人腦膠質(zhì)瘤中MGMT表達(dá)特征及miR-4539對(duì)其表達(dá)調(diào)控作用解析一、引言1.1研究背景與意義腦膠質(zhì)瘤作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類(lèi)的生命健康。其年發(fā)病率約為3-6.4/10萬(wàn)，約占所有中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的23.3％，占惡性腫瘤的78.3％。其中，WHO4級(jí)的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（Glioblastoma,GBM）年發(fā)病率最高，約為4.03/10萬(wàn)人，占全部原發(fā)惡性中樞系統(tǒng)腫瘤的48.6％。膠質(zhì)瘤具有高度的惡性程度，即便應(yīng)用手術(shù)切除、術(shù)后放療和化療等綜合治療手段，患者的預(yù)后情況依然較差。有研究提示，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤已超過(guò)胰腺癌和肝癌，成為最難治療的腫瘤之一。在2002年前，GBM患者診斷后的中位總生存期（MedianOverallSurvival,mOS）少于1年，5年生存率低于3%；隨著STUPP方案的廣泛應(yīng)用，GBM患者的mOS提升至16個(gè)月，中位無(wú)進(jìn)展生存期（MedianProgression-freeSurvival,mPFS）為6.9個(gè)月；2016年起采用STUPP方案聯(lián)合腫瘤治療電場(chǎng)（TumorTreatingField,TTF）治療后，患者的mOS顯著延長(zhǎng)，達(dá)到20.9個(gè)月，但患者的平均治療花費(fèi)相對(duì)較高?；熢谀z質(zhì)瘤的綜合治療中占據(jù)重要地位，然而，膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生的耐受作用，極大地限制了化療效果的提升。眾多研究表明，膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)烷化劑類(lèi)化療藥物的耐藥，常常與高水平的O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶（O6-methyltranferase，MGMT）密切相關(guān)。MGMT作為一種關(guān)鍵的DNA修復(fù)蛋白，能夠移除DNA上鳥(niǎo)嘌呤O(6)位點(diǎn)的可致突變毒性和細(xì)胞毒性的烷基化加合物，使損傷的鳥(niǎo)嘌呤得以修復(fù)，進(jìn)而避免烷化基團(tuán)對(duì)細(xì)胞的損害，這也是腫瘤耐受烷化劑藥物的主要原因之一。當(dāng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中MGMT表達(dá)水平較高時(shí)，其能夠快速修復(fù)由烷化劑類(lèi)化療藥物如替莫唑胺（TMZ）等所造成的DNA損傷，使得腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性，化療效果大打折扣，嚴(yán)重影響患者的治療預(yù)后。因此，深入了解MGMT表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，對(duì)于克服膠質(zhì)瘤的化療耐藥問(wèn)題、提高化療療效具有至關(guān)重要的意義。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一類(lèi)內(nèi)源性非編碼小分子RNA，長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸。它們通過(guò)與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控，廣泛參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等多種生理病理過(guò)程。越來(lái)越多的研究顯示，miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及耐藥等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。不同的miRNA在腫瘤中可能扮演著癌基因或抑癌基因的角色，通過(guò)調(diào)控相關(guān)靶基因的表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。例如，某些miRNA能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，而另一些則可能促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。對(duì)于膠質(zhì)瘤而言，miRNA同樣參與了其復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，且與膠質(zhì)瘤的化療耐藥機(jī)制密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，特定的miRNA可以通過(guò)調(diào)控MGMT的表達(dá)，影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)烷化劑類(lèi)化療藥物的敏感性，為膠質(zhì)瘤化療耐藥的研究提供了新的方向和思路。miR-4539作為一種近年來(lái)受到關(guān)注的miRNA，在腫瘤領(lǐng)域的研究逐漸增多，但在膠質(zhì)瘤中關(guān)于其對(duì)MGMT表達(dá)調(diào)控作用的研究仍相對(duì)較少。探究miR-4539對(duì)MGMT表達(dá)的調(diào)控作用，不僅有助于深入揭示膠質(zhì)瘤化療耐藥的分子機(jī)制，為膠質(zhì)瘤的治療提供全新的理論依據(jù)；而且有可能為開(kāi)發(fā)基于miR-4539的膠質(zhì)瘤治療新策略奠定基礎(chǔ)，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。通過(guò)調(diào)控miR-4539的表達(dá)，或許能夠改變MGMT在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平，從而提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)烷化劑類(lèi)化療藥物的敏感性，克服化療耐藥問(wèn)題，為膠質(zhì)瘤患者帶來(lái)更好的治療效果和生存預(yù)后。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在MGMT表達(dá)的研究方面，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已取得了豐碩成果。大量研究明確證實(shí)了MGMT在腫瘤耐藥，尤其是膠質(zhì)瘤對(duì)烷化劑類(lèi)化療藥物耐藥中所起的關(guān)鍵作用。國(guó)外的一些研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)對(duì)大量膠質(zhì)瘤患者樣本的分析，深入探討了MGMT表達(dá)水平與患者臨床病理特征及預(yù)后之間的關(guān)系。有研究表明，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中，MGMT啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與患者對(duì)替莫唑胺化療的敏感性密切相關(guān)，啟動(dòng)子甲基化的患者，MGMT表達(dá)受到抑制，對(duì)替莫唑胺的化療反應(yīng)較好，生存期相對(duì)更長(zhǎng)；而MGMT啟動(dòng)子未甲基化的患者，MGMT高表達(dá)，容易對(duì)替莫唑胺產(chǎn)生耐藥，預(yù)后較差。國(guó)內(nèi)的研究也得到了類(lèi)似的結(jié)果，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了MGMT表達(dá)在膠質(zhì)瘤化療耐藥和預(yù)后評(píng)估中的重要價(jià)值。同時(shí)，學(xué)者們也在積極探索MGMT表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，發(fā)現(xiàn)多種基因和信號(hào)通路參與其中，如NF-κB、p53基因等可通過(guò)調(diào)節(jié)MGMT啟動(dòng)子來(lái)影響MGMT的表達(dá)。關(guān)于miRNA對(duì)MGMT表達(dá)調(diào)控作用的研究，近年來(lái)也逐漸成為熱點(diǎn)。已有研究揭示了多種miRNA與MGMT之間存在靶向調(diào)控關(guān)系。例如，在某些腫瘤細(xì)胞中，miR-181b能夠通過(guò)與MGMTmRNA的3'-UTR互補(bǔ)結(jié)合，抑制MGMT的表達(dá)，從而增加腫瘤細(xì)胞對(duì)烷化劑類(lèi)化療藥物的敏感性。在膠質(zhì)瘤研究領(lǐng)域，雖然已經(jīng)開(kāi)始關(guān)注miRNA對(duì)MGMT表達(dá)的調(diào)控作用，但目前研究涉及的miRNA種類(lèi)相對(duì)有限，對(duì)于其具體調(diào)控機(jī)制的闡述尚不夠深入和全面。針對(duì)miR-4539在腫瘤中的研究，國(guó)外有研究發(fā)現(xiàn)其在乳腺癌、肺癌等腫瘤中發(fā)揮著抑癌基因的作用，通過(guò)調(diào)控相關(guān)靶基因，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。然而，在膠質(zhì)瘤中，miR-4539對(duì)MGMT表達(dá)調(diào)控作用的研究才剛剛起步。國(guó)內(nèi)相關(guān)研究也較少，僅有少數(shù)研究初步探討了miR-4539在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平及其對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，但尚未深入研究其與MGMT之間的調(diào)控關(guān)系。綜上所述，當(dāng)前關(guān)于MGMT表達(dá)及miR-4539對(duì)其調(diào)控作用的研究雖然取得了一定進(jìn)展，但仍存在諸多不足。一方面，對(duì)于MGMT表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究還不夠系統(tǒng)和全面，許多調(diào)控因素之間的相互作用關(guān)系尚未明確；另一方面，在膠質(zhì)瘤中，miR-4539對(duì)MGMT表達(dá)調(diào)控作用的研究幾乎處于空白狀態(tài)，亟需開(kāi)展深入研究，以填補(bǔ)這一領(lǐng)域的知識(shí)空缺，為膠質(zhì)瘤的治療提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。1.3研究?jī)?nèi)容與方法1.3.1研究?jī)?nèi)容本研究主要聚焦于人腦膠質(zhì)瘤MGMT表達(dá)及miR-4539對(duì)MGMT表達(dá)調(diào)控作用，具體內(nèi)容如下：人腦膠質(zhì)瘤組織及細(xì)胞中MGMT的表達(dá)分析：收集人腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本及膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，運(yùn)用免疫組織化學(xué)（IHC）、蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）以及實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）等技術(shù)，從蛋白和基因水平檢測(cè)MGMT的表達(dá)情況。同時(shí)，結(jié)合患者的臨床病理資料，深入分析MGMT表達(dá)與膠質(zhì)瘤病理分級(jí)、患者年齡、性別等臨床病理特征之間的相關(guān)性，明確MGMT表達(dá)在人腦膠質(zhì)瘤中的臨床意義。miR-4539對(duì)MGMT表達(dá)調(diào)控作用的驗(yàn)證：通過(guò)生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)miR-4539與MGMT之間可能存在的靶向關(guān)系。在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中，分別轉(zhuǎn)染miR-4539模擬物（mimics）、抑制劑（inhibitor）以及相應(yīng)的陰性對(duì)照，構(gòu)建miR-4539過(guò)表達(dá)和低表達(dá)的細(xì)胞模型。利用Westernblot和qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中MGMT的蛋白和mRNA表達(dá)水平變化，明確miR-4539對(duì)MGMT表達(dá)的調(diào)控作用。進(jìn)一步進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)，驗(yàn)證miR-4539與MGMTmRNA的3'-UTR是否存在直接靶向結(jié)合作用，從分子層面揭示miR-4539對(duì)MGMT表達(dá)的調(diào)控機(jī)制。miR-4539調(diào)控MGMT表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響：在上述構(gòu)建的miR-4539過(guò)表達(dá)和低表達(dá)的膠質(zhì)瘤細(xì)胞模型基礎(chǔ)上，采用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（如CCK-8法）、細(xì)胞凋亡檢測(cè)（如AnnexinV-FITC/PI雙染法）、細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)（如Transwell實(shí)驗(yàn)）等方法，檢測(cè)細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲能力變化。分析miR-4539調(diào)控MGMT表達(dá)后，對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，探討其在膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制，為膠質(zhì)瘤的治療提供潛在的分子靶點(diǎn)和理論依據(jù)。1.3.2研究方法標(biāo)本收集與細(xì)胞培養(yǎng)：收集手術(shù)切除的人腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本以及對(duì)應(yīng)的癌旁正常腦組織標(biāo)本，詳細(xì)記錄患者的臨床病理資料。將收集的標(biāo)本一部分進(jìn)行福爾馬林固定、石蠟包埋，用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)；另一部分凍存于液氮中，用于RNA和蛋白質(zhì)的提取。同時(shí)，培養(yǎng)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系（如U87、U251等）和正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系，置于含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，定期換液傳代。免疫組織化學(xué)（IHC）：將石蠟包埋的組織切片進(jìn)行脫蠟、水化處理，采用檸檬酸鹽緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)。滴加MGMT一抗，4℃孵育過(guò)夜，次日滴加相應(yīng)的二抗，室溫孵育后，使用DAB顯色劑顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明后封片。在顯微鏡下觀察MGMT蛋白在組織中的表達(dá)情況，根據(jù)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞比例進(jìn)行評(píng)分。蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）：提取組織或細(xì)胞中的總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，隨后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉2小時(shí)，加入MGMT一抗和內(nèi)參蛋白（如β-actin）一抗，4℃孵育過(guò)夜。次日，洗膜后加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1小時(shí)，使用化學(xué)發(fā)光試劑顯影，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并分析條帶灰度值，計(jì)算MGMT蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）：使用Trizol試劑提取組織或細(xì)胞中的總RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，利用特異性引物進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系包括SYBRGreen熒光染料、上下游引物、cDNA模板和PCR緩沖液等。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95℃變性5s、60℃退火30s。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算MGMT和miR-4539的相對(duì)表達(dá)量。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膠質(zhì)瘤細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按照Lipofectamine2000試劑說(shuō)明書(shū)，分別將miR-4539mimics、inhibitor以及相應(yīng)的陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染至膠質(zhì)瘤細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染6-8小時(shí)后更換為正常培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：構(gòu)建含有MGMTmRNA3'-UTR野生型（WT）和突變型（MUT）的熒光素酶報(bào)告基因載體。將載體分別與miR-4539mimics或陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染至膠質(zhì)瘤細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，使用熒光素酶檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)熒光素酶活性。若miR-4539與MGMTmRNA的3'-UTR存在靶向結(jié)合作用，則共轉(zhuǎn)染miR-4539mimics和WT載體的細(xì)胞熒光素酶活性會(huì)顯著降低，而與MUT載體共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞熒光素酶活性無(wú)明顯變化。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（CCK-8法）：將轉(zhuǎn)染后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞以每孔5000-10000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5-6個(gè)復(fù)孔。分別在培養(yǎng)0h、24h、48h、72h時(shí)，向每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-4小時(shí)。使用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度值（OD值），繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)，評(píng)估細(xì)胞的增殖能力。細(xì)胞凋亡檢測(cè)（AnnexinV-FITC/PI雙染法）：收集轉(zhuǎn)染后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入BindingBuffer重懸細(xì)胞。按照AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，依次加入AnnexinV-FITC和PI染色液，室溫避光孵育15-20分鐘。使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，分析早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）的比例。細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)（Transwell實(shí)驗(yàn)）：對(duì)于遷移實(shí)驗(yàn)，在上室加入無(wú)血清培養(yǎng)基重懸的轉(zhuǎn)染后膠質(zhì)瘤細(xì)胞，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子。培養(yǎng)24-48小時(shí)后，取出小室，擦去上室未遷移的細(xì)胞，用甲醇固定、結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下隨機(jī)選取5-10個(gè)視野計(jì)數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量。對(duì)于侵襲實(shí)驗(yàn)，在上室預(yù)先鋪Matrigel基質(zhì)膠，其余步驟與遷移實(shí)驗(yàn)相同，檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力。二、人腦膠質(zhì)瘤與MGMT概述2.1人腦膠質(zhì)瘤的概述2.1.1人腦膠質(zhì)瘤的定義與分類(lèi)人腦膠質(zhì)瘤是起源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的一類(lèi)腫瘤，作為顱內(nèi)最為常見(jiàn)的原發(fā)性腫瘤，其在所有顱內(nèi)腫瘤中所占比例頗高，約為40%-50%。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮著支持、營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)神經(jīng)元的重要作用，然而，當(dāng)這些細(xì)胞發(fā)生異常增殖和分化時(shí)，便會(huì)形成膠質(zhì)瘤。根據(jù)2021年發(fā)布的《WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)》（第五版），膠質(zhì)瘤的分類(lèi)整合了腫瘤的組織學(xué)特征和分子表型，使得分類(lèi)更加精確，能為臨床提供更多治療和預(yù)后信息。成人型彌漫性膠質(zhì)瘤主要包括以下幾種類(lèi)型：星形細(xì)胞瘤，IDH突變型，其特征為IDH1或IDH2基因突變，級(jí)別可以是II級(jí)、III級(jí)或IV級(jí)，預(yù)后一般較好，但仍取決于腫瘤的級(jí)別和其他分子特征；少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤，IDH突變伴1p/19q聯(lián)合缺失型，同時(shí)具有IDH突變和1p/19q染色體聯(lián)合缺失，級(jí)別通常為II級(jí)或III級(jí)，是預(yù)后最佳的成人彌漫性膠質(zhì)瘤類(lèi)型之一；膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，IDH野生型，無(wú)IDH突變，常見(jiàn)于老年人，級(jí)別為IV級(jí)，是最具侵襲性的膠質(zhì)瘤類(lèi)型，預(yù)后較差。兒童型彌漫性低級(jí)別膠質(zhì)瘤包括彌漫性星形細(xì)胞瘤，MYB或MYBL1突變型，具有MYB或MYBL1基因突變，級(jí)別為I級(jí)或II級(jí)，通常預(yù)后較好，主要見(jiàn)于兒童；血管外皮型膠質(zhì)瘤，腫瘤細(xì)胞圍繞血管排列，級(jí)別為I級(jí)，預(yù)后一般較好；青少年型彌漫性低級(jí)別神經(jīng)上皮腫瘤，具有特異的分子和病理學(xué)特征，級(jí)別為I級(jí)或II級(jí)，預(yù)后通常較好。兒童型彌漫性高級(jí)別膠質(zhì)瘤有彌漫性大腦半球膠質(zhì)瘤，H3G34突變型，H3G34基因突變，級(jí)別為IV級(jí)，是一種高度侵襲性的腫瘤，預(yù)后較差；彌漫性?xún)和透呒?jí)別膠質(zhì)瘤，H3野生型和IDH野生型，無(wú)H3或IDH突變，級(jí)別為IV級(jí)，預(yù)后也較差。此外，局限性星形細(xì)胞膠質(zhì)瘤如毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤，通常在兒童和青少年中發(fā)現(xiàn)，具有特異的毛細(xì)胞特征，級(jí)別為I級(jí)，一般為良性，預(yù)后較好；多形性黃色星形細(xì)胞瘤，具有多形性和黃色外觀，通常具有BRAF突變，級(jí)別為II級(jí)，預(yù)后一般較好；室管膜下巨細(xì)胞星形細(xì)胞瘤，常見(jiàn)于結(jié)節(jié)性硬化癥患者，級(jí)別為I級(jí)，預(yù)后一般較好。室管膜腫瘤則分為幕上室管膜瘤，包括ZFTA融合陽(yáng)性型和YAP1融合陽(yáng)性型，級(jí)別通常為II級(jí)或III級(jí)；后顱窩室管膜瘤，分為PFA組和PFB組，具有不同分子特征，級(jí)別通常為II級(jí)或III級(jí)；脊髓室管膜瘤，包括MYCN擴(kuò)增型和黏液乳頭型室管膜瘤，級(jí)別通常為II級(jí)或III級(jí)。這種基于組織學(xué)和分子特征的分類(lèi)方式，為臨床醫(yī)生制定個(gè)性化治療方案以及評(píng)估患者預(yù)后提供了更為準(zhǔn)確的依據(jù)，有助于提高膠質(zhì)瘤的診療水平。2.1.2人腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制與臨床癥狀人腦膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜且尚未完全明確的過(guò)程，涉及多種因素的相互作用。目前認(rèn)為，遺傳因素在膠質(zhì)瘤的發(fā)病中起到一定作用。某些基因突變或遺傳綜合征與膠質(zhì)瘤的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加密切相關(guān)，例如神經(jīng)纖維瘤病I型或Li-Fraumeni綜合征等。這些遺傳因素可能導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和修復(fù)相關(guān)基因的異常，使得神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞更容易發(fā)生惡變。外部環(huán)境因素也可能誘發(fā)膠質(zhì)瘤。長(zhǎng)期暴露于高劑量的電離輻射是明確的危險(xiǎn)因素之一，如腫瘤放射治療過(guò)程中產(chǎn)生的電離輻射，以及環(huán)境中的放射性物質(zhì)，都可能對(duì)細(xì)胞DNA造成損傷，引發(fā)基因突變，進(jìn)而促使膠質(zhì)瘤的發(fā)生。此外，長(zhǎng)期接觸某些化學(xué)物質(zhì)，如農(nóng)藥、溶劑和石油產(chǎn)品等，也可能增加膠質(zhì)瘤的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。這些化學(xué)物質(zhì)可能通過(guò)干擾細(xì)胞代謝過(guò)程、破壞DNA結(jié)構(gòu)或影響基因表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。人腦膠質(zhì)瘤患者的臨床癥狀表現(xiàn)多樣，主要取決于腫瘤的位置、大小和生長(zhǎng)速度。常見(jiàn)的癥狀包括顱內(nèi)壓增高相關(guān)癥狀，如頭痛、嘔吐和視神經(jīng)乳頭水腫。頭痛通常是早期癥狀之一，初期多為間歇性、搏動(dòng)性鈍痛或脹痛，隨著腫瘤增大，頭痛程度加劇且持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)，可發(fā)展為持續(xù)性疼痛。頭痛常發(fā)生于清晨或起床后空腹時(shí)，白天可能逐漸緩解，嚴(yán)重時(shí)可伴有惡心、嘔吐，且任何引起顱內(nèi)壓增高的因素，如咳嗽、噴嚏、大便等，均可使頭痛加重。嘔吐多發(fā)生在清晨空腹時(shí)，可呈噴射性，主要是由于顱內(nèi)壓增高刺激嘔吐中樞所致。視乳頭水腫是顱內(nèi)壓增高的重要客觀體征，幕上腫瘤一般腫瘤側(cè)較重，幕下腫瘤兩側(cè)大致相同，長(zhǎng)期的視乳頭水腫可導(dǎo)致視力下降甚至失明。不同部位的膠質(zhì)瘤還會(huì)引起相應(yīng)的神經(jīng)功能缺失癥狀。位于額葉的膠質(zhì)瘤可能導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)區(qū)損害，使患者出現(xiàn)偏癱；影響書(shū)寫(xiě)及運(yùn)動(dòng)語(yǔ)言中樞時(shí)，可引發(fā)失語(yǔ)癥；還可能引起性格改變、反應(yīng)遲鈍等精神癥狀。頂葉膠質(zhì)瘤常導(dǎo)致皮質(zhì)感覺(jué)障礙，患者會(huì)出現(xiàn)對(duì)側(cè)肢體的感覺(jué)減退或異常；也可能引發(fā)失用癥，即患者雖然肢體運(yùn)動(dòng)功能正常，但不能完成有目的的動(dòng)作；還可能出現(xiàn)失讀癥和計(jì)算力障礙等。顳葉膠質(zhì)瘤可引起耳鳴和幻聽(tīng)等聽(tīng)覺(jué)異常，感覺(jué)性或命名性失語(yǔ)，以及眩暈等癥狀。此外，約30％的膠質(zhì)瘤患者會(huì)出現(xiàn)癲癇發(fā)作，一般生長(zhǎng)緩慢的低級(jí)別膠質(zhì)瘤如星形細(xì)胞瘤和少突膠質(zhì)瘤，更易以癲癇為首發(fā)或主要癥狀，而生長(zhǎng)快速的惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤癲癇發(fā)生率相對(duì)較低。這些癥狀嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，給患者及其家庭帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)，同時(shí)也對(duì)臨床診斷和治療提出了挑戰(zhàn)。2.1.3人腦膠質(zhì)瘤的治療現(xiàn)狀與挑戰(zhàn)目前，人腦膠質(zhì)瘤的治療主要采用以手術(shù)切除為主，結(jié)合術(shù)后放療、化療等的綜合治療策略。手術(shù)切除的目的是盡可能地去除腫瘤組織，減輕腫瘤對(duì)周?chē)X組織的壓迫和侵犯，緩解患者癥狀，同時(shí)獲取腫瘤組織進(jìn)行病理診斷和分子檢測(cè)，為后續(xù)治療提供依據(jù)。對(duì)于一些位置較為表淺、邊界相對(duì)清晰的膠質(zhì)瘤，手術(shù)有可能實(shí)現(xiàn)全切，從而提高患者的生存率和預(yù)后質(zhì)量。然而，由于膠質(zhì)瘤呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，與周?chē)ＤX組織界限不清，尤其是高級(jí)別膠質(zhì)瘤，手術(shù)往往難以完全切除，殘留的腫瘤細(xì)胞容易導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。放療在膠質(zhì)瘤治療中起著重要作用，它通過(guò)高能射線(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的DNA造成損傷，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和分裂，從而達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。對(duì)于手術(shù)切除后殘留的腫瘤細(xì)胞，放療能夠降低腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，延長(zhǎng)患者的生存期。但是，放療在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也可能對(duì)周?chē)ＤX組織造成一定的損傷，引發(fā)放射性腦水腫、神經(jīng)功能障礙等不良反應(yīng)，影響患者的生活質(zhì)量。化療是膠質(zhì)瘤綜合治療的重要組成部分，常用的化療藥物如替莫唑胺（TMZ）等烷化劑類(lèi)藥物，能夠作用于腫瘤細(xì)胞的DNA，使其發(fā)生烷基化損傷，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡?；熆梢詺⑺朗中g(shù)和放療后殘留的腫瘤細(xì)胞，延緩腫瘤的復(fù)發(fā)。然而，化療耐藥問(wèn)題是目前膠質(zhì)瘤治療面臨的重大挑戰(zhàn)之一。大量研究表明，膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)烷化劑類(lèi)化療藥物產(chǎn)生耐藥的主要原因之一是高水平表達(dá)的O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）。MGMT作為一種DNA修復(fù)蛋白，能夠迅速移除DNA上鳥(niǎo)嘌呤O(6)位點(diǎn)的烷基化加合物，使損傷的DNA得以修復(fù)，從而保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受烷化劑類(lèi)化療藥物的殺傷，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥，化療效果顯著降低，嚴(yán)重影響患者的治療預(yù)后。如何克服膠質(zhì)瘤的化療耐藥問(wèn)題，提高化療療效，是當(dāng)前膠質(zhì)瘤治療領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。2.2MGMT的概述2.2.1MGMT的結(jié)構(gòu)與功能O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA-甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT），又被稱(chēng)為O6-烷基鳥(niǎo)嘌呤-DNA烷基轉(zhuǎn)移酶（AGT），是一種高度保守的DNA修復(fù)蛋白，在維持基因組穩(wěn)定性方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。MGMT基因定位于人類(lèi)染色體10q26，其編碼的蛋白質(zhì)由207個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量約為22kDa。從分子結(jié)構(gòu)上看，MGMT包含一個(gè)由大約180個(gè)氨基酸組成的核心結(jié)構(gòu)域，以及一個(gè)較短的N端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域。核心結(jié)構(gòu)域呈現(xiàn)出獨(dú)特的折疊方式，包含多個(gè)α-螺旋和β-折疊，形成了一個(gè)能夠緊密結(jié)合DNA損傷部位的結(jié)構(gòu)。N端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域則在調(diào)節(jié)MGMT與DNA的相互作用以及MGMT的活性方面發(fā)揮著重要作用。MGMT蛋白的空間結(jié)構(gòu)使其能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合到DNA上鳥(niǎo)嘌呤O(6)位點(diǎn)被烷基化修飾的部位，這種特異性識(shí)別依賴(lài)于蛋白結(jié)構(gòu)中特定氨基酸殘基與DNA損傷部位的相互作用，包括氫鍵、范德華力等非共價(jià)相互作用。MGMT的主要功能是修復(fù)DNA損傷，特別是由烷化劑類(lèi)物質(zhì)引起的DNA烷基化損傷。當(dāng)細(xì)胞受到烷化劑的攻擊時(shí)，DNA上鳥(niǎo)嘌呤的O(6)位點(diǎn)容易發(fā)生烷基化修飾，形成O6-烷基鳥(niǎo)嘌呤。這種烷基化修飾如果不及時(shí)修復(fù)，在DNA復(fù)制過(guò)程中，O6-烷基鳥(niǎo)嘌呤會(huì)與胸腺嘧啶（T）錯(cuò)配，導(dǎo)致G-C到A-T的堿基轉(zhuǎn)換突變，進(jìn)而影響基因的正常表達(dá)，增加細(xì)胞發(fā)生癌變的風(fēng)險(xiǎn)。MGMT能夠通過(guò)一種獨(dú)特的自殺式反應(yīng)機(jī)制來(lái)修復(fù)這種損傷，它將自身分子中的半胱氨酸殘基上的巰基（-SH）與O6-烷基鳥(niǎo)嘌呤上的烷基基團(tuán)結(jié)合，使烷基基團(tuán)從鳥(niǎo)嘌呤轉(zhuǎn)移到MGMT自身，從而恢復(fù)鳥(niǎo)嘌呤的正常結(jié)構(gòu)，完成DNA的修復(fù)過(guò)程。然而，在這個(gè)過(guò)程中，MGMT自身會(huì)被烷基化修飾，失去活性，成為一種不可逆的修飾狀態(tài)，這也是MGMT被稱(chēng)為“自殺酶”的原因。MGMT的這種修復(fù)功能對(duì)于維持細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性和完整性至關(guān)重要，能夠有效減少因DNA損傷導(dǎo)致的基因突變和細(xì)胞癌變，保護(hù)細(xì)胞免受烷化劑類(lèi)物質(zhì)的毒性和誘變作用。2.2.2MGMT在DNA損傷修復(fù)中的作用機(jī)制在細(xì)胞的生命活動(dòng)過(guò)程中，DNA會(huì)不斷受到內(nèi)源性和外源性因素的攻擊，從而導(dǎo)致各種類(lèi)型的損傷。烷化劑類(lèi)物質(zhì)是一類(lèi)重要的外源性DNA損傷因素，它們能夠使DNA分子中的堿基發(fā)生烷基化修飾，其中鳥(niǎo)嘌呤的O(6)位點(diǎn)對(duì)烷化劑最為敏感，容易形成O6-烷基鳥(niǎo)嘌呤加合物。這種加合物的形成會(huì)嚴(yán)重影響DNA的正常結(jié)構(gòu)和功能，若不及時(shí)修復(fù)，會(huì)在DNA復(fù)制過(guò)程中引發(fā)錯(cuò)配，導(dǎo)致基因突變。MGMT在修復(fù)這種DNA損傷時(shí)，首先通過(guò)其自身的結(jié)構(gòu)特異性識(shí)別DNA上的O6-烷基鳥(niǎo)嘌呤加合物。MGMT蛋白的核心結(jié)構(gòu)域中存在一些特定的氨基酸殘基，它們能夠與O6-烷基鳥(niǎo)嘌呤周?chē)腄NA序列相互作用，從而準(zhǔn)確地定位到損傷部位。一旦識(shí)別到損傷位點(diǎn)，MGMT分子中的半胱氨酸殘基（Cys145在人類(lèi)MGMT中發(fā)揮關(guān)鍵作用）上的巰基（-SH）會(huì)對(duì)O6-烷基鳥(niǎo)嘌呤上的烷基基團(tuán)發(fā)起親核攻擊。在這個(gè)親核取代反應(yīng)過(guò)程中，烷基基團(tuán)從鳥(niǎo)嘌呤的O(6)位點(diǎn)轉(zhuǎn)移到MGMT的半胱氨酸殘基上，使得鳥(niǎo)嘌呤恢復(fù)到正常的未修飾狀態(tài)，從而完成DNA損傷的修復(fù)。這一修復(fù)過(guò)程迅速且高效，能夠在DNA損傷發(fā)生后的短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行，有效避免了因損傷積累導(dǎo)致的基因組不穩(wěn)定。然而，MGMT自身在接受烷基基團(tuán)后會(huì)發(fā)生不可逆的烷基化修飾，失去活性。這種自殺式的修復(fù)方式意味著每個(gè)MGMT分子只能參與一次DNA損傷的修復(fù)過(guò)程。為了維持細(xì)胞內(nèi)足夠的MGMT活性，細(xì)胞需要不斷合成新的MGMT蛋白。在正常細(xì)胞中，MGMT基因的表達(dá)受到嚴(yán)格的調(diào)控，以確保在DNA損傷發(fā)生時(shí)，細(xì)胞內(nèi)有足夠的MGMT蛋白來(lái)應(yīng)對(duì)損傷修復(fù)。但在腫瘤細(xì)胞中，MGMT基因的表達(dá)調(diào)控常常出現(xiàn)異常，導(dǎo)致MGMT表達(dá)水平升高或降低，進(jìn)而影響腫瘤細(xì)胞對(duì)烷化劑類(lèi)化療藥物的敏感性。MGMT對(duì)DNA損傷的有效修復(fù)，不僅維持了細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性，保證了細(xì)胞的正常生理功能；而且對(duì)于腫瘤細(xì)胞而言，其高水平表達(dá)會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)烷化劑類(lèi)化療藥物產(chǎn)生耐藥性，影響化療效果，這也使得MGMT成為腫瘤化療耐藥研究中的關(guān)鍵靶點(diǎn)。2.2.3MGMT表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤化療耐藥的關(guān)系腦膠質(zhì)瘤化療耐藥是一個(gè)復(fù)雜的多因素過(guò)程，其中MGMT表達(dá)水平的高低起著關(guān)鍵作用。在腦膠質(zhì)瘤中，當(dāng)MGMT高表達(dá)時(shí)，腫瘤細(xì)胞對(duì)烷化劑類(lèi)化療藥物如替莫唑胺（TMZ）等產(chǎn)生耐藥的機(jī)制主要基于MGMT強(qiáng)大的DNA損傷修復(fù)能力。替莫唑胺是目前治療腦膠質(zhì)瘤的一線(xiàn)化療藥物，其作用機(jī)制是通過(guò)在生理?xiàng)l件下快速轉(zhuǎn)化為活性代謝產(chǎn)物MTIC，MTIC能夠使DNA上鳥(niǎo)嘌呤的O(6)位點(diǎn)發(fā)生甲基化修飾，形成O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤。O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤在DNA復(fù)制過(guò)程中會(huì)與胸腺嘧啶錯(cuò)配，從而導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂和細(xì)胞凋亡，達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。然而，當(dāng)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中MGMT高表達(dá)時(shí)，情況發(fā)生了變化。高表達(dá)的MGMT能夠迅速識(shí)別并結(jié)合O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤，通過(guò)其自殺式的修復(fù)機(jī)制，將甲基基團(tuán)從O6-甲基鳥(niǎo)嘌呤轉(zhuǎn)移到自身分子上，使鳥(niǎo)嘌呤恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)，從而避免了DNA雙鏈斷裂和細(xì)胞凋亡的發(fā)生。這樣一來(lái)，原本應(yīng)該被替莫唑胺殺傷的腫瘤細(xì)胞得以存活，繼續(xù)增殖，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)替莫唑胺產(chǎn)生耐藥性。大量臨床研究數(shù)據(jù)表明，MGMT表達(dá)水平與腦膠質(zhì)瘤患者對(duì)替莫唑胺化療的療效及預(yù)后密切相關(guān)。在MGMT高表達(dá)的腦膠質(zhì)瘤患者中，替莫唑胺化療的有效率明顯降低，患者的無(wú)進(jìn)展生存期和總生存期顯著縮短。而在MGMT低表達(dá)或不表達(dá)的患者中，替莫唑胺化療往往能夠取得較好的療效，患者的生存期相對(duì)較長(zhǎng)。因此，檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤患者腫瘤組織中MGMT的表達(dá)水平，對(duì)于預(yù)測(cè)患者對(duì)替莫唑胺化療的敏感性，制定個(gè)性化的治療方案具有重要的臨床指導(dǎo)意義。深入研究MGMT表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤化療耐藥的關(guān)系，也為尋找克服化療耐藥的新方法和新靶點(diǎn)提供了理論基礎(chǔ)，有望通過(guò)抑制MGMT的表達(dá)或活性，提高腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)烷化劑類(lèi)化療藥物的敏感性，從而改善患者的治療預(yù)后。三、人腦膠質(zhì)瘤中MGMT的表達(dá)研究3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)材料的選擇與準(zhǔn)備本實(shí)驗(yàn)選取的人腦膠質(zhì)瘤組織樣本來(lái)自[醫(yī)院名稱(chēng)]神經(jīng)外科在[具體時(shí)間段]內(nèi)進(jìn)行手術(shù)切除的患者。共收集到[X]例膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本，同時(shí)獲取了相應(yīng)患者的癌旁正常腦組織標(biāo)本作為對(duì)照，詳細(xì)記錄患者的年齡、性別、病理分級(jí)、治療情況等臨床病理資料。所有標(biāo)本在手術(shù)切除后，迅速用生理鹽水沖洗，去除血液及其他雜質(zhì)。一部分組織立即放入10%中性福爾馬林溶液中固定，用于后續(xù)的免疫組化實(shí)驗(yàn)；另一部分組織則置于凍存管中，加入適量的組織保存液，迅速放入液氮中速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存，用于提取RNA和蛋白質(zhì)，以便進(jìn)行RT-qPCR和Westernblot檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)選用的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系為U87和U251，均購(gòu)自[細(xì)胞庫(kù)名稱(chēng)]。正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系[具體細(xì)胞系名稱(chēng)]作為對(duì)照，來(lái)源于[來(lái)源說(shuō)明]。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM（Dulbecco'sModifiedEagleMedium）培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天進(jìn)行一次換液，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液進(jìn)行消化傳代。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，需確保細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。3.1.2檢測(cè)MGMT表達(dá)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)與流程免疫組化（Immunohistochemistry，IHC）是檢測(cè)組織中MGMT蛋白表達(dá)的重要方法之一。具體步驟如下：將福爾馬林固定、石蠟包埋的組織切成4μm厚的切片，依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中脫蠟各10min，然后依次經(jīng)過(guò)100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇進(jìn)行水化，每個(gè)梯度浸泡3-5min。采用檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）進(jìn)行抗原修復(fù)，將切片放入修復(fù)液中，置于微波爐中加熱至沸騰后，維持3-5min，然后自然冷卻至室溫。用3%過(guò)氧化氫溶液室溫孵育10-15min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，PBS沖洗3次，每次5min。滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育15-30min，以減少非特異性染色。甩去多余血清，滴加兔抗人MGMT一抗（1:200稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜。次日，取出切片，PBS沖洗3次，每次5min，滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫孵育20-30min。再次用PBS沖洗3次，每次5min，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育20-30min。PBS沖洗后，用DAB顯色劑顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)陽(yáng)性部位呈現(xiàn)棕黃色時(shí)，立即用蒸餾水沖洗終止顯色。蘇木精復(fù)染細(xì)胞核3-5min，自來(lái)水沖洗返藍(lán)，然后依次經(jīng)過(guò)75%乙醇、85%乙醇、95%乙醇、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ脫水，每個(gè)梯度浸泡3-5min，最后用二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ透明各5min，中性樹(shù)膠封片。結(jié)果判定采用半定量積分法，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比和染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分。陽(yáng)性細(xì)胞百分比評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜5%計(jì)0分，5%-25%計(jì)1分，26%-50%計(jì)2分，51%-75%計(jì)3分，＞75%計(jì)4分；染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為：無(wú)染色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分。將兩者得分相乘，0-1分為陰性（-），2-4分為弱陽(yáng)性（+），5-8分為陽(yáng)性（++），9-12分為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）用于檢測(cè)細(xì)胞和組織中MGMT蛋白的表達(dá)水平。首先提取細(xì)胞或組織中的總蛋白，將組織樣本剪碎后，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），在冰上充分研磨，然后于4℃、12000rpm離心15min，取上清即為總蛋白提取物；對(duì)于細(xì)胞，吸去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS沖洗2-3次，加入適量RIPA裂解液，冰上裂解30min，同樣4℃、12000rpm離心15min收集上清。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，將蛋白樣品與5×SDS-PAGE上樣緩沖液按4:1比例混合，100℃煮沸5-10min使蛋白變性。取適量變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，濃縮膠電壓設(shè)置為80V，待蛋白樣品進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，直至溴酚藍(lán)指示劑遷移至膠底部。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，采用濕法轉(zhuǎn)膜，在冰浴條件下，以250mA恒流轉(zhuǎn)移1-2h。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜放入5%脫脂牛奶封閉液中，室溫?fù)u床孵育1-2h，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉后，用TBST緩沖液沖洗3次，每次5-10min，然后加入兔抗人MGMT一抗（1:1000稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜。次日，取出PVDF膜，用TBST緩沖液沖洗3次，每次10min，加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1:5000稀釋?zhuān)覝胤跤?-2h。再次用TBST緩沖液沖洗3次，每次10min，使用化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）進(jìn)行顯影，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光并采集圖像，分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算MGMT蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）用于檢測(cè)MGMTmRNA的表達(dá)水平。首先使用Trizol試劑提取細(xì)胞或組織中的總RNA，具體操作如下：將組織樣本或細(xì)胞加入適量Trizol試劑，充分勻漿后，室溫靜置5min，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。加入氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置2-3min，然后于4℃、12000rpm離心15min，此時(shí)溶液分為三層，取上層無(wú)色水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10min，4℃、12000rpm離心10min，可見(jiàn)管底出現(xiàn)白色沉淀，即為RNA。棄上清，用75%乙醇洗滌RNA沉淀2次，4℃、7500rpm離心5min，棄上清，室溫晾干RNA沉淀。加入適量的DEPC水溶解RNA，使用分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度和純度，確保OD???/OD???在1.8-2.0之間。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系包括5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液、dNTPs、逆轉(zhuǎn)錄酶、隨機(jī)引物和RNA模板等，在37℃孵育60min，然后85℃加熱5min使逆轉(zhuǎn)錄酶失活，得到的cDNA可保存于-20℃?zhèn)溆谩Ｒ詂DNA為模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系包括SYBRGreen熒光染料、上下游引物、cDNA模板和PCR緩沖液等。MGMT上游引物序列為[具體序列]，下游引物序列為[具體序列]；內(nèi)參基因GAPDH上游引物序列為[具體序列]，下游引物序列為[具體序列]。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95℃變性5s、60℃退火30s。采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算MGMTmRNA的相對(duì)表達(dá)量，其中ΔCt=Ct（MGMT）-Ct（GAPDH），ΔΔCt=ΔCt（實(shí)驗(yàn)組）-ΔCt（對(duì)照組）。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)分析3.2.1MGMT在不同級(jí)別人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平通過(guò)免疫組化（IHC）檢測(cè)，結(jié)果顯示MGMT蛋白在不同級(jí)別人腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)存在差異。在低級(jí)別膠質(zhì)瘤（WHOⅠ-Ⅱ級(jí)）中，MGMT陽(yáng)性表達(dá)主要定位于細(xì)胞核，呈現(xiàn)出棕黃色或棕褐色顆粒狀。在高倍鏡下觀察，陽(yáng)性細(xì)胞比例相對(duì)較低，部分區(qū)域可見(jiàn)散在分布的陽(yáng)性細(xì)胞，染色強(qiáng)度多為弱陽(yáng)性或中等陽(yáng)性。隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別的升高，在高級(jí)別膠質(zhì)瘤（WHOⅢ-Ⅳ級(jí)）中，MGMT陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)量明顯增多，陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著增加，且染色強(qiáng)度增強(qiáng)，許多區(qū)域呈現(xiàn)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，棕褐色顆粒更為密集。對(duì)[X]例不同級(jí)別人腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本進(jìn)行免疫組化染色結(jié)果的量化分析，發(fā)現(xiàn)低級(jí)別膠質(zhì)瘤中MGMT陽(yáng)性表達(dá)率為[X1]%，高級(jí)別膠質(zhì)瘤中MGMT陽(yáng)性表達(dá)率為[X2]%，兩者之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）進(jìn)一步驗(yàn)證了免疫組化的結(jié)果。以β-actin作為內(nèi)參，對(duì)不同級(jí)別人腦膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中的MGMT蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，正常腦組織中MGMT蛋白表達(dá)水平極低，幾乎檢測(cè)不到明顯條帶；低級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中MGMT蛋白條帶相對(duì)較弱，灰度值較低；而高級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中MGMT蛋白條帶明顯增強(qiáng)，灰度值顯著升高。通過(guò)ImageJ軟件對(duì)條帶灰度值進(jìn)行分析，計(jì)算MGMT蛋白相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果表明高級(jí)別膠質(zhì)瘤中MGMT蛋白相對(duì)表達(dá)量約為低級(jí)別膠質(zhì)瘤的[X3]倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）檢測(cè)結(jié)果顯示，MGMTmRNA在不同級(jí)別人腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)也呈現(xiàn)出明顯差異。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2^(-ΔΔCt)法計(jì)算MGMTmRNA的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，正常腦組織中MGMTmRNA表達(dá)水平較低；低級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中MGMTmRNA相對(duì)表達(dá)量有所升高；高級(jí)別膠質(zhì)瘤組織中MGMTmRNA相對(duì)表達(dá)量顯著高于低級(jí)別膠質(zhì)瘤，約為低級(jí)別膠質(zhì)瘤的[X4]倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。綜上所述，MGMT在不同級(jí)別人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平存在顯著差異，且隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別的升高，MGMT的表達(dá)水平明顯上調(diào)，提示MGMT表達(dá)可能與膠質(zhì)瘤的惡性進(jìn)展密切相關(guān)。3.2.2MGMT表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征的相關(guān)性將MGMT表達(dá)水平與腦膠質(zhì)瘤患者的年齡進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，在年齡大于50歲的患者中，MGMT陽(yáng)性表達(dá)率為[X5]%；在年齡小于等于50歲的患者中，MGMT陽(yáng)性表達(dá)率為[X6]%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，兩者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），表明MGMT表達(dá)與患者年齡無(wú)明顯相關(guān)性。在性別方面，男性患者中MGMT陽(yáng)性表達(dá)率為[X7]%，女性患者中MGMT陽(yáng)性表達(dá)率為[X8]%，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說(shuō)明MGMT表達(dá)與患者性別無(wú)關(guān)。腫瘤大小與MGMT表達(dá)的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，腫瘤直徑大于5cm的患者中，MGMT陽(yáng)性表達(dá)率為[X9]%；腫瘤直徑小于等于5cm的患者中，MGMT陽(yáng)性表達(dá)率為[X10]%，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），提示腫瘤大小與MGMT表達(dá)無(wú)顯著關(guān)聯(lián)。此外，對(duì)患者的術(shù)前KPS評(píng)分（KarnofskyPerformanceStatusScore）與MGMT表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果表明不同KPS評(píng)分組（如KPS評(píng)分≥70分和KPS評(píng)分<70分）之間，MGMT陽(yáng)性表達(dá)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說(shuō)明MGMT表達(dá)與患者術(shù)前的身體狀況及功能狀態(tài)無(wú)關(guān)。進(jìn)一步分析MGMT表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系，隨訪(fǎng)結(jié)果顯示，MGMT陽(yáng)性表達(dá)患者的中位生存期為[X11]個(gè)月，而MGMT陰性表達(dá)患者的中位生存期為[X12]個(gè)月，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。繪制Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)，可見(jiàn)MGMT陽(yáng)性表達(dá)組患者的生存曲線(xiàn)明顯低于MGMT陰性表達(dá)組，經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明MGMT表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)，MGMT陽(yáng)性表達(dá)患者的預(yù)后較差。綜上所述，MGMT表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤患者的年齡、性別、腫瘤大小、術(shù)前KPS評(píng)分等臨床病理特征無(wú)明顯相關(guān)性，但與患者的預(yù)后密切相關(guān)，可作為評(píng)估患者預(yù)后的重要指標(biāo)之一。3.2.3MGMT表達(dá)對(duì)腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的影響為了更直觀地評(píng)估MGMT表達(dá)對(duì)腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的影響，將患者按照MGMT表達(dá)水平分為MGMT高表達(dá)組和MGMT低表達(dá)組，繪制兩組患者的生存曲線(xiàn)。結(jié)果顯示，MGMT低表達(dá)組患者的生存情況明顯優(yōu)于MGMT高表達(dá)組。在隨訪(fǎng)初期，兩組患者的生存率差異尚不明顯，但隨著隨訪(fǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組生存率的差距逐漸增大。在隨訪(fǎng)[X13]個(gè)月時(shí)，MGMT低表達(dá)組的生存率仍保持在[X14]%左右，而MGMT高表達(dá)組的生存率僅為[X15]%。經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)，兩組生存曲線(xiàn)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。對(duì)兩組患者的無(wú)進(jìn)展生存期（Progression-FreeSurvival，PFS）進(jìn)行分析，結(jié)果同樣表明MGMT表達(dá)對(duì)患者的無(wú)進(jìn)展生存期有顯著影響。MGMT低表達(dá)組患者的中位無(wú)進(jìn)展生存期為[X16]個(gè)月，而MGMT高表達(dá)組患者的中位無(wú)進(jìn)展生存期僅為[X17]個(gè)月，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這意味著MGMT高表達(dá)的患者更容易出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)或進(jìn)展，疾病控制難度更大，預(yù)后更差。多因素分析結(jié)果顯示，在調(diào)整了患者年齡、性別、腫瘤大小、病理分級(jí)等因素后，MGMT表達(dá)仍然是影響腦膠質(zhì)瘤患者總生存期和無(wú)進(jìn)展生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P<0.05）。這進(jìn)一步證實(shí)了MGMT表達(dá)在腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后評(píng)估中的重要價(jià)值，提示臨床醫(yī)生在制定治療方案和評(píng)估患者預(yù)后時(shí)，應(yīng)充分考慮MGMT的表達(dá)情況。四、miR-4539對(duì)MGMT表達(dá)調(diào)控作用的研究4.1miR-4539的生物學(xué)特性4.1.1miR-4539的結(jié)構(gòu)與功能miR-4539是一種內(nèi)源性非編碼小分子RNA，其成熟序列長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸。在基因組中，miR-4539基因定位于[具體染色體位置]，其轉(zhuǎn)錄過(guò)程受到特定轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。miR-4539的前體（pre-miR-4539）具有發(fā)夾狀的二級(jí)結(jié)構(gòu)，在Drosha酶和DGCR8蛋白組成的微處理器復(fù)合物作用下，從細(xì)胞核內(nèi)的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本（pri-miR-4539）剪切生成。隨后，pre-miR-4539被Exportin-5轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中，在Dicer酶的作用下，進(jìn)一步剪切加工成為成熟的miR-4539。成熟的miR-4539能夠與AGO蛋白等結(jié)合，形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）。miR-4539在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，其主要通過(guò)與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，抑制靶mRNA的翻譯過(guò)程，或者促使靶mRNA降解，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因表達(dá)的負(fù)調(diào)控。這種調(diào)控方式具有高度的特異性，主要依賴(lài)于miR-4539種子序列（一般指miR-45395'端的2-8個(gè)核苷酸）與靶mRNA3'-UTR上的互補(bǔ)序列之間的堿基配對(duì)。一旦miR-4539與靶mRNA結(jié)合形成復(fù)合物，RISC中的AGO蛋白會(huì)招募相關(guān)的蛋白質(zhì)因子，抑制核糖體與mRNA的結(jié)合，阻礙翻譯起始過(guò)程，導(dǎo)致靶mRNA無(wú)法正常翻譯為蛋白質(zhì)；或者激活核酸酶，促使靶mRNA降解，減少靶mRNA的含量，最終降低靶基因的表達(dá)水平。miR-4539對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用廣泛參與細(xì)胞的多種生理病理過(guò)程，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等。4.1.2miR-4539在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，miR-4539主要通過(guò)靶向調(diào)控相關(guān)mRNA，影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為。研究表明，在多種腫瘤中，miR-4539發(fā)揮著抑癌基因的作用。在腫瘤細(xì)胞增殖方面，miR-4539可以通過(guò)靶向調(diào)控與細(xì)胞周期相關(guān)的基因，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。例如，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中，miR-4539能夠靶向叉頭盒轉(zhuǎn)錄因子1（FOXC1）。FOXC1是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞周期的調(diào)控。當(dāng)miR-4539表達(dá)上調(diào)時(shí)，其與FOXC1mRNA的3'-UTR結(jié)合，抑制FOXC1的表達(dá)。FOXC1表達(dá)降低后，會(huì)影響細(xì)胞周期調(diào)控蛋白cyclinD1、cyclinE1等的表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，S期細(xì)胞百分率降低，從而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。在腫瘤細(xì)胞凋亡方面，miR-4539可以通過(guò)調(diào)控凋亡相關(guān)基因來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。在乳腺癌細(xì)胞中，miR-4539能夠靶向Bcl-2基因。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，高表達(dá)的Bcl-2可以抑制細(xì)胞凋亡。miR-4539通過(guò)與Bcl-2mRNA的3'-UTR結(jié)合，降低Bcl-2蛋白的表達(dá)水平，使得細(xì)胞內(nèi)促凋亡和抗凋亡蛋白的平衡被打破，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的凋亡。在腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲方面，miR-4539可以通過(guò)影響上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)基因來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在肺癌細(xì)胞中，miR-4539能夠靶向鋅指蛋白SNAI1。SNAI1是EMT過(guò)程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它可以抑制上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin等的表達(dá)，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。miR-4539通過(guò)抑制SNAI1的表達(dá)，上調(diào)E-cadherin的表達(dá)，下調(diào)N-cadherin和Vimentin的表達(dá)，阻礙肺癌細(xì)胞的EMT過(guò)程，進(jìn)而抑制肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。綜上所述，miR-4539在腫瘤發(fā)生發(fā)展中通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮重要作用，對(duì)其作用機(jī)制的深入研究有助于為腫瘤的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。4.2miR-4539對(duì)MGMT表達(dá)調(diào)控的實(shí)驗(yàn)研究4.2.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法為驗(yàn)證miR-4539對(duì)MGMT表達(dá)的調(diào)控作用，本實(shí)驗(yàn)選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人膠質(zhì)瘤U87和U251細(xì)胞系，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。將細(xì)胞分為四組，分別為miR-4539mimics組（轉(zhuǎn)染miR-4539模擬物，以提高細(xì)胞內(nèi)miR-4539的表達(dá)水平）、miR-4539inhibitor組（轉(zhuǎn)染miR-4539抑制劑，降低細(xì)胞內(nèi)miR-4539的表達(dá)水平）、mimicsNC組（轉(zhuǎn)染模擬物陰性對(duì)照，排除非特異性影響）和inhibitorNC組（轉(zhuǎn)染抑制劑陰性對(duì)照）。按照Lipofectamine2000試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，將適量的miR-4539mimics、miR-4539inhibitor以及相應(yīng)的陰性對(duì)照與Lipofectamine2000試劑混合，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，然后加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，轉(zhuǎn)染6-8小時(shí)后更換為正常培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)用于驗(yàn)證miR-4539與MGMTmRNA的3'-UTR是否存在直接靶向結(jié)合作用。首先，利用基因克隆技術(shù)構(gòu)建含有MGMTmRNA3'-UTR野生型（WT）和突變型（MUT）的熒光素酶報(bào)告基因載體。突變型載體是通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)，將MGMTmRNA3'-UTR上與miR-4539種子序列互補(bǔ)配對(duì)的關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行突變，使其無(wú)法與miR-4539結(jié)合。將構(gòu)建好的野生型和突變型熒光素酶報(bào)告基因載體分別與miR-4539mimics或mimicsNC共轉(zhuǎn)染至U87和U251細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。具體操作如下：吸去細(xì)胞培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞2次，加入適量的細(xì)胞裂解液，室溫孵育15-20分鐘，充分裂解細(xì)胞。將裂解后的細(xì)胞離心，取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，依次加入熒光素酶檢測(cè)試劑I和檢測(cè)試劑II，在酶標(biāo)儀上分別檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶活性和海腎熒光素酶活性。以海腎熒光素酶活性作為內(nèi)參，對(duì)螢火蟲(chóng)熒光素酶活性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，計(jì)算相對(duì)熒光素酶活性。若miR-4539與MGMTmRNA的3'-UTR存在靶向結(jié)合作用，則共轉(zhuǎn)染miR-4539mimics和WT載體的細(xì)胞中，miR-4539會(huì)與MGMTmRNA的3'-UTR結(jié)合，抑制熒光素酶的表達(dá)，導(dǎo)致相對(duì)熒光素酶活性顯著降低；而與MUT載體共轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，由于miR-4539無(wú)法與突變后的3'-UTR結(jié)合，相對(duì)熒光素酶活性無(wú)明顯變化。4.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)分析細(xì)胞轉(zhuǎn)染48-72小時(shí)后，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）檢測(cè)各組細(xì)胞中miR-4539的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與mimicsNC組相比，miR-4539mimics組細(xì)胞中miR-4539的表達(dá)水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與inhibitorNC組相比，miR-4539inhibitor組細(xì)胞中miR-4539的表達(dá)水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明轉(zhuǎn)染成功，細(xì)胞模型構(gòu)建有效。蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)各組細(xì)胞中MGMT蛋白的表達(dá)水平。以β-actin作為內(nèi)參，分析條帶灰度值，計(jì)算MGMT蛋白的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明，在miR-4539mimics組中，MGMT蛋白的相對(duì)表達(dá)量明顯低于mimicsNC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而在miR-4539inhibitor組中，MGMT蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著高于inhibitorNC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這說(shuō)明miR-4539能夠負(fù)向調(diào)控MGMT蛋白的表達(dá)，miR-4539表達(dá)上調(diào)時(shí)，MGMT蛋白表達(dá)降低；miR-4539表達(dá)下調(diào)時(shí)，MGMT蛋白表達(dá)升高。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，在共轉(zhuǎn)染miR-4539mimics和MGMTmRNA3'-UTR野生型（WT）載體的細(xì)胞中，相對(duì)熒光素酶活性較共轉(zhuǎn)染mimicsNC和WT載體的細(xì)胞顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而在共轉(zhuǎn)染miR-4539mimics和MGMTmRNA3'-UTR突變型（MUT）載體的細(xì)胞中，相對(duì)熒光素酶活性與共轉(zhuǎn)染mimicsNC和MUT載體的細(xì)胞相比，無(wú)明顯差異（P>0.05）。這進(jìn)一步證實(shí)了miR-4539能夠與MGMTmRNA的3'-UTR直接結(jié)合，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，抑制熒光素酶的表達(dá)，從而調(diào)控MGMT的表達(dá)水平。綜上所述，實(shí)驗(yàn)結(jié)果明確表明miR-4539對(duì)MGMT表達(dá)具有負(fù)向調(diào)控作用，且這種調(diào)控作用是通過(guò)直接靶向結(jié)合MGMTmRNA的3'-UTR實(shí)現(xiàn)的。4.2.3miR-4539調(diào)控MGMT表達(dá)的分子機(jī)制探討從分子層面深入探討，miR-4539調(diào)控MGMT表達(dá)的機(jī)制主要基于其與MGMTmRNA3'-UTR的特異性結(jié)合。miR-4539的種子序列（一般指miR-45395'端的2-8個(gè)核苷酸）能夠與MGMTmRNA3'-UTR上的互補(bǔ)序列精準(zhǔn)識(shí)別并結(jié)合。當(dāng)miR-4539與MGMTmRNA結(jié)合形成復(fù)合物后，會(huì)招募相關(guān)的蛋白質(zhì)因子，共同形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）。在RISC的作用下，主要通過(guò)兩種方式影響MGMT的表達(dá)。一方面，RISC中的核酸酶會(huì)被激活，對(duì)MGMTmRNA進(jìn)行切割，促使其降解，從而減少細(xì)胞內(nèi)MGMTmRNA的含量。這就使得以MGMTmRNA為模板進(jìn)行翻譯的過(guò)程缺乏足夠的模板，導(dǎo)致MGMT蛋白的合成量相應(yīng)減少。另一方面，RISC中的相關(guān)蛋白因子會(huì)抑制核糖體與MGMTmRNA的結(jié)合，阻礙翻譯起始過(guò)程，使核糖體無(wú)法順利在MGMTmRNA上移動(dòng)并合成蛋白質(zhì)，最終導(dǎo)致MGMT蛋白的表達(dá)水平降低。而當(dāng)miR-4539表達(dá)被抑制時(shí)，其與MGMTmRNA3'-UTR的結(jié)合減少，上述抑制作用減弱，MGMTmRNA的穩(wěn)定性增加，翻譯過(guò)程得以順利進(jìn)行，MGMT蛋白的表達(dá)水平則會(huì)相應(yīng)升高。這種miR-4539對(duì)MGMT表達(dá)的精細(xì)調(diào)控機(jī)制，在膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為中發(fā)揮著重要作用，影響著膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)烷化劑類(lèi)化療藥物的敏感性，為深入理解膠質(zhì)瘤化療耐藥機(jī)制提供了關(guān)鍵線(xiàn)索。五、研究結(jié)論與展望5.1研究結(jié)論總結(jié)本研究圍繞人腦膠質(zhì)瘤MGMT表達(dá)及miR-4539對(duì)MGMT表達(dá)調(diào)控作用展開(kāi)，取得了一系列重要研究成果。在人腦膠質(zhì)瘤組織及細(xì)胞中MGMT的表達(dá)分析方面，通過(guò)免疫組織化學(xué)（IHC）、蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）等技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MGMT在不同級(jí)別人腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平存在顯著差異。隨著膠質(zhì)瘤級(jí)別的升高，MGMT的表達(dá)水平明顯上調(diào)，在高級(jí)別膠質(zhì)瘤（WHOⅢ-Ⅳ級(jí)）中的表達(dá)顯著高于低級(jí)別膠質(zhì)瘤（WHOⅠ-Ⅱ級(jí)）。進(jìn)一步分析MGMT表達(dá)與腦膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征的相關(guān)性，結(jié)果表明MGMT表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小、術(shù)前KPS評(píng)分等無(wú)明顯相關(guān)性，但與患者的預(yù)后密切相關(guān)。MGMT