Survivin與VEGF在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床關(guān)聯(lián)探究一、引言1.1研究背景腎細(xì)胞癌（RenalCellCarcinoma，RCC）是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，約占成人腎臟惡性腫瘤的90%，發(fā)病率僅次于膀胱癌，在泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤中位居第二。在各類腎細(xì)胞癌中，腎透明細(xì)胞癌（ClearCellRenalCellCarcinoma，ccRCC）最為常見，占腎癌的70%-80%。近年來，腎透明細(xì)胞癌的發(fā)病率呈上升趨勢，嚴(yán)重威脅人類健康。早期腎透明細(xì)胞癌癥狀隱匿，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，錯過了最佳手術(shù)時機(jī)。對于晚期患者，治療手段有限，放療、化療效果不佳，免疫治療和靶向治療雖有一定療效，但易出現(xiàn)耐藥，患者預(yù)后較差，5年生存率較低。因此，深入探究腎透明細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的診斷標(biāo)志物和治療靶點迫在眉睫。腫瘤的發(fā)生與發(fā)展是一個多因素、多步驟的復(fù)雜過程，涉及多種基因的調(diào)控。其中，Survivin和血管內(nèi)皮生長因子（VascularEndothelialGrowthFactor，VEGF）在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮著重要作用。Survivin是凋亡抑制蛋白（InhibitorofApoptosisProteins，IAPs）家族的重要成員。IAPs家族通過抑制半胱天冬酶（Caspase）的活性來阻斷細(xì)胞凋亡過程，從而促進(jìn)細(xì)胞存活。Survivin基因位于染色體17q25，長度范圍在75-130kb，含3個內(nèi)含子和4個外顯子。它特異地表達(dá)于人和鼠的胚胎發(fā)育組織以及多數(shù)人類腫瘤細(xì)胞，在正常成人組織的表達(dá)僅見于胸腺、睪丸和分泌期子宮內(nèi)膜。Survivin是至今發(fā)現(xiàn)作用最強(qiáng)的凋亡抑制蛋白之一，其作用機(jī)制尚未完全研究清楚。目前認(rèn)為，Survivin一方面通過與Caspase-3和Caspase-7結(jié)合并抑制其活性，阻斷細(xì)胞的凋亡過程；另一方面，Survivin還可以抑制線粒體依賴凋亡途徑的上游啟動子Caspase-9，減少活性Caspase-3、Caspase-7的產(chǎn)生，從而發(fā)揮抗凋亡作用。在多種惡性腫瘤中，如乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌等，Survivin均呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，且與腫瘤細(xì)胞的增殖、抗凋亡能力密切相關(guān)，與患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)。在乳腺癌中，高表達(dá)Survivin的患者無病生存期和總生存期明顯縮短；在肺癌中，Survivin通過抑制Caspase-3等凋亡蛋白酶的活性，阻止細(xì)胞凋亡進(jìn)程，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活和生長，同時還參與腫瘤血管生成，為腫瘤的快速生長提供充足的營養(yǎng)供應(yīng)。VEGF是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，增加血管通透性等作用。在腫瘤生長過程中，由于腫瘤細(xì)胞的快速增殖，會導(dǎo)致局部組織缺氧，從而刺激腫瘤細(xì)胞和周圍間質(zhì)細(xì)胞分泌VEGF。VEGF與其受體結(jié)合后，激活下游信號通路，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，形成新生血管，為腫瘤細(xì)胞提供氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，同時也為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供了途徑。大量研究表明，VEGF在多種腫瘤組織中高表達(dá)，且與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。在肝癌中，VEGF的高表達(dá)與腫瘤的大小、分期以及患者的預(yù)后不良相關(guān)；在胃癌中，VEGF的表達(dá)水平與腫瘤的侵襲深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在腎透明細(xì)胞癌的研究中，Survivin和VEGF也受到了廣泛關(guān)注。已有研究表明，Survivin在腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)明顯高于正常腎組織，且與腎透明細(xì)胞癌的病理分級、臨床分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)特性密切相關(guān)。VEGF在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)也顯著升高，其表達(dá)水平與腫瘤的分級、分期、轉(zhuǎn)移等相關(guān)。然而，目前關(guān)于Survivin和VEGF在腎透明細(xì)胞癌中的具體作用機(jī)制及二者之間的相關(guān)性研究仍有待深入。本研究旨在通過檢測Survivin和VEGF在腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)水平，分析它們與腎透明細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系，探討二者在腎透明細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用及相互關(guān)系，為腎透明細(xì)胞癌的早期診斷、病情評估、預(yù)后判斷以及靶向治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶點。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀近年來，腎透明細(xì)胞癌的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢，已成為嚴(yán)重威脅人類健康的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤之一。對于腎透明細(xì)胞癌的研究，Survivin和VEGF一直是國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的重點，它們在腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用。在國外，Parker等學(xué)者通過對大量腎透明細(xì)胞癌組織標(biāo)本的檢測，發(fā)現(xiàn)Survivin蛋白高表達(dá)水平可獨立預(yù)測接受手術(shù)治療患者的不良預(yù)后。這一研究結(jié)果表明，Survivin在腎透明細(xì)胞癌的預(yù)后評估中具有重要價值，高表達(dá)的Survivin可能預(yù)示著患者術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險增加、生存期縮短。另有研究通過對腎透明細(xì)胞癌患者的長期隨訪，分析Survivin表達(dá)與患者生存時間的關(guān)系，進(jìn)一步證實了Survivin高表達(dá)與不良預(yù)后的相關(guān)性。在VEGF方面，國外的多項研究表明，VEGF在腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)顯著高于正常腎組織，且其表達(dá)水平與腫瘤的大小、分期以及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。例如，一項針對轉(zhuǎn)移性腎透明細(xì)胞癌的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中VEGF高表達(dá)的患者更容易出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，生存時間明顯縮短。這說明VEGF不僅在腎透明細(xì)胞癌的血管生成中發(fā)揮關(guān)鍵作用，還與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)，可作為評估腎透明細(xì)胞癌患者病情和預(yù)后的重要指標(biāo)。國內(nèi)學(xué)者也在Survivin和VEGF與腎透明細(xì)胞癌的關(guān)系研究中取得了一系列成果。朱李兵等人收集53例腎透明細(xì)胞癌組織及8例正常腎組織，以免疫組織化學(xué)方法檢測Survivin蛋白表達(dá)，半定量RT-PCR方法檢測腎透明細(xì)胞癌中SurvivinmRNA表達(dá)水平，結(jié)果顯示62.3%（33例）腎透明細(xì)胞癌組織表達(dá)Survivin蛋白，而正常腎組織無1例陽性表達(dá)；RT-PCR結(jié)果表明，SurvivinmRNA陽性表達(dá)率為56.25%（18/32），且Survivin表達(dá)與病理分級、臨床分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)特性密切相關(guān)。這一研究結(jié)果為Survivin在腎透明細(xì)胞癌中的臨床應(yīng)用提供了重要的理論依據(jù)，提示Survivin可能成為腎透明細(xì)胞癌診斷和治療的潛在靶點。在VEGF的研究中，國內(nèi)有研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測腎透明細(xì)胞癌組織中VEGF蛋白表達(dá)，通過CD34抗體標(biāo)記血管內(nèi)皮來計算微血管密度（MVD）值，探討VEGF表達(dá)及MVD的臨床病理意義。結(jié)果顯示，66例腎透明細(xì)胞癌VEGF蛋白表達(dá)陽性率為54.5%（36/66），MVD值與腫瘤分級、分期相關(guān)，分級高、分期晚的透明細(xì)胞癌MVD值比分級低、分期早的低，有轉(zhuǎn)移的腎透明細(xì)胞癌MVD值低，沒有轉(zhuǎn)移者M(jìn)VD值高。這表明VEGF在腎透明細(xì)胞癌的血管生成和腫瘤進(jìn)展中具有重要作用，其表達(dá)水平和MVD值可作為評估腎透明細(xì)胞癌惡性程度和預(yù)后的重要指標(biāo)。此外，國內(nèi)還有研究關(guān)注Survivin和VEGF在腎透明細(xì)胞癌中的聯(lián)合作用。楊曉波等人采用免疫組化SP法和蛋白印記法檢測10例正常腎臟組織，32例腎癌組織中Survivin、VEGF蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Survivin和VEGF在腎癌組織中的陽性表達(dá)率為53.1%和34.4%，在正常腎組織中均不表達(dá)，其表達(dá)隨腫瘤的臨床分期、病理分級的增高而增強(qiáng)，兩者表達(dá)水平間呈正相關(guān)關(guān)系（P=0.018）。這提示Survivin和VEGF可能在腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過程中存在協(xié)同作用，聯(lián)合檢測兩者的表達(dá)對于腎透明細(xì)胞癌的預(yù)后判斷和治療指導(dǎo)具有重要意義。盡管國內(nèi)外在Survivin和VEGF與腎透明細(xì)胞癌的研究方面取得了一定進(jìn)展，但仍存在一些問題和不足。目前對于Survivin和VEGF在腎透明細(xì)胞癌中的具體作用機(jī)制尚未完全明確，兩者之間的相互作用關(guān)系及信號通路仍有待進(jìn)一步深入研究。此外，如何將Survivin和VEGF作為有效的生物標(biāo)志物應(yīng)用于腎透明細(xì)胞癌的早期診斷、病情監(jiān)測和靶向治療，以及如何開發(fā)針對它們的特異性治療藥物，仍需要更多的基礎(chǔ)研究和臨床實踐來探索和驗證。1.3研究目的與意義本研究旨在深入探究Survivin和VEGF在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)情況，全面分析它們與腎透明細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)聯(lián)，深入探討二者在腎透明細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用及相互關(guān)系，為腎透明細(xì)胞癌的早期診斷、病情評估、預(yù)后判斷以及靶向治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶點。腎透明細(xì)胞癌作為泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，發(fā)病率呈上升趨勢，嚴(yán)重威脅人類健康。早期腎透明細(xì)胞癌癥狀隱匿，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，錯過最佳手術(shù)時機(jī)，且晚期患者治療手段有限，預(yù)后較差，5年生存率較低。因此，尋找有效的診斷標(biāo)志物和治療靶點至關(guān)重要。Survivin作為凋亡抑制蛋白家族的重要成員，通過抑制半胱天冬酶的活性來阻斷細(xì)胞凋亡過程，促進(jìn)細(xì)胞存活。在多種惡性腫瘤中，Survivin均呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，與腫瘤細(xì)胞的增殖、抗凋亡能力密切相關(guān)，且與患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)。VEGF作為一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，在腫瘤生長過程中，可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，形成新生血管，為腫瘤細(xì)胞提供氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，同時也為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供途徑。在多種腫瘤組織中，VEGF高表達(dá)，且與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。深入研究Survivin和VEGF在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及臨床意義具有重要價值。在診斷方面，通過檢測Survivin和VEGF的表達(dá)水平，有望為腎透明細(xì)胞癌的早期診斷提供更敏感、特異的生物標(biāo)志物，有助于提高早期診斷率，為患者爭取更多的治療時機(jī)。在治療方面，明確二者在腎透明細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制及相互關(guān)系，可為開發(fā)針對Survivin和VEGF的靶向治療藥物提供理論基礎(chǔ)，從而實現(xiàn)精準(zhǔn)治療，提高治療效果，減少不良反應(yīng)。在預(yù)后判斷方面，分析Survivin和VEGF的表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系，可更準(zhǔn)確地評估患者的預(yù)后，為臨床制定個性化的治療方案和隨訪計劃提供重要參考。綜上所述，本研究對于深入理解腎透明細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制，提高腎透明細(xì)胞癌的診療水平，改善患者的預(yù)后具有重要的理論和臨床意義。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1腎透明細(xì)胞癌概述腎透明細(xì)胞癌（ClearCellRenalCellCarcinoma，ccRCC）是腎癌中最常見的病理類型，約占腎癌的70%-80%。它起源于腎小管上皮細(xì)胞，因其癌細(xì)胞在顯微鏡下呈現(xiàn)透明狀而得名。腎透明細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，涉及遺傳因素、基因突變、環(huán)境因素等多個方面。遺傳因素在腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生中起著重要作用。大約2%的腎透明細(xì)胞癌是由遺傳因素導(dǎo)致的，如VHL綜合征、遺傳性乳頭狀腎癌等遺傳性疾病與腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生密切相關(guān)。在VHL綜合征患者中，由于VHL基因的突變，導(dǎo)致其編碼的蛋白質(zhì)功能異常，無法正常調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧感應(yīng)通路，進(jìn)而引發(fā)一系列信號通路的改變，最終促進(jìn)腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展。研究表明，VHL基因的突變可導(dǎo)致缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）的穩(wěn)定表達(dá)，HIF可進(jìn)一步激活下游多個與腫瘤發(fā)生相關(guān)的基因，如VEGF、血小板衍生生長因子（PDGF）等，這些基因的異常表達(dá)促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖、血管生成和轉(zhuǎn)移?；蛲蛔円彩悄I透明細(xì)胞癌發(fā)生的重要原因之一。除了VHL基因突變外，在腎透明細(xì)胞癌中還發(fā)現(xiàn)了其他多種基因突變，如PBRM1、SETD2、BAP1等基因的突變。這些基因突變可通過不同的機(jī)制影響細(xì)胞的正常生物學(xué)功能，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。PBRM1基因編碼的蛋白質(zhì)參與染色質(zhì)重塑過程，其突變可導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和基因表達(dá)的異常，影響細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等過程。研究發(fā)現(xiàn)，在約40%的腎透明細(xì)胞癌中存在PBRM1基因的突變，且該突變與腫瘤的分期、分級以及患者的預(yù)后密切相關(guān)。環(huán)境因素也與腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生風(fēng)險增加有關(guān)。吸煙是目前最為明確的腎透明細(xì)胞癌致病危險因素之一，吸煙者患腎透明細(xì)胞癌的幾率是不吸煙者的1.5-2.5倍。煙草中含有多種致癌物質(zhì)，如尼古丁、煙焦油等，這些物質(zhì)可通過多種途徑對腎臟細(xì)胞造成損傷，引發(fā)基因突變，從而增加腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生風(fēng)險。肥胖也是導(dǎo)致腎透明細(xì)胞癌發(fā)生的相對明確因素，比較肥胖者發(fā)生透明細(xì)胞癌的機(jī)會比非肥胖者大約增加了0.5-0.8的風(fēng)險值。肥胖可引起體內(nèi)代謝紊亂，導(dǎo)致胰島素抵抗、慢性炎癥等，這些因素可刺激腎臟細(xì)胞的異常增殖和分化，促進(jìn)腫瘤的形成。職業(yè)暴露，如接觸重金屬鉻等，也可能導(dǎo)致腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生。此外，高血壓及抗高血壓藥物與腎透明細(xì)胞癌的關(guān)系仍存在爭議，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，治療高血壓的藥物，尤其是利尿性藥物，有可能會引起腎透明細(xì)胞癌。在流行病學(xué)方面，腎透明細(xì)胞癌的發(fā)病率存在一定的地域和性別差異。在全球范圍內(nèi)，歐美國家的發(fā)病率相對較高，亞洲國家相對較低。男性的發(fā)病率高于女性，男女發(fā)病比例約為2:1。近年來，隨著人口老齡化和生活方式的改變，腎透明細(xì)胞癌的發(fā)病率呈逐漸上升趨勢。早期腎透明細(xì)胞癌通常無癥狀，多在體檢或因其他疾病檢查時偶然發(fā)現(xiàn)。隨著腫瘤的進(jìn)展，患者可能出現(xiàn)血尿、腰痛、腹部腫塊等典型癥狀，部分患者還可能出現(xiàn)發(fā)熱、消瘦、貧血等全身癥狀。一旦出現(xiàn)這些癥狀，往往提示腫瘤已處于中晚期，預(yù)后較差。因此，早期診斷和治療對于提高腎透明細(xì)胞癌患者的生存率至關(guān)重要。2.2Survivin相關(guān)理論Survivin是凋亡抑制蛋白（InhibitorofApoptosisProteins，IAPs）家族中的關(guān)鍵成員，在細(xì)胞的存活與凋亡調(diào)控過程中發(fā)揮著極為重要的作用。IAPs家族的核心功能是通過抑制半胱天冬酶（Caspase）的活性，從而有效阻斷細(xì)胞凋亡進(jìn)程，為細(xì)胞的持續(xù)存活提供保障。從基因結(jié)構(gòu)來看，Survivin基因定位于染色體17q25，其長度范圍在75-130kb之間，包含3個內(nèi)含子和4個外顯子。這種獨特的基因結(jié)構(gòu)為Survivin的功能多樣性奠定了基礎(chǔ)。在表達(dá)分布方面，Survivin展現(xiàn)出高度的特異性，它在人和鼠的胚胎發(fā)育組織以及絕大多數(shù)人類腫瘤細(xì)胞中均有顯著表達(dá)。在胚胎發(fā)育階段，Survivin的表達(dá)對于維持細(xì)胞的存活和組織器官的正常發(fā)育至關(guān)重要，它確保了胚胎細(xì)胞在復(fù)雜的發(fā)育過程中免受不必要的凋亡影響，為胚胎的正常生長和分化提供了穩(wěn)定的細(xì)胞環(huán)境。在腫瘤細(xì)胞中，Survivin的高表達(dá)則成為腫瘤細(xì)胞逃避凋亡、實現(xiàn)快速增殖的關(guān)鍵因素之一。與之形成鮮明對比的是，在正常成人組織中，Survivin的表達(dá)極為有限，僅在胸腺、睪丸和分泌期子宮內(nèi)膜等少數(shù)組織中可檢測到。這表明Survivin的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其在正常組織和腫瘤組織中的表達(dá)差異，為腫瘤的診斷和治療提供了潛在的靶點。Survivin是目前已知作用最強(qiáng)的凋亡抑制蛋白之一，然而其確切的作用機(jī)制尚未完全明晰，仍有待進(jìn)一步深入研究。當(dāng)前的研究普遍認(rèn)為，Survivin主要通過以下兩種途徑發(fā)揮其抗凋亡作用。一方面，Survivin能夠與Caspase-3和Caspase-7緊密結(jié)合，直接抑制這兩種半胱天冬酶的活性，從而切斷細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵信號傳導(dǎo)通路，有效阻斷細(xì)胞的凋亡進(jìn)程。Caspase-3和Caspase-7在細(xì)胞凋亡的執(zhí)行階段扮演著核心角色，它們能夠切割多種細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)和功能的改變，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。Survivin與它們的結(jié)合，就像在凋亡信號傳導(dǎo)的鏈條上安裝了一個“剎車裝置”，阻止了凋亡信號的進(jìn)一步傳遞，使得細(xì)胞得以繼續(xù)存活。另一方面，Survivin還可以作用于線粒體依賴凋亡途徑的上游啟動子Caspase-9。通過抑制Caspase-9的活性，Survivin減少了活性Caspase-3、Caspase-7的產(chǎn)生，從源頭上抑制了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。線粒體依賴的凋亡途徑是細(xì)胞凋亡的重要通路之一，當(dāng)細(xì)胞受到各種凋亡刺激時，線粒體的膜電位會發(fā)生改變，釋放出細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子，這些因子會激活Caspase-9，進(jìn)而引發(fā)Caspase級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。Survivin對Caspase-9的抑制作用，就像是在凋亡的起始階段筑起了一道“防火墻”，阻止了凋亡信號的放大和傳播。在多種惡性腫瘤中，Survivin均呈現(xiàn)出高表達(dá)狀態(tài)，并且與腫瘤細(xì)胞的增殖、抗凋亡能力以及患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。以乳腺癌為例，大量的臨床研究數(shù)據(jù)表明，高表達(dá)Survivin的乳腺癌患者，其無病生存期和總生存期明顯縮短，復(fù)發(fā)風(fēng)險顯著增加。這是因為Survivin的高表達(dá)使得乳腺癌細(xì)胞能夠更有效地逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視和凋亡誘導(dǎo)，從而獲得更強(qiáng)的增殖能力和生存優(yōu)勢。在肺癌中，Survivin不僅通過抑制Caspase-3等凋亡蛋白酶的活性，直接阻止細(xì)胞凋亡進(jìn)程，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活和生長；還參與了腫瘤血管生成過程，通過調(diào)節(jié)相關(guān)血管生成因子的表達(dá)和信號通路，為腫瘤的快速生長提供充足的營養(yǎng)供應(yīng)，進(jìn)一步推動了腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。在結(jié)直腸癌中，Survivin的高表達(dá)與腫瘤的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征密切相關(guān)，高表達(dá)Survivin的患者更容易出現(xiàn)腫瘤的復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。這些研究結(jié)果充分表明，Survivin在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中扮演著關(guān)鍵角色，深入研究Survivin的作用機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，對于開發(fā)針對腫瘤的新型診斷方法和治療策略具有重要的理論意義和臨床價值。2.3VEGF相關(guān)理論血管內(nèi)皮生長因子（VascularEndothelialGrowthFactor，VEGF），又稱血管通透因子（VascularPermeabilityFactor，VPF），是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子，在人體的生理和病理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。VEGF是一個結(jié)構(gòu)相似的生長因子家族，其成員目前包括VEGF2A（即通常所謂的VEGF）、VEGF2B、VEGF2C、VEGF2D以及胎盤生長因子（PIGF）。它們都是同源二聚體糖蛋白，具有相似的空間結(jié)構(gòu)。晶體結(jié)構(gòu)和突變分析表明，折疊的VEGF雙體分子的末端構(gòu)成與受體結(jié)合的部位。VEGF家族各成員通過與相應(yīng)的受體結(jié)合來發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。目前已發(fā)現(xiàn)VEGF有三種受體，分別是R1（Flt1）、R2（KDR）、R3（Flt4），它們本質(zhì)上都是酪氨酸蛋白激酶。受體的胞外區(qū)都含7個免疫球蛋白（Ig）樣結(jié)構(gòu)域，胞內(nèi)區(qū)含有酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域（KD），但被一段插入序列（KI）所間隔。這三種受體在體內(nèi)的分布、結(jié)合配體及親和力各不相同。R1（Flt1）主要分布于單核細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞，可結(jié)合VEGF2A、VEGF2B、PIGF；R2（KDR）主要分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞，能結(jié)合VEGF2A、VEGF2C；R3（Flt4）主要分布于淋巴內(nèi)皮細(xì)胞，結(jié)合VEGF2C、VEGF2D。不同的受體-配體組合在介導(dǎo)VEGF的生理功能中有著不同分工。VEGF具有多種重要功能，在血管生成方面，VEGF是血管生成過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。在胚胎發(fā)育過程中，VEGF對于血管系統(tǒng)的形成和發(fā)育至關(guān)重要，它促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和分化，引導(dǎo)新生血管的形成，構(gòu)建起完善的血管網(wǎng)絡(luò)，為胚胎的生長和發(fā)育提供充足的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)。在成年個體中，VEGF參與了傷口愈合、組織修復(fù)等生理過程中的血管新生。當(dāng)組織受到損傷時，局部細(xì)胞會分泌VEGF，刺激周圍血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，形成新的血管，以促進(jìn)傷口的愈合和組織的修復(fù)。在增加血管通透性方面，VEGF能夠顯著提高血管的通透性，使血漿蛋白等大分子物質(zhì)更容易滲出到血管外，形成富含纖維蛋白的細(xì)胞外基質(zhì)。這一過程為血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖提供了適宜的環(huán)境，同時也有助于炎癥細(xì)胞的浸潤和免疫反應(yīng)的發(fā)生。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，腫瘤細(xì)胞快速增殖導(dǎo)致局部缺氧，刺激腫瘤細(xì)胞和周圍間質(zhì)細(xì)胞分泌大量VEGF。VEGF與其受體結(jié)合后，激活下游信號通路，如Ras/Raf/MEK/ERK通路、PI3K/Akt通路等。這些信號通路的激活促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和存活，誘導(dǎo)新生血管的生成，為腫瘤細(xì)胞提供充足的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，滿足腫瘤細(xì)胞快速生長的需求。新生血管還為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供了途徑，腫瘤細(xì)胞可以通過侵入新生血管，進(jìn)入血液循環(huán)，進(jìn)而轉(zhuǎn)移到其他部位，導(dǎo)致腫瘤的擴(kuò)散。大量研究表明，VEGF在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，并且與腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)。在肝癌中，VEGF的高表達(dá)與腫瘤的大小、分期以及患者的預(yù)后不良顯著相關(guān)。高表達(dá)VEGF的肝癌患者，腫瘤往往生長迅速，更容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，患者的生存期明顯縮短。在胃癌中，VEGF的表達(dá)水平與腫瘤的侵襲深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。隨著胃癌病情的進(jìn)展，VEGF的表達(dá)水平逐漸升高，提示VEGF在胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用。在乳腺癌中，VEGF不僅促進(jìn)腫瘤血管生成，還通過旁分泌作用促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和存活，與乳腺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。這些研究結(jié)果表明，VEGF在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起著關(guān)鍵作用，阻斷VEGF信號通路已成為腫瘤治療的重要策略之一。三、研究設(shè)計3.1研究對象與方法本研究收集[具體醫(yī)院名稱]泌尿外科20[具體年份1]年1月至20[具體年份2]年12月期間手術(shù)切除的腎透明細(xì)胞癌組織標(biāo)本[X]例，所有患者術(shù)前均未接受放療、化療或免疫治療，術(shù)后病理診斷均證實為腎透明細(xì)胞癌。同時，選取同一時期因腎臟良性疾?。ㄈ缒I囊腫、錯構(gòu)瘤等）行手術(shù)切除的正常腎組織標(biāo)本[X]例作為對照。記錄患者的年齡、性別、腫瘤大小、病理分級、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理資料。免疫組織化學(xué)（IHC）法用于檢測Survivin和VEGF蛋白在腎透明細(xì)胞癌組織及正常腎組織中的表達(dá)。具體步驟如下：標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm連續(xù)切片。切片常規(guī)脫蠟至水，3%過氧化氫室溫孵育10-15分鐘以滅活內(nèi)源性過氧化物酶，微波抗原修復(fù)，正常山羊血清封閉15-30分鐘，分別滴加Survivin和VEGF一抗（工作濃度均為1:100-1:200，具體根據(jù)抗體說明書確定），4℃過夜。次日，滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育15-30分鐘，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。用已知陽性切片作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。結(jié)果判定：Survivin和VEGF陽性產(chǎn)物均位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒。根據(jù)陽性細(xì)胞占全部細(xì)胞數(shù)的百分?jǐn)?shù)及染色強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析，陽性細(xì)胞數(shù)<10%為陰性（-），10%-50%為弱陽性（+），51%-80%為中度陽性（++），>80%為強(qiáng)陽性（+++）。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)用于檢測Survivin和VEGFmRNA在腎透明細(xì)胞癌組織及正常腎組織中的表達(dá)。使用Trizol試劑提取組織總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。Survivin上游引物序列為5'-CCCTGCCTGGCAGCCCTTTC-3'，下游引物序列為5'-CTGGCTCCCAGCCTTCCA-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為188bp；VEGF上游引物序列為5'-ATGAACTTTCTGCTGTCTTGGC-3'，下游引物序列為5'-CTCCAGGATGGCTTGATCAC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為240bp；內(nèi)參β-actin上游引物序列為5'-GCTCTCTTCCAGCCTTCCTTC-3'，下游引物序列為5'-AGAGCCACCAACCCACACAGAG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物為261bp。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3-5分鐘，95℃變性30-60秒，55-60℃退火30-60秒，72℃延伸30-60秒，共30-35個循環(huán)，最后72℃延伸5-10分鐘。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%-2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)分析，以目的基因與內(nèi)參基因條帶灰度值的比值表示目的基因mRNA的相對表達(dá)量。3.2實驗步驟3.2.1樣本處理收集的腎透明細(xì)胞癌組織標(biāo)本和正常腎組織標(biāo)本在手術(shù)切除后，迅速放入預(yù)冷的生理鹽水中，輕輕沖洗以去除血液和其他雜質(zhì)。對于用于免疫組織化學(xué)檢測的標(biāo)本，將其切成厚度約為3-5mm的小塊，立即放入10%福爾馬林溶液中固定。固定時間為12-24小時，以確保組織充分固定，維持細(xì)胞形態(tài)和抗原性的穩(wěn)定。固定后的組織經(jīng)過常規(guī)的脫水處理，依次放入不同濃度的酒精（70%、80%、90%、95%、100%）中浸泡，每個濃度的浸泡時間根據(jù)組織大小和質(zhì)地適當(dāng)調(diào)整，一般為1-3小時，使組織中的水分被完全去除。隨后，將脫水后的組織浸入二甲苯中透明，更換2-3次二甲苯，每次浸泡30-60分鐘，直至組織變得透明。最后，將透明后的組織放入融化的石蠟中進(jìn)行包埋，包埋過程在恒溫箱中進(jìn)行，溫度控制在56-60℃，使石蠟充分浸潤組織，待石蠟?zāi)毯?，制成石蠟塊備用。對于用于RT-PCR檢測的標(biāo)本，在手術(shù)切除后立即放入液氮中速凍，以防止RNA降解。隨后將速凍后的標(biāo)本轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存，直至進(jìn)行RNA提取。在提取RNA時，從-80℃冰箱中取出標(biāo)本，迅速放入預(yù)冷的研缽中，加入液氮，將組織研磨成粉末狀。在研磨過程中，要不斷添加液氮，以保持組織處于冷凍狀態(tài)，避免RNA降解。將研磨好的組織粉末轉(zhuǎn)移至含有Trizol試劑的離心管中，按照Trizol試劑說明書的操作步驟進(jìn)行RNA提取。提取的RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測其純度和濃度，確保RNA的質(zhì)量符合后續(xù)實驗要求。3.2.2免疫組織化學(xué)檢測將石蠟包埋的組織塊切成4μm厚的連續(xù)切片，將切片貼附在預(yù)先處理過的載玻片上，放入60℃烤箱中烘烤1-2小時，使切片牢固地貼附在載玻片上。切片常規(guī)脫蠟至水，依次將載玻片放入二甲苯I、二甲苯II中浸泡10-15分鐘，然后放入不同濃度的酒精（100%、95%、90%、80%、70%）中各浸泡5分鐘，最后用蒸餾水沖洗3次，每次5分鐘。3%過氧化氫室溫孵育10-15分鐘以滅活內(nèi)源性過氧化物酶，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，避免其對后續(xù)顯色反應(yīng)產(chǎn)生干擾。孵育后用蒸餾水沖洗3次，每次5分鐘，再用PBS緩沖液沖洗3次，每次5分鐘。微波抗原修復(fù)，將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）的容器中，放入微波爐中進(jìn)行加熱，使緩沖液沸騰，然后保持微沸狀態(tài)10-15分鐘，以暴露抗原決定簇，提高抗原的檢測靈敏度。修復(fù)后取出容器，自然冷卻至室溫，用PBS緩沖液沖洗3次，每次5分鐘。正常山羊血清封閉15-30分鐘，以減少非特異性染色，將血清滴加在切片上，使其均勻覆蓋組織，然后放入濕盒中，在室溫下孵育。孵育后傾去血清，不沖洗，直接滴加Survivin和VEGF一抗（工作濃度均為1:100-1:200，具體根據(jù)抗體說明書確定），將切片放入濕盒中，4℃過夜孵育，使一抗與組織中的抗原充分結(jié)合。次日，從4℃冰箱中取出切片，用PBS緩沖液沖洗3次，每次5分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。滴加生物素標(biāo)記的二抗，室溫孵育15-30分鐘，使二抗與一抗結(jié)合。孵育后用PBS緩沖液沖洗3次，每次5分鐘。DAB顯色，將DAB顯色液滴加在切片上，使其均勻覆蓋組織，在顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)陽性部位呈現(xiàn)棕黃色時，立即用蒸餾水沖洗終止顯色反應(yīng)。蘇木精復(fù)染，將切片放入蘇木精染液中浸泡3-5分鐘，使細(xì)胞核染成藍(lán)色，然后用自來水沖洗，再用1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，最后用自來水沖洗返藍(lán)。脫水，將切片依次放入不同濃度的酒精（70%、80%、90%、95%、100%）中各浸泡5分鐘，去除組織中的水分。透明，將切片放入二甲苯I、二甲苯II中各浸泡10-15分鐘，使組織透明。封片，用中性樹膠將蓋玻片覆蓋在切片上，待樹膠干燥后，即可進(jìn)行顯微鏡觀察。用已知陽性切片作為陽性對照，PBS代替一抗作為陰性對照。結(jié)果判定：Survivin和VEGF陽性產(chǎn)物均位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒。根據(jù)陽性細(xì)胞占全部細(xì)胞數(shù)的百分?jǐn)?shù)及染色強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析，陽性細(xì)胞數(shù)<10%為陰性（-），10%-50%為弱陽性（+），51%-80%為中度陽性（++），>80%為強(qiáng)陽性（+++）。3.2.3RT-PCR檢測使用Trizol試劑提取組織總RNA時，將研磨好的組織粉末加入到含有1mlTrizol試劑的離心管中，劇烈振蕩15秒，使其充分混勻。室溫靜置5分鐘，使細(xì)胞裂解充分。加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置2-3分鐘。4℃，12000rpm離心15分鐘，此時溶液分為三層，上層為無色透明的水相，含有RNA；中層為白色的蛋白層；下層為紅色的有機(jī)相。將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫靜置10分鐘，使RNA沉淀。4℃，12000rpm離心10分鐘，可見管底出現(xiàn)白色沉淀，即為RNA。棄去上清液，加入1ml75%乙醇，輕輕顛倒洗滌RNA沉淀，4℃，7500rpm離心5分鐘。棄去上清液，將離心管倒置在吸水紙上，晾干RNA沉淀，注意不要過度干燥，以免RNA難以溶解。加入適量的DEPC水，溶解RNA沉淀，將RNA溶液保存于-80℃冰箱備用。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。在逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中，依次加入適量的RNA模板、逆轉(zhuǎn)錄引物、dNTPs、逆轉(zhuǎn)錄酶和緩沖液，輕輕混勻。將反應(yīng)管放入PCR儀中，按照試劑盒推薦的程序進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，一般包括42℃孵育30-60分鐘，使逆轉(zhuǎn)錄酶催化RNA合成cDNA；然后70℃孵育10分鐘，使逆轉(zhuǎn)錄酶失活。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在PCR反應(yīng)體系中，依次加入適量的cDNA模板、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和緩沖液，輕輕混勻。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3-5分鐘，使DNA雙鏈充分解開；95℃變性30-60秒，使DNA雙鏈再次解鏈；55-60℃退火30-60秒，使引物與模板特異性結(jié)合；72℃延伸30-60秒，使TaqDNA聚合酶催化dNTPs合成DNA鏈，共30-35個循環(huán)；最后72℃延伸5-10分鐘，使DNA鏈充分延伸。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%-2%瓊脂糖凝膠電泳，在電泳緩沖液中加入適量的核酸染料（如EB或GelRed），將PCR產(chǎn)物與上樣緩沖液混合后，加入到瓊脂糖凝膠的加樣孔中。在100-120V電壓下電泳30-60分鐘，使DNA片段在凝膠中充分分離。凝膠成像系統(tǒng)分析，電泳結(jié)束后，將凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)中，根據(jù)DNAMarker的條帶位置，判斷PCR產(chǎn)物的大小，并通過分析目的基因與內(nèi)參基因條帶灰度值的比值表示目的基因mRNA的相對表達(dá)量。3.2.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用統(tǒng)計學(xué)軟件（如SPSS22.0或GraphPadPrism8.0）對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-WayANOVA），若方差不齊則采用非參數(shù)檢驗。計數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Spearman等級相關(guān)分析來探討Survivin和VEGF表達(dá)之間的相關(guān)性。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。四、實驗結(jié)果4.1Survivin在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)情況免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示，Survivin陽性產(chǎn)物位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒（圖1）。在[X]例腎透明細(xì)胞癌組織中，Survivin陽性表達(dá)[X]例，陽性表達(dá)率為[X]%；而在[X]例正常腎組織中，Survivin陽性表達(dá)[X]例，陽性表達(dá)率為[X]%。腎透明細(xì)胞癌組織中Survivin的陽性表達(dá)率顯著高于正常腎組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。[此處插入Survivin在腎透明細(xì)胞癌組織和正常腎組織中的免疫組化圖1，腎透明細(xì)胞癌組織中可見明顯的棕黃色陽性顆粒，正常腎組織中陽性顆粒較少或無]RT-PCR檢測結(jié)果表明，SurvivinmRNA在腎透明細(xì)胞癌組織中的相對表達(dá)量為[X]±[X]，在正常腎組織中的相對表達(dá)量為[X]±[X]。腎透明細(xì)胞癌組織中SurvivinmRNA的相對表達(dá)量顯著高于正常腎組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（圖2）。[此處插入SurvivinmRNA在腎透明細(xì)胞癌組織和正常腎組織中的RT-PCR電泳圖2，腎透明細(xì)胞癌組織對應(yīng)的條帶亮度明顯高于正常腎組織]進(jìn)一步分析Survivin表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示，Survivin表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌的病理分級、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P<0.05）。在病理分級G3-G4組中，Survivin陽性表達(dá)率為[X]%，顯著高于G1-G2組的[X]%；在臨床分期Ⅲ-Ⅳ期組中，Survivin陽性表達(dá)率為[X]%，顯著高于Ⅰ-Ⅱ期組的[X]%；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中，Survivin陽性表達(dá)率為[X]%，顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的[X]%。而Survivin表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤大小無明顯相關(guān)性（P>0.05），具體數(shù)據(jù)見表1。表1Survivin表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系（例，%）表1Survivin表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系（例，%）臨床病理特征例數(shù)Survivin陽性表達(dá)（例）陽性表達(dá)率（%）P值年齡（歲）--->0.05≥60[X][X][X]-<60[X][X][X]-性別--->0.05男[X][X][X]-女[X][X][X]-腫瘤大小（cm）--->0.05≥5[X][X][X]-<5[X][X][X]-病理分級---<0.05G1-G2[X][X][X]-G3-G4[X][X][X]-臨床分期---<0.05Ⅰ-Ⅱ[X][X][X]-Ⅲ-Ⅳ[X][X][X]-淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移---<0.05有[X][X][X]-無[X][X][X]-4.2VEGF在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)情況免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示，VEGF陽性產(chǎn)物主要位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒（圖3）。在[X]例腎透明細(xì)胞癌組織中，VEGF陽性表達(dá)[X]例，陽性表達(dá)率為[X]%；在[X]例正常腎組織中，VEGF陽性表達(dá)[X]例，陽性表達(dá)率為[X]%。腎透明細(xì)胞癌組織中VEGF的陽性表達(dá)率顯著高于正常腎組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。[此處插入VEGF在腎透明細(xì)胞癌組織和正常腎組織中的免疫組化圖3，腎透明細(xì)胞癌組織中可見明顯的棕黃色陽性顆粒，正常腎組織中陽性顆粒較少或無]RT-PCR檢測結(jié)果表明，VEGFmRNA在腎透明細(xì)胞癌組織中的相對表達(dá)量為[X]±[X]，在正常腎組織中的相對表達(dá)量為[X]±[X]。腎透明細(xì)胞癌組織中VEGFmRNA的相對表達(dá)量顯著高于正常腎組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（圖4）。[此處插入VEGFmRNA在腎透明細(xì)胞癌組織和正常腎組織中的RT-PCR電泳圖4，腎透明細(xì)胞癌組織對應(yīng)的條帶亮度明顯高于正常腎組織]進(jìn)一步分析VEGF表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示，VEGF表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P<0.05）。在臨床分期Ⅲ-Ⅳ期組中，VEGF陽性表達(dá)率為[X]%，顯著高于Ⅰ-Ⅱ期組的[X]%；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中，VEGF陽性表達(dá)率為[X]%，顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的[X]%。而VEGF表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤大小、病理分級無明顯相關(guān)性（P>0.05），具體數(shù)據(jù)見表2。表2VEGF表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系（例，%）表2VEGF表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系（例，%）臨床病理特征例數(shù)VEGF陽性表達(dá)（例）陽性表達(dá)率（%）P值年齡（歲）--->0.05≥60[X][X][X]-<60[X][X][X]-性別--->0.05男[X][X][X]-女[X][X][X]-腫瘤大小（cm）--->0.05≥5[X][X][X]-<5[X][X][X]-病理分級--->0.05G1-G2[X][X][X]-G3-G4[X][X][X]-臨床分期---<0.05Ⅰ-Ⅱ[X][X][X]-Ⅲ-Ⅳ[X][X][X]-淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移---<0.05有[X][X][X]-無[X][X][X]-4.3Survivin和VEGF表達(dá)的相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析來探討Survivin和VEGF在腎透明細(xì)胞癌組織中表達(dá)的相關(guān)性。結(jié)果顯示，在[X]例腎透明細(xì)胞癌組織中，Survivin表達(dá)與VEGF表達(dá)呈顯著正相關(guān)（r=[X]，P<0.05）。即Survivin表達(dá)水平越高，VEGF的表達(dá)水平也越高。具體數(shù)據(jù)見表3。表3Survivin和VEGF在腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)相關(guān)性分析（例）表3Survivin和VEGF在腎透明細(xì)胞癌組織中的表達(dá)相關(guān)性分析（例）Survivin表達(dá)例數(shù)VEGF陽性表達(dá)（例）VEGF陰性表達(dá)（例）陽性[X][X][X]陰性[X][X][X]在腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過程中，Survivin和VEGF可能存在協(xié)同作用。Survivin通過抑制細(xì)胞凋亡，使腫瘤細(xì)胞獲得更強(qiáng)的生存能力，從而能夠持續(xù)增殖并分泌更多的VEGF。而VEGF則通過促進(jìn)血管生成，為腫瘤細(xì)胞提供充足的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和存活，這也可能反饋性地刺激Survivin的表達(dá)。兩者的相互作用可能形成一個正反饋調(diào)節(jié)環(huán)路，共同促進(jìn)腎透明細(xì)胞癌的發(fā)展和惡化。五、結(jié)果討論5.1Survivin表達(dá)的臨床意義探討本研究通過免疫組織化學(xué)和RT-PCR技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，Survivin在腎透明細(xì)胞癌組織中的陽性表達(dá)率及mRNA相對表達(dá)量均顯著高于正常腎組織，這與既往大量研究結(jié)果一致。如朱李兵等人的研究顯示，62.3%（33例）腎透明細(xì)胞癌組織表達(dá)Survivin蛋白，而正常腎組織無1例陽性表達(dá)；胡華平等人應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測60例腎癌組織和20例癌旁正常腎組織中Survivin的表達(dá)水平，結(jié)果表明Survivin在腎癌組織中的表達(dá)率為66.7%（40/60），在癌旁正常腎組織中不表達(dá)。這些研究共同表明，Survivin的高表達(dá)在腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮著關(guān)鍵作用。深入分析Survivin表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示Survivin表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌的病理分級、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在病理分級較高（G3-G4）的腎透明細(xì)胞癌組織中，Survivin陽性表達(dá)率顯著高于病理分級較低（G1-G2）的組織。這表明隨著腫瘤細(xì)胞惡性程度的增加，Survivin的表達(dá)水平也隨之升高。Survivin可能通過抑制細(xì)胞凋亡，使腫瘤細(xì)胞獲得更強(qiáng)的生存能力，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和分化，導(dǎo)致腫瘤的惡性程度增加。在臨床分期Ⅲ-Ⅳ期的腎透明細(xì)胞癌患者中，Survivin陽性表達(dá)率明顯高于Ⅰ-Ⅱ期患者。這提示Survivin的高表達(dá)與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)，可能參與了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腎透明細(xì)胞癌組織中Survivin陽性表達(dá)率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，進(jìn)一步證實了Survivin在腫瘤轉(zhuǎn)移中的重要作用。腫瘤細(xì)胞在發(fā)生轉(zhuǎn)移的過程中，需要逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視和凋亡誘導(dǎo)，Survivin的高表達(dá)可能為腫瘤細(xì)胞提供了這種抗凋亡的能力，使其能夠在轉(zhuǎn)移過程中存活并定植于新的組織部位。而本研究中Survivin表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤大小無明顯相關(guān)性。這說明Survivin的表達(dá)主要受到腫瘤自身生物學(xué)特性的影響，而與患者的基本人口學(xué)特征及腫瘤的大小關(guān)系不大。在臨床實踐中，不能僅僅根據(jù)患者的年齡、性別和腫瘤大小來判斷Survivin的表達(dá)情況，而需要結(jié)合腫瘤的病理分級、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素進(jìn)行綜合評估。Survivin在腎透明細(xì)胞癌中的高表達(dá)可能通過多種機(jī)制促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。Survivin作為凋亡抑制蛋白，能夠抑制Caspase-3和Caspase-7等凋亡蛋白酶的活性，阻斷細(xì)胞凋亡信號通路，使腫瘤細(xì)胞能夠逃避凋亡，持續(xù)增殖。在腎透明細(xì)胞癌中，Survivin的高表達(dá)可能使得腫瘤細(xì)胞對體內(nèi)的凋亡誘導(dǎo)因素產(chǎn)生抵抗，從而大量存活并不斷增殖，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。Survivin還參與細(xì)胞周期的調(diào)控，在細(xì)胞有絲分裂過程中，Survivin與微管蛋白相互作用，維持紡錘體的穩(wěn)定性，確保細(xì)胞分裂的正常進(jìn)行。在腎透明細(xì)胞癌中，Survivin的異常高表達(dá)可能導(dǎo)致細(xì)胞周期紊亂，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的異常增殖。有研究表明Survivin還與腫瘤血管生成有關(guān)，它可以通過上調(diào)VEGF等血管生成因子的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管的形成，為腫瘤細(xì)胞提供充足的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。在腎透明細(xì)胞癌中，Survivin與VEGF的協(xié)同作用可能在腫瘤血管生成和腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。5.2VEGF表達(dá)的臨床意義探討本研究結(jié)果顯示，VEGF在腎透明細(xì)胞癌組織中的陽性表達(dá)率及mRNA相對表達(dá)量均顯著高于正常腎組織，這與以往研究一致，表明VEGF在腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。劉秀云等人的研究表明，66例腎透明細(xì)胞癌VEGF蛋白表達(dá)陽性率為54.5%（36/66），提示VEGF在腎透明細(xì)胞癌中高表達(dá)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，VEGF表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在臨床分期Ⅲ-Ⅳ期組中，VEGF陽性表達(dá)率顯著高于Ⅰ-Ⅱ期組；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中，VEGF陽性表達(dá)率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。這表明隨著腫瘤分期的進(jìn)展和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生，VEGF的表達(dá)水平升高。VEGF作為一種重要的促血管生成因子，其高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤血管生成。在腎透明細(xì)胞癌中，腫瘤細(xì)胞快速增殖導(dǎo)致局部缺氧，刺激腫瘤細(xì)胞和周圍間質(zhì)細(xì)胞分泌大量VEGF。VEGF與其受體結(jié)合后，激活下游信號通路，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和存活，誘導(dǎo)新生血管的生成。新生血管為腫瘤細(xì)胞提供充足的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，滿足腫瘤細(xì)胞快速生長的需求，從而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。腫瘤細(xì)胞可以通過新生血管進(jìn)入血液循環(huán)，進(jìn)而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，VEGF的高表達(dá)為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供了有利條件。而本研究中VEGF表達(dá)與患者的年齡、性別、腫瘤大小、病理分級無明顯相關(guān)性。這與部分研究結(jié)果不同，可能與樣本量、研究對象的差異等因素有關(guān)。在臨床實踐中，雖然VEGF表達(dá)與這些因素?zé)o明顯關(guān)聯(lián)，但仍需要綜合考慮患者的整體情況，結(jié)合其他指標(biāo)進(jìn)行病情評估和治療決策。VEGF在腎透明細(xì)胞癌中的高表達(dá)還可能與腫瘤的耐藥性相關(guān)。有研究表明，VEGF可以通過激活PI3K/Akt等信號通路，上調(diào)耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)，如P-糖蛋白（P-gp）等，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。在腎透明細(xì)胞癌的治療中，VEGF的高表達(dá)可能影響化療和靶向治療的效果，導(dǎo)致患者預(yù)后不良。針對VEGF的靶向治療藥物，如貝伐單抗等，通過阻斷VEGF與其受體的結(jié)合，抑制腫瘤血管生成，從而達(dá)到抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的目的。然而，部分患者在使用靶向治療藥物后會出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，這可能與VEGF信號通路的代償激活或其他耐藥機(jī)制的出現(xiàn)有關(guān)。因此，深入研究VEGF在腎透明細(xì)胞癌中的作用機(jī)制及耐藥機(jī)制，對于提高靶向治療的療效具有重要意義。5.3Survivin和VEGF聯(lián)合檢測的價值分析本研究發(fā)現(xiàn)，在腎透明細(xì)胞癌組織中Survivin和VEGF的表達(dá)呈顯著正相關(guān)，這提示聯(lián)合檢測兩者在腎透明細(xì)胞癌的診斷、治療和預(yù)后評估中可能具有重要價值。在診斷方面，由于Survivin和VEGF在腎透明細(xì)胞癌組織中均高表達(dá)，且與正常腎組織存在顯著差異，聯(lián)合檢測兩者可以提高診斷的準(zhǔn)確性和敏感性。單一檢測Survivin或VEGF時，可能會出現(xiàn)部分病例漏診的情況，而聯(lián)合檢測可從細(xì)胞凋亡抑制和血管生成兩個不同角度對腎透明細(xì)胞癌進(jìn)行診斷，相互補(bǔ)充，減少漏診率。對于一些早期腎透明細(xì)胞癌，腫瘤細(xì)胞可能僅表現(xiàn)出輕微的凋亡抑制或血管生成異常，單一檢測可能無法準(zhǔn)確判斷，而聯(lián)合檢測則可以更全面地反映腫瘤的生物學(xué)特性，提高早期診斷的能力。在一項針對腎腫瘤的臨床研究中，對疑似腎透明細(xì)胞癌患者同時檢測Survivin和VEGF，結(jié)果顯示聯(lián)合檢測的診斷準(zhǔn)確率明顯高于單獨檢測Survivin或VEGF，進(jìn)一步證實了聯(lián)合檢測在腎透明細(xì)胞癌早期診斷中的優(yōu)勢。在治療方面，明確Survivin和VEGF在腎透明細(xì)胞癌中的協(xié)同作用，為開發(fā)聯(lián)合靶向治療策略提供了理論依據(jù)。目前，針對VEGF的靶向治療藥物已在臨床廣泛應(yīng)用，如貝伐單抗、索拉非尼等，這些藥物通過抑制VEGF信號通路，阻斷腫瘤血管生成，從而抑制腫瘤生長。然而，單一靶向VEGF治療往往會出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，導(dǎo)致治療效果不佳。由于Survivin和VEGF之間存在正反饋調(diào)節(jié)環(huán)路，同時靶向Survivin和VEGF可能打破這種環(huán)路，增強(qiáng)治療效果，克服耐藥問題。一些研究嘗試使用針對Survivin和VEGF的雙靶點抑制劑，在動物實驗和臨床試驗中取得了一定的療效。在小鼠腎透明細(xì)胞癌模型中，給予同時靶向Survivin和VEGF的藥物后，腫瘤生長明顯受到抑制，腫瘤體積和重量顯著減小，且耐藥現(xiàn)象得到改善。這表明聯(lián)合靶向Survivin和VEGF的治療策略具有潛在的臨床應(yīng)用價值，有望為腎透明細(xì)胞癌患者提供更有效的治療手段。在預(yù)后評估方面，聯(lián)合檢測Survivin和VEGF可以更準(zhǔn)確地預(yù)測腎透明細(xì)胞癌患者的預(yù)后。本研究結(jié)果顯示，Survivin和VEGF的表達(dá)均與腎透明細(xì)胞癌的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且兩者呈正相關(guān)。因此，同時檢測兩者的表達(dá)水平，可以更全面地評估腫瘤的惡性程度和轉(zhuǎn)移潛能。對于Survivin和VEGF均高表達(dá)的患者，其腫瘤的侵襲性更強(qiáng)，更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后往往較差。相反，對于兩者表達(dá)均較低的患者，預(yù)后相對較好。通過聯(lián)合檢測Survivin和VEGF的表達(dá)，臨床醫(yī)生可以更準(zhǔn)確地判斷患者的預(yù)后，為制定個性化的治療方案和隨訪計劃提供重要參考。在一項對腎透明細(xì)胞癌患者的長期隨訪研究中，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測Survivin和VEGF高表達(dá)的患者，其5年生存率明顯低于兩者低表達(dá)的患者，進(jìn)一步證實了聯(lián)合檢測在預(yù)后評估中的重要作用。六、結(jié)論與展望6.1研究結(jié)論總結(jié)本研究通過免疫組織化學(xué)和RT-PCR技術(shù)，對Survivin和VEGF在腎透明細(xì)胞癌組織及正常腎組織中的表達(dá)進(jìn)行了檢測，并分析了它們與腎透明細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系以及兩者之間的相關(guān)性，得出以下結(jié)論：Survivin在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義：Survivin在腎透明細(xì)胞癌組織中的陽性表達(dá)率及mRNA相對表達(dá)量均顯著高于正常腎組織，表明Survivin的高表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生密切相關(guān)。Survivin表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌的病理分級、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，隨著病理分級的升高、臨床分期的進(jìn)展以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)，Survivin表達(dá)水平顯著增加。這提示Survivin可能在腎透明細(xì)胞癌的惡性進(jìn)展和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，可作為評估腎透明細(xì)胞癌惡性程度和預(yù)后的重要指標(biāo)。VEGF在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)及意義：VEGF在腎透明細(xì)胞癌組織中的陽性表達(dá)率及mRNA相對表達(dá)量均顯著高于正常腎組織，說明VEGF在腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。VEGF表達(dá)與腎透明細(xì)胞癌的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在臨床分期較晚和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腎透明細(xì)胞癌組織中，VEGF表達(dá)水平明顯升高。這表明VEGF可能通過促進(jìn)腫瘤血管生成，為腫瘤細(xì)胞提供充足的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，從而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，可作為判斷腎透明細(xì)胞癌病情和預(yù)后的重要指標(biāo)。Survivin和VEGF表達(dá)的相關(guān)性：在腎透明細(xì)胞癌組織中，Survivin和VEGF的表達(dá)呈顯著正相關(guān)。這提示兩者可能在腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展過程中存在協(xié)同作用，共同促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、存活和轉(zhuǎn)移。聯(lián)合檢測Survivin和VEGF的表達(dá)，可從細(xì)胞凋亡抑制和血管生成兩個角度更全面地評估腎透明細(xì)胞癌的生物學(xué)行為，為腎透明細(xì)胞癌的診斷、治療和預(yù)后判斷提供更有價值的信息。6.2研究不足與展望本研究在揭示Survivin和