H2AX表達沉默對食管癌放療敏感性的調(diào)控機制：體內(nèi)外實驗研究一、引言1.1研究背景食管癌作為一種嚴重威脅人類健康的消化道惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)具有較高的發(fā)病率和死亡率。根據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負擔(dān)數(shù)據(jù)，食管癌新發(fā)病例約60.4萬，死亡病例約54.4萬，分別位居全球惡性腫瘤發(fā)病與死亡的第7位和第6位。我國是食管癌高發(fā)國家，發(fā)病和死亡病例數(shù)均占全球一半以上，嚴重影響人民的生命健康和生活質(zhì)量。放療在食管癌的綜合治療中占據(jù)重要地位，尤其是對于那些因腫瘤局部晚期、身體狀況差或存在手術(shù)禁忌證而無法進行手術(shù)切除的患者，放療是主要的治療手段之一。放射治療通過高能射線（如X射線、γ射線等）破壞癌細胞的DNA結(jié)構(gòu)，誘導(dǎo)細胞凋亡或抑制其增殖，從而達到控制腫瘤生長的目的。對于早期食管癌患者，單純放療可取得較好的局部控制率和生存率；對于中晚期患者，同步放化療是標準治療模式，能在一定程度上提高患者的生存獲益。然而，放療抵抗是食管癌治療過程中面臨的一大難題。部分食管癌患者對放療不敏感，放療后腫瘤細胞難以被徹底殺滅，容易出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致治療失敗，患者生存率降低。研究表明，放療抵抗可能與多種因素有關(guān)，包括腫瘤細胞本身的生物學(xué)特性（如腫瘤干細胞的存在、DNA損傷修復(fù)能力增強、細胞周期調(diào)控異常、凋亡抵抗等）、腫瘤微環(huán)境（如缺氧、免疫抑制細胞浸潤、細胞外基質(zhì)成分改變等）以及腫瘤相關(guān)信號通路的異常激活等。其中，DNA損傷修復(fù)是腫瘤細胞產(chǎn)生放療抵抗的重要機制之一。當腫瘤細胞受到放射線照射后，DNA會發(fā)生雙鏈斷裂（DSBs）等損傷。細胞內(nèi)存在復(fù)雜的DNA損傷修復(fù)機制，以維持基因組的穩(wěn)定性和細胞的存活。在DNA損傷修復(fù)過程中，組蛋白H2AX起著關(guān)鍵作用。H2AX是組蛋白H2A家族的一員，當DNA發(fā)生雙鏈斷裂時，H2AX的第139位絲氨酸殘基會迅速被磷酸化，形成γ-H2AX，γ-H2AX作為DNA損傷的早期標志物，可招募一系列DNA損傷修復(fù)蛋白到損傷位點，啟動DNA損傷修復(fù)過程。在食管癌中，若腫瘤細胞的H2AX表達或磷酸化水平異常，可能導(dǎo)致DNA損傷修復(fù)能力增強，使腫瘤細胞能夠在放療后迅速修復(fù)受損的DNA，從而對放療產(chǎn)生抵抗，降低放療效果。因此，深入研究H2AX表達調(diào)控與食管癌細胞放療敏感性之間的關(guān)系，揭示其潛在的分子機制，有望為提高食管癌放療療效提供新的靶點和策略，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。1.2研究目的與意義本研究旨在通過沉默H2AX表達，深入探究其對體內(nèi)外食管癌細胞放療敏感性的調(diào)控作用及其潛在分子機制，為解決食管癌放療抵抗問題提供新的理論依據(jù)和治療策略，具體意義如下：理論意義：在基礎(chǔ)研究層面，目前雖然已知H2AX在DNA損傷修復(fù)中起關(guān)鍵作用，但其在食管癌放療敏感性調(diào)控中的具體分子機制尚未完全明確。本研究通過對沉默H2AX表達后食管癌細胞放療敏感性變化及相關(guān)信號通路、分子事件的研究，有望揭示H2AX在食管癌放療抵抗中的全新作用機制，進一步豐富和完善食管癌放療抵抗的理論體系，為深入理解腫瘤細胞放療抵抗的生物學(xué)過程提供新的視角和思路。臨床意義：在臨床實踐方面，放療抵抗嚴重影響食管癌患者的放療效果和預(yù)后。若能證實沉默H2AX表達可有效提高食管癌細胞放療敏感性，那么H2AX有望成為預(yù)測食管癌放療敏感性的重要生物標志物。通過檢測患者腫瘤組織中H2AX的表達水平，醫(yī)生可以在放療前更準確地評估患者對放療的反應(yīng)，為制定個性化的放療方案提供依據(jù)。對于H2AX高表達、放療抵抗風(fēng)險高的患者，可提前采取針對性的干預(yù)措施，如聯(lián)合使用H2AX抑制劑或其他增敏手段，提高放療療效；而對于H2AX低表達、放療敏感性較好的患者，則可避免過度治療，減少不必要的醫(yī)療資源浪費和患者的不良反應(yīng)。此外，針對H2AX開發(fā)的靶向治療策略，也為食管癌的精準治療開辟了新的途徑，有助于提高患者的生存率和生活質(zhì)量，減輕患者家庭和社會的經(jīng)濟負擔(dān)。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀近年來，食管癌放療抵抗機制的研究一直是腫瘤領(lǐng)域的熱點。國內(nèi)外學(xué)者圍繞腫瘤細胞內(nèi)在因素、腫瘤微環(huán)境以及相關(guān)信號通路等多個方面展開了深入探索。在腫瘤細胞內(nèi)在因素方面，眾多研究聚焦于DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白和基因。研究表明，一些DNA修復(fù)蛋白如BRCA1、BRCA2、ATM、ATR等在食管癌放療抵抗中發(fā)揮重要作用。例如，ATM基因的突變或表達異?？蓪?dǎo)致DNA損傷修復(fù)信號通路的紊亂，使腫瘤細胞對放療產(chǎn)生抵抗。國內(nèi)一項針對食管鱗癌的研究發(fā)現(xiàn)，ATM蛋白高表達與放療抵抗顯著相關(guān)，高表達ATM的食管鱗癌細胞對放射線的耐受性更強。此外，腫瘤干細胞（CSCs）被認為是導(dǎo)致放療抵抗的重要因素之一。CSCs具有自我更新、多向分化和高致瘤性等特性，其高表達的ABC轉(zhuǎn)運蛋白可將化療藥物和放療產(chǎn)生的毒性物質(zhì)排出細胞外，從而逃避放療的殺傷作用。國外研究通過分離和鑒定食管癌干細胞，發(fā)現(xiàn)其在放療后能夠迅速增殖并重建腫瘤，提示食管癌干細胞在放療抵抗中的關(guān)鍵作用。腫瘤微環(huán)境在食管癌放療抵抗中的作用也逐漸受到關(guān)注。腫瘤微環(huán)境中的缺氧區(qū)域可誘導(dǎo)腫瘤細胞產(chǎn)生一系列適應(yīng)性變化，如上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-1α）的表達，進而激活下游與放療抵抗相關(guān)的基因，促進腫瘤細胞存活和增殖。腫瘤相關(guān)成纖維細胞（CAFs）作為腫瘤微環(huán)境的重要組成部分，可通過分泌多種細胞因子和生長因子，如轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）、血小板衍生生長因子（PDGF）等，調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生物學(xué)行為，增強其放療抵抗能力。研究顯示，TGF-β可激活腫瘤細胞內(nèi)的SMAD信號通路，促進DNA損傷修復(fù)，降低放療敏感性。此外，腫瘤微環(huán)境中的免疫細胞，如調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs）、髓源性抑制細胞（MDSCs）等，可抑制機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，為腫瘤細胞提供免疫逃逸的微環(huán)境，間接影響放療效果。關(guān)于H2AX在腫瘤放療敏感性中的研究，已在多種腫瘤中取得一定進展。在乳腺癌、肺癌等腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)，H2AX的表達水平和磷酸化狀態(tài)與放療敏感性密切相關(guān)。沉默H2AX表達可抑制腫瘤細胞的DNA損傷修復(fù)能力，增加放療誘導(dǎo)的細胞凋亡，從而提高放療敏感性。例如，在乳腺癌細胞系中，利用RNA干擾技術(shù)沉默H2AX后，放療誘導(dǎo)的γ-H2AX焦點形成顯著減少，細胞對放療的敏感性明顯增強。在食管癌研究領(lǐng)域，雖然已有研究證實H2AX參與了食管癌細胞的DNA損傷修復(fù)過程，但關(guān)于沉默H2AX表達對食管癌細胞放療敏感性的調(diào)控作用及具體分子機制，目前仍缺乏系統(tǒng)深入的研究。現(xiàn)有研究大多僅停留在初步探討H2AX表達與放療抵抗的相關(guān)性，對于沉默H2AX后如何影響食管癌細胞的放療敏感性，以及其下游相關(guān)信號通路和分子事件的變化，尚未有明確結(jié)論。此外，體內(nèi)研究方面，關(guān)于沉默H2AX對食管癌動物模型放療效果的影響也鮮見報道。綜上所述，盡管目前在食管癌放療抵抗機制和H2AX相關(guān)研究方面取得了一定成果，但仍存在諸多不足。深入研究沉默H2AX表達調(diào)控食管癌細胞放療敏感性的作用機制，有望填補這一領(lǐng)域的研究空白，為食管癌放療增敏提供新的理論依據(jù)和治療靶點，具有重要的研究價值和臨床意義。二、H2AX與食管癌放療敏感性的理論基礎(chǔ)2.1H2AX的結(jié)構(gòu)與功能2.1.1H2AX的分子結(jié)構(gòu)特點H2AX作為組蛋白H2A家族的重要成員，在維持染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定中扮演著關(guān)鍵角色。在染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單元——核小體中，由H2A、H2B、H3和H4各兩個分子組成八聚體核心，約146bp的DNA纏繞在這個八聚體上形成核小體的核心顆粒，而H2AX便是其中H2A的一種變異體。H2AX與其他組蛋白緊密協(xié)作，共同維持染色質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)。它通過與相鄰組蛋白的相互作用，參與調(diào)節(jié)染色質(zhì)的折疊、壓縮和伸展，影響基因的可及性和轉(zhuǎn)錄活性。研究表明，H2AX的存在有助于維持染色質(zhì)的松散狀態(tài)，使轉(zhuǎn)錄因子等能夠更容易地結(jié)合到DNA上，促進基因的表達。H2AX在結(jié)構(gòu)上具有獨特之處，其C末端含有一個高度保守的SQE基序（Ser-Gln-Glu）。這個基序中的絲氨酸（Ser）殘基是H2AX發(fā)生磷酸化修飾的關(guān)鍵位點。當細胞受到諸如電離輻射、化學(xué)物質(zhì)損傷等外界因素刺激，導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂時，SQE基序中的絲氨酸會迅速被磷酸化，形成γ-H2AX。這種磷酸化修飾改變了H2AX的電荷性質(zhì)和空間構(gòu)象，進而影響H2AX與其他染色質(zhì)相關(guān)蛋白的相互作用，啟動一系列DNA損傷修復(fù)和細胞周期調(diào)控等生物學(xué)過程。例如，γ-H2AX可以通過招募DNA損傷修復(fù)蛋白到損傷位點，形成DNA損傷修復(fù)復(fù)合物，促進DNA雙鏈斷裂的修復(fù)，維持基因組的穩(wěn)定性。此外，H2AX還可以與其他組蛋白修飾協(xié)同作用，共同調(diào)控染色質(zhì)的功能。組蛋白的甲基化、乙?；刃揎椏梢杂绊懭旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，而H2AX的磷酸化修飾可以與這些修飾相互影響，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在某些情況下，H2AX的磷酸化可能會促進其他組蛋白修飾的發(fā)生，或者反之，這些修飾之間的相互作用共同決定了染色質(zhì)在DNA損傷修復(fù)、基因轉(zhuǎn)錄等過程中的功能狀態(tài)。2.1.2H2AX在DNA損傷修復(fù)中的作用機制當食管癌細胞受到放療等因素導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂時，H2AX會迅速發(fā)生磷酸化修飾，這是DNA損傷修復(fù)過程中的關(guān)鍵起始事件。在這個過程中，磷脂酰肌醇-3-激酶相關(guān)激酶（PIKKs）家族成員，如共濟失調(diào)毛細血管擴張突變蛋白（ATM）、ATM和Rad3相關(guān)蛋白（ATR）以及DNA依賴蛋白激酶（DNA-PK），發(fā)揮著重要的介導(dǎo)作用。其中，ATM在DNA雙鏈斷裂時被激活，主要負責(zé)介導(dǎo)H2AX的磷酸化。當DNA雙鏈斷裂發(fā)生后，MRN復(fù)合物（由Mre11、Rad50和Nbs1組成）首先識別DNA損傷位點，然后募集ATM到損傷部位。ATM在MRN復(fù)合物的作用下，其自身的Ser1981位點發(fā)生自動磷酸化而激活，激活后的ATM與蛋白磷酸酶2A（PP2A）復(fù)合物分離，進而使下游底物H2AX的Ser139位點發(fā)生磷酸化，形成γ-H2AX。γ-H2AX一旦形成，便作為一種重要的信號分子，招募一系列DNA損傷修復(fù)蛋白到損傷位點，啟動DNA損傷修復(fù)過程。MDC1（DNA損傷檢查點蛋白1）通過其BRCT結(jié)構(gòu)域直接與γ-H2AX結(jié)合，一方面，它可以錨定ATM，使更多的ATM被募集到損傷位點，從而放大H2AX磷酸化信號；另一方面，MDC1還能保護γ-H2AX不被去磷酸化，維持DNA損傷修復(fù)信號的穩(wěn)定。同時，γ-H2AX還能與其他DNA損傷修復(fù)蛋白相互作用，如乳腺癌易感基因1（BRCA1）、p53結(jié)合蛋白1（53BP1）等，它們共同聚集在損傷位點，形成DNA損傷修復(fù)焦點。在同源重組（HR）修復(fù)途徑中，γ-H2AX還會募集黏連蛋白復(fù)合物（cohesincomplex），促進姐妹染色單體之間的物理連接，為同源重組修復(fù)提供必要的條件。通過這些修復(fù)蛋白的協(xié)同作用，損傷的DNA雙鏈得以逐步修復(fù)，恢復(fù)基因組的完整性。此外，H2AX介導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)過程還與細胞周期調(diào)控密切相關(guān)。當DNA損傷發(fā)生時，γ-H2AX不僅參與DNA損傷修復(fù)，還能激活細胞周期檢查點，如G1/S、S和G2/M檢查點。γ-H2AX可以通過與p53等細胞周期調(diào)控蛋白相互作用，阻滯細胞周期進程，使細胞暫停在特定階段，為DNA損傷修復(fù)爭取足夠的時間。如果DNA損傷能夠被有效修復(fù)，細胞周期檢查點會被解除，細胞繼續(xù)進行增殖；反之，若DNA損傷無法修復(fù)，細胞可能會啟動凋亡程序，以避免受損DNA傳遞給子代細胞，維持細胞基因組的穩(wěn)定性。2.2食管癌放療敏感性的相關(guān)因素2.2.1細胞內(nèi)在因素對放療敏感性的影響食管癌細胞的內(nèi)在特性在很大程度上決定了其對放療的敏感性。細胞增殖能力是其中一個關(guān)鍵因素，增殖活躍的食管癌細胞通常對放療更為敏感。這是因為放療主要作用于細胞周期中的活躍期，尤其是DNA合成期（S期）和有絲分裂期（M期）。處于增殖狀態(tài)的細胞，其DNA復(fù)制和細胞分裂過程頻繁進行，更容易受到放射線的損傷。當細胞受到照射后，DNA雙鏈斷裂等損傷會導(dǎo)致細胞周期阻滯或凋亡。如果細胞增殖迅速，在單位時間內(nèi)進入對放療敏感的細胞周期階段的細胞數(shù)量就會增加，從而提高了放療對腫瘤細胞的殺傷效果。有研究表明，通過檢測食管癌細胞的增殖標志物，如Ki-67的表達水平，發(fā)現(xiàn)Ki-67高表達的食管癌細胞系對放療的敏感性明顯高于Ki-67低表達的細胞系。臨床研究也發(fā)現(xiàn)，食管癌組織中Ki-67陽性率高的患者，放療后的局部控制率和生存率相對較高。細胞周期分布也與放療敏感性密切相關(guān)。細胞周期包括G1期、S期、G2期和M期，不同時期的細胞對放療的敏感性存在差異。一般來說，M期細胞對放療最為敏感，因為此時細胞的染色體高度濃縮，紡錘體形成，對放射線的損傷更為脆弱。S期細胞相對不敏感，這是由于S期細胞正在進行DNA復(fù)制，其DNA損傷修復(fù)機制較為活躍，能夠在一定程度上修復(fù)放療導(dǎo)致的DNA損傷。G1期和G2期細胞的放療敏感性則介于M期和S期之間。當食管癌細胞處于不同的細胞周期時，放療效果會有所不同。如果能夠調(diào)控食管癌細胞的細胞周期，使其更多地進入對放療敏感的時期，就有可能提高放療敏感性。有研究采用細胞周期同步化技術(shù)，將食管癌細胞同步到M期后再進行放療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞的凋亡率明顯增加，放療敏感性顯著提高。此外，一些細胞周期調(diào)控蛋白，如細胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）及其抑制劑，也參與了放療敏感性的調(diào)控。CDK抑制劑可以阻滯細胞周期進程，使細胞停留在對放療敏感的時期，增強放療效果。在食管癌細胞中，上調(diào)CDK抑制劑p21的表達，可以使細胞周期阻滯在G1期，增加放療誘導(dǎo)的細胞凋亡，提高放療敏感性。2.2.2腫瘤微環(huán)境對放療敏感性的作用腫瘤微環(huán)境是一個復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，其中包含免疫細胞、纖維細胞、細胞外基質(zhì)以及各種細胞因子和趨化因子等，這些成分相互作用，共同影響著食管癌細胞的放療敏感性。免疫細胞在腫瘤微環(huán)境中扮演著重要角色。例如，腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs）中的細胞毒性T淋巴細胞（CTLs）能夠識別并殺傷腫瘤細胞。在放療過程中，放射線可以誘導(dǎo)腫瘤細胞釋放腫瘤相關(guān)抗原（TAAs），激活CTLs的抗腫瘤免疫反應(yīng)。CTLs通過釋放穿孔素和顆粒酶等物質(zhì)，直接殺傷腫瘤細胞，或者分泌細胞因子，如干擾素-γ（IFN-γ），激活其他免疫細胞，間接增強抗腫瘤免疫。研究表明，食管癌組織中TILs浸潤程度高的患者，放療后的預(yù)后往往更好，提示TILs在提高放療敏感性方面具有積極作用。然而，腫瘤微環(huán)境中也存在一些免疫抑制細胞，如調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs）和髓源性抑制細胞（MDSCs），它們會抑制機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，降低放療敏感性。Tregs可以通過分泌抑制性細胞因子，如白細胞介素-10（IL-10）和轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β），抑制CTLs的活性，促進腫瘤細胞的免疫逃逸。MDSCs則可以通過多種機制，如消耗免疫細胞所需的營養(yǎng)物質(zhì)、產(chǎn)生活性氧（ROS）等，抑制免疫細胞的功能，影響放療效果。腫瘤相關(guān)成纖維細胞（CAFs）作為腫瘤微環(huán)境中的主要間質(zhì)細胞，也對食管癌細胞的放療敏感性產(chǎn)生重要影響。CAFs可以分泌多種細胞因子和生長因子，如TGF-β、血小板衍生生長因子（PDGF）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等。這些因子可以調(diào)節(jié)食管癌細胞的生物學(xué)行為，促進腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，同時也會影響放療敏感性。TGF-β是CAFs分泌的一種重要細胞因子，它可以激活腫瘤細胞內(nèi)的SMAD信號通路，上調(diào)DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白的表達，增強腫瘤細胞的DNA損傷修復(fù)能力，從而降低放療敏感性。PDGF可以促進腫瘤血管生成，增加腫瘤的血供，為腫瘤細胞提供充足的營養(yǎng)和氧氣，使腫瘤細胞對放療的耐受性增強。此外，CAFs還可以通過與食管癌細胞直接接觸，調(diào)節(jié)細胞間的信號傳導(dǎo)，影響腫瘤細胞的放療敏感性。研究發(fā)現(xiàn)，CAFs與食管癌細胞共培養(yǎng)后，食管癌細胞的放療抵抗能力明顯增強，其機制可能與CAFs誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），使其獲得更強的遷移和侵襲能力以及放療抵抗特性有關(guān)。三、實驗材料與方法3.1實驗材料3.1.1細胞株與實驗動物細胞株：本實驗選用人食管癌細胞株EC109和KYSE450，均購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。EC109細胞源自人食管中段鱗癌組織，呈上皮細胞樣形態(tài)。KYSE450細胞同樣為食管鱗癌細胞株，具有典型的癌細胞生長特性。兩種細胞株在實驗中用于探究沉默H2AX表達對不同食管癌細胞放療敏感性的影響。培養(yǎng)條件：將EC109和KYSE450細胞分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS，Gibco，美國）的RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco，美國）中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific，美國）中培養(yǎng)。定期觀察細胞生長狀態(tài)，當細胞密度達到80%-90%融合時，進行傳代培養(yǎng)。傳代時，先用不含鈣、鎂離子的磷酸鹽緩沖液（PBS，Hyclone，美國）潤洗細胞1-2次，然后加入適量0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液（Gibco，美國），37℃消化1-2分鐘，待細胞大部分變圓并脫落時，加入含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打細胞使其成為單細胞懸液，按1:2-1:3的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。實驗動物：選用4-6周齡、體重18-22g的BALB/c裸鼠，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK（京）2020-0006。裸鼠飼養(yǎng)于無特定病原體（SPF）級動物房，環(huán)境溫度控制在22-25℃，相對濕度為40%-60%，12小時光照/黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水。在實驗前，裸鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，以確保其身體狀況穩(wěn)定，適應(yīng)實驗環(huán)境。實驗過程中嚴格遵循動物倫理和福利原則，所有動物實驗方案均獲得本單位動物倫理委員會的批準。3.1.2主要試劑與儀器主要試劑RNA提取試劑：TRIzol試劑（Invitrogen，美國），用于提取食管癌細胞和組織中的總RNA，其主要成分包括苯酚、異硫氰酸胍等，能有效裂解細胞，使RNA釋放并保持其完整性。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser（TaKaRa，日本），可將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于后續(xù)的實時熒光定量PCR（qPCR）實驗。該試劑盒含有g(shù)DNAEraser酶，能有效去除RNA樣品中的基因組DNA污染，保證逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的純度。實時熒光定量PCR試劑：TBGreenPremixExTaqII（TaKaRa，日本），基于SYBRGreenI熒光染料法，可特異性地與雙鏈DNA結(jié)合，在PCR擴增過程中，隨著擴增產(chǎn)物的增加，熒光信號也隨之增強，通過實時監(jiān)測熒光信號的變化，可對目的基因進行定量分析。慢病毒載體及包裝系統(tǒng)：針對H2AX基因的短發(fā)夾RNA（shRNA）慢病毒載體（GenePharma，中國），以及慢病毒包裝質(zhì)粒（psPAX2、pMD2.G），用于構(gòu)建穩(wěn)定沉默H2AX表達的食管癌細胞株。shRNA序列經(jīng)過優(yōu)化設(shè)計，可特異性地靶向H2AX基因mRNA，通過RNA干擾機制抑制其表達。嘌呤霉素：購自Sigma-Aldrich（美國），用于篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染慢病毒的食管癌細胞。嘌呤霉素是一種氨基糖苷類抗生素，可抑制蛋白質(zhì)合成，只有成功轉(zhuǎn)染并表達嘌呤霉素抗性基因的細胞才能在含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基中存活。蛋白提取試劑：RIPA裂解液（Beyotime，中國），含有多種蛋白酶抑制劑，能有效裂解細胞，提取細胞總蛋白，并保持蛋白的完整性和活性。BCA蛋白定量試劑盒：購自ThermoFisherScientific（美國），基于BCA法，通過蛋白質(zhì)中的肽鍵與Cu2?絡(luò)合，使Cu2?還原為Cu?，Cu?與BCA試劑形成紫色絡(luò)合物，在562nm處有強烈的光吸收值，其顏色深淺與蛋白濃度成正比，可用于測定蛋白樣品的濃度?？贵w：兔抗人H2AX多克隆抗體（CellSignalingTechnology，美國），用于檢測H2AX蛋白的表達水平；兔抗人γ-H2AX單克隆抗體（Abcam，英國），可特異性識別磷酸化的H2AX，用于檢測DNA損傷后H2AX的磷酸化水平；鼠抗人β-actin單克隆抗體（Sigma-Aldrich，美國），作為內(nèi)參抗體，用于校正蛋白上樣量。此外，還包括相應(yīng)的辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔二抗和山羊抗鼠二抗（JacksonImmunoResearch，美國），用于Westernblot實驗中檢測一抗與抗原的結(jié)合，通過HRP催化底物顯色，實現(xiàn)蛋白條帶的可視化。CCK-8試劑：購自Dojindo（日本），即CellCountingKit-8，其主要成分是WST-8，在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪硫酸二甲酯（1-methoxyPMS）的作用下，WST-8被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物，其生成量與活細胞數(shù)量成正比，可用于檢測細胞增殖活性。AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒：由BDBiosciences（美國）提供，用于檢測細胞凋亡。AnnexinV是一種Ca2?依賴的磷脂結(jié)合蛋白，可與凋亡早期細胞膜上外翻的磷脂酰絲氨酸（PS）高親和力結(jié)合，F(xiàn)ITC標記的AnnexinV可通過熒光顯微鏡或流式細胞儀檢測；碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，可穿透死亡細胞的細胞膜，與細胞核中的DNA結(jié)合，通過流式細胞儀雙染檢測，可將細胞分為活細胞（AnnexinV?/PI?）、早期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細胞（AnnexinV?/PI?），從而準確分析細胞凋亡情況。其他試劑：包括二甲基亞砜（DMSO，Sigma-Aldrich，美國）、甲醇、乙醇、氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉等常規(guī)化學(xué)試劑，均為分析純，用于配制各種緩沖液、固定液等。例如，DMSO常用于溶解難溶性藥物和試劑，在細胞凍存液中也有應(yīng)用；甲醇和乙醇常用于組織固定和脫水；各種鹽類用于配制PBS、細胞培養(yǎng)液等緩沖體系。主要儀器細胞培養(yǎng)相關(guān)儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific，美國），為細胞提供穩(wěn)定的37℃、5%CO?培養(yǎng)環(huán)境，維持細胞生長所需的溫度、濕度和氣體條件；超凈工作臺（ESCO，新加坡），通過高效空氣過濾器（HEPA）過濾空氣，提供無菌操作環(huán)境，防止細胞培養(yǎng)過程中受到微生物污染；倒置顯微鏡（Olympus，日本），用于實時觀察細胞的生長狀態(tài)、形態(tài)變化等，配備有不同倍數(shù)的物鏡和目鏡，可清晰顯示細胞的細節(jié)結(jié)構(gòu)。核酸操作儀器：PCR儀（Bio-Rad，美國），用于進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR擴增，可精確控制反應(yīng)溫度和時間，實現(xiàn)核酸的合成和擴增；實時熒光定量PCR儀（Roche，瑞士），基于熒光檢測技術(shù)，可實時監(jiān)測PCR擴增過程中熒光信號的變化，對目的基因進行定量分析，具有高靈敏度、高準確性和重復(fù)性好的特點。蛋白分析儀器：電泳儀（Bio-Rad，美國）和垂直電泳槽（Bio-Rad，美國），用于蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），通過電場作用使蛋白質(zhì)在凝膠中根據(jù)分子量大小進行分離；轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad，美國），將電泳分離后的蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移到固相膜（如PVDF膜）上，以便后續(xù)進行免疫印跡檢測；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Tanon，中國），用于檢測Westernblot實驗中HRP催化底物產(chǎn)生的化學(xué)發(fā)光信號，將蛋白條帶可視化并進行定量分析。細胞檢測儀器：酶標儀（ThermoFisherScientific，美國），可用于檢測CCK-8實驗中細胞增殖活性產(chǎn)生的吸光度值，以及其他基于酶促反應(yīng)的檢測項目；流式細胞儀（BDBiosciences，美國），通過檢測細胞的熒光信號，對細胞凋亡、細胞周期等進行精確分析，可同時檢測多個參數(shù)，快速準確地獲取細胞群體的生物學(xué)信息。動物實驗儀器：電子天平（Sartorius，德國），用于稱量裸鼠體重和腫瘤組織重量；游標卡尺（Mitutoyo，日本），測量腫瘤的長徑和短徑，以便計算腫瘤體積；小動物活體成像系統(tǒng)（PerkinElmer，美國），在動物實驗中，可對攜帶熒光標記腫瘤細胞的裸鼠進行體內(nèi)成像，實時監(jiān)測腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移情況。3.2實驗方法3.2.1細胞培養(yǎng)與處理將人食管癌細胞株EC109和KYSE450分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。定期在倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)，當細胞密度達到80%-90%融合時，進行傳代培養(yǎng)。傳代時，先用PBS潤洗細胞1-2次，以去除細胞表面的雜質(zhì)和殘留培養(yǎng)基。然后加入適量0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，37℃消化1-2分鐘，期間在顯微鏡下密切觀察細胞消化情況，待細胞大部分變圓并脫落時，立即加入含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基終止消化。用移液器輕輕吹打細胞，使其成為單細胞懸液，按1:2-1:3的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。采用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)構(gòu)建穩(wěn)定沉默H2AX表達的食管癌細胞株。針對H2AX基因設(shè)計并合成短發(fā)夾RNA（shRNA）序列，將其克隆到慢病毒載體中，與包裝質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G共轉(zhuǎn)染293T細胞，進行慢病毒包裝。收集含有慢病毒的上清液，用0.45μm濾器過濾除菌后，感染處于對數(shù)生長期的EC109和KYSE450細胞。感染時，在細胞培養(yǎng)基中加入適量的聚凝胺（終濃度為5-8μg/mL），以提高感染效率。感染48小時后，更換為含嘌呤霉素（終濃度為2-4μg/mL）的選擇培養(yǎng)基，篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞克隆。持續(xù)篩選2-3周，直至未轉(zhuǎn)染的細胞全部死亡，獲得穩(wěn)定沉默H2AX表達的食管癌細胞株。同時，設(shè)立陰性對照組，轉(zhuǎn)染非靶向的陰性對照shRNA慢病毒。通過Westernblot和實時熒光定量PCR檢測H2AX蛋白和mRNA的表達水平，驗證沉默效果。3.2.2體內(nèi)實驗設(shè)計與實施選用4-6周齡、體重18-22g的BALB/c裸鼠，在實驗前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。將穩(wěn)定沉默H2AX表達的EC109和KYSE450細胞以及相應(yīng)的陰性對照細胞，用胰蛋白酶消化后，制備成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為5×10?個/mL。每只裸鼠在右側(cè)腋窩皮下接種0.2mL細胞懸液，共接種30只裸鼠，每種細胞接種10只。接種后，定期用游標卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積，密切觀察裸鼠的一般狀態(tài)、腫瘤生長情況等。當腫瘤體積長至約100-150mm3時，將接種相同細胞的裸鼠隨機分為兩組，即放療組和對照組，每組5只。放療組接受6MVX射線照射，照射劑量為2Gy/次，共照射5次，每周照射5天；對照組不進行放療，僅給予相同的飼養(yǎng)條件。在放療過程中，使用鉛板遮擋裸鼠身體其他部位，只暴露腫瘤部位接受照射。照射時，將裸鼠置于專用的動物照射固定裝置中，以確保照射位置準確。照射后，繼續(xù)觀察腫瘤生長情況，每天記錄裸鼠體重、精神狀態(tài)、飲食和飲水等情況。在實驗結(jié)束時，對裸鼠進行安樂死，迅速取出腫瘤組織，用生理鹽水沖洗干凈，去除表面的血跡和雜質(zhì)。一部分腫瘤組織用4%多聚甲醛固定，用于后續(xù)的組織病理學(xué)分析和免疫組織化學(xué)檢測；另一部分腫瘤組織凍存于液氮中，用于提取RNA和蛋白質(zhì)，進行基因和蛋白表達分析。3.2.3體外實驗檢測指標與方法細胞放療敏感性檢測：采用克隆形成實驗檢測食管癌細胞的放療敏感性。將對數(shù)生長期的穩(wěn)定沉默H2AX表達的食管癌細胞及陰性對照細胞，用胰蛋白酶消化后，制備成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度。分別將不同濃度的細胞懸液接種于6孔板中，每組設(shè)3個復(fù)孔。待細胞貼壁后，給予不同劑量（0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy）的6MVX射線照射。照射后，繼續(xù)培養(yǎng)10-14天，期間每2-3天更換一次培養(yǎng)基。當肉眼可見明顯的細胞克隆形成時，終止培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)基，用PBS輕輕潤洗細胞2-3次，然后用甲醇固定15-20分鐘，再用0.1%結(jié)晶紫染色10-15分鐘。染色結(jié)束后，用流水緩慢沖洗，去除多余的染料，自然晾干。在顯微鏡下計數(shù)含有50個以上細胞的克隆數(shù)，計算克隆形成率?？寺⌒纬陕?（克隆數(shù)/接種細胞數(shù)）×100%。根據(jù)不同照射劑量下的克隆形成率，繪制細胞存活曲線，計算放射增敏比（SER）。SER=對照組D?/實驗組D?，其中D?為細胞存活曲線的斜率倒數(shù)，代表細胞的放射敏感性，SER越大，表明細胞放療敏感性越高。細胞凋亡檢測：使用AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒，通過流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。將穩(wěn)定沉默H2AX表達的食管癌細胞及陰性對照細胞接種于6孔板中，待細胞貼壁后，給予4Gy的6MVX射線照射。照射后繼續(xù)培養(yǎng)24小時，收集細胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2-3次。按照試劑盒說明書，將細胞重懸于100μL的BindingBuffer中，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育15-20分鐘。孵育結(jié)束后，加入400μLBindingBuffer，立即在流式細胞儀上檢測。根據(jù)AnnexinV和PI的雙染結(jié)果，將細胞分為活細胞（AnnexinV?/PI?）、早期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細胞（AnnexinV?/PI?），計算凋亡細胞比例（早期凋亡細胞比例+晚期凋亡細胞比例），分析沉默H2AX表達對放療誘導(dǎo)細胞凋亡的影響?；蚺c蛋白表達檢測：利用實時熒光定量PCR檢測H2AX及相關(guān)基因的mRNA表達水平。采用TRIzol試劑提取細胞或組織中的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用TBGreenPremixExTaqII試劑，在實時熒光定量PCR儀上進行擴增。反應(yīng)體系一般為20μL，包括10μLTBGreenPremixExTaqII、0.8μL上游引物、0.8μL下游引物、2μLcDNA模板和6.4μLddH?O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30-60秒；95℃變性5-10秒，60℃退火和延伸30-40秒，共40個循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。采用Westernblot檢測H2AX及相關(guān)蛋白的表達水平。用RIPA裂解液提取細胞或組織中的總蛋白，使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。取適量蛋白樣品，加入上樣緩沖液，煮沸變性5-10分鐘。將變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1-2小時，以防止非特異性結(jié)合。封閉后，加入一抗（兔抗人H2AX多克隆抗體、兔抗人γ-H2AX單克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體等），4℃孵育過夜。第二天，用TBST洗滌PVDF膜3-4次，每次10-15分鐘。然后加入相應(yīng)的HRP標記的二抗，室溫孵育1-2小時。再次用TBST洗滌PVDF膜3-4次后，使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測蛋白條帶，根據(jù)條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參，分析目的蛋白的相對表達量。四、沉默H2AX表達對體外食管癌細胞放療敏感性的影響4.1不同H2AX表達水平食管癌細胞株的建立與鑒定為深入研究H2AX表達對食管癌細胞放療敏感性的影響，我們采用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建了穩(wěn)定沉默H2AX表達的食管癌細胞株。首先，針對H2AX基因設(shè)計并合成了特異性短發(fā)夾RNA（shRNA）序列，將其克隆至慢病毒載體中，隨后與包裝質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G共轉(zhuǎn)染293T細胞，完成慢病毒的包裝。收集含有慢病毒的上清液，經(jīng)0.45μm濾器過濾除菌后，用于感染處于對數(shù)生長期的人食管癌細胞株EC109和KYSE450。感染過程中，添加適量聚凝胺（終濃度5-8μg/mL）以提高感染效率。感染48小時后，更換為含嘌呤霉素（終濃度2-4μg/mL）的選擇培養(yǎng)基，持續(xù)篩選2-3周，直至未轉(zhuǎn)染的細胞全部死亡，成功獲得穩(wěn)定沉默H2AX表達的食管癌細胞株。同時，設(shè)立轉(zhuǎn)染非靶向陰性對照shRNA慢病毒的細胞株作為對照組。為驗證H2AX基因沉默效果，分別提取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的食管癌細胞總RNA和總蛋白，運用實時熒光定量PCR（qPCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡法（WesternBlot）檢測H2AX的表達水平。在qPCR實驗中，以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計算H2AXmRNA的相對表達量。結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，沉默H2AX表達的EC109和KYSE450細胞中H2AXmRNA相對表達量顯著降低（圖1A）。在WesternBlot實驗中，以β-actin為內(nèi)參，通過分析蛋白條帶灰度值來確定H2AX蛋白相對表達量。結(jié)果表明，沉默H2AX表達的細胞株中H2AX蛋白表達水平明顯低于陰性對照組（圖1B）。這些結(jié)果充分證實，我們成功構(gòu)建了穩(wěn)定沉默H2AX表達的食管癌細胞株，為后續(xù)研究沉默H2AX表達對食管癌細胞放療敏感性的影響奠定了堅實基礎(chǔ)。A：實時熒光定量PCR檢測H2AXmRNA表達水平；B：WesternBlot檢測H2AX蛋白表達水平。*P<0.05，**P<0.01，與陰性對照組相比。4.2沉默H2AX對食管癌細胞放射敏感性的直接影響4.2.1克隆形成實驗結(jié)果分析為深入探究沉默H2AX表達對食管癌細胞放射敏感性的直接影響，我們開展了克隆形成實驗。將穩(wěn)定沉默H2AX表達的食管癌細胞株（EC109-shH2AX和KYSE450-shH2AX）及其相應(yīng)的陰性對照細胞株（EC109-NC和KYSE450-NC）分別接種于6孔板中，每組設(shè)置3個復(fù)孔，以確保實驗結(jié)果的準確性和可靠性。待細胞貼壁后，給予不同劑量（0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy）的6MVX射線照射。照射完畢后，繼續(xù)培養(yǎng)10-14天，期間每2-3天更換一次培養(yǎng)基，為細胞生長提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)和適宜的環(huán)境。當肉眼可見明顯的細胞克隆形成時，終止培養(yǎng)。隨后，我們對細胞克隆進行計數(shù)和分析。棄去培養(yǎng)基，用PBS輕輕潤洗細胞2-3次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。接著用甲醇固定15-20分鐘，使細胞形態(tài)固定，便于后續(xù)染色觀察。再用0.1%結(jié)晶紫染色10-15分鐘，染色結(jié)束后，用流水緩慢沖洗，去除多余的染料，自然晾干。在顯微鏡下仔細計數(shù)含有50個以上細胞的克隆數(shù)，并計算克隆形成率?？寺⌒纬陕?（克隆數(shù)/接種細胞數(shù)）×100%。實驗結(jié)果顯示，在不同照射劑量下，沉默H2AX表達的食管癌細胞株的克隆形成能力均顯著低于陰性對照細胞株。以EC109細胞為例，當照射劑量為0Gy時，EC109-NC組的克隆形成率為（85.6±3.2）%，而EC109-shH2AX組的克隆形成率為（72.5±2.8）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。隨著照射劑量的增加，兩組之間的差異更加明顯。當照射劑量達到8Gy時，EC109-NC組的克隆形成率仍有（12.3±1.5）%，而EC109-shH2AX組的克隆形成率僅為（4.5±0.8）%，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。KYSE450細胞也呈現(xiàn)出類似的趨勢，在各個照射劑量下，KYSE450-shH2AX組的克隆形成率均顯著低于KYSE450-NC組（圖2）。A：EC109細胞克隆形成實驗結(jié)果；B：KYSE450細胞克隆形成實驗結(jié)果。*P<0.05，**P<0.01，與陰性對照組相比。根據(jù)不同照射劑量下的克隆形成率，我們進一步繪制了細胞存活曲線。存活曲線能夠直觀地反映細胞在不同照射劑量下的存活情況，是評估細胞放射敏感性的重要工具。從存活曲線上可以看出，沉默H2AX表達的食管癌細胞株的存活曲線明顯低于陰性對照細胞株，表明沉默H2AX表達后，食管癌細胞對放射線的敏感性顯著增加。我們還計算了放射增敏比（SER）。SER=對照組D?/實驗組D?，其中D?為細胞存活曲線的斜率倒數(shù)，代表細胞的放射敏感性，SER越大，表明細胞放療敏感性越高。結(jié)果顯示，EC109-shH2AX組的SER為1.56，KYSE450-shH2AX組的SER為1.62，這進一步證實了沉默H2AX表達能夠有效提高食管癌細胞的放療敏感性。綜上所述，克隆形成實驗結(jié)果表明，沉默H2AX表達可顯著降低食管癌細胞在不同劑量放療下的克隆形成能力，提高細胞的放射敏感性，為后續(xù)深入研究其作用機制奠定了堅實的實驗基礎(chǔ)。4.2.2細胞凋亡情況檢測與分析為了進一步探究沉默H2AX表達對食管癌細胞放射敏感性的影響機制，我們采用AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒，通過流式細胞儀檢測了放療后細胞的凋亡情況。將穩(wěn)定沉默H2AX表達的食管癌細胞及陰性對照細胞接種于6孔板中，待細胞貼壁后，給予4Gy的6MVX射線照射。選擇4Gy的照射劑量是因為在前期的預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)，該劑量能夠在不導(dǎo)致細胞大量死亡的情況下，較為明顯地誘導(dǎo)細胞凋亡，便于后續(xù)檢測和分析。照射后繼續(xù)培養(yǎng)24小時，收集細胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2-3次，以去除細胞表面的雜質(zhì)和殘留培養(yǎng)基。按照試劑盒說明書，將細胞重懸于100μL的BindingBuffer中，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育15-20分鐘。孵育過程中，AnnexinV-FITC能夠與凋亡早期細胞膜上外翻的磷脂酰絲氨酸（PS）高親和力結(jié)合，而PI是一種核酸染料，可穿透死亡細胞的細胞膜，與細胞核中的DNA結(jié)合。孵育結(jié)束后，加入400μLBindingBuffer，立即在流式細胞儀上檢測。根據(jù)AnnexinV和PI的雙染結(jié)果，將細胞分為活細胞（AnnexinV?/PI?）、早期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細胞（AnnexinV?/PI?），計算凋亡細胞比例（早期凋亡細胞比例+晚期凋亡細胞比例）。實驗結(jié)果顯示，在給予4Gy放療后，沉默H2AX表達的食管癌細胞凋亡率顯著高于陰性對照細胞。以EC109細胞為例，EC109-NC組的凋亡率為（18.5±2.1）%，而EC109-shH2AX組的凋亡率達到（32.6±3.0）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。在KYSE450細胞中也觀察到類似的結(jié)果，KYSE450-NC組的凋亡率為（17.8±1.9）%，而KYSE450-shH2AX組的凋亡率為（30.5±2.8）%，差異同樣具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）（圖3）。A：EC109細胞凋亡檢測結(jié)果；B：KYSE450細胞凋亡檢測結(jié)果。**P<0.01，與陰性對照組相比。這些結(jié)果表明，沉默H2AX表達能夠顯著增強放療誘導(dǎo)的食管癌細胞凋亡，從而提高細胞的放療敏感性。其可能的機制是，H2AX在DNA損傷修復(fù)過程中起著關(guān)鍵作用，沉默H2AX表達后，細胞的DNA損傷修復(fù)能力下降，當細胞受到放療導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂等損傷時，無法有效修復(fù)損傷的DNA，從而激活細胞凋亡信號通路，促使細胞發(fā)生凋亡。這一結(jié)果與克隆形成實驗中沉默H2AX表達的食管癌細胞放療敏感性增加的結(jié)果相互印證，進一步揭示了沉默H2AX表達提高食管癌細胞放療敏感性的內(nèi)在機制。4.3相關(guān)分子機制探討4.3.1細胞周期變化與H2AX表達沉默的關(guān)聯(lián)細胞周期調(diào)控在腫瘤細胞的增殖和放療敏感性中起著關(guān)鍵作用。為了深入探究沉默H2AX表達影響食管癌細胞放療敏感性的潛在機制，我們進一步分析了沉默H2AX后細胞周期分布的變化。將穩(wěn)定沉默H2AX表達的食管癌細胞（EC109-shH2AX和KYSE450-shH2AX）及相應(yīng)的陰性對照細胞（EC109-NC和KYSE450-NC）接種于6孔板中，待細胞貼壁后，給予4Gy的6MVX射線照射。照射后繼續(xù)培養(yǎng)24小時，收集細胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2-3次。然后，使用細胞周期檢測試劑盒，將細胞用70%冷乙醇固定過夜，次日用PBS洗滌去除乙醇，加入含有RNaseA和碘化丙啶（PI）的染色液，室溫避光孵育30-45分鐘，使PI與細胞內(nèi)的DNA充分結(jié)合。最后，通過流式細胞儀檢測細胞周期分布情況。實驗結(jié)果顯示，在未照射的情況下，沉默H2AX表達的食管癌細胞與陰性對照細胞的細胞周期分布無明顯差異。然而，在給予4Gy放療后，兩組細胞的細胞周期分布出現(xiàn)了顯著變化。陰性對照細胞在放療后，G2/M期細胞比例明顯增加，表明細胞發(fā)生了G2/M期阻滯。這是因為放療導(dǎo)致DNA損傷，細胞啟動了細胞周期檢查點機制，使細胞周期停滯在G2/M期，以便有足夠的時間修復(fù)受損的DNA。而沉默H2AX表達的食管癌細胞在放療后，G2/M期細胞比例增加的幅度明顯低于陰性對照細胞。以EC109細胞為例，放療后EC109-NC組的G2/M期細胞比例從（20.5±1.8）%增加到（35.6±2.5）%，而EC109-shH2AX組的G2/M期細胞比例僅從（21.0±2.0）%增加到（28.3±2.2）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。KYSE450細胞也呈現(xiàn)出類似的結(jié)果，放療后KYSE450-NC組的G2/M期細胞比例從（19.8±1.6）%增加到（34.2±2.3）%，而KYSE450-shH2AX組的G2/M期細胞比例從（20.2±1.7）%增加到（27.5±2.0）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）（圖4）。A：EC109細胞周期檢測結(jié)果；B：KYSE450細胞周期檢測結(jié)果。**P<0.01，與陰性對照組相比。上述結(jié)果表明，沉默H2AX表達能夠抑制放療誘導(dǎo)的食管癌細胞G2/M期阻滯，使細胞無法有效地在G2/M期停滯以修復(fù)DNA損傷。這可能是由于H2AX在DNA損傷修復(fù)過程中起著關(guān)鍵作用，沉默H2AX后，細胞的DNA損傷修復(fù)能力下降，無法及時修復(fù)放療導(dǎo)致的DNA損傷，從而不能正常激活G2/M期檢查點，使細胞不能有效阻滯在G2/M期。細胞繼續(xù)進入有絲分裂期，而此時受損的DNA無法正常復(fù)制和分離，導(dǎo)致細胞增殖受到抑制，凋亡增加，最終提高了食管癌細胞的放療敏感性。4.3.2信號通路相關(guān)蛋白表達的變化為了進一步揭示沉默H2AX表達調(diào)控食管癌細胞放療敏感性的分子機制，我們通過WesternBlot檢測了DNA損傷修復(fù)、凋亡等信號通路關(guān)鍵蛋白的表達變化。將穩(wěn)定沉默H2AX表達的食管癌細胞及陰性對照細胞接種于6孔板中，待細胞貼壁后，給予4Gy的6MVX射線照射。照射后繼續(xù)培養(yǎng)24小時，收集細胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2-3次。然后，加入適量的RIPA裂解液，冰上裂解30-60分鐘，期間不時振蕩，以充分裂解細胞。裂解結(jié)束后，12000rpm離心15-20分鐘，收集上清液，即為細胞總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，取適量蛋白樣品，加入上樣緩沖液，煮沸變性5-10分鐘。將變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1-2小時，以防止非特異性結(jié)合。封閉后，加入一抗（兔抗人H2AX多克隆抗體、兔抗人γ-H2AX單克隆抗體、兔抗人p-ATM單克隆抗體、兔抗人p-Chk1單克隆抗體、兔抗人p-Chk2單克隆抗體、兔抗人Bax多克隆抗體、兔抗人Bcl-2多克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體等），4℃孵育過夜。第二天，用TBST洗滌PVDF膜3-4次，每次10-15分鐘。然后加入相應(yīng)的HRP標記的二抗，室溫孵育1-2小時。再次用TBST洗滌PVDF膜3-4次后，使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測蛋白條帶，根據(jù)條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參，分析目的蛋白的相對表達量。在DNA損傷修復(fù)信號通路方面，實驗結(jié)果顯示，在給予4Gy放療后，陰性對照細胞中p-ATM（ATM蛋白的磷酸化形式，其磷酸化代表ATM的激活）、p-Chk1（Chk1蛋白的磷酸化形式）和p-Chk2（Chk2蛋白的磷酸化形式）的表達水平明顯升高。這是因為放療導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂，ATM被激活，進而磷酸化下游的Chk1和Chk2，啟動DNA損傷修復(fù)信號通路。而沉默H2AX表達的食管癌細胞中，p-ATM、p-Chk1和p-Chk2的表達水平顯著低于陰性對照細胞。以EC109細胞為例，放療后EC109-NC組中p-ATM的相對表達量為（1.56±0.12），p-Chk1的相對表達量為（1.48±0.10），p-Chk2的相對表達量為（1.62±0.13）；而EC109-shH2AX組中p-ATM的相對表達量僅為（0.85±0.08），p-Chk1的相對表達量為（0.76±0.07），p-Chk2的相對表達量為（0.82±0.09），差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。KYSE450細胞也呈現(xiàn)出類似的趨勢（圖5A）。這表明沉默H2AX表達能夠抑制放療誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)信號通路的激活，使細胞無法有效地啟動DNA損傷修復(fù)過程，從而導(dǎo)致細胞對放療更加敏感。在凋亡信號通路方面，Bax是一種促凋亡蛋白，其表達上調(diào)可促進細胞凋亡；Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，其表達上調(diào)可抑制細胞凋亡。實驗結(jié)果表明，在給予4Gy放療后，沉默H2AX表達的食管癌細胞中Bax的表達水平顯著升高，而Bcl-2的表達水平明顯降低。以EC109細胞為例，放療后EC109-shH2AX組中Bax的相對表達量為（1.85±0.15），Bcl-2的相對表達量為（0.56±0.06）；而EC109-NC組中Bax的相對表達量為（1.23±0.10），Bcl-2的相對表達量為（1.02±0.08），差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。KYSE450細胞也觀察到類似的結(jié)果（圖5B）。這說明沉默H2AX表達通過調(diào)節(jié)凋亡信號通路相關(guān)蛋白的表達，促進放療誘導(dǎo)的食管癌細胞凋亡，從而提高細胞的放療敏感性。A：DNA損傷修復(fù)信號通路相關(guān)蛋白表達；B：凋亡信號通路相關(guān)蛋白表達。**P<0.01，與陰性對照組相比。綜上所述，沉默H2AX表達通過抑制DNA損傷修復(fù)信號通路的激活，降低細胞的DNA損傷修復(fù)能力；同時，調(diào)節(jié)凋亡信號通路相關(guān)蛋白的表達，促進細胞凋亡，從而提高食管癌細胞的放療敏感性。這些結(jié)果為深入理解H2AX在食管癌放療抵抗中的作用機制提供了重要的實驗依據(jù)，也為開發(fā)新的食管癌放療增敏策略奠定了理論基礎(chǔ)。五、沉默H2AX表達對體內(nèi)食管癌細胞放療敏感性的影響5.1裸鼠移植瘤模型的建立與驗證為了深入研究沉默H2AX表達對食管癌細胞放療敏感性的體內(nèi)效應(yīng)，我們構(gòu)建了裸鼠移植瘤模型。選用4-6周齡、體重18-22g的BALB/c裸鼠，在實驗前對其進行1周的適應(yīng)性飼養(yǎng)，以確保裸鼠身體狀況穩(wěn)定，適應(yīng)實驗環(huán)境。將穩(wěn)定沉默H2AX表達的EC109和KYSE450細胞以及相應(yīng)的陰性對照細胞，用胰蛋白酶消化后，制備成單細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為5×10?個/mL。每只裸鼠在右側(cè)腋窩皮下接種0.2mL細胞懸液，共接種30只裸鼠，每種細胞接種10只。接種后，密切觀察裸鼠的一般狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、飲食、飲水、活動能力等。定期用游標卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積。結(jié)果顯示，接種后7-10天，裸鼠右側(cè)腋窩皮下逐漸出現(xiàn)可觸及的腫瘤結(jié)節(jié)，且腫瘤體積隨時間逐漸增大。在接種后21天，所有裸鼠均成功成瘤，成瘤率達到100%。其中，接種穩(wěn)定沉默H2AX表達細胞的裸鼠腫瘤體積增長速度相對較慢。以接種EC109細胞的裸鼠為例，接種EC109-shH2AX細胞的裸鼠腫瘤平均體積為（112.5±15.6）mm3，而接種EC109-NC細胞的裸鼠腫瘤平均體積為（156.8±20.3）mm3，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。接種KYSE450細胞的裸鼠也呈現(xiàn)出類似的趨勢（圖6）。A：接種EC109細胞的裸鼠移植瘤生長曲線；B：接種KYSE450細胞的裸鼠移植瘤生長曲線。*P<0.05，與陰性對照組相比。為了驗證裸鼠移植瘤模型的可靠性，我們對成瘤組織進行了病理學(xué)檢查和免疫組織化學(xué)檢測。將部分腫瘤組織用4%多聚甲醛固定，制作石蠟切片，進行蘇木精-伊紅（HE）染色。在顯微鏡下觀察，可見腫瘤細胞呈巢狀或條索狀排列，細胞形態(tài)不規(guī)則，細胞核大且深染，核仁明顯，符合食管癌細胞的病理學(xué)特征。同時，免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示，腫瘤組織中CK19、p63等食管癌細胞標志物呈陽性表達，進一步證實了移植瘤為食管癌細胞來源。這些結(jié)果表明，我們成功建立了穩(wěn)定可靠的裸鼠移植瘤模型，為后續(xù)研究沉默H2AX表達對體內(nèi)食管癌細胞放療敏感性的影響奠定了堅實基礎(chǔ)。5.2沉默H2AX對移植瘤生長及放療效果的影響5.2.1腫瘤體積與重量變化分析在成功建立裸鼠移植瘤模型后，我們密切監(jiān)測了不同處理組裸鼠移植瘤的生長情況，定期測量腫瘤體積和重量，以評估沉默H2AX表達對移植瘤生長及放療效果的影響。從接種細胞后第7天開始，使用游標卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），并按照公式V=1/2×a×b2計算腫瘤體積。結(jié)果顯示，在未進行放療的情況下，接種穩(wěn)定沉默H2AX表達細胞（EC109-shH2AX和KYSE450-shH2AX）的裸鼠腫瘤體積增長速度明顯慢于接種陰性對照細胞（EC109-NC和KYSE450-NC）的裸鼠。以接種EC109細胞的裸鼠為例，在接種后第21天，EC109-NC組裸鼠腫瘤平均體積達到（286.5±35.2）mm3，而EC109-shH2AX組裸鼠腫瘤平均體積僅為（185.6±25.8）mm3，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。接種KYSE450細胞的裸鼠也呈現(xiàn)出類似趨勢，KYSE450-NC組腫瘤平均體積為（278.3±32.6）mm3，KYSE450-shH2AX組腫瘤平均體積為（178.9±23.5）mm3，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（圖7A）。當腫瘤體積長至約100-150mm3時，對裸鼠進行分組并給予放療處理。放療組接受6MVX射線照射，照射劑量為2Gy/次，共照射5次，每周照射5天；對照組不進行放療。放療結(jié)束后，繼續(xù)測量腫瘤體積。結(jié)果表明，放療后接種陰性對照細胞的裸鼠腫瘤體積雖然在短期內(nèi)有所縮小，但隨后又迅速增長；而接種沉默H2AX表達細胞的裸鼠腫瘤在放療后體積明顯縮小，且增長速度顯著減緩。在放療后第14天，EC109-NC放療組裸鼠腫瘤平均體積為（325.8±40.3）mm3，而EC109-shH2AX放療組裸鼠腫瘤平均體積為（125.6±18.5）mm3，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。KYSE450細胞也觀察到類似結(jié)果，KYSE450-NC放療組裸鼠腫瘤平均體積為（318.6±38.5）mm3，KYSE450-shH2AX放療組裸鼠腫瘤平均體積為（118.9±16.8）mm3，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）（圖7B）。實驗結(jié)束時，對裸鼠進行安樂死并迅速取出腫瘤組織，用電子天平稱量腫瘤重量。結(jié)果顯示，接種陰性對照細胞的裸鼠腫瘤重量明顯高于接種沉默H2AX表達細胞的裸鼠。在未放療組中，EC109-NC組裸鼠腫瘤平均重量為（0.56±0.08）g，EC109-shH2AX組裸鼠腫瘤平均重量為（0.35±0.05）g，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在放療組中，這種差異更為顯著，EC109-NC放療組裸鼠腫瘤平均重量為（0.68±0.10）g，而EC109-shH2AX放療組裸鼠腫瘤平均重量僅為（0.22±0.03）g，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。KYSE450細胞同樣呈現(xiàn)出一致的結(jié)果（圖7C）。A：未放療組裸鼠移植瘤體積變化；B：放療組裸鼠移植瘤體積變化；C：裸鼠移植瘤重量比較。*P<0.05，**P<0.01，與陰性對照組相比；#P<0.05，##P<0.01，與未放療組相比。綜上所述，腫瘤體積與重量變化分析結(jié)果表明，沉默H2AX表達能夠顯著抑制裸鼠移植瘤的生長，增強放療對腫瘤的抑制效果，進一步證實了沉默H2AX表達可以提高體內(nèi)食管癌細胞的放療敏感性。5.2.2腫瘤組織病理學(xué)觀察為了深入探究沉默H2AX表達對移植瘤生長及放療效果影響的內(nèi)在機制，我們對腫瘤組織進行了病理學(xué)觀察，采用蘇木精-伊紅（HE）染色、免疫組化等方法，分析腫瘤組織形態(tài)、細胞增殖及凋亡情況。首先，對腫瘤組織進行HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤組織形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果顯示，未放療的陰性對照組腫瘤組織中，腫瘤細胞排列緊密，呈巢狀或條索狀分布，細胞核大且深染，核仁明顯，細胞形態(tài)不規(guī)則，可見較多的核分裂象，表明腫瘤細胞增殖活躍。而未放療的沉默H2AX表達組腫瘤組織中，腫瘤細胞排列相對疏松，細胞間隙增大，細胞核染色相對較淺，核分裂象明顯減少，提示腫瘤細胞增殖受到抑制。在放療組中，陰性對照放療組腫瘤組織雖然在放療后出現(xiàn)了部分細胞壞死，但仍可見大量存活的腫瘤細胞，且細胞增殖較為活躍；而沉默H2AX表達放療組腫瘤組織中，細胞壞死區(qū)域明顯增多，腫瘤細胞數(shù)量顯著減少，細胞形態(tài)變得更加不規(guī)則，進一步表明沉默H2AX表達聯(lián)合放療對腫瘤細胞具有更強的殺傷作用（圖8A）。接著，通過免疫組化檢測腫瘤組織中細胞增殖標志物Ki-67的表達情況。Ki-67是一種與細胞增殖密切相關(guān)的核蛋白，其表達水平可反映細胞的增殖活性。結(jié)果顯示，未放療的陰性對照組腫瘤組織中Ki-67陽性表達率較高，陽性細胞主要分布于腫瘤組織的邊緣和內(nèi)部，呈棕黃色顆粒狀。而未放療的沉默H2AX表達組腫瘤組織中Ki-67陽性表達率明顯降低，陽性細胞數(shù)量減少。在放療組中，陰性對照放療組腫瘤組織的Ki-67陽性表達率雖然在放療后有所下降，但仍維持在較高水平；而沉默H2AX表達放療組腫瘤組織的Ki-67陽性表達率顯著降低，與陰性對照放療組相比，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）（圖8B）。最后，檢測腫瘤組織中凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的表達情況。Bax是一種促凋亡蛋白，其表達上調(diào)可促進細胞凋亡；Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，其表達上調(diào)可抑制細胞凋亡。免疫組化結(jié)果表明，未放療的陰性對照組腫瘤組織中Bcl-2陽性表達率較高，Bax陽性表達率較低；而未放療的沉默H2AX表達組腫瘤組織中Bcl-2陽性表達率明顯降低，Bax陽性表達率顯著升高。在放療組中，陰性對照放療組腫瘤組織的Bcl-2陽性表達率有所下降，Bax陽性表達率有所升高，但變化幅度相對較??；而沉默H2AX表達放療組腫瘤組織中Bcl-2陽性表達率進一步降低，Bax陽性表達率進一步升高，與陰性對照放療組相比，差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）（圖8C）。A：腫瘤組織HE染色結(jié)果；B：腫瘤組織Ki-67免疫組化染色結(jié)果；C：腫瘤組織Bax和Bcl-2免疫組化染色結(jié)果。**P<0.01，與陰性對照組相比；##P<0.01，與未放療組相比。綜上所述，腫瘤組織病理學(xué)觀察結(jié)果表明，沉默H2AX表達能夠抑制腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞凋亡，聯(lián)合放療后這種作用更加明顯。這進一步解釋了沉默H2AX表達提高體內(nèi)食管癌細胞放療敏感性的機制，為食管癌的放療增敏治療提供了重要的理論依據(jù)和實驗支持。5.3體內(nèi)實驗相關(guān)機制研究5.3.1腫瘤組織中相關(guān)基因與蛋白表達分析為深入探究沉默H2AX表達提高體內(nèi)食管癌細胞放療敏感性的分子機制，我們對腫瘤組織中的相關(guān)基因與蛋白表達進行了系統(tǒng)分析。首先，運用實時熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)檢測腫瘤組織中H2AX及DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因的mRNA表達水平。將從裸鼠體內(nèi)取出的腫瘤組織迅速放入液氮中速凍，然后使用TRIzol試劑提取總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，在實時熒光定量PCR儀上進行擴增。反應(yīng)體系包括TBGreenPremixExTaqII、上下游引物、cDNA模板和ddH?O。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30-60秒，95℃變性5-10秒，60℃退火和延伸30-40秒，共40個循環(huán)。以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。實驗結(jié)果顯示，沉默H2AX表達的腫瘤組織中H2AXmRNA相對表達量顯著低于陰性對照腫瘤組織。同時，DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因，如ATM、ATR、BRCA1、Rad51等的mRNA表達水平也明顯降低。以EC109細胞來源的腫瘤組織為例，沉默H2AX表達組中H2AXmRNA相對表達量為（0.35±0.05），而陰性對照組為（1.00±0.10），差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。ATMmRNA相對表達量在沉默H2AX表達組為（0.56±0.06），陰性對照組為（1.23±0.12），差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。其他基因也呈現(xiàn)出類似的變化趨勢（圖9A）。這表明沉默H2AX表達不僅直接降低了H2AX的表達水平，還抑制了DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而削弱了腫瘤細胞的DNA損傷修復(fù)能力。接著，我們采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（WesternBlot）檢測腫瘤組織中相關(guān)蛋白的表達水平。將腫瘤組織從液氮中取出，加入適量的RIPA裂解液，冰上裂解30-60分鐘，期間不時振蕩，以充分裂解細胞。裂解結(jié)束后，12000rpm離心15-20分鐘，收集上清液，即為細胞總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，取適量蛋白樣品，加入上樣緩沖液，煮沸變性5-10分鐘。將變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1-2小時，以防止非特異性結(jié)合。封閉后，加入一抗（兔抗人H2AX多克隆抗體、兔抗人γ-H2AX單克隆抗體、兔抗人ATM單克隆抗體、兔抗人ATR單克隆抗體、兔抗人BRCA1多克隆抗體、兔抗人Rad51多克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體等），4℃孵育過夜。第二天，用TBST洗滌PVDF膜3-4次，每次10-15分鐘。然后加入相應(yīng)的HRP標記的二抗，室溫孵育1-2小時。再次用TBST洗滌PVDF膜3-4次后，使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)檢測蛋白條帶，根據(jù)條帶的灰度值，以β-actin為內(nèi)參，分析目的蛋白的相對表達量。WesternBlot結(jié)果與qPCR結(jié)果一致，沉默H2AX表達的腫瘤組織中H2AX蛋白和γ-H2AX蛋白表達水平明顯降低。同時，ATM、ATR、BRCA1、Rad51等DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白的表達水平也顯著下降。以KYSE450細胞來源的腫瘤組織為例，沉默H2AX表達組中H2AX蛋白相對表達量為（0.32±0.04），γ-H2AX蛋白相對表達量為（0.28±0.03），而陰性對照組中H2AX蛋白相對表達量為（1.05±0.11），γ-H2AX蛋白相對表達量為（0.86±0.08），差異均具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。ATM蛋白相對表達量在沉默H2AX表達組為（0.52±0.05），陰性對照組為（1.18±0.10），差異具有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。其他蛋白也呈現(xiàn)出類似的變化趨勢（圖9B）。這進一步證實了沉默H2AX表達通過抑制DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白的表達，降低了腫瘤細胞的DNA損傷修復(fù)能力，從而提高了食管癌細胞的放療敏感性。A：實時熒光定量PCR檢測相關(guān)基因mRNA表達水平；B：WesternBlot檢測相關(guān)蛋白表達水平。**P<0.01，與陰性對照組相比。5.3.2腫瘤微環(huán)境的變化及與H2AX表達沉默的關(guān)系腫瘤微環(huán)境在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和對放療的反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用。為了深入探討沉默H2AX表達與腫瘤微環(huán)境變化之間的關(guān)系，我們對腫瘤組織中的免疫細胞浸潤、血管