儀器分析經(jīng)典柱色譜技術(shù)演講人：日期:CATALOGUE目錄02核心分離模式01技術(shù)基本原理03操作流程要點(diǎn)04關(guān)鍵應(yīng)用領(lǐng)域05性能評(píng)價(jià)指標(biāo)06技術(shù)發(fā)展演進(jìn)技術(shù)基本原理01吸附與分配作用機(jī)理固定相與流動(dòng)相相互作用表面化學(xué)性質(zhì)影響分配平衡動(dòng)態(tài)過程固定相（如硅膠或氧化鋁）通過表面活性位點(diǎn)吸附混合物組分，流動(dòng)相（溶劑）攜帶組分通過固定相時(shí)，因吸附力差異實(shí)現(xiàn)分離。極性組分與固定相作用強(qiáng)，移動(dòng)速度慢。組分在固定相和流動(dòng)相間反復(fù)分配，溶解度高的組分傾向于停留在固定相中，導(dǎo)致遷移速率差異。分配系數(shù)（K）決定組分保留行為，K值越大，保留時(shí)間越長(zhǎng)。固定相表面修飾（如鍵合烷基鏈）可改變其極性，反相色譜中非極性固定相優(yōu)先保留非極性組分，與正相色譜的保留規(guī)律相反。色譜柱分離理論基礎(chǔ)塔板理論模型將色譜柱視為多級(jí)平衡單元（理論塔板），通過計(jì)算理論塔板數(shù)（N）評(píng)價(jià)柱效。N值越高，峰形越窄，分離效率越好，反映色譜柱的分離能力。速率理論優(yōu)化分離基于VanDeemter方程分析擴(kuò)散、傳質(zhì)阻力等因素對(duì)峰展寬的影響。優(yōu)化流動(dòng)相流速、固定相粒徑可減小縱向擴(kuò)散，提高分離度。選擇性因子（α）作用α定義為兩組分調(diào)整保留時(shí)間之比，α>1是分離的前提。通過調(diào)節(jié)固定相類型、流動(dòng)相組成或溫度可改變?chǔ)林?，?shí)現(xiàn)難分離物質(zhì)對(duì)的基線分離。保留值與分離度概念保留時(shí)間（tR）與死時(shí)間（t0）tR反映組分與固定相作用強(qiáng)度，t0為不保留組分通過色譜柱的時(shí)間。調(diào)整保留時(shí)間（tR'=tR-t0）用于消除系統(tǒng)誤差，更準(zhǔn)確比較不同條件下的保留行為。分離度（Rs）量化標(biāo)準(zhǔn)Rs=2(tR2-tR1)/(W1+W2)，其中W為峰寬。Rs≥1.5視為完全分離，可通過增加柱長(zhǎng)、優(yōu)化流動(dòng)相比例或調(diào)整溫度提升Rs值。容量因子（k'）計(jì)算k'=(tR-t0)/t0，衡量組分在固定相中的滯留程度。k'值需控制在1-10范圍內(nèi)，過小則分離不充分，過大則分析時(shí)間過長(zhǎng)。核心分離模式02正相色譜技術(shù)極性固定相選擇正相色譜采用高極性固定相（如硅膠、氧化鋁），其表面活性位點(diǎn)通過氫鍵或偶極作用吸附極性化合物，適用于分離中等極性至強(qiáng)極性物質(zhì)，如酚類、醛酮類化合物。01流動(dòng)相極性調(diào)控流動(dòng)相通常由非極性溶劑（如正己烷）與極性調(diào)節(jié)劑（如異丙醇）組成，通過調(diào)節(jié)比例控制洗脫強(qiáng)度。極性越強(qiáng)的組分保留時(shí)間越長(zhǎng)，實(shí)現(xiàn)梯度洗脫分離。競(jìng)爭(zhēng)吸附機(jī)制溶質(zhì)與溶劑分子在固定相表面發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)吸附，溶質(zhì)極性基團(tuán)與吸附位點(diǎn)結(jié)合力越強(qiáng)，保留值越高。該技術(shù)對(duì)異構(gòu)體（如鄰/對(duì)位取代芳烴）分離效果顯著。應(yīng)用局限性因水會(huì)破壞硅膠鍵合結(jié)構(gòu)，正相色譜需嚴(yán)格避免含水體系，且分析物需具備可極化官能團(tuán)，限制了其在生物大分子分析中的應(yīng)用。020304反相色譜技術(shù)非極性固定相設(shè)計(jì)以C18、C8鍵合硅膠為代表，固定相表面覆蓋長(zhǎng)鏈烷基，通過疏水相互作用保留非極性或弱極性化合物，廣泛用于藥物（如四環(huán)素類抗生素）、多肽的分離純化。極性流動(dòng)相體系采用水-甲醇/乙腈作為流動(dòng)相，通過增加有機(jī)相比例提高洗脫能力。緩沖鹽（如磷酸鹽）可調(diào)節(jié)pH以改善離子化化合物的峰形。通用性與穩(wěn)定性反相色譜介質(zhì)化學(xué)穩(wěn)定性高，耐受pH2-8范圍，兼容紫外/質(zhì)譜檢測(cè)，適合復(fù)雜基質(zhì)（如血漿、植物提取物）中目標(biāo)物的高靈敏度分析。保留機(jī)制優(yōu)化可通過末端封尾技術(shù)減少硅羥基殘留，或嵌入極性基團(tuán)（如酰胺）實(shí)現(xiàn)親水相互作用（HILIC），擴(kuò)展對(duì)強(qiáng)極性物質(zhì)的保留能力。離子交換色譜法電荷選擇性分離陽離子交換樹脂（如磺酸基修飾）捕獲帶正電物質(zhì)（氨基酸、蛋白質(zhì)），陰離子交換樹脂（如季銨基修飾）吸附負(fù)電物質(zhì)（核酸、有機(jī)酸），通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相離子強(qiáng)度或pH梯度洗脫。動(dòng)態(tài)容量控制交換容量取決于樹脂功能基團(tuán)密度（通常1-5meq/g），高交聯(lián)度樹脂（如DVB基質(zhì)）機(jī)械強(qiáng)度大但溶脹性差，需平衡分離效率與柱壓限制。生物大分子純化強(qiáng)離子交換劑（如SPSepharose）用于單克隆抗體捕獲，弱交換劑（如DEAE纖維素）適合酶類分離，配合NaCl線性梯度可實(shí)現(xiàn)高分辨率分級(jí)。抑制柱技術(shù)在離子色譜中，抑制柱通過中和背景電導(dǎo)（如將NaOH淋洗液轉(zhuǎn)化為水），大幅提高電導(dǎo)檢測(cè)器對(duì)低濃度離子的響應(yīng)靈敏度（可達(dá)ppb級(jí)）。操作流程要點(diǎn)03根據(jù)目標(biāo)化合物的極性選擇固定相（如硅膠、氧化鋁或鍵合相），正相色譜選用極性固定相（如硅膠），反相色譜選用非極性固定相（如C18鍵合硅膠），確保與流動(dòng)相形成有效分配平衡。固定相選擇與裝柱固定相極性匹配采用濕法或干法裝柱時(shí)需避免氣泡和斷層，固定相填充需均勻緊實(shí)以提高分離效率，通常通過敲擊柱壁或減壓抽吸排除空隙。裝柱均勻性與緊實(shí)度柱高與直徑比例需根據(jù)分離難度調(diào)整，復(fù)雜混合物需較長(zhǎng)柱床（高徑比20:1以上），簡(jiǎn)單分離可縮短柱床以節(jié)省時(shí)間和溶劑消耗。柱床高度與直徑比優(yōu)化樣品載入與洗脫控制樣品溶解與上樣技術(shù)樣品需溶解于少量初始流動(dòng)相或低極性溶劑中，避免溶劑強(qiáng)度過高導(dǎo)致譜帶擴(kuò)散；上樣時(shí)沿柱壁緩慢注入，減少固定相擾動(dòng)。梯度洗脫策略對(duì)于極性范圍寬的混合物，采用梯度洗脫（如正相色譜中逐步增加甲醇比例），逐步提高流動(dòng)相洗脫能力，平衡分離速度與分辨率。流速調(diào)節(jié)與壓力監(jiān)控流速需與固定相顆粒大小匹配（如硅膠柱常用1-2mL/min），過高流速導(dǎo)致峰展寬，過低則延長(zhǎng)分離時(shí)間；反相柱需注意系統(tǒng)耐壓限制。組分收集與檢測(cè)分段收集與薄層色譜（TLC）監(jiān)控按時(shí)間或體積分段收集洗脫液，結(jié)合TLC點(diǎn)板快速鑒定組分純度，調(diào)整收集區(qū)間以避免交叉污染。在線檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用組分濃縮與溶劑去除配備紫外檢測(cè)器或示差折光檢測(cè)器實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)洗脫曲線，識(shí)別峰形對(duì)稱性并判斷分離效果，必要時(shí)優(yōu)化洗脫條件。對(duì)收集的組分采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)或氮吹濃縮，尤其對(duì)低濃度目標(biāo)物需避免高溫破壞，反相色譜組分可能需凍干去除水相溶劑。123關(guān)鍵應(yīng)用領(lǐng)域04天然產(chǎn)物成分純化植物有效成分提取柱色譜技術(shù)廣泛應(yīng)用于從植物中分離生物堿、黃酮類、萜類等活性成分，通過調(diào)整固定相（如硅膠、氧化鋁）和流動(dòng)相（如正己烷-乙酸乙酯體系）的極性差異實(shí)現(xiàn)高效純化。海洋天然產(chǎn)物富集對(duì)于海藻或海綿中含量極低的活性物質(zhì)（如溴代酚類），常先通過正相硅膠柱初步分離，再結(jié)合凝膠色譜進(jìn)一步純化，提高產(chǎn)物收率。微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物分離針對(duì)發(fā)酵液中的抗生素、色素等復(fù)雜混合物，采用梯度洗脫策略可逐步分離目標(biāo)化合物，例如利用反相C18柱分離鏈霉菌產(chǎn)生的多烯類抗生素。藥物活性物質(zhì)分離使用鍵合型手性固定相（如纖維素衍生物涂覆硅膠），通過柱色譜可實(shí)現(xiàn)光學(xué)異構(gòu)體的完全分離，例如布洛芬對(duì)映體的制備級(jí)純化。手性藥物拆分合成中間體純化代謝產(chǎn)物研究在多步有機(jī)合成中，柱色譜能有效去除副產(chǎn)物和催化劑殘留，特別適用于對(duì)熱不穩(wěn)定的化合物，如肽類合成中的保護(hù)基去除產(chǎn)物純化。采用HPLC聯(lián)用柱色譜技術(shù)分離藥物體內(nèi)代謝物，通過優(yōu)化流動(dòng)相pH值和有機(jī)相比例，可區(qū)分結(jié)構(gòu)相似的葡萄糖醛酸結(jié)合物與硫酸酯化產(chǎn)物。針對(duì)土壤中的多氯聯(lián)苯（PCBs）等污染物，先用弗羅里硅土柱進(jìn)行前處理去除干擾物，再結(jié)合GC-MS分析，檢測(cè)限可達(dá)ppt級(jí)。環(huán)境污染物分析持久性有機(jī)污染物檢測(cè)采用螯合樹脂填充柱選擇性吸附不同價(jià)態(tài)金屬離子，通過控制洗脫液EDTA濃度實(shí)現(xiàn)Cr(Ⅲ)與Cr(Ⅵ)的分離測(cè)定。水體重金屬形態(tài)分析使用串聯(lián)色譜柱系統(tǒng)（硅膠柱+氨基柱）分離PM2.5中的多環(huán)芳烴，結(jié)合熒光檢測(cè)器可實(shí)現(xiàn)16種USEPA優(yōu)先監(jiān)控物質(zhì)的準(zhǔn)確定量。大氣顆粒物組分研究性能評(píng)價(jià)指標(biāo)05柱效與塔板數(shù)計(jì)算理論塔板數(shù)（N）計(jì)算塔板高度（H）評(píng)估有效塔板數(shù)（Neff）修正通過色譜峰保留時(shí)間（tR）和峰寬（W）計(jì)算，公式為N=16(tR/W)^2，數(shù)值越高表明柱效越好，分離能力越強(qiáng)?？紤]死時(shí)間（t0）的影響，公式為Neff=16(tR-t0/W)^2，更真實(shí)反映實(shí)際分離效能。H=L/N（L為柱長(zhǎng)），數(shù)值越小說明單位柱長(zhǎng)內(nèi)理論塔板數(shù)越多，柱效越高。分離因子測(cè)定相對(duì)保留值（α）計(jì)算α=tR2'/tR1'（tR'為調(diào)整保留時(shí)間），α>1表示組分可分離，數(shù)值越大分離度越高。選擇性因子優(yōu)化通過調(diào)整固定相極性、流動(dòng)相組成或溫度，改變?chǔ)林狄蕴嵘y分離物質(zhì)對(duì)的分離效果。實(shí)際分離案例驗(yàn)證針對(duì)同分異構(gòu)體或極性相近化合物，需結(jié)合α值與實(shí)際色譜圖判斷分離可行性。峰對(duì)稱性判斷拖尾因子（Tf）測(cè)定Tf=W0.05/2f（W0.05為5%峰高處峰寬，f為峰前沿至頂點(diǎn)距離），理想值為1，Tf>1表明峰拖尾。前伸因子（Ff）分析Ff=W0.05/2b（b為峰后沿至頂點(diǎn)距離），F(xiàn)f<1提示峰前伸，可能因柱效下降或樣品過載導(dǎo)致。不對(duì)稱度（As）綜合評(píng)估As=B/A（A、B分別為10%峰高處的左右半峰寬），As=1為對(duì)稱峰，偏離1需優(yōu)化流動(dòng)相pH或柱溫。技術(shù)發(fā)展演進(jìn)06傳統(tǒng)經(jīng)典柱通常采用硅膠、氧化鋁或纖維素等極性固定相，填充時(shí)需保證均勻性和緊密性，避免出現(xiàn)溝流或氣泡，影響分離效率。填充方法包括干法裝柱和濕法裝柱，濕法裝柱可減少固定相顆粒間的空隙，提高柱效。傳統(tǒng)經(jīng)典柱構(gòu)建固定相選擇與填充流動(dòng)相的選擇需根據(jù)目標(biāo)化合物的極性和溶解度，常用溶劑包括正己烷、乙酸乙酯、甲醇等。通過調(diào)節(jié)流動(dòng)相極性（如梯度洗脫）可改善分離效果，洗脫順序遵循“相似相溶”原則，極性小的組分先出峰。流動(dòng)相優(yōu)化柱色譜分離效果受流速、柱溫及柱長(zhǎng)影響。流速過快可能導(dǎo)致傳質(zhì)不充分，過慢則延長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)時(shí)間；柱溫升高可降低流動(dòng)相黏度，但可能影響固定相穩(wěn)定性；增加柱長(zhǎng)可提高理論塔板數(shù)，但需權(quán)衡分離時(shí)間與效率。操作條件控制中壓制備色譜設(shè)備與柱體設(shè)計(jì)中壓制備色譜系統(tǒng)采用不銹鋼柱或玻璃柱，配備高壓泵和在線檢測(cè)器（如UV檢測(cè)器），固定相顆粒粒徑通常為15-50μm，兼具高載樣量和分離效率。柱體直徑與長(zhǎng)度比例需優(yōu)化，以平衡分離速度與分辨率。動(dòng)態(tài)軸向壓縮技術(shù)通過活塞動(dòng)態(tài)壓縮固定相床層，減少柱床塌陷和溝流現(xiàn)象，提高柱效和重現(xiàn)性。該技術(shù)尤其適用于大規(guī)模制備分離，如天然產(chǎn)物純化或藥物中間體提純。梯度洗脫與自動(dòng)化中壓系統(tǒng)支持多溶劑梯度洗脫，通過編程控制流動(dòng)相比例變化，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜混合物的高效分離。自動(dòng)化進(jìn)樣和餾分收集功能顯著提升實(shí)驗(yàn)通量和重復(fù)性，適用于工業(yè)化生產(chǎn)?，F(xiàn)代高效液相關(guān)聯(lián)超高效液相色譜（UPLC）多維色譜聯(lián)用核殼色譜柱技術(shù)采用亞2μm粒徑固定相和超高壓系統(tǒng)