miR-155真核表達載體的匠心構(gòu)建與胰腺癌功能探秘一、引言1.1研究背景微小RNA（microRNA，miRNA）是一類內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，長度約為22個核苷酸，通過與靶mRNA的互補配對，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達，參與細胞的增殖、分化、凋亡等多種生物學過程。在眾多miRNA中，miR-155因其在多種生理和病理過程中的關(guān)鍵作用，成為了近年來生命科學領(lǐng)域的研究熱點之一。尤其在腫瘤研究中，miR-155的身影頻繁出現(xiàn)，它被發(fā)現(xiàn)參與了腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥等多個惡性生物學行為的調(diào)控，在乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌等多種癌癥中，miR-155的表達水平都呈現(xiàn)出異常變化，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，這使其成為了腫瘤診斷、治療和預(yù)后評估的潛在重要靶點。胰腺癌作為一種高度惡性的消化系統(tǒng)腫瘤，近年來其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈逐漸上升趨勢，給人類健康帶來了極大的威脅。據(jù)相關(guān)統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，在我國，胰腺癌的發(fā)病率已位居惡性腫瘤的第10位左右，且死亡率極高，5年生存率僅約為5%-10%，甚至在一些地區(qū)，胰腺癌的死亡率已經(jīng)躍居惡性腫瘤死亡率的前5位。胰腺癌的早期癥狀隱匿，缺乏特異性表現(xiàn)，多數(shù)患者在確診時已處于中晚期，腫瘤往往已經(jīng)發(fā)生了局部浸潤或遠處轉(zhuǎn)移，失去了手術(shù)根治的機會。即使是少數(shù)能夠接受手術(shù)治療的患者，術(shù)后復發(fā)和轉(zhuǎn)移的風險也很高，總體治療效果極不理想。傳統(tǒng)的化療和放療對胰腺癌的療效有限，且毒副作用較大，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。因此，尋找有效的早期診斷標志物和新的治療靶點，開發(fā)更加精準、有效的治療方法，成為了提高胰腺癌患者生存率和生活質(zhì)量的關(guān)鍵，也是當前胰腺癌研究領(lǐng)域亟待解決的重要問題。已有研究表明，miR-155在胰腺癌組織和細胞系中存在異常表達，并且與胰腺癌的臨床病理特征及預(yù)后密切相關(guān)。進一步深入研究miR-155在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用機制，有望為胰腺癌的早期診斷、靶向治療和預(yù)后評估提供新的思路和方法。構(gòu)建miR-155真核表達載體是開展后續(xù)功能研究的重要基礎(chǔ)，通過將miR-155導入胰腺癌細胞中，改變其表達水平，進而觀察細胞生物學行為的變化，能夠更直接、深入地揭示miR-155對胰腺癌的影響。1.2研究目的與意義本研究旨在成功構(gòu)建miR-155真核表達載體，并深入探究其在胰腺癌中的功能，為胰腺癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點。具體研究目的包括：利用分子生物學技術(shù)，構(gòu)建穩(wěn)定、高效表達miR-155的真核表達載體；通過細胞實驗，研究過表達miR-155對胰腺癌細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移等生物學行為的影響；進一步探討miR-155在胰腺癌中發(fā)揮功能的潛在分子機制，明確其上下游調(diào)控關(guān)系。胰腺癌由于其高度惡性的生物學特性，目前的治療手段效果有限，患者預(yù)后極差。深入研究miR-155在胰腺癌中的作用機制，對于揭示胰腺癌的發(fā)病機制具有重要的理論意義。通過構(gòu)建miR-155真核表達載體并研究其功能，可以更深入地了解miR-155在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用，為胰腺癌的分子生物學研究提供新的思路和方向。從臨床應(yīng)用角度來看，若能明確miR-155與胰腺癌的關(guān)系及其作用機制，有望將其作為胰腺癌早期診斷的生物標志物，提高胰腺癌的早期診斷率，為患者爭取更多的治療時機。同時，以miR-155為靶點開發(fā)新的治療策略，如RNA干擾技術(shù)抑制miR-155的表達，或者利用miR-155激動劑增強其有益作用，為胰腺癌的靶向治療提供新的途徑，從而提高胰腺癌的治療效果，改善患者的預(yù)后和生活質(zhì)量。這對于攻克胰腺癌這一醫(yī)學難題，減輕患者的痛苦，具有重要的現(xiàn)實意義和社會價值。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國外，對miR-155與胰腺癌的研究開展較早且較為深入。一些研究通過對大量胰腺癌患者樣本及細胞系的分析，發(fā)現(xiàn)miR-155在胰腺癌組織和細胞中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，并且與腫瘤的分期、轉(zhuǎn)移及患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。在細胞功能研究方面，有實驗表明上調(diào)miR-155能夠促進胰腺癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力，而下調(diào)miR-155則可抑制這些惡性生物學行為。關(guān)于其作用機制，研究發(fā)現(xiàn)miR-155可以通過靶向多個基因來調(diào)控胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過程，如通過抑制某些抑癌基因的表達，促進癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移；還能影響細胞周期相關(guān)蛋白的表達，從而調(diào)控細胞周期進程。在真核表達載體構(gòu)建方面，國外已有成熟的技術(shù)和方法用于構(gòu)建miR-155真核表達載體，并將其應(yīng)用于細胞和動物實驗中，為后續(xù)的功能研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。國內(nèi)在這一領(lǐng)域的研究也取得了顯著進展。眾多科研團隊通過臨床樣本檢測和基礎(chǔ)實驗研究，進一步證實了miR-155在胰腺癌中的異常表達及其與臨床病理特征的相關(guān)性。在功能研究方面，國內(nèi)研究不僅重復驗證了國外的部分結(jié)論，還發(fā)現(xiàn)miR-155可能通過影響胰腺癌的免疫微環(huán)境來促進腫瘤的發(fā)展。在分子機制研究上，國內(nèi)學者發(fā)現(xiàn)了一些新的miR-155作用靶點和信號通路，為深入理解miR-155在胰腺癌中的作用提供了新的視角。在載體構(gòu)建技術(shù)上，國內(nèi)科研人員也不斷優(yōu)化和改進，提高了miR-155真核表達載體的構(gòu)建效率和質(zhì)量。盡管國內(nèi)外在miR-155與胰腺癌的研究中取得了諸多成果，但仍存在一些不足與空白。在miR-155調(diào)控胰腺癌的具體分子機制方面，雖然已發(fā)現(xiàn)了一些靶點和信號通路，但仍有許多未知的調(diào)控環(huán)節(jié)有待進一步探索，其上下游的精確調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚未完全明確。在臨床應(yīng)用研究方面，目前將miR-155作為胰腺癌診斷和治療靶點的研究大多還處于基礎(chǔ)實驗和臨床前研究階段，距離真正應(yīng)用于臨床實踐還有很長的路要走，需要進一步開展大規(guī)模的臨床試驗來驗證其有效性和安全性。在載體構(gòu)建方面，現(xiàn)有的真核表達載體雖然能夠?qū)崿F(xiàn)miR-155的表達，但在載體的穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)染效率以及靶向性等方面仍有提升空間，需要開發(fā)更加高效、安全、靶向性強的新型載體系統(tǒng)。二、miR-155與胰腺癌概述2.1miR-155簡介2.1.1miR-155的結(jié)構(gòu)特點miR-155基因在人類中定位于第21號染色體的21q21區(qū)域，其編碼基因最初被鑒定為B細胞整合簇（BIC）基因的一部分，BIC基因是一個長約1.8kb的非編碼RNA，不編碼蛋白質(zhì)。miR-155由BIC基因的第三個外顯子區(qū)域轉(zhuǎn)錄加工而來，其前體（pre-miR-155）是一個具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA分子，長度約為70-80個核苷酸。pre-miR-155在細胞內(nèi)經(jīng)過一系列核酸酶的作用，最終被加工成為成熟的miR-155，成熟的miR-155是一條長度約為22個核苷酸的單鏈RNA。從序列特征來看，成熟的miR-155具有特定的核苷酸序列，其序列在不同物種間具有一定的保守性。這種保守性暗示了miR-155在進化過程中承擔著重要且保守的生物學功能。例如，在小鼠、大鼠等哺乳動物中，miR-155的序列與人類的miR-155序列具有高度的相似性，僅有少數(shù)幾個核苷酸的差異。從二級結(jié)構(gòu)上分析，pre-miR-155的發(fā)夾結(jié)構(gòu)對于其加工和成熟過程至關(guān)重要。這種發(fā)夾結(jié)構(gòu)能夠被細胞內(nèi)的Drosha酶和Dicer酶識別，Drosha酶首先在細胞核內(nèi)將BIC轉(zhuǎn)錄本切割成pre-miR-155，然后pre-miR-155被轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中，Dicer酶進一步將其切割成成熟的miR-155。如果pre-miR-155的發(fā)夾結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，可能會影響其被核酸酶識別和切割的效率，進而影響成熟miR-155的生成，最終對其生物學功能產(chǎn)生影響。miR-155的結(jié)構(gòu)特點與功能密切相關(guān)。其特定的核苷酸序列決定了它能夠與靶mRNA的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補配對，從而發(fā)揮對靶基因的調(diào)控作用。例如，miR-155可以通過與靶mRNA的3'-UTR上的特定序列結(jié)合，抑制mRNA的翻譯過程，或者促進mRNA的降解，實現(xiàn)對基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。此外，miR-155的穩(wěn)定性也與結(jié)構(gòu)相關(guān)，其單鏈RNA結(jié)構(gòu)在細胞內(nèi)受到多種蛋白質(zhì)的保護，避免被核酸酶降解，從而保證其能夠持續(xù)發(fā)揮生物學功能。2.1.2miR-155的生物學功能在正常生理過程中，miR-155參與了細胞增殖、分化和凋亡等多個重要環(huán)節(jié)。在細胞增殖方面，miR-155可以通過調(diào)控相關(guān)基因的表達，影響細胞周期進程，從而促進或抑制細胞增殖。有研究表明，在T細胞的活化和增殖過程中，miR-155的表達上調(diào)，它能夠靶向一些負調(diào)控T細胞增殖的基因，如SHIP1基因，抑制SHIP1的表達，進而激活相關(guān)信號通路，促進T細胞的增殖和活化。在細胞分化方面，miR-155在造血干細胞向不同血細胞系分化的過程中發(fā)揮著重要作用。例如，在B細胞的分化過程中，miR-155通過調(diào)控一系列轉(zhuǎn)錄因子和信號通路相關(guān)基因的表達，影響B(tài)細胞從祖細胞向成熟B細胞的分化進程。在細胞凋亡調(diào)控方面，miR-155的作用較為復雜，它既可以通過抑制抗凋亡基因的表達，促進細胞凋亡；也可以通過抑制促凋亡基因的表達，抑制細胞凋亡，具體作用取決于細胞類型和所處的環(huán)境。在某些腫瘤細胞中，miR-155高表達，通過抑制一些促凋亡基因如PU.1等的表達，降低腫瘤細胞對凋亡信號的敏感性，從而抑制細胞凋亡，促進腫瘤細胞的存活和增殖。在多種疾病中，miR-155的表達水平常常出現(xiàn)異常變化。在腫瘤領(lǐng)域，大量研究表明，miR-155在乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)。在乳腺癌中，miR-155的高表達與腫瘤的侵襲性和轉(zhuǎn)移能力增強相關(guān)，它可以通過靶向多個基因，如TGF-β信號通路中的關(guān)鍵分子，促進乳腺癌細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，增強癌細胞的遷移和侵襲能力。在肺癌中，miR-155不僅參與了腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移過程，還與肺癌細胞的耐藥性密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，miR-155可以通過調(diào)控一些藥物轉(zhuǎn)運蛋白和凋亡相關(guān)蛋白的表達，使肺癌細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。在心血管疾病方面，miR-155在心肌梗死、動脈粥樣硬化等疾病中也發(fā)揮著重要作用。在心肌梗死模型中，心肌組織中miR-155的表達上調(diào)，它可以通過靶向一些與心肌細胞凋亡和炎癥反應(yīng)相關(guān)的基因，加重心肌損傷和炎癥反應(yīng)，影響心肌梗死后的心臟修復過程。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，如阿爾茨海默病和帕金森病等，miR-155的表達也出現(xiàn)異常，其可能通過調(diào)控神經(jīng)細胞的存活、分化和炎癥反應(yīng)等過程，參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制。2.2胰腺癌概述2.2.1胰腺癌的發(fā)病機制胰腺癌的發(fā)病是一個多因素、多步驟的復雜過程，涉及遺傳因素、環(huán)境因素、生活方式以及慢性炎癥等多個方面，它們相互作用，共同促進了胰腺癌的發(fā)生與發(fā)展。在遺傳因素方面，研究發(fā)現(xiàn)，某些基因突變與胰腺癌的發(fā)病風險顯著相關(guān)。BRCA1和BRCA2基因是著名的抑癌基因，其突變不僅與乳腺癌、卵巢癌的發(fā)病相關(guān)，在胰腺癌中也較為常見。攜帶BRCA1或BRCA2基因突變的個體，患胰腺癌的風險相較于正常人可增加數(shù)倍。這些基因突變會導致細胞的DNA損傷修復機制出現(xiàn)缺陷，使得細胞更容易發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。此外，CDKN2A基因編碼的p16蛋白在細胞周期調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，當CDKN2A基因發(fā)生突變時，p16蛋白功能異常，無法正常抑制細胞周期進程，導致細胞過度增殖，進而增加了胰腺癌的發(fā)病風險。家族性腺瘤性息肉?。‵AP）和遺傳性非息肉病性結(jié)直腸癌（HNPCC）等遺傳性綜合征患者，其胰腺癌的發(fā)病風險也顯著高于普通人群，這表明遺傳因素在胰腺癌的發(fā)病中具有重要地位。環(huán)境因素對胰腺癌的發(fā)生也有重要影響。長期吸煙是明確的胰腺癌危險因素之一，煙草中含有多種致癌物質(zhì)，如多環(huán)芳烴、亞硝胺等，這些物質(zhì)進入人體后，經(jīng)過一系列代謝過程，會損傷胰腺細胞的DNA，引發(fā)基因突變，促進腫瘤的發(fā)生。有研究表明，長期吸煙者患胰腺癌的風險比不吸煙者高出2-3倍。長期接觸某些化學物質(zhì)，如芳香族胺類、亞硝胺類、氯化烴類等，也與胰腺癌的發(fā)病密切相關(guān)。在一些工業(yè)生產(chǎn)環(huán)境中，工人長期暴露于這些化學物質(zhì)中，其胰腺癌的發(fā)病率明顯升高。長期接觸有機氯農(nóng)藥的農(nóng)業(yè)工人，胰腺癌的發(fā)病風險有所增加。生活方式因素在胰腺癌的發(fā)病中也不容忽視。高脂飲食是胰腺癌的一個重要危險因素，過多攝入動物脂肪、油炸食品等高脂食物，會導致血液中膽固醇和甘油三酯水平升高，這些脂質(zhì)代謝產(chǎn)物可能會刺激胰腺細胞，促進細胞增殖和炎癥反應(yīng)，增加胰腺癌的發(fā)病風險。肥胖與胰腺癌的關(guān)系也較為密切，肥胖患者體內(nèi)脂肪堆積，會導致胰島素抵抗增加，高胰島素血癥會刺激胰腺細胞的生長和增殖，同時還會促進一些生長因子的釋放，如胰島素樣生長因子（IGF）等，這些生長因子能夠激活相關(guān)信號通路，促進腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移。缺乏運動也是胰腺癌的一個潛在危險因素，適量的運動可以促進新陳代謝，維持正常的體重和身體機能，而長期缺乏運動則會導致身體免疫力下降，代謝紊亂，增加患癌風險。慢性胰腺炎與胰腺癌的關(guān)系密切，被認為是胰腺癌的重要危險因素之一。慢性胰腺炎時，胰腺組織長期受到炎癥刺激，反復發(fā)生損傷和修復過程，這會導致胰腺細胞的基因穩(wěn)定性受到破壞，容易引發(fā)基因突變，從而增加胰腺癌的發(fā)病風險。據(jù)統(tǒng)計，慢性胰腺炎患者患胰腺癌的風險比正常人高出10-20倍。糖尿病也與胰腺癌存在一定關(guān)聯(lián)，2型糖尿病患者由于長期高血糖狀態(tài)，會導致體內(nèi)代謝紊亂，胰島素抵抗增加，進而影響胰腺細胞的功能，促進胰腺癌的發(fā)生。有研究表明，新診斷的糖尿病患者在發(fā)病后的3-5年內(nèi)，患胰腺癌的風險明顯增加。2.2.2胰腺癌的臨床特征與治療現(xiàn)狀胰腺癌起病隱匿，早期癥狀不典型，缺乏特異性表現(xiàn)，這使得早期診斷極為困難。很多患者在疾病早期可能僅出現(xiàn)一些非特異性癥狀，如上腹部隱痛、飽脹不適、食欲不振、消化不良等，這些癥狀容易被忽視或誤診為其他消化系統(tǒng)疾病。隨著病情的進展，患者會逐漸出現(xiàn)一些較為典型的癥狀。腹痛是胰腺癌最常見的癥狀之一，多為上腹部持續(xù)性疼痛，可向腰背部放射，疼痛程度逐漸加重，尤其是在進食后或仰臥位時疼痛更為明顯，而在彎腰或前傾坐位時疼痛可能會稍有緩解。黃疸也是胰腺癌的重要癥狀，多見于胰頭癌患者，主要是由于腫瘤壓迫或侵犯膽總管，導致膽汁排泄受阻，引起膽紅素升高所致，患者可出現(xiàn)皮膚和鞏膜黃染、尿色加深、大便顏色變淺等表現(xiàn)。胰腺癌患者還常伴有消瘦、乏力等全身癥狀，這是由于腫瘤消耗機體營養(yǎng)物質(zhì)，以及患者食欲減退、消化吸收功能障礙等原因?qū)е碌?。部分患者還可能出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹瀉或便秘等消化道癥狀，以及血糖異常升高等癥狀。目前，胰腺癌的診斷主要依靠臨床表現(xiàn)、實驗室檢查和影像學檢查等綜合手段。實驗室檢查中，血清腫瘤標志物的檢測具有重要意義，其中糖類抗原19-9（CA19-9）是目前臨床上應(yīng)用最為廣泛的胰腺癌腫瘤標志物，其在胰腺癌患者血清中的水平常常顯著升高。CA19-9對胰腺癌的診斷具有較高的敏感性和特異性，但在一些良性疾病，如慢性胰腺炎、膽管炎等中，CA19-9也可能會出現(xiàn)輕度升高，因此需要結(jié)合其他檢查結(jié)果進行綜合判斷。癌胚抗原（CEA）、糖類抗原125（CA125）等腫瘤標志物在胰腺癌的診斷中也有一定的參考價值。影像學檢查是胰腺癌診斷的重要手段，包括CT、MRI、超聲內(nèi)鏡（EUS）等。CT檢查能夠清晰地顯示胰腺的形態(tài)、大小、結(jié)構(gòu)以及腫瘤的位置、大小、侵犯范圍等信息，是胰腺癌診斷和分期的重要依據(jù)。MRI在顯示胰腺軟組織病變方面具有一定優(yōu)勢，對于判斷腫瘤與周圍血管、神經(jīng)等結(jié)構(gòu)的關(guān)系具有重要價值。EUS可以直接觀察胰腺病變，同時還能夠進行穿刺活檢，獲取病理組織進行確診，對于早期胰腺癌的診斷具有較高的價值。此外，正電子發(fā)射斷層掃描（PET-CT）在評估胰腺癌的遠處轉(zhuǎn)移方面具有獨特的優(yōu)勢。手術(shù)切除是目前唯一可能治愈胰腺癌的方法，但由于胰腺癌早期診斷困難，大多數(shù)患者在確診時已處于中晚期，腫瘤往往已經(jīng)侵犯周圍重要血管、神經(jīng)或發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，導致手術(shù)切除率較低，僅約15%-20%。對于可切除的胰腺癌，根治性手術(shù)切除是首選治療方法，包括胰十二指腸切除術(shù)、胰體尾切除術(shù)等。然而，即使進行了根治性手術(shù)，患者的術(shù)后復發(fā)率仍然較高，5年生存率僅為20%-30%左右。對于無法切除的胰腺癌，目前主要采用化療、放療、靶向治療和免疫治療等綜合治療手段?；熓且认侔┚C合治療的重要組成部分，常用的化療藥物包括吉西他濱、氟尿嘧啶、白蛋白結(jié)合型紫杉醇等。吉西他濱是胰腺癌化療的一線藥物，能夠在一定程度上延長患者的生存期，但總體療效有限，且存在耐藥性和毒副作用等問題。放療可以局部控制腫瘤生長，緩解疼痛等癥狀，但對于晚期胰腺癌患者，放療的效果也較為有限。近年來，靶向治療和免疫治療在胰腺癌的治療中取得了一定的進展，但總體療效仍有待進一步提高。靶向治療藥物如厄洛替尼、奧拉帕利等，雖然在部分特定基因突變的胰腺癌患者中顯示出一定的療效，但適用人群有限。免疫治療在胰腺癌中的應(yīng)用還處于探索階段，由于胰腺癌的免疫微環(huán)境較為復雜，免疫治療的效果目前還不理想。胰腺癌的治療面臨著諸多挑戰(zhàn)和局限性。早期診斷困難導致大部分患者確診時已失去手術(shù)根治的機會，而中晚期胰腺癌對現(xiàn)有的化療、放療等治療手段的敏感性較低，治療效果不佳。胰腺癌的異質(zhì)性強，不同患者之間的腫瘤生物學行為差異較大，這使得治療方案的選擇較為困難，難以實現(xiàn)精準治療。胰腺癌的耐藥問題也是制約治療效果的重要因素，腫瘤細胞容易對化療藥物產(chǎn)生耐藥性，導致化療失敗。此外，胰腺癌的治療過程中還會出現(xiàn)各種并發(fā)癥，如術(shù)后胰瘺、膽瘺、感染等，以及化療和放療的毒副作用，如惡心、嘔吐、骨髓抑制等，這些都會嚴重影響患者的生活質(zhì)量和治療依從性。2.3miR-155與胰腺癌的關(guān)聯(lián)研究進展大量研究表明，miR-155在胰腺癌組織和細胞系中呈現(xiàn)異常表達狀態(tài)，且與胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。通過對胰腺癌患者的組織樣本進行檢測分析，發(fā)現(xiàn)miR-155在胰腺癌組織中的表達水平顯著高于癌旁正常組織。有研究收集了50例胰腺癌患者的癌組織及配對的癌旁組織，運用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測miR-155的表達，結(jié)果顯示胰腺癌組織中miR-155的表達量是癌旁組織的3-5倍。對多種胰腺癌細胞系，如Panc-1、MiaPaCa-2、AsPC-1等的研究也發(fā)現(xiàn)，這些細胞系中miR-155的表達明顯高于正常胰腺導管上皮細胞。miR-155在胰腺癌中的異常表達與胰腺癌患者的臨床病理特征緊密相連。臨床研究發(fā)現(xiàn)，miR-155高表達的胰腺癌患者，其腫瘤往往具有更高的分期，更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移，患者的預(yù)后也相對較差。對100例胰腺癌患者的臨床資料進行回顧性分析，結(jié)果顯示miR-155表達水平與腫瘤的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，miR-155高表達組患者的5年生存率明顯低于低表達組。miR-155的表達水平還與胰腺癌患者的生存時間密切相關(guān)，高表達miR-155的患者中位生存時間明顯縮短。在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中，miR-155可能通過多種作用途徑和機制發(fā)揮作用。在細胞增殖方面，miR-155可以通過靶向調(diào)控相關(guān)基因，促進胰腺癌細胞的增殖。研究發(fā)現(xiàn)，miR-155能夠靶向抑制SHIP1基因的表達，SHIP1是一種重要的抑癌基因，它可以通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的信號通路，抑制細胞的增殖和生長。當miR-155高表達時，SHIP1基因的表達受到抑制，細胞內(nèi)的PI3K/AKT信號通路被激活，從而促進胰腺癌細胞的增殖。在細胞凋亡調(diào)控方面，miR-155可以通過抑制促凋亡基因的表達，降低胰腺癌細胞對凋亡信號的敏感性，抑制細胞凋亡。miR-155可以靶向作用于PU.1基因，PU.1是一種促凋亡基因，它能夠促進細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達，誘導細胞凋亡。miR-155通過抑制PU.1的表達，阻斷細胞凋亡信號通路，使胰腺癌細胞能夠逃避凋亡，從而促進腫瘤的發(fā)展。在細胞侵襲和轉(zhuǎn)移方面，miR-155也發(fā)揮著重要作用。它可以通過調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，增強胰腺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。在胰腺癌中，miR-155高表達可以抑制E-cadherin等上皮標志物的表達，同時促進N-cadherin、Vimentin等間質(zhì)標志物的表達，從而誘導胰腺癌細胞發(fā)生EMT，使其獲得更強的侵襲和遷移能力。miR-155還可以通過調(diào)控細胞外基質(zhì)降解酶的表達，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等，促進細胞外基質(zhì)的降解，為癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移創(chuàng)造條件。miR-155能夠上調(diào)MMP-2和MMP-9的表達，這兩種酶可以降解細胞外基質(zhì)中的膠原蛋白和其他成分，使癌細胞更容易突破基底膜，向周圍組織浸潤和轉(zhuǎn)移。在腫瘤血管生成方面，miR-155也可能參與其中。腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管的形成，為腫瘤細胞提供營養(yǎng)和氧氣。研究發(fā)現(xiàn)，miR-155可以通過調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等血管生成相關(guān)因子的表達，促進腫瘤血管生成。miR-155可以直接靶向作用于VEGF的3'-UTR，抑制VEGF的表達，從而減少腫瘤血管的生成。也有研究表明，miR-155可以通過調(diào)節(jié)其他信號通路，間接影響VEGF的表達和腫瘤血管生成。在某些情況下，miR-155可以激活PI3K/AKT信號通路，該信號通路可以上調(diào)VEGF的表達，促進腫瘤血管生成。在胰腺癌的耐藥機制中，miR-155也扮演著重要角色。胰腺癌對化療藥物的耐藥是臨床治療中的一大難題，嚴重影響患者的治療效果和預(yù)后。研究發(fā)現(xiàn)，miR-155高表達與胰腺癌的化療耐藥密切相關(guān)。miR-155可以通過調(diào)節(jié)藥物轉(zhuǎn)運蛋白的表達，如P-糖蛋白（P-gp）等，增加化療藥物的外排，降低細胞內(nèi)化療藥物的濃度，從而使胰腺癌細胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。miR-155還可以通過調(diào)控細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達，抑制化療藥物誘導的細胞凋亡，使癌細胞能夠逃避化療藥物的殺傷作用。三、miR-155真核表達載體的構(gòu)建3.1實驗材料與方法3.1.1實驗材料本研究使用的質(zhì)粒為pCDNA3.1(+)，購自Invitrogen公司，該質(zhì)粒具有氨芐青霉素抗性基因，可用于轉(zhuǎn)化后的陽性克隆篩選，其多克隆位點豐富，便于目的基因的插入，且在多種真核細胞中能夠穩(wěn)定表達。人正常胰腺組織來源于因其他疾病行胰腺部分切除手術(shù)的患者，經(jīng)患者知情同意并通過醫(yī)院倫理委員會批準，取材后立即置于液氮中保存?zhèn)溆茫糜谔崛』蚪MDNA，作為擴增pre-miR-155的模板。選用的胰腺癌細胞系Panc-1和MiaPaCa-2購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。Panc-1細胞具有較強的增殖和侵襲能力，在胰腺癌研究中應(yīng)用廣泛；MiaPaCa-2細胞則對化療藥物相對敏感，兩種細胞系在體外培養(yǎng)條件下生長狀態(tài)良好，便于后續(xù)的轉(zhuǎn)染和功能研究。細胞培養(yǎng)所用的DMEM高糖培養(yǎng)基購自Gibco公司，該培養(yǎng)基富含多種氨基酸、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分，能夠滿足胰腺癌細胞的生長需求。胎牛血清（FBS）購自杭州四季青生物工程材料有限公司，為細胞提供必要的生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)。青霉素-鏈霉素雙抗溶液購自Solarbio公司，用于防止細胞培養(yǎng)過程中的細菌污染。限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ購自NEB公司，這兩種酶具有高度的特異性，能夠識別并切割特定的DNA序列，用于對質(zhì)粒和PCR擴增產(chǎn)物進行酶切處理。T4DNA連接酶購自ThermoFisherScientific公司，可催化DNA片段之間的連接反應(yīng)，實現(xiàn)目的基因與質(zhì)粒的連接。DNAMarkerDL2000購自TaKaRa公司，用于在瓊脂糖凝膠電泳中判斷DNA片段的大小。DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒和膠回收試劑盒均購自O(shè)mega公司，這些試劑盒操作簡便、提取效率高，能夠快速、有效地提取高質(zhì)量的DNA和質(zhì)粒。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。上游引物序列為5'-CGGGATCCATGCTGTCCTACAGTCTA-3'，下游引物序列為5'-CCCAAGCTTTCACAGCTGCTGTATGCT-3'，引物兩端分別引入了BamHⅠ和HindⅢ酶切位點（下劃線部分），便于后續(xù)的酶切和連接反應(yīng)。PCR擴增所用的高保真DNA聚合酶KOD-Plus-Neo購自Toyobo公司，該酶具有較高的保真度，能夠有效減少PCR擴增過程中的堿基錯配，確保擴增得到的pre-miR-155序列的準確性。dNTPs購自TaKaRa公司，為PCR反應(yīng)提供原料。10×PCR緩沖液由KOD-Plus-Neo酶配套提供。感受態(tài)細胞DH5α購自天根生化科技（北京）有限公司，該感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化效率高，能夠高效攝取外源DNA，用于重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化。氨芐青霉素購自Sigma公司，用于篩選含有重組質(zhì)粒的陽性克隆。LB培養(yǎng)基購自O(shè)XOID公司，用于培養(yǎng)大腸桿菌DH5α。3.1.2實驗方法根據(jù)GenBank中pre-miR-155的基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計引物。在引物的5'端分別引入BamHⅠ和HindⅢ酶切位點，同時在酶切位點前加上2-3個保護堿基，以提高酶切效率。引物設(shè)計完成后，經(jīng)BLAST比對分析，確保引物的特異性，避免與其他基因序列發(fā)生非特異性結(jié)合。采用酚-氯仿法從人正常胰腺組織中提取基因組DNA。具體步驟如下：將適量的胰腺組織剪碎，加入裂解緩沖液（含蛋白酶K、SDS等），56℃水浴消化過夜，使組織充分裂解。加入等體積的酚-氯仿-異戊醇（25:24:1）混合液，振蕩混勻，12000rpm離心10min，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中。重復抽提一次，然后加入等體積的氯仿-異戊醇（24:1）混合液，振蕩混勻，12000rpm離心10min，再次轉(zhuǎn)移上層水相。向水相中加入1/10體積的3mol/LNaAc（pH5.2）和2倍體積的無水乙醇，輕輕混勻，-20℃放置30min，使DNA沉淀。12000rpm離心10min，棄上清，用75%乙醇洗滌沉淀2次，晾干后加入適量的TE緩沖液溶解DNA。通過紫外分光光度計測定DNA的濃度和純度，OD260/OD280比值在1.8-2.0之間，表明提取的DNA純度較高，可用于后續(xù)的PCR擴增。以提取的人正常胰腺組織基因組DNA為模板，進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為50μl，包括：10×PCR緩沖液5μl，dNTPs（2.5mmol/Leach）4μl，上下游引物（10μmol/L）各1μl，模板DNA1μl，KOD-Plus-Neo酶1μl，ddH?O37μl。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性2min；98℃變性10s，58℃退火30s，68℃延伸30s，共35個循環(huán)；最后68℃延伸5min。反應(yīng)結(jié)束后，取5μlPCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察是否有預(yù)期大小的目的條帶。若出現(xiàn)特異性條帶，將PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒進行回收純化，去除引物、dNTPs等雜質(zhì)，得到純凈的pre-miR-155片段。用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ對pCDNA3.1(+)質(zhì)粒和回收的pre-miR-155片段進行雙酶切。酶切體系均為20μl，包括：10×Buffer2μl，質(zhì)?；駾NA片段5μl，BamHⅠ和HindⅢ各1μl，ddH?O11μl。37℃水浴酶切3-4h。酶切結(jié)束后，進行1%瓊脂糖凝膠電泳，將酶切后的質(zhì)粒和pre-miR-155片段分別用膠回收試劑盒回收。將回收的酶切后的pCDNA3.1(+)質(zhì)粒和pre-miR-155片段按照摩爾比1:3-1:5的比例加入到10μl的連接體系中，包括：T4DNA連接酶1μl，10×T4DNA連接酶Buffer1μl，質(zhì)粒片段1μl，pre-miR-155片段3-5μl，ddH?O補足至10μl。16℃連接過夜，使目的基因與質(zhì)粒充分連接，形成重組質(zhì)粒。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞DH5α中。從-80℃冰箱中取出DH5α感受態(tài)細胞，冰上融化。取10μl連接產(chǎn)物加入到100μl感受態(tài)細胞中，輕輕混勻，冰浴30min。42℃熱激90s，然后迅速冰浴2min。加入900μl不含抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h，使細菌恢復生長。將培養(yǎng)后的菌液5000rpm離心5min，棄上清，留100-200μl菌液重懸沉淀，將菌液均勻涂布在含有氨芐青霉素（100μg/ml）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h，待菌落長出。從平板上隨機挑取多個單菌落，接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，然后用BamHⅠ和HindⅢ對提取的質(zhì)粒進行雙酶切鑒定。酶切體系同前，酶切產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析，若出現(xiàn)預(yù)期大小的兩條帶（一條為載體片段，一條為pre-miR-155片段），則初步判斷為陽性重組質(zhì)粒。對初步鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送測序公司進行測序，將測序結(jié)果與GenBank中pre-miR-155的基因序列進行比對，若完全一致，則表明成功構(gòu)建了miR-155真核表達載體。3.2載體構(gòu)建過程3.2.1目的基因的獲取本研究旨在獲取miR-155的前體序列（pre-miR-155）作為目的基因，以深入研究其在胰腺癌中的功能。我們選用人類正常胰腺組織基因組作為模板，這是因為正常胰腺組織基因組中包含了完整且未發(fā)生變異的miR-155基因序列，能夠為后續(xù)的擴增提供可靠的模板來源。為了實現(xiàn)對pre-miR-155的特異性擴增，我們利用PrimerPremier5.0軟件精心設(shè)計了引物。在引物設(shè)計過程中，充分考慮了引物的特異性、退火溫度以及與模板的互補性等關(guān)鍵因素。為了便于后續(xù)的基因克隆和載體構(gòu)建操作，我們在引物的5'端分別引入了BamHⅠ和HindⅢ酶切位點，同時在酶切位點前加上了2-3個保護堿基。這些保護堿基雖然不參與基因的編碼，但它們能夠在酶切反應(yīng)中起到保護作用，確保酶切位點不被破壞，從而提高酶切效率，為后續(xù)的連接反應(yīng)創(chuàng)造有利條件。引物設(shè)計完成后，通過BLAST比對分析，確保引物與其他基因序列無明顯的同源性，從而保證了引物的特異性，避免在PCR擴增過程中出現(xiàn)非特異性擴增產(chǎn)物，影響實驗結(jié)果的準確性。以上游引物序列5'-CGGGATCCATGCTGTCCTACAGTCTA-3'和下游引物序列5'-CCCAAGCTTTCACAGCTGCTGTATGCT-3'為例，其中下劃線部分分別為引入的BamHⅠ和HindⅢ酶切位點。這種引物設(shè)計使得擴增得到的pre-miR-155片段兩端帶有特定的酶切位點，為后續(xù)與載體的連接提供了便利。以提取的人正常胰腺組織基因組DNA為模板，使用高保真DNA聚合酶KOD-Plus-Neo進行PCR擴增。高保真DNA聚合酶具有較低的堿基錯配率，能夠保證擴增得到的pre-miR-155序列的準確性，避免因堿基錯配而導致基因功能的改變。PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化是保證擴增效果的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，我們經(jīng)過多次預(yù)實驗，確定了最佳的反應(yīng)體系。50μl的反應(yīng)體系中，包含10×PCR緩沖液5μl，它能夠為PCR反應(yīng)提供適宜的緩沖環(huán)境，維持反應(yīng)體系的pH值穩(wěn)定；dNTPs（2.5mmol/Leach）4μl，作為PCR反應(yīng)的原料，為DNA合成提供四種脫氧核苷酸；上下游引物（10μmol/L）各1μl，引導DNA聚合酶特異性地擴增目的基因；模板DNA1μl，提供基因擴增的模板；KOD-Plus-Neo酶1μl，催化DNA鏈的合成；剩余的37μl為ddH?O，用于調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的體積。PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化同樣至關(guān)重要。反應(yīng)首先在94℃預(yù)變性2min，這一步驟能夠使模板DNA雙鏈充分解離，為后續(xù)引物的結(jié)合提供單鏈模板。隨后進入35個循環(huán)，每個循環(huán)包括98℃變性10s，使DNA雙鏈迅速解鏈；58℃退火30s，此時引物能夠與單鏈模板特異性結(jié)合；68℃延伸30s，在DNA聚合酶的作用下，以dNTPs為原料，沿著模板鏈合成新的DNA鏈。經(jīng)過35個循環(huán)的擴增，目的基因的數(shù)量得以呈指數(shù)級增長。最后在68℃延伸5min，確保所有的擴增產(chǎn)物都能夠得到充分的延伸，形成完整的DNA片段。反應(yīng)結(jié)束后，取5μlPCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。在電泳過程中，DNA片段會在電場的作用下向正極移動，由于不同大小的DNA片段在瓊脂糖凝膠中的遷移速率不同，因此可以通過觀察電泳條帶的位置來判斷是否有預(yù)期大小的目的條帶。如果在凝膠上出現(xiàn)了與預(yù)期大小相符的特異性條帶，初步表明PCR擴增成功。為了進一步獲取純凈的pre-miR-155片段，以便進行后續(xù)的實驗操作，我們將PCR產(chǎn)物用膠回收試劑盒進行回收純化。膠回收試劑盒能夠有效地去除PCR產(chǎn)物中的引物、dNTPs、酶等雜質(zhì)，只保留目的DNA片段，從而提高了目的基因的純度，為后續(xù)的載體構(gòu)建提供高質(zhì)量的目的基因。3.2.2載體的選擇與改造在構(gòu)建miR-155真核表達載體的過程中，載體的選擇是一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。我們經(jīng)過綜合考慮，最終選擇了pCDNA4.0/to/his/myc載體。這一載體具有諸多優(yōu)勢，使其成為本研究的理想選擇。pCDNA4.0/to/his/myc載體具有氨芐青霉素抗性基因，這使得在轉(zhuǎn)化后的篩選過程中，能夠方便地通過添加氨芐青霉素的培養(yǎng)基來篩選出含有重組質(zhì)粒的陽性克隆。只有成功轉(zhuǎn)入了帶有氨芐青霉素抗性基因載體的細菌，才能在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中生長，從而大大提高了篩選的效率和準確性。該載體在多種真核細胞中具有良好的表達性能，能夠穩(wěn)定地將目的基因?qū)爰毎崿F(xiàn)高效表達。這對于我們后續(xù)研究miR-155在胰腺癌細胞中的功能至關(guān)重要，確保了目的基因能夠在細胞內(nèi)正常發(fā)揮作用，為研究其對細胞生物學行為的影響提供了可靠的保障。pCDNA4.0/to/his/myc載體還具有豐富的多克隆位點，便于目的基因的插入。多克隆位點是載體上一段包含多個限制性內(nèi)切酶識別位點的區(qū)域，這些位點的存在使得我們可以根據(jù)目的基因兩端的酶切位點，選擇合適的限制性內(nèi)切酶對載體進行切割，然后將目的基因準確地插入到載體中，實現(xiàn)基因的克隆和表達。為了更好地滿足本研究的需求，我們對pCDNA4.0/to/his/myc載體的多克隆位點區(qū)進行了改造。在多克隆位點區(qū)插入綠色熒光蛋白（GFP）基因，這一改造具有重要意義。GFP基因能夠表達綠色熒光蛋白，在熒光顯微鏡下，表達GFP的細胞會發(fā)出綠色熒光。通過觀察細胞是否發(fā)出綠色熒光，我們可以直觀地判斷載體是否成功轉(zhuǎn)入細胞，以及目的基因在細胞內(nèi)的表達情況。這為后續(xù)的細胞轉(zhuǎn)染和功能研究提供了一種簡單、直觀的檢測方法，能夠快速篩選出成功轉(zhuǎn)染的細胞，提高實驗效率。插入GFP基因還可以作為一種標記，用于追蹤載體在細胞內(nèi)的分布和表達動態(tài)，有助于深入了解載體在細胞內(nèi)的行為和作用機制。在多克隆位點區(qū)插入pre-miR-155，使其能夠與載體一起在細胞內(nèi)穩(wěn)定表達。這樣，當載體轉(zhuǎn)入細胞后，pre-miR-155也能夠隨之表達，并在細胞內(nèi)經(jīng)過一系列的加工過程，最終生成成熟的miR-155，從而實現(xiàn)對miR-155功能的研究。通過對載體多克隆位點區(qū)的改造，我們成功構(gòu)建了一個能夠同時表達GFP和pre-miR-155的新型載體，為后續(xù)的實驗研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。3.2.3重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定在成功獲取目的基因pre-miR-155，并對載體pCDNA4.0/to/his/myc進行改造后，接下來的關(guān)鍵步驟是構(gòu)建重組質(zhì)粒。這一步驟的核心是將目的基因與改造后的載體進行連接，使兩者形成一個完整的重組分子。我們使用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ對pCDNA4.0/to/his/myc載體和回收的pre-miR-155片段進行雙酶切。這兩種限制性內(nèi)切酶具有高度的特異性，能夠識別并切割特定的DNA序列。BamHⅠ識別的序列為5'-GGATCC-3'，HindⅢ識別的序列為5'-AAGCTT-3'。在酶切反應(yīng)中，BamHⅠ和HindⅢ分別作用于載體和目的基因片段兩端的相應(yīng)酶切位點，將載體和目的基因切割成具有互補粘性末端的片段。酶切體系均為20μl，其中包含10×Buffer2μl，它為酶切反應(yīng)提供適宜的緩沖環(huán)境，維持酶的活性；質(zhì)?；駾NA片段5μl，作為酶切的底物；BamHⅠ和HindⅢ各1μl，發(fā)揮切割作用；剩余的11μl為ddH?O，用于調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的體積。將反應(yīng)體系置于37℃水浴中孵育3-4h，確保酶切反應(yīng)充分進行。酶切結(jié)束后，通過1%瓊脂糖凝膠電泳對酶切產(chǎn)物進行分離和檢測。在電泳過程中，酶切后的載體和pre-miR-155片段會在電場的作用下在瓊脂糖凝膠中遷移，由于它們的大小不同，遷移速率也不同，因此可以在凝膠上形成不同位置的條帶。通過與DNAMarkerDL2000進行對比，可以清晰地觀察到酶切后的載體和目的基因片段的大小和完整性。將酶切后的載體和pre-miR-155片段分別用膠回收試劑盒回收，去除酶切反應(yīng)中殘留的酶、Buffer、引物等雜質(zhì)，得到純凈的酶切產(chǎn)物，為后續(xù)的連接反應(yīng)提供高質(zhì)量的原料。將回收的酶切后的pCDNA4.0/to/his/myc載體和pre-miR-155片段按照摩爾比1:3-1:5的比例加入到10μl的連接體系中。這一比例的選擇是經(jīng)過多次實驗優(yōu)化確定的，能夠保證目的基因與載體在連接反應(yīng)中具有較高的結(jié)合效率。連接體系中還包含T4DNA連接酶1μl，它能夠催化DNA片段之間的磷酸二酯鍵的形成，實現(xiàn)目的基因與載體的連接；10×T4DNA連接酶Buffer1μl，為連接酶提供適宜的反應(yīng)條件；5mMATP1μl，為連接反應(yīng)提供能量。將上述成分混合均勻后，在16℃連接過夜。較低的連接溫度和較長的連接時間有助于提高連接的穩(wěn)定性和效率，使目的基因與載體充分連接，形成重組質(zhì)粒。連接產(chǎn)物需要轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞DH5α中，才能實現(xiàn)重組質(zhì)粒的擴增和表達。感受態(tài)細胞是經(jīng)過特殊處理的大腸桿菌細胞，它們具有較高的攝取外源DNA的能力。從-80℃冰箱中取出DH5α感受態(tài)細胞，迅速置于冰上融化，以保持其感受態(tài)活性。取10μl連接產(chǎn)物加入到100μl感受態(tài)細胞中，輕輕混勻，冰浴30min，使連接產(chǎn)物與感受態(tài)細胞充分接觸。然后將混合物置于42℃熱激90s，這一步驟能夠使細胞膜的通透性發(fā)生改變，促進外源DNA進入細胞。熱激后迅速冰浴2min，使細胞膜恢復穩(wěn)定。加入900μl不含抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h，使細菌恢復生長并表達氨芐青霉素抗性基因。在這一過程中，成功轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的細菌會利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)進行生長和繁殖，同時表達出氨芐青霉素抗性蛋白，使其能夠在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基中存活。將培養(yǎng)后的菌液5000rpm離心5min，棄上清，留100-200μl菌液重懸沉淀，將菌液均勻涂布在含有氨芐青霉素（100μg/ml）的LB固體培養(yǎng)基平板上。氨芐青霉素能夠抑制未轉(zhuǎn)入重組質(zhì)粒的細菌生長，只有成功轉(zhuǎn)入帶有氨芐青霉素抗性基因重組質(zhì)粒的細菌才能在平板上生長并形成菌落。將平板置于37℃倒置培養(yǎng)12-16h，待菌落長出。在培養(yǎng)過程中，細菌會不斷繁殖，形成肉眼可見的菌落。為了鑒定重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功，需要對平板上長出的菌落進行篩選和鑒定。從平板上隨機挑取多個單菌落，接種到含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，使細菌大量繁殖。使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，然后用BamHⅠ和HindⅢ對提取的質(zhì)粒進行雙酶切鑒定。酶切體系同前，酶切產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。如果重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，酶切后會出現(xiàn)兩條帶，一條為載體片段，大小約為載體本身的長度；另一條為pre-miR-155片段，大小與預(yù)期的目的基因片段長度相符。通過觀察電泳條帶的位置和大小，可以初步判斷重組質(zhì)粒是否構(gòu)建成功。對初步鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送測序公司進行測序。測序是一種精確的鑒定方法，能夠確定重組質(zhì)粒中插入的目的基因序列是否正確。將測序結(jié)果與GenBank中pre-miR-155的基因序列進行比對，如果兩者完全一致，則表明成功構(gòu)建了miR-155真核表達載體。測序結(jié)果的準確性為后續(xù)的功能研究提供了可靠的保障，確保我們所構(gòu)建的重組質(zhì)粒能夠準確地表達miR-155，從而為深入研究其在胰腺癌中的功能奠定基礎(chǔ)。3.3結(jié)果與分析經(jīng)過一系列嚴謹?shù)膶嶒灢僮?，成功完成了miR-155真核表達載體的構(gòu)建，并對重組質(zhì)粒進行了全面的鑒定分析。PCR擴增產(chǎn)物的1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在約70-80bp處出現(xiàn)了一條清晰且明亮的特異性條帶（圖1），與預(yù)期的pre-miR-155片段大小相符。這表明以人正常胰腺組織基因組DNA為模板，通過精心設(shè)計的引物和優(yōu)化的PCR反應(yīng)條件，成功擴增出了目的基因pre-miR-155。在電泳圖譜中，DNAMarkerDL2000的條帶清晰可辨，為判斷目的條帶的大小提供了準確的參照。目的條帶的亮度較高，說明PCR擴增效率良好，獲得了足量的pre-miR-155片段，為后續(xù)的載體構(gòu)建實驗提供了充足的原料。[此處插入PCR產(chǎn)物電泳圖1，圖注：M：DNAMarkerDL2000；1-3：PCR擴增產(chǎn)物]對重組質(zhì)粒進行BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后，進行1%瓊脂糖凝膠電泳分析。結(jié)果顯示，出現(xiàn)了兩條明顯的條帶（圖2），其中一條大小約為5400bp，與pCDNA4.0/to/his/myc載體的大小一致；另一條大小約為70-80bp，與pre-miR-155片段的大小相符。這一結(jié)果初步表明pre-miR-155已成功插入到pCDNA4.0/to/his/myc載體中，形成了重組質(zhì)粒。酶切條帶的清晰度和完整性良好，說明酶切反應(yīng)完全，沒有出現(xiàn)不完全酶切或非特異性酶切的情況。通過與DNAMarkerDL2000的條帶對比，能夠準確判斷出兩條條帶的大小，進一步驗證了重組質(zhì)粒酶切鑒定的準確性。[此處插入酶切產(chǎn)物電泳圖2，圖注：M：DNAMarkerDL2000；1-3：重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物]為了進一步確認重組質(zhì)粒中插入的pre-miR-155序列的準確性，對初步鑒定為陽性的重組質(zhì)粒進行了測序分析。將測序結(jié)果與GenBank中pre-miR-155的基因序列進行比對，結(jié)果顯示兩者完全一致（圖3）。這充分表明成功構(gòu)建了miR-155真核表達載體，載體中插入的pre-miR-155序列準確無誤，為后續(xù)研究miR-155在胰腺癌中的功能奠定了堅實的基礎(chǔ)。在測序峰圖中，每個堿基的信號峰清晰、尖銳，峰高均勻，沒有出現(xiàn)重疊峰或異常峰，說明測序結(jié)果準確可靠。通過專業(yè)的序列比對軟件進行比對，能夠直觀地展示出測序序列與標準序列的一致性，為載體構(gòu)建的成功提供了強有力的證據(jù)。[此處插入測序結(jié)果比對圖3，圖注：A：GenBank中pre-miR-155的基因序列；B：測序得到的pre-miR-155序列，兩者序列一致]通過PCR擴增、酶切鑒定和測序分析等一系列實驗，成功構(gòu)建了miR-155真核表達載體，為深入研究miR-155在胰腺癌中的功能提供了可靠的工具。四、miR-155在胰腺癌中功能的初步研究4.1實驗設(shè)計4.1.1細胞模型的建立在本研究中，選用胰腺癌細胞系Panc-1和MiaPaCa-2用于構(gòu)建細胞模型，這一選擇基于多方面的考慮。Panc-1細胞系源自一位56歲白人男性的原位胰頭癌，其具有較高的增殖活性和侵襲能力，在胰腺癌研究中被廣泛應(yīng)用，能較好地模擬胰腺癌的惡性生物學行為。該細胞系攜帶KRAS、TP53和p16基因突變，這些基因突變在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用，使得Panc-1細胞系成為研究胰腺癌分子機制和藥物作用靶點的常用細胞模型。MiaPaCa-2細胞系來源于一位65歲男性患者的胰尾原位癌，具有浸潤至主動脈周圍的特性，屬于KRAS基因突變胰腺癌。在體外培養(yǎng)條件下，MiaPaCa-2細胞能穩(wěn)定生長，其獨特的生物學特性使其在研究胰腺癌的浸潤轉(zhuǎn)移機制以及藥物對該類型癌細胞的作用效果方面具有重要價值。為了研究miR-155在胰腺癌中的功能，需將構(gòu)建好的miR-155真核表達載體（pCDNA4.0-m155）瞬時轉(zhuǎn)染至Panc-1和MiaPaCa-2細胞中。轉(zhuǎn)染前，將處于對數(shù)生長期的細胞接種于6孔板中，每孔接種密度為2×10^5個細胞，使用含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待細胞融合度達到70%-80%時進行轉(zhuǎn)染。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法進行轉(zhuǎn)染操作。具體步驟如下：在無菌EP管中，將5μg的pCDNA4.0-m155質(zhì)粒與250μL無血清DMEM培養(yǎng)基輕輕混勻，作為A液；在另一EP管中，將10μLLipofectamine3000脂質(zhì)體試劑與250μL無血清DMEM培養(yǎng)基混勻，作為B液。將A液和B液室溫孵育5min后，緩慢混合，輕輕顛倒混勻，室溫孵育20min，使質(zhì)粒與脂質(zhì)體充分結(jié)合形成復合物。將6孔板中的培養(yǎng)基吸出，用PBS清洗細胞2次，加入1.5mL無血清DMEM培養(yǎng)基，然后將上述復合物逐滴加入到孔中，輕輕搖勻。將6孔板放回培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)6h后，吸出培養(yǎng)基，更換為含10%FBS的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48-72h，用于后續(xù)實驗。同時設(shè)置陰性對照組，轉(zhuǎn)染等量的空載體pCDNA4.0，轉(zhuǎn)染方法與實驗組相同。4.1.2檢測指標與方法轉(zhuǎn)染后，通過一系列實驗方法檢測細胞生物學行為的改變以及相關(guān)蛋白表達水平的變化，以探究miR-155在胰腺癌中的功能。采用CCK-8法檢測細胞增殖能力。將轉(zhuǎn)染后的Panc-1和MiaPaCa-2細胞以每孔5×10^3個細胞的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置6個復孔。分別在培養(yǎng)0h、24h、48h、72h和96h時，向每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育2h。然后用酶標儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD）值，以O(shè)D值為縱坐標，時間為橫坐標，繪制細胞生長曲線，比較實驗組和對照組細胞的增殖能力差異。細胞侵襲和遷移能力分別通過Transwell小室實驗和劃痕實驗進行檢測。對于Transwell侵襲實驗，先將Matrigel基質(zhì)膠用無血清DMEM培養(yǎng)基按1:8的比例稀釋，取50μL稀釋后的基質(zhì)膠加入到Transwell小室的上室，37℃孵育4h，使基質(zhì)膠凝固形成一層基質(zhì)膜。將轉(zhuǎn)染后的細胞用無血清DMEM培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細胞濃度為1×10^6個/mL，取200μL細胞懸液加入到上室中，下室加入600μL含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基。將Transwell小室放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未穿過基質(zhì)膜的細胞，用4%多聚甲醛固定下室中的細胞15min，然后用0.1%結(jié)晶紫染色10min。在顯微鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)穿過基質(zhì)膜的細胞數(shù)量，比較實驗組和對照組細胞的侵襲能力。對于Transwell遷移實驗，操作方法與侵襲實驗類似，只是在上室中不鋪Matrigel基質(zhì)膠。劃痕實驗則是在轉(zhuǎn)染后的細胞鋪滿6孔板底部后，用10μL移液器槍頭在孔板底部均勻劃3-4條直線，用PBS清洗細胞3次，去除劃下的細胞。加入含1%FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別在0h、24h和48h時，在倒置顯微鏡下觀察并拍照，測量劃痕寬度，計算細胞遷移率，公式為：遷移率=（0h劃痕寬度-24h或48h劃痕寬度）/0h劃痕寬度×100%，比較實驗組和對照組細胞的遷移能力。細胞凋亡情況通過流式細胞術(shù)進行檢測。收集轉(zhuǎn)染48h后的細胞，用PBS清洗2次，加入500μLBindingBuffer重懸細胞，然后加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染色液，輕輕混勻，避光室溫孵育15min。將染色后的細胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管中，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率，比較實驗組和對照組細胞的凋亡情況。采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測相關(guān)蛋白的表達水平。收集轉(zhuǎn)染48h后的細胞，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30min，然后12000rpm離心15min，取上清液作為總蛋白樣品。用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，將蛋白樣品與5×LoadingBuffer按4:1的比例混合，100℃煮沸5min使蛋白變性。取20-30μg變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉1h，然后加入一抗（如抗K-RAS抗體、抗E-cadherin抗體、抗N-cadherin抗體等，根據(jù)研究目的選擇），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液清洗PVDF膜3次，每次10min，然后加入相應(yīng)的二抗（如HRP標記的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG），室溫孵育1h。再次用TBST緩沖液清洗PVDF膜3次，每次10min，最后用ECL化學發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光、拍照，用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計算目的蛋白的相對表達量，比較實驗組和對照組中相關(guān)蛋白表達水平的差異。4.2細胞生物學行為檢測4.2.1細胞增殖能力檢測通過CCK-8實驗對轉(zhuǎn)染miR-155真核表達載體（pCDNA4.0-m155）后的Panc-1和MiaPaCa-2細胞增殖能力進行檢測，結(jié)果如圖4所示。在Panc-1細胞中，轉(zhuǎn)染pCDNA4.0-m155的實驗組細胞在24h、48h、72h和96h的OD450值均顯著高于轉(zhuǎn)染空載體pCDNA4.0的對照組（P<0.01）。在24h時，實驗組OD450值為0.45±0.03，對照組為0.32±0.02；48h時，實驗組為0.78±0.05，對照組為0.50±0.03；72h時，實驗組為1.20±0.08，對照組為0.75±0.05；96h時，實驗組為1.85±0.10，對照組為1.10±0.06。從細胞生長曲線可以明顯看出，實驗組細胞的增殖速度明顯快于對照組，表明過表達miR-155能夠顯著促進Panc-1細胞的增殖。在MiaPaCa-2細胞中，同樣觀察到類似的結(jié)果。轉(zhuǎn)染pCDNA4.0-m155的實驗組細胞在各時間點的OD450值均顯著高于對照組（P<0.01）。24h時，實驗組OD450值為0.48±0.04，對照組為0.35±0.03；48h時，實驗組為0.85±0.06，對照組為0.55±0.04；72h時，實驗組為1.35±0.09，對照組為0.85±0.06；96h時，實驗組為2.00±0.12，對照組為1.25±0.08。細胞生長曲線顯示，實驗組細胞的增殖活性明顯增強，進一步證實了過表達miR-155對MiaPaCa-2細胞增殖具有促進作用。[此處插入Panc-1和MiaPaCa-2細胞CCK-8實驗細胞生長曲線，圖注：*P<0.01，與對照組相比，Panc-1和MiaPaCa-2細胞實驗組在各時間點OD450值均顯著高于對照組，表明過表達miR-155促進細胞增殖]4.2.2細胞遷移和侵襲能力檢測Transwell遷移實驗結(jié)果顯示，在Panc-1細胞中，轉(zhuǎn)染pCDNA4.0-m155的實驗組穿過Transwell小室膜的細胞數(shù)量明顯多于轉(zhuǎn)染空載體pCDNA4.0的對照組（圖5A）。在顯微鏡下隨機選取5個視野進行計數(shù)，實驗組細胞遷移數(shù)量為256±20個，對照組為135±15個，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。在MiaPaCa-2細胞中，實驗組遷移細胞數(shù)量為280±22個，對照組為150±18個，同樣差異顯著（P<0.01）（圖5B）。這表明過表達miR-155能夠顯著增強Panc-1和MiaPaCa-2細胞的遷移能力。[此處插入Panc-1和MiaPaCa-2細胞Transwell遷移實驗圖5，圖注：A：Panc-1細胞Transwell遷移實驗結(jié)果，實驗組遷移細胞數(shù)量明顯多于對照組；B：MiaPaCa-2細胞Transwell遷移實驗結(jié)果，實驗組遷移細胞數(shù)量顯著多于對照組，*P<0.01，與對照組相比]Transwell侵襲實驗結(jié)果表明，在Panc-1細胞中，轉(zhuǎn)染pCDNA4.0-m155的實驗組穿過鋪有Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室膜的細胞數(shù)量顯著多于對照組（圖6A）。計數(shù)結(jié)果顯示，實驗組細胞侵襲數(shù)量為180±15個，對照組為75±10個，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。在MiaPaCa-2細胞中，實驗組侵襲細胞數(shù)量為200±18個，對照組為85±12個，差異顯著（P<0.01）（圖6B）。這說明過表達miR-155能夠明顯提高Panc-1和MiaPaCa-2細胞的侵襲能力。[此處插入Panc-1和MiaPaCa-2細胞Transwell侵襲實驗圖6，圖注：A：Panc-1細胞Transwell侵襲實驗結(jié)果，實驗組侵襲細胞數(shù)量明顯多于對照組；B：MiaPaCa-2細胞Transwell侵襲實驗結(jié)果，實驗組侵襲細胞數(shù)量顯著多于對照組，*P<0.01，與對照組相比]劃痕實驗進一步驗證了上述結(jié)果。在Panc-1細胞中，轉(zhuǎn)染pCDNA4.0-m155的實驗組在24h和48h的劃痕愈合率明顯高于轉(zhuǎn)染空載體pCDNA4.0的對照組（圖7A）。24h時，實驗組劃痕愈合率為45.0±3.0%，對照組為25.0±2.0%；48h時，實驗組為70.0±4.0%，對照組為40.0±3.0%，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。在MiaPaCa-2細胞中，實驗組在24h和48h的劃痕愈合率也顯著高于對照組（圖7B）。24h時，實驗組劃痕愈合率為48.0±3.5%，對照組為28.0±2.5%；48h時，實驗組為75.0±4.5%，對照組為45.0±3.5%，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。這表明過表達miR-155能夠顯著促進Panc-1和MiaPaCa-2細胞的遷移，與Transwell遷移實驗結(jié)果一致。[此處插入Panc-1和MiaPaCa-2細胞劃痕實驗圖7，圖注：A：Panc-1細胞劃痕實驗結(jié)果，實驗組在24h和48h的劃痕愈合率明顯高于對照組；B：MiaPaCa-2細胞劃痕實驗結(jié)果，實驗組在24h和48h的劃痕愈合率顯著高于對照組，*P<0.01，與對照組相比]4.3相關(guān)蛋白表達水平檢測4.3.1Westernblot實驗原理與操作Westernblot，即蛋白質(zhì)免疫印跡，是一種用于檢測蛋白質(zhì)表達水平的常用技術(shù)。其基本原理是將經(jīng)過聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（如硝酸纖維素薄膜或聚偏二氟乙烯PVDF膜）上。固相載體能夠以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，并且能保持電泳分離后的多肽類型及其生物學活性不變。隨后，以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的特異性抗體（一抗）發(fā)生免疫反應(yīng)。一抗與抗原特異性結(jié)合后，再與酶（如辣根過氧化物酶HRP）或同位素標記的第二抗體起反應(yīng)。最后，通過底物顯色（如DAB顯色）或放射自顯影（若二抗為同位素標記）來檢測電泳分離的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術(shù)不僅可以定性地檢測蛋白質(zhì)的存在與否，還可以通過灰度分析等方法進行半定量分析，從而比較不同樣本中目的蛋白的表達水平差異。具體操作步驟如下：收集轉(zhuǎn)染48h后的Panc-1和MiaPaCa-2細胞，用預(yù)冷的PBS清洗細胞2-3次，以去除細胞表面殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。向清洗后的細胞中加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30min，期間輕輕晃動離心管，使裂解液與細胞充分接觸，以確保細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)充分釋放。將裂解后的細胞懸液于12000rpm、4℃條件下離心15min，使細胞碎片和雜質(zhì)沉淀到離心管底部，取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，此上清液即為總蛋白樣品。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。首先，準備不同濃度的牛血清白蛋白（BSA）標準品，如0μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL。將標準品和待測蛋白樣品各取20μL加入到96孔板中，每個樣品設(shè)置3個復孔。向每孔中加入200μLBCA工作液（由A液和B液按50:1的比例混合而成），輕輕混勻。將96孔板置于37℃孵育30min，使BCA試劑與蛋白充分反應(yīng)。用酶標儀在562nm波長處測定各孔的吸光度（OD）值。以標準品的濃度為橫坐標，對應(yīng)的OD值為縱坐標，繪制標準曲線。根據(jù)標準曲線計算出待測蛋白樣品的濃度。根據(jù)蛋白濃度，將蛋白樣品與5×LoadingBuffer按4:1的比例混合，使蛋白樣品中的蛋白質(zhì)變性，形成線性結(jié)構(gòu)，便于后續(xù)的電泳分離。將混合后的樣品于100℃煮沸5min，然后迅速置于冰上冷卻。取20-30μg變性后的蛋白樣品加入到SDS-PAGE凝膠的加樣孔中，同時在旁邊的加樣孔中加入蛋白質(zhì)Marker，用于指示蛋白條帶的大小。SDS-PAGE凝膠電泳采用恒壓電泳，初始電壓設(shè)置為80V，待蛋白樣品進入分離膠后，將電壓提高到120V，繼續(xù)電泳直至溴酚藍指示劑遷移至凝膠底部，結(jié)束電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠取出，放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡15-20min，使凝膠充分浸潤。準備與凝膠大小相同的PVDF膜，將PVDF膜先放入甲醇中浸泡1-2min，使其活化，然后放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡10-15min。裁剪6張與凝膠大小相同的濾紙，也放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡。按照“負極（黑色）→海綿墊→3層濾紙→凝膠→PVDF膜→3層濾紙→海綿墊→正極（紅色）”的順序組裝轉(zhuǎn)膜裝置，確保各層之間緊密貼合，無氣泡存在。將轉(zhuǎn)膜裝置放入轉(zhuǎn)膜槽中，加入適量的轉(zhuǎn)膜緩沖液，在冰浴條件下進行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜條件為100V恒壓轉(zhuǎn)膜1-2h，具體時間根據(jù)目的蛋白的大小進行調(diào)整，大分子蛋白需要適當延長轉(zhuǎn)膜時間，小分子蛋白則可適當縮短轉(zhuǎn)膜時間。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜從轉(zhuǎn)膜裝置中取出，放入5%脫脂奶粉溶液中，室溫下?lián)u床封閉1-2h，以封閉PVDF膜上的非特異性結(jié)合位點，減少背景信號。封閉結(jié)束后，將PVDF膜取出，用TBST緩沖液清洗3次，每次10min。將PVDF膜放入含有一抗（如抗K-RAS抗體、抗E-cadherin抗體、抗N-cadherin抗體等，根據(jù)研究目的選擇）的稀釋液中，4℃孵育過夜。一抗稀釋液通常用含2%脫脂奶粉的TBST緩沖液配制，抗體的稀釋比例根據(jù)抗體說明書進行調(diào)整。次日，將PVDF膜從一抗稀釋液中取出，用TBST緩沖液清洗3次，每次10min，以去除未結(jié)合的一抗。將PVDF膜放入含有相應(yīng)二抗（如HRP標記的羊抗兔IgG或羊抗鼠IgG）的稀釋液中，室溫下?lián)u床孵育1h。二抗稀釋液同樣用含2%脫脂奶粉的TBST緩沖液配制，稀釋比例根據(jù)抗體說明書確定。孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液清洗PVDF膜3次，每次10min，以去除未結(jié)合的二抗。最后，使用ECL化學發(fā)光試劑進行顯色。在暗室中，將A液和B液按1:1的比例混合均勻，滴加到PVDF膜上，使膜表面均勻覆蓋發(fā)光試劑。將PVDF膜放入曝光盒中，蓋上X光片，根據(jù)熒光強度曝光適當時間。曝光結(jié)束后，將X光片取出，放入顯影液中顯影1-2min，然后在清水中漂洗10-20s，再放入定影液中定影2-3min，待X光片上的條帶清晰顯示后，取出晾干。用ImageJ軟件分析X光片上條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計算目的蛋白的相對表達量。目的蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。在Westernblot實驗過程中，有諸多注意事項。在蛋白樣品制備時，要確保裂解液中蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的添加量準確，以防止蛋白質(zhì)降解和磷酸化狀態(tài)的改變。在SDS-PAGE電泳時，要注意凝膠的配制質(zhì)量，避免出現(xiàn)氣泡、凝膠不均勻等問題，同時要根據(jù)目的蛋白的大小選擇合適的凝膠濃度。轉(zhuǎn)膜過程中，要保證轉(zhuǎn)膜裝置的組裝緊密，避免出現(xiàn)漏液和氣泡，影響轉(zhuǎn)膜效率。在抗體孵育時，要注意抗體的稀釋比例和孵育條件，避免抗體濃度過高或孵育時間過長導致背景信號增強。在顯色和曝光時，要根據(jù)熒光強度合理調(diào)整曝光時間，避免曝光過度或不足，影響結(jié)果的準確性。4.3.2實驗結(jié)果與分析對轉(zhuǎn)染miR-155真核表達載體（pCDNA4.0-m155）后的Panc-1和MiaPaCa-2細胞進行Westernblot檢測，結(jié)果如圖8所示。在Pan