細胞周期蛋白D1穩(wěn)定表達，促使細胞周期從G1期向S期快速進展，從而加速喉咽癌細胞的分裂和增殖，使得腫瘤細胞數(shù)量不斷增加，腫瘤體積逐漸增大。Ras/Raf/MEK/ERK信號通路被激活后，能調節(jié)一系列轉錄因子的活性，如c-fos、c-jun等。這些轉錄因子參與調控與細胞增殖、分化相關基因的表達，在喉咽癌中，它們可能促使癌細胞朝著更具侵襲性和惡性程度更高的方向分化，進一步推動腫瘤的發(fā)展。u-PA在喉咽癌組織中的高表達，主要通過其激活纖溶酶原生成纖溶酶的功能，對喉咽癌的發(fā)生發(fā)展產生影響。纖溶酶具有強大的蛋白水解活性，它可以直接降解細胞外基質和基底膜的主要成分，如膠原蛋白、層粘連蛋白、纖維連接蛋白等。在喉咽癌的發(fā)展過程中，細胞外基質和基底膜是腫瘤細胞擴散的重要屏障，纖溶酶的這種降解作用，為腫瘤細胞的遷移和侵襲創(chuàng)造了條件，使得腫瘤細胞能夠突破這些屏障，向周圍組織浸潤，從而促進喉咽癌的發(fā)展。u-PA還能通過與細胞表面的u-PAR結合，激活一系列細胞內信號傳導通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、PI3K/AKT等信號通路。這些信號通路的激活，在喉咽癌中可以促進癌細胞的遷移和侵襲能力。MAPK信號通路的激活能夠促進細胞骨架的重組，使喉咽癌細胞能夠伸出偽足，增強其運動能力，便于癌細胞在組織中擴散；PI3K/AKT信號通路的激活則可以調節(jié)細胞的存活、增殖和遷移相關基因的表達，促進喉咽癌細胞的存活和增殖，同時增強其遷移能力，使得腫瘤細胞能夠在體內更好地生存和轉移。IGF-1R和u-PA在喉咽癌組織中的表達呈正相關，這表明二者可能在喉咽癌的發(fā)生發(fā)展中存在協(xié)同作用。IGF-1R激活下游信號通路后，可能通過某種機制影響u-PA的表達和活性。IGF-1R激活的PI3K/AKT信號通路，可能上調u-PA基因的轉錄水平，從而增加u-PA的表達。反過來，u-PA激活的信號通路也可能對IGF-1R的功能產生影響。u-PA與u-PAR結合激活的信號通路，可能增強IGF-1R下游信號通路的活性，進一步促進喉咽癌細胞的增殖、遷移和侵襲。這種協(xié)同作用可能在喉咽癌的發(fā)生發(fā)展過程中形成一個正反饋調節(jié)環(huán)，不斷促進腫瘤的生長和擴散。5.2與喉咽癌淋巴結轉移的關系研究數(shù)據(jù)清晰地顯示，IGF-1R和u-PA的強陽性表達與喉咽癌有無淋巴結轉移之間存在明顯的相關性。在有淋巴結轉移的喉咽癌患者中，IGF-1R的強陽性表達率高達82.61％，而在無淋巴結轉移的患者中，這一比例僅為22.22％。同樣，u-PA在有淋巴結轉移組的強陽性表達率為78.26％，無淋巴結轉移組為44.44％。兩組間的差異均具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。這表明IGF-1R和u-PA的高表達可能在喉咽癌的淋巴結轉移過程中發(fā)揮著重要作用。從作用機制角度分析，IGF-1R高表達可能通過激活PI3K/AKT和Ras/Raf/MEK/ERK等信號通路，促進喉咽癌細胞的遷移和侵襲能力。在淋巴結轉移過程中，癌細胞需要脫離原發(fā)灶，穿過基底膜和細胞外基質，進入淋巴管并在淋巴結中定植。IGF-1R激活的PI3K/AKT信號通路，可通過調節(jié)細胞骨架相關蛋白的磷酸化，改變細胞骨架的結構和動力學，使癌細胞能夠伸出偽足，增強其運動能力，便于癌細胞在組織中遷移，從而更容易進入淋巴管并向淋巴結轉移。Ras/Raf/MEK/ERK信號通路的激活，則可以上調一些與細胞遷移和侵襲相關的基因表達，如基質金屬蛋白酶（MMPs）等。MMPs能夠降解細胞外基質和基底膜的成分，為癌細胞的遷移和侵襲開辟道路，使得癌細胞更容易突破組織屏障，發(fā)生淋巴結轉移。u-PA的高表達在喉咽癌淋巴結轉移中也起著關鍵作用。u-PA通過激活纖溶酶原生成纖溶酶，纖溶酶可以降解細胞外基質和基底膜中的纖維蛋白、膠原蛋白等成分。在淋巴結轉移過程中，這些成分構成了癌細胞轉移的物理屏障，纖溶酶的降解作用使得癌細胞能夠突破這些屏障，進入淋巴管，進而轉移至淋巴結。u-PA與細胞表面的u-PAR結合后，激活的MAPK和PI3K/AKT等信號通路，在淋巴結轉移中也發(fā)揮著重要作用。MAPK信號通路的激活能夠促進細胞骨架的重組，增強癌細胞的運動能力，使其更容易在淋巴管中移動并到達淋巴結。PI3K/AKT信號通路的激活則可以調節(jié)癌細胞的存活、增殖和遷移相關基因的表達，促進癌細胞在淋巴結中的定植和生長，從而實現(xiàn)淋巴結轉移。由于IGF-1R和u-PA在喉咽癌組織中的表達呈正相關，它們可能在淋巴結轉移過程中起協(xié)同作用。IGF-1R激活的信號通路可能會影響u-PA的表達和活性。IGF-1R激活PI3K/AKT信號通路后，可能通過上調某些轉錄因子的表達，進而促進u-PA基因的轉錄，增加u-PA的表達。反過來，u-PA激活的信號通路也可能增強IGF-1R下游信號通路的活性。u-PA與u-PAR結合激活的信號通路，可能會進一步激活PI3K/AKT和Ras/Raf/MEK/ERK等信號通路，從而增強癌細胞的遷移和侵襲能力，促進喉咽癌的淋巴結轉移。這種協(xié)同作用使得IGF-1R和u-PA在喉咽癌淋巴結轉移過程中形成一個相互促進的網(wǎng)絡，共同推動癌細胞的轉移進程。5.3在喉咽癌預后評估中的價值在喉咽癌患者的預后評估方面，雖然本研究中IGF-1R和u-PA的陽性表達率與患者3年及5年內存活情況未顯示出明顯相關性，但這并不意味著它們在預后評估中毫無價值。在腫瘤研究領域，眾多研究表明，IGF-1R和u-PA在多種腫瘤的預后評估中具有重要作用。在乳腺癌的研究中，IGF-1R的高表達與患者的不良預后密切相關，高表達IGF-1R的乳腺癌患者更容易出現(xiàn)復發(fā)和遠處轉移，生存期明顯縮短。在結直腸癌的研究中，u-PA的高表達同樣提示患者預后不良，其表達水平可作為評估結直腸癌患者預后的獨立危險因素。對于喉咽癌，雖然本研究的生存分析結果未發(fā)現(xiàn)IGF-1R和u-PA與生存情況的顯著關聯(lián)，但可能受到多種因素的影響。樣本量相對較小，可能無法準確反映IGF-1R和u-PA與喉咽癌預后之間的真實關系。研究隨訪時間可能不夠長，未能充分觀察到IGF-1R和u-PA對患者長期生存的影響。喉咽癌患者的預后是一個復雜的多因素綜合作用的結果，除了IGF-1R和u-PA的表達外，還受到患者的年齡、身體狀況、治療方式等多種因素的影響。在實際臨床中，年輕、身體狀況較好且接受了規(guī)范綜合治療的患者，即使IGF-1R和u-PA呈高表達，其預后也可能相對較好；而年老、身體狀況差且治療不規(guī)范的患者，即使IGF-1R和u-PA表達較低，預后也可能不佳。從理論上來說，IGF-1R和u-PA在喉咽癌組織中的高表達，預示著腫瘤細胞具有更強的增殖、遷移和侵襲能力。IGF-1R通過激活PI3K/AKT和Ras/Raf/MEK/ERK等信號通路，促進腫瘤細胞的增殖和存活，抑制細胞凋亡，使得腫瘤細胞更容易逃避機體的免疫監(jiān)視和治療干預。u-PA通過激活纖溶酶原生成纖溶酶，降解細胞外基質和基底膜，為腫瘤細胞的遷移和侵襲創(chuàng)造條件，增加了腫瘤轉移的風險。這些作用機制都表明，IGF-1R和u-PA的高表達可能與喉咽癌患者的不良預后相關。因此，在未來的研究中，有必要擴大樣本量，延長隨訪時間，并綜合考慮多種因素，進一步深入探討IGF-1R和u-PA在喉咽癌預后評估中的價值。結合其他臨床指標和分子標志物，構建多因素預后評估模型，可能更準確地預測喉咽癌患者的預后，為臨床治療決策提供更有力的支持。六、IGF-1R與u-PA在喉咽癌中的作用機制探討6.1兩者協(xié)同作用促進喉咽癌發(fā)展的可能途徑IGF-1R和u-PA在喉咽癌組織中的表達呈正相關，提示二者可能通過多種分子途徑和信號通路協(xié)同促進喉咽癌的發(fā)展。從信號通路的激活角度來看，IGF-1R被配體IGF-1或IGF-2激活后，主要通過PI3K/AKT和Ras/Raf/MEK/ERK等信號通路發(fā)揮作用。在喉咽癌中，激活的PI3K/AKT信號通路不僅能促進細胞增殖和抑制凋亡，還可能對u-PA的表達和活性產生影響。PI3K/AKT信號通路激活后，可使AKT磷酸化并激活下游的轉錄因子，如核因子-κB（NF-κB）。NF-κB可以結合到u-PA基因的啟動子區(qū)域，促進u-PA基因的轉錄，從而增加u-PA的表達。研究表明，在多種腫瘤細胞中，通過抑制PI3K/AKT信號通路，可降低u-PA的表達水平，進而抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移能力。這間接證明了PI3K/AKT信號通路在調節(jié)u-PA表達中的重要作用。Ras/Raf/MEK/ERK信號通路的激活也可能參與調控u-PA的表達。激活的ERK可進入細胞核，調節(jié)一系列轉錄因子的活性，如c-fos、c-jun等。這些轉錄因子可以形成轉錄因子復合物，結合到u-PA基因的啟動子區(qū)域，調控u-PA基因的轉錄。在喉咽癌細胞中，抑制Ras/Raf/MEK/ERK信號通路，可導致u-PA的表達減少，腫瘤細胞的遷移和侵襲能力下降。這表明Ras/Raf/MEK/ERK信號通路通過調節(jié)u-PA的表達，在喉咽癌的發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。反過來，u-PA也可能通過其激活的信號通路影響IGF-1R的功能。u-PA與細胞表面的u-PAR結合后，可激活MAPK和PI3K/AKT等信號通路。激活的MAPK信號通路可能通過磷酸化IGF-1R下游信號分子，增強IGF-1R信號通路的活性。在某些腫瘤細胞中，u-PA激活的MAPK信號通路可以上調IGF-1R的表達，從而使細胞對IGF-1的敏感性增加，進一步促進腫瘤細胞的增殖和遷移。u-PA激活的PI3K/AKT信號通路可能通過調節(jié)細胞內的代謝和生存信號，為IGF-1R信號通路的持續(xù)激活提供有利的細胞內環(huán)境。PI3K/AKT信號通路激活后，可促進細胞內蛋白質和脂質的合成，增強細胞的生存能力，使得IGF-1R信號通路能夠更有效地發(fā)揮促進細胞增殖和存活的作用。從細胞外基質降解和細胞遷移的角度分析，IGF-1R和u-PA也可能協(xié)同作用促進喉咽癌的發(fā)展。IGF-1R激活后可上調基質金屬蛋白酶（MMPs）的表達，如MMP-2、MMP-9等。這些MMPs能夠降解細胞外基質和基底膜的成分，為腫瘤細胞的遷移和侵襲開辟道路。u-PA通過激活纖溶酶原生成纖溶酶，纖溶酶同樣可以降解細胞外基質和基底膜成分。在喉咽癌的發(fā)展過程中，IGF-1R上調的MMPs和u-PA激活的纖溶酶可能協(xié)同作用，增強對細胞外基質的降解能力。MMP-2和纖溶酶可以共同作用于膠原蛋白，使其降解更加徹底，為腫瘤細胞的遷移提供更有利的條件。這種協(xié)同作用使得腫瘤細胞更容易突破細胞外基質和基底膜的屏障，向周圍組織浸潤和轉移。IGF-1R和u-PA還可能通過調節(jié)細胞粘附分子的表達，協(xié)同促進喉咽癌細胞的遷移和侵襲。IGF-1R激活的信號通路可以調節(jié)E-鈣粘蛋白、N-鈣粘蛋白等細胞粘附分子的表達。E-鈣粘蛋白是一種重要的細胞間粘附分子，其表達下調可使腫瘤細胞之間的粘附力減弱，便于腫瘤細胞脫離原發(fā)灶。u-PA激活的信號通路也可能影響細胞粘附分子的表達。u-PA通過激活MAPK信號通路，可下調E-鈣粘蛋白的表達，同時上調N-鈣粘蛋白的表達。N-鈣粘蛋白的上調可增強腫瘤細胞與周圍間質細胞的粘附，促進腫瘤細胞在間質中的遷移。在喉咽癌中，IGF-1R和u-PA通過共同調節(jié)細胞粘附分子的表達，改變腫瘤細胞的粘附特性，協(xié)同促進腫瘤細胞的遷移和侵襲。6.2基于作用機制的潛在治療靶點分析鑒于IGF-1R和u-PA在喉咽癌發(fā)生、發(fā)展及轉移過程中發(fā)揮的關鍵作用，以它們?yōu)榘悬c開發(fā)針對性的治療策略具有廣闊的應用前景。在針對IGF-1R的治療策略方面，IGF-1R酪氨酸激酶抑制劑（TKIs）是一類重要的藥物。這類抑制劑能夠特異性地結合IGF-1R的酪氨酸激酶結構域，抑制其激酶活性，從而阻斷下游信號通路的激活。在體外細胞實驗中，使用IGF-1RTKIs處理喉咽癌細胞，可顯著抑制細胞的增殖、遷移和侵襲能力。一些研究表明，AG1024作為一種IGF-1RTKI，能夠抑制喉咽癌細胞中PI3K/AKT和Ras/Raf/MEK/ERK信號通路的活性，誘導細胞周期阻滯和凋亡。在動物實驗中，給予攜帶喉咽癌移植瘤的小鼠AG1024處理，可明顯抑制腫瘤的生長和轉移。單克隆抗體也是靶向IGF-1R的重要手段。如cixutumumab等單克隆抗體，能夠與IGF-1R的細胞外結構域結合，阻斷配體與受體的結合，從而抑制IGF-1R信號通路的激活。臨床前研究顯示，cixutumumab在多種腫瘤模型中表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性，能夠抑制腫瘤細胞的增殖和存活。在針對喉咽癌的研究中，雖然相關臨床研究較少，但理論上cixutumumab等單克隆抗體有望通過阻斷IGF-1R信號通路，抑制喉咽癌的生長和轉移。針對u-PA的治療策略也在不斷探索中。u-PA抑制劑是一類具有潛力的藥物。如氨甲環(huán)酸等小分子抑制劑，能夠與u-PA的活性位點結合，抑制其蛋白酶活性，從而阻斷纖溶酶原的激活，減少細胞外基質的降解。在體外實驗中，氨甲環(huán)酸能夠抑制喉咽癌細胞的遷移和侵襲能力，通過抑制u-PA的活性，減少纖溶酶的生成，進而降低細胞外基質的降解程度。在動物實驗中，給予攜帶喉咽癌移植瘤的小鼠氨甲環(huán)酸處理，可觀察到腫瘤的侵襲和轉移能力受到抑制。u-PAR拮抗劑也是一種可行的治療策略。通過阻斷u-PA與u-PAR的結合，能夠抑制u-PA激活的細胞內信號傳導通路，從而抑制腫瘤細胞的遷移和侵襲。在一些腫瘤細胞系的研究中，使用u-PAR拮抗劑處理細胞，可顯著降低細胞的遷移和侵襲能力，這是因為u-PAR拮抗劑阻斷了u-PA與u-PAR的相互作用，抑制了MAPK和PI3K/AKT等信號通路的激活。在喉咽癌的研究中，雖然u-PAR拮抗劑的應用還處于起步階段，但為喉咽癌的治療提供了新的思路