VIPR1在肺腺癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征的相關(guān)性研究：潛在的預(yù)后與治療靶點探索一、引言1.1研究背景肺癌作為全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率均位居前列的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類的健康。據(jù)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的最新數(shù)據(jù)顯示，2020年全球肺癌新發(fā)病例約220萬，死亡病例約180萬，分別占所有惡性腫瘤的11.4%和18.0%。其中，肺腺癌作為肺癌的主要亞型之一，近年來其發(fā)病率呈持續(xù)上升趨勢，在我國，肺腺癌約占肺癌總數(shù)的50%以上，已成為肺癌研究領(lǐng)域的重點關(guān)注對象。肺腺癌的發(fā)生發(fā)展是一個涉及多基因、多信號通路異常激活或失活的復(fù)雜過程。盡管在過去幾十年中，針對肺腺癌的診斷和治療取得了一定進(jìn)展，如手術(shù)技術(shù)的改進(jìn)、化療藥物的更新以及靶向治療和免疫治療的興起，顯著提高了部分患者的生存率和生活質(zhì)量。然而，由于肺腺癌發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，早期診斷困難，且部分患者對現(xiàn)有治療手段存在耐藥性，導(dǎo)致肺腺癌患者的總體預(yù)后仍然較差，5年生存率僅為15%-20%左右。因此，深入探究肺腺癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的診斷標(biāo)志物和治療靶點，對于提高肺腺癌的早期診斷率、改善患者預(yù)后具有重要的臨床意義。血管活性腸肽受體1（VIPR1）作為G蛋白偶聯(lián)受體超家族的重要成員，廣泛分布于人體多種組織和器官中，包括肺組織。VIPR1主要通過與內(nèi)源性配體血管活性腸肽（VIP）特異性結(jié)合，激活下游一系列復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如cAMP/PKA、PLC/PKC等，在調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、遷移以及免疫調(diào)節(jié)等生理病理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。已有研究表明，VIPR1在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)異常表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。例如，在乳腺癌中，VIPR1的高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖活性增強(qiáng)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及患者預(yù)后不良顯著相關(guān)；在結(jié)直腸癌中，VIPR1通過激活PI3K/AKT信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。然而，目前關(guān)于VIPR1在肺腺癌組織中的表達(dá)情況及其與肺腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系，尚缺乏系統(tǒng)深入的研究。綜上所述，本研究旨在通過檢測VIPR1在肺腺癌組織及癌旁正常肺組織中的表達(dá)水平，并進(jìn)一步分析其與肺腺癌患者臨床病理特征（如年齡、性別、腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等）之間的相關(guān)性，初步探討VIPR1在肺腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的潛在作用機(jī)制，為肺腺癌的早期診斷、預(yù)后評估以及靶向治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶點。1.2研究目的與意義本研究旨在通過檢測VIPR1在肺腺癌組織及癌旁正常肺組織中的表達(dá)水平，分析其與肺腺癌患者臨床病理特征（如年齡、性別、腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等）之間的相關(guān)性，初步探討VIPR1在肺腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的潛在作用機(jī)制。從理論意義來看，深入研究VIPR1在肺腺癌中的表達(dá)及作用機(jī)制，有助于揭示肺腺癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，進(jìn)一步完善對肺腺癌發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識，為后續(xù)的基礎(chǔ)研究提供新的思路和方向。目前，雖然對肺腺癌的發(fā)病機(jī)制有了一定的了解，但仍存在許多未知領(lǐng)域。通過研究VIPR1這一潛在的關(guān)鍵分子，有望發(fā)現(xiàn)新的信號通路和分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，填補(bǔ)該領(lǐng)域在基礎(chǔ)研究方面的部分空白。在臨床應(yīng)用價值上，若VIPR1的表達(dá)與肺腺癌的臨床病理特征存在顯著相關(guān)性，那么它有可能成為肺腺癌早期診斷的新型生物標(biāo)志物。早期診斷對于提高肺腺癌患者的治愈率和生存率至關(guān)重要，目前臨床上常用的診斷方法如影像學(xué)檢查、腫瘤標(biāo)志物檢測等存在一定的局限性。若能將VIPR1作為新的診斷指標(biāo)，結(jié)合現(xiàn)有的診斷手段，可提高早期診斷的準(zhǔn)確性，有助于患者的早期干預(yù)和治療。此外，VIPR1還可能作為評估肺腺癌患者預(yù)后的重要指標(biāo)。通過檢測患者體內(nèi)VIPR1的表達(dá)水平，醫(yī)生能夠更準(zhǔn)確地預(yù)測患者的病情發(fā)展和生存情況，從而為制定個性化的治療方案提供依據(jù)。對于預(yù)后較差的患者，可及時調(diào)整治療策略，加強(qiáng)治療強(qiáng)度；對于預(yù)后較好的患者，則可適當(dāng)減少不必要的治療，降低患者的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。從治療角度而言，若證實VIPR1在肺腺癌的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用，它將有望成為肺腺癌靶向治療的新靶點，為開發(fā)新型靶向治療藥物提供理論基礎(chǔ)，推動肺腺癌治療領(lǐng)域的發(fā)展，為患者帶來更多的治療選擇和生存希望。二、VIPR1與肺腺癌的理論基礎(chǔ)2.1VIPR1概述2.1.1VIPR1基因與蛋白結(jié)構(gòu)VIPR1基因，全稱血管活性腸肽受體1（vasoactiveintestinalpeptidereceptor1）基因，定位于人類染色體3p22.1位置。作為蛋白編碼基因，其編碼的蛋白質(zhì)是血管活性腸肽（VIP）的特異性受體。在基因結(jié)構(gòu)層面，VIPR1基因包含多個外顯子和內(nèi)含子，不同外顯子的組合拼接可產(chǎn)生多種轉(zhuǎn)錄本，進(jìn)而翻譯出具有不同結(jié)構(gòu)和功能特性的蛋白質(zhì)亞型。這種復(fù)雜的基因結(jié)構(gòu)為VIPR1在不同組織和生理病理條件下發(fā)揮多樣化功能奠定了基礎(chǔ)。從蛋白質(zhì)層面來看，VIPR1蛋白屬于G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）超家族成員，具有典型的七跨膜結(jié)構(gòu)域。其N端位于細(xì)胞外，負(fù)責(zé)與配體VIP的識別與結(jié)合；C端位于細(xì)胞內(nèi)，與G蛋白相互作用，介導(dǎo)信號的跨膜傳遞。在細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，存在多個糖基化位點，這些糖基化修飾對于維持受體的正確構(gòu)象、穩(wěn)定性以及與配體的親和力具有重要作用。而細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域則包含多個磷酸化位點，在受體激活后，可被多種蛋白激酶磷酸化，進(jìn)一步調(diào)節(jié)受體的活性和下游信號通路的傳遞。VIPR1所屬的VIP受體家族，除了VIPR1之外，還包括VIPR2（VPAC2）。雖然VIPR1和VIPR2都能與VIP結(jié)合，但它們在組織分布、親和力以及介導(dǎo)的生物學(xué)效應(yīng)上存在一定差異。例如，VIPR1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織中均有廣泛表達(dá)，而VIPR2在某些組織中的表達(dá)具有相對特異性；在親和力方面，VIP與VIPR1和VIPR2的結(jié)合親和力也有所不同，這導(dǎo)致它們在相同配體濃度下激活下游信號通路的程度和方式存在差異，進(jìn)而參與調(diào)控不同的生理過程。2.1.2VIPR1的功能與作用機(jī)制VIPR1的核心功能是作為VIP的受體，介導(dǎo)VIP的生物學(xué)效應(yīng)。VIP作為一種廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織中的神經(jīng)肽，在機(jī)體的生理調(diào)節(jié)中扮演著關(guān)鍵角色，涉及神經(jīng)調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)、心血管調(diào)節(jié)等多個方面。而VIPR1通過與VIP特異性結(jié)合，將細(xì)胞外的信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)，從而激活一系列復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，實現(xiàn)對細(xì)胞功能的精細(xì)調(diào)控。當(dāng)VIP與VIPR1結(jié)合后，首先觸發(fā)的是G蛋白偶聯(lián)過程。由于VIPR1是G蛋白偶聯(lián)受體，其與VIP結(jié)合后，受體發(fā)生構(gòu)象變化，進(jìn)而與G蛋白相互作用并使其激活。激活的G蛋白進(jìn)一步激活腺苷酸環(huán)化酶（AC），AC催化ATP轉(zhuǎn)化為環(huán)磷酸腺苷（cAMP），導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cAMP水平顯著升高。cAMP作為重要的第二信使，可激活蛋白激酶A（PKA），PKA通過對下游多種效應(yīng)分子進(jìn)行磷酸化修飾，如轉(zhuǎn)錄因子、離子通道蛋白、代謝酶等，從而調(diào)控細(xì)胞的基因表達(dá)、離子轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝活動等多種生物學(xué)功能。在某些情況下，VIPR1還能激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路。這一過程涉及一系列激酶的級聯(lián)激活，如Ras、Raf、MEK和ERK等。激活后的MAPK可進(jìn)入細(xì)胞核，磷酸化特定的轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)與細(xì)胞增殖、分化、存活相關(guān)基因的表達(dá)，從而在細(xì)胞的生長發(fā)育以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。此外，VIPR1還可能通過與其他信號通路之間的交互作用，如磷脂酶C（PLC）/蛋白激酶C（PKC）信號通路等，進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)行為，形成一個復(fù)雜而精細(xì)的信號調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。2.2肺腺癌概述2.2.1肺腺癌的病理特征肺腺癌本質(zhì)上屬于惡性上皮性腫瘤，其顯著的病理特征在于伴有腺樣分化或黏液產(chǎn)生。從起源角度來看，肺腺癌細(xì)胞的具體起源至今尚未完全明確，不過在發(fā)病部位上，雖然多數(shù)發(fā)生在肺外周部，但也有部分為中央型，甚至存在于支氣管內(nèi)。在組織形態(tài)方面，分化程度較高的肺腺癌細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)出多樣化，且具備明確的腺體或腺樣結(jié)構(gòu)。依據(jù)2015年世界衛(wèi)生組織（WHO）肺腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)，肺腺癌主要分為以下幾種常見的病理亞型：貼壁為主型，腫瘤細(xì)胞主要沿著肺泡壁貼壁生長，此型在肺腺癌中占比約為40%，通常分化程度良好，生長較為緩慢，轉(zhuǎn)移相對較晚，預(yù)后相對較好；腺泡為主型，腫瘤細(xì)胞形成典型的腺泡狀結(jié)構(gòu)，占比約30%，對放化療相對敏感，預(yù)后情況也較為可觀；乳頭為主型，腫瘤細(xì)胞構(gòu)建成乳頭狀結(jié)構(gòu)，占比大概10%，該型容易侵犯血管和淋巴管，從而導(dǎo)致預(yù)后相對較差；微乳頭為主型，腫瘤細(xì)胞呈微乳頭結(jié)構(gòu)，占比約5%，具有極強(qiáng)的侵襲性，極易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移，在各亞型中預(yù)后最差；實體為主型，腫瘤細(xì)胞緊密排列，呈現(xiàn)實體狀，占比約15%，此型分化程度差，同樣易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移，預(yù)后不佳。除了這些常見亞型外，還有一些較為罕見的亞型，如黏液型、腺樣囊性癌等。細(xì)胞學(xué)檢查在肺腺癌的診斷中起著關(guān)鍵作用。用于肺腺癌診斷的細(xì)胞學(xué)標(biāo)本來源豐富，主要包括氣管鏡刷檢、漿膜腔積液、細(xì)針穿刺、痰及支氣管灌洗等。通過對這些標(biāo)本進(jìn)行細(xì)致的形態(tài)學(xué)觀察，并結(jié)合免疫細(xì)胞化學(xué)（ICC）染色結(jié)果，可以實現(xiàn)對細(xì)胞學(xué)標(biāo)本的準(zhǔn)確診斷、分型以及細(xì)胞來源判斷，為臨床治療方案的制定提供重要依據(jù)。2.2.2肺腺癌的臨床特征與診療現(xiàn)狀肺腺癌在早期階段通常缺乏明顯的特異性癥狀，許多患者往往是在體檢或因其他原因進(jìn)行胸部影像學(xué)檢查時偶然發(fā)現(xiàn)。隨著病情的逐漸進(jìn)展，患者可能會出現(xiàn)一系列癥狀，咳嗽是較為常見的癥狀之一，多表現(xiàn)為刺激性干咳，且常規(guī)止咳藥物治療效果欠佳；咯血也時有發(fā)生，多為痰中帶血，少數(shù)患者可能出現(xiàn)大量咯血；胸痛也是常見癥狀，疼痛性質(zhì)多樣，可為隱痛、脹痛或刺痛等，疼痛程度和持續(xù)時間因人而異；部分患者還會出現(xiàn)發(fā)熱癥狀，多為低熱，體溫一般在38℃以下，抗生素治療效果不明顯。肺腺癌具有較強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，早期即可侵犯血管和淋巴管，進(jìn)而引發(fā)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其中胸膜是較為常見的轉(zhuǎn)移部位。當(dāng)肺腺癌發(fā)生胸膜轉(zhuǎn)移時，可導(dǎo)致患者出現(xiàn)胸痛、胸腔積液等癥狀，嚴(yán)重影響患者的呼吸功能和生活質(zhì)量。此外，肺腺癌還容易轉(zhuǎn)移至腦、骨、肝等重要器官，當(dāng)發(fā)生腦轉(zhuǎn)移時，患者可出現(xiàn)頭痛、頭暈、惡心、嘔吐、視力障礙、肢體偏癱等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀；骨轉(zhuǎn)移可引起轉(zhuǎn)移部位的疼痛、病理性骨折等；肝轉(zhuǎn)移則可能導(dǎo)致肝功能異常、黃疸、肝區(qū)疼痛等癥狀。在治療方面，目前肺腺癌的治療手段呈現(xiàn)多樣化。對于早期肺腺癌患者，手術(shù)切除是主要的治療方法，包括肺葉切除術(shù)、肺段切除術(shù)等，手術(shù)能夠直接切除腫瘤組織，有望達(dá)到根治的目的。對于中期肺腺癌患者，通常采用手術(shù)聯(lián)合化療、放療的綜合治療方案，化療可以通過使用化學(xué)藥物殺死殘留的腫瘤細(xì)胞，降低腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險；放療則利用高能射線對腫瘤部位進(jìn)行照射，進(jìn)一步殺滅腫瘤細(xì)胞。對于晚期肺腺癌患者，由于腫瘤已經(jīng)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，手術(shù)治療的意義相對較小，此時主要采用化療、靶向治療、免疫治療等全身治療手段。靶向治療是針對肺腺癌患者特定的基因突變，使用相應(yīng)的靶向藥物進(jìn)行治療，如針對表皮生長因子受體（EGFR）基因突變的吉非替尼、厄洛替尼等藥物，能夠精準(zhǔn)地作用于腫瘤細(xì)胞，抑制其生長和增殖，具有療效顯著、副作用相對較小的優(yōu)點；免疫治療則通過激活患者自身的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的識別和殺傷能力，如使用程序性死亡受體1（PD-1）抑制劑、程序性死亡配體1（PD-L1）抑制劑等，為晚期肺腺癌患者帶來了新的治療希望。然而，盡管肺腺癌的治療取得了一定進(jìn)展，但由于其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，部分患者對現(xiàn)有治療手段存在耐藥性，導(dǎo)致總體預(yù)后仍然不容樂觀，5年生存率有待進(jìn)一步提高。三、VIPR1在肺腺癌組織中的表達(dá)研究3.1研究材料與方法3.1.1實驗材料本研究收集了[具體醫(yī)院名稱]胸外科2019年1月至2021年12月期間手術(shù)切除的肺腺癌組織標(biāo)本80例，所有患者術(shù)前均未接受放療、化療或其他抗腫瘤治療。同時，選取距離腫瘤邊緣5cm以上的癌旁正常肺組織作為對照，共80例。標(biāo)本在手術(shù)切除后立即放入液氮中速凍，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。所有患者均簽署了知情同意書，本研究?jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（倫理批件號：[具體倫理批件號]）。實驗選用的肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H1299和PC9購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。A549細(xì)胞系來源于人肺腺癌組織，具有典型的上皮樣細(xì)胞形態(tài)，廣泛應(yīng)用于肺癌的基礎(chǔ)研究；H1299細(xì)胞系是從接受過放射治療的患者的肺淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中建立的，屬于非小細(xì)胞癌的大細(xì)胞癌亞型，其增殖能力、遷移和侵襲能力較強(qiáng)，常用于轉(zhuǎn)移機(jī)制與腫瘤侵襲研究；PC9細(xì)胞系來源于肺腺癌（分化型）組織，攜帶EGFR突變（19號外顯子缺失，delE746_A750），對EGFR抑制劑高度敏感，是肺腺癌中經(jīng)典的靶向治療研究模型。細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS，Gibco公司，美國）、1%青霉素-鏈霉素雙抗（Solarbio公司，中國）的RPMI-1640培養(yǎng)基（HyClone公司，美國）中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司，美國）中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時進(jìn)行傳代或?qū)嶒灐嶒炛杏玫降闹饕噭┌ǎ篢rizol試劑（Invitrogen公司，美國）用于RNA提取；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司，日本），將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；SYBRGreenMasterMix（Roche公司，瑞士），用于qPCR反應(yīng)，以定量檢測基因表達(dá)水平；兔抗人VIPR1多克隆抗體（Abcam公司，英國）、免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，中國），用于免疫組化實驗，檢測組織和細(xì)胞中VIPR1蛋白的表達(dá)情況；DAB顯色液（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，中國），在免疫組化實驗中用于顯色；其他常規(guī)試劑如氯仿、異丙醇、75%乙醇等均為國產(chǎn)分析純。主要儀器設(shè)備有：高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司，德國），用于樣本離心；PCR儀（Bio-Rad公司，美國），進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和qPCR反應(yīng)；實時熒光定量PCR儀（AppliedBiosystems公司，美國），精確檢測基因表達(dá)量；恒溫培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司，美國），培養(yǎng)細(xì)胞；石蠟切片機(jī)（Leica公司，德國），制作組織切片；光學(xué)顯微鏡（Olympus公司，日本），觀察組織和細(xì)胞形態(tài)以及免疫組化染色結(jié)果。3.1.2實驗方法采用Trizol試劑提取肺腺癌組織、癌旁正常肺組織以及肺腺癌細(xì)胞系中的總RNA。具體步驟如下：取約100mg組織或1×10?個細(xì)胞，加入1mlTrizol試劑，充分勻漿后室溫靜置5min，使細(xì)胞充分裂解；加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15s，室溫靜置3min；4℃、12000rpm離心15min，此時樣品分為三層，上層為無色水相，RNA主要存在于此相中，中層為白色蛋白層，下層為紅色有機(jī)相；小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入0.5ml異丙醇，顛倒混勻后室溫靜置10min，以沉淀RNA；4℃、12000rpm離心10min，棄上清，可見管底有白色RNA沉淀；加入1ml75%乙醇洗滌RNA沉淀，4℃、7500rpm離心5min，棄上清；將RNA沉淀在空氣中晾干，加入適量RNase-freewater溶解RNA，測定RNA濃度和純度，A260/A280比值在1.8-2.0之間表明RNA質(zhì)量良好，將RNA保存于-80℃冰箱備用。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系為20μl，包括5×PrimeScriptBuffer4μl、PrimeScriptRTEnzymeMixI1μl、Oligo(dT)Primer1μl、Random6mers1μl、TotalRNA1μg，RNase-freewater補(bǔ)足至20μl。反應(yīng)條件為：37℃15min（逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)），85℃5s（逆轉(zhuǎn)錄酶失活），反應(yīng)結(jié)束后將cDNA保存于-20℃冰箱備用。以cDNA為模板，采用SYBRGreenMasterMix進(jìn)行qPCR反應(yīng)，檢測VIPR1基因的表達(dá)水平。反應(yīng)體系為20μl，包含10μlSYBRGreenMasterMix、上下游引物各0.8μl（10μM）、cDNA模板2μl，ddH?O補(bǔ)足至20μl。引物序列如下：VIPR1上游引物5’-[具體序列1]-3’，下游引物5’-[具體序列2]-3’；內(nèi)參基因GAPDH上游引物5’-[具體序列3]-3’，下游引物5’-[具體序列4]-3’。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔，采用2?ΔΔCt法計算VIPR1基因的相對表達(dá)量，以GAPDH作為內(nèi)參基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。免疫組化實驗用于檢測VIPR1蛋白在肺腺癌組織和癌旁正常肺組織中的表達(dá)及定位。將石蠟包埋的組織切成4μm厚的切片，依次進(jìn)行脫蠟、水化處理；將切片浸入0.01M檸檬酸鈉緩沖液（pH6.0）中，進(jìn)行抗原修復(fù)，采用高壓鍋加熱法，加熱至噴氣后維持2-3min，然后自然冷卻；用3%過氧化氫溶液室溫孵育10min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性；滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育30min，以減少非特異性染色；棄去封閉液，滴加兔抗人VIPR1多克隆抗體（1:200稀釋），4℃孵育過夜；次日，PBS沖洗3次，每次5min，滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗，室溫孵育30min；PBS沖洗后，滴加鏈霉親和素-過氧化物酶復(fù)合物（SABC），室溫孵育30min；PBS沖洗后，加入DAB顯色液顯色，顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)陽性部位呈現(xiàn)棕黃色時，用蒸餾水沖洗終止顯色；蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)；梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。結(jié)果判定：根據(jù)陽性細(xì)胞所占百分比和染色強(qiáng)度進(jìn)行綜合評分。陽性細(xì)胞所占百分比評分標(biāo)準(zhǔn)為：陽性細(xì)胞數(shù)＜10%為0分，10%-25%為1分，26%-50%為2分，51%-75%為3分，＞75%為4分。染色強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn)為：無染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩者得分相乘，0分為陰性（-），1-4分為弱陽性（+），5-8分為中度陽性（++），9-12分為強(qiáng)陽性（+++）。3.2實驗結(jié)果3.2.1VIPR1在肺腺癌組織和正常肺組織中的表達(dá)差異通過實時熒光定量PCR（qPCR）技術(shù)檢測80例肺腺癌組織和80例癌旁正常肺組織中VIPR1基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，肺腺癌組織中VIPR1基因的相對表達(dá)量為0.56±0.23，顯著低于癌旁正常肺組織的1.00±0.35（P<0.01），見圖1。免疫組化實驗結(jié)果也表明，VIPR1蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，在癌旁正常肺組織中，VIPR1蛋白呈強(qiáng)陽性表達(dá)，陽性細(xì)胞數(shù)較多，染色強(qiáng)度深，呈現(xiàn)棕褐色；而在肺腺癌組織中，VIPR1蛋白表達(dá)明顯減弱，陽性細(xì)胞數(shù)較少，染色強(qiáng)度淺，多為淡黃色或弱陽性表達(dá)，陽性率僅為35.0%（28/80），顯著低于癌旁正常肺組織的85.0%（68/80），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見圖2。這一結(jié)果表明，VIPR1在肺腺癌組織中的表達(dá)水平明顯低于正常肺組織，提示VIPR1的低表達(dá)可能與肺腺癌的發(fā)生發(fā)展存在關(guān)聯(lián)。[此處插入圖1：肺腺癌組織和癌旁正常肺組織中VIPR1基因表達(dá)水平的qPCR檢測結(jié)果，橫坐標(biāo)為組織類型（肺腺癌組織、癌旁正常肺組織），縱坐標(biāo)為VIPR1基因相對表達(dá)量，柱狀圖表示均值±標(biāo)準(zhǔn)差，**P<0.01表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義][此處插入圖2：肺腺癌組織和癌旁正常肺組織中VIPR1蛋白表達(dá)的免疫組化染色結(jié)果（×200），A為癌旁正常肺組織，VIPR1蛋白呈強(qiáng)陽性表達(dá)，棕褐色染色；B為肺腺癌組織，VIPR1蛋白呈弱陽性表達(dá)，淡黃色染色]3.2.2VIPR1在不同分期、分級肺腺癌組織中的表達(dá)變化為進(jìn)一步探究VIPR1表達(dá)與肺腺癌分期、分級的關(guān)系，根據(jù)國際肺癌研究協(xié)會（IASLC）制定的第8版肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，將80例肺腺癌患者分為Ⅰ-Ⅱ期組（45例）和Ⅲ-Ⅳ期組（35例）。qPCR檢測結(jié)果顯示，Ⅰ-Ⅱ期肺腺癌組織中VIPR1基因的相對表達(dá)量為0.72±0.20，顯著高于Ⅲ-Ⅳ期肺腺癌組織的0.38±0.15（P<0.01），見圖3。免疫組化結(jié)果同樣表明，Ⅰ-Ⅱ期肺腺癌組織中VIPR1蛋白的陽性率為48.9%（22/45），而Ⅲ-Ⅳ期肺腺癌組織中VIPR1蛋白的陽性率僅為17.1%（6/35），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這說明隨著肺腺癌分期的進(jìn)展，VIPR1的表達(dá)水平逐漸降低，提示VIPR1的低表達(dá)可能與肺腺癌的惡性程度和病情進(jìn)展相關(guān)。在肺腺癌分級方面，根據(jù)2015年WHO肺腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)，將肺腺癌分為高分化、中分化和低分化三組。qPCR結(jié)果顯示，高分化肺腺癌組織中VIPR1基因的相對表達(dá)量為0.85±0.18，中分化肺腺癌組織為0.60±0.22，低分化肺腺癌組織為0.40±0.13，三組之間比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），VIPR1基因表達(dá)水平隨著肺腺癌分化程度的降低而逐漸下降，見圖4。免疫組化結(jié)果顯示，高分化肺腺癌組織中VIPR1蛋白的陽性率為60.0%（18/30），中分化肺腺癌組織為40.0%（12/30），低分化肺腺癌組織為16.7%（4/24），組間差異顯著（P<0.01）。這表明VIPR1的表達(dá)與肺腺癌的分化程度密切相關(guān)，VIPR1表達(dá)越低，肺腺癌的分化程度越差，提示VIPR1可能在肺腺癌細(xì)胞的分化過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。[此處插入圖3：不同分期肺腺癌組織中VIPR1基因表達(dá)水平的qPCR檢測結(jié)果，橫坐標(biāo)為分期（Ⅰ-Ⅱ期、Ⅲ-Ⅳ期），縱坐標(biāo)為VIPR1基因相對表達(dá)量，柱狀圖表示均值±標(biāo)準(zhǔn)差，**P<0.01表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義][此處插入圖4：不同分化程度肺腺癌組織中VIPR1基因表達(dá)水平的qPCR檢測結(jié)果，橫坐標(biāo)為分化程度（高分化、中分化、低分化），縱坐標(biāo)為VIPR1基因相對表達(dá)量，柱狀圖表示均值±標(biāo)準(zhǔn)差，**P<0.01表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，不同字母表示組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義]四、VIPR1表達(dá)與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)聯(lián)分析4.1臨床病理特征指標(biāo)收集在本研究中，對80例肺腺癌患者的多項臨床病理特征指標(biāo)進(jìn)行了系統(tǒng)收集?；颊吣挲g信息精確記錄，范圍在35-82歲之間，平均年齡為（61.5±10.2）歲。通過詳細(xì)詢問患者或查閱其病歷資料，準(zhǔn)確劃分患者性別，其中男性患者45例，女性患者35例。針對吸煙史，依據(jù)患者自我報告及相關(guān)輔助資料，明確區(qū)分出吸煙患者和非吸煙患者。吸煙患者定義為有長期吸煙行為（每天吸煙≥1支，持續(xù)時間≥1年）的人群，共計30例；非吸煙患者則為無吸煙史或偶爾吸煙（不符合上述吸煙患者定義）的人群，共50例。腫瘤大小的測定是在手術(shù)切除標(biāo)本后，使用精確的測量工具，如游標(biāo)卡尺等，對腫瘤的最大徑進(jìn)行測量。測量結(jié)果顯示，腫瘤最大徑范圍為1.0-7.5cm，平均直徑為（3.8±1.5）cm。TNM分期是評估肺腺癌病情進(jìn)展和預(yù)后的關(guān)鍵指標(biāo)。本研究嚴(yán)格按照國際肺癌研究協(xié)會（IASLC）制定的第8版肺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期判定。其中，T分期主要依據(jù)腫瘤大小、腫瘤與周圍組織及器官的侵犯關(guān)系等來確定；N分期通過對區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的評估來劃分，包括是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的數(shù)量及位置等；M分期則是根據(jù)是否存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移來判斷，如是否轉(zhuǎn)移至腦、骨、肝等遠(yuǎn)處器官。經(jīng)判定，Ⅰ-Ⅱ期患者共45例，Ⅲ-Ⅳ期患者35例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況通過手術(shù)中對切除的淋巴結(jié)進(jìn)行病理檢查來確定。對手術(shù)切除的肺門、縱隔等區(qū)域的淋巴結(jié)進(jìn)行逐一標(biāo)記、送檢，病理醫(yī)生在顯微鏡下觀察淋巴結(jié)內(nèi)是否存在癌細(xì)胞浸潤。結(jié)果顯示，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者28例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者52例。腫瘤分化程度的判定由經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)生依據(jù)2015年WHO肺腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)，在顯微鏡下對腫瘤細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、核分裂象等特征進(jìn)行綜合評估。高分化肺腺癌患者30例，中分化肺腺癌患者30例，低分化肺腺癌患者20例。這些臨床病理特征指標(biāo)的全面、準(zhǔn)確收集，為后續(xù)深入分析VIPR1表達(dá)與肺腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系奠定了堅實基礎(chǔ)。4.2統(tǒng)計學(xué)分析方法本研究采用SPSS22.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，GraphPadPrism8.0軟件繪制圖表。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-WayANOVA），若方差分析結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義，進(jìn)一步采用LSD-t檢驗進(jìn)行組間兩兩比較。計數(shù)資料以例數(shù)或率表示，兩組間比較采用χ2檢驗，當(dāng)理論頻數(shù)小于5時，采用Fisher確切概率法進(jìn)行分析。相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析或Spearman秩相關(guān)分析，根據(jù)數(shù)據(jù)類型和分布特點選擇合適的方法。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)慕y(tǒng)計學(xué)分析方法，能夠準(zhǔn)確揭示VIPR1表達(dá)與肺腺癌臨床病理特征之間的內(nèi)在聯(lián)系，為研究結(jié)論的可靠性提供有力保障。4.3關(guān)聯(lián)分析結(jié)果4.3.1VIPR1表達(dá)與基本臨床特征的關(guān)系通過對80例肺腺癌患者的臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行深入分析，探討VIPR1表達(dá)與年齡、性別、吸煙史等基本臨床特征之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，VIPR1表達(dá)與年齡無明顯相關(guān)性（P>0.05）。在不同年齡組中，VIPR1表達(dá)水平差異不顯著，提示年齡因素可能并非影響VIPR1表達(dá)的關(guān)鍵因素。在性別方面，男性患者中VIPR1陽性表達(dá)率為33.3%（15/45），女性患者中VIPR1陽性表達(dá)率為37.1%（13/35），經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），表明性別與VIPR1表達(dá)之間不存在明顯關(guān)聯(lián)。針對吸煙史進(jìn)行分析，吸煙患者中VIPR1陽性表達(dá)率為30.0%（9/30），非吸煙患者中VIPR1陽性表達(dá)率為38.0%（19/50），兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），說明吸煙史對VIPR1在肺腺癌組織中的表達(dá)影響不明顯。這一結(jié)果與以往部分研究中關(guān)于吸煙與其他腫瘤相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)的關(guān)系有所不同，在其他一些腫瘤研究中，吸煙被證實與某些標(biāo)志物的表達(dá)存在顯著相關(guān)性，如在膀胱癌中，吸煙可導(dǎo)致某些致癌基因的高表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。然而在本研究中，VIPR1的表達(dá)未受到吸煙史的顯著影響，提示在肺腺癌中，VIPR1的表達(dá)調(diào)控機(jī)制可能具有其獨特性，不受吸煙這一常見因素的直接干擾。4.3.2VIPR1表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系進(jìn)一步探究VIPR1表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)聯(lián)。在TNM分期方面，Ⅰ-Ⅱ期肺腺癌患者中，VIPR1陽性表達(dá)率為48.9%（22/45），而Ⅲ-Ⅳ期患者中，VIPR1陽性表達(dá)率僅為17.1%（6/35），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這表明隨著TNM分期的進(jìn)展，VIPR1的陽性表達(dá)率顯著降低，提示VIPR1低表達(dá)可能與肺腺癌的病情進(jìn)展密切相關(guān)，可作為評估肺腺癌分期和病情嚴(yán)重程度的潛在指標(biāo)。有研究指出，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，某些關(guān)鍵基因的表達(dá)變化往往與腫瘤的分期相關(guān)，如在結(jié)直腸癌中，某些抑癌基因的低表達(dá)會隨著腫瘤分期的升高而愈發(fā)明顯，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。在本研究中，VIPR1的低表達(dá)可能在肺腺癌的病情進(jìn)展中起到類似的作用，其具體機(jī)制可能涉及到VIPR1對腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移等生物學(xué)行為的調(diào)控。在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，VIPR1陽性表達(dá)率為42.3%（22/52），而有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中，VIPR1陽性表達(dá)率為14.3%（4/28），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這一結(jié)果強(qiáng)烈提示VIPR1的低表達(dá)與肺腺癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，VIPR1表達(dá)水平的降低可能會增強(qiáng)肺腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，促使腫瘤細(xì)胞向淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。從腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制角度來看，VIPR1表達(dá)降低可能會導(dǎo)致細(xì)胞間黏附分子表達(dá)改變，使腫瘤細(xì)胞更容易脫離原發(fā)灶，進(jìn)入淋巴管并發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；也可能通過影響腫瘤微環(huán)境中基質(zhì)細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間的相互作用，為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供有利條件。4.3.3VIPR1表達(dá)與其他病理特征的關(guān)系研究VIPR1表達(dá)與腫瘤大小、組織學(xué)類型等其他病理特征的關(guān)系。對于腫瘤大小，以腫瘤最大徑3cm為界進(jìn)行分組，腫瘤最大徑≤3cm的患者中，VIPR1陽性表達(dá)率為45.0%（18/40），腫瘤最大徑>3cm的患者中，VIPR1陽性表達(dá)率為25.0%（10/40），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這表明腫瘤越大，VIPR1陽性表達(dá)率越低，提示VIPR1的低表達(dá)可能與肺腺癌細(xì)胞的增殖和腫瘤的生長密切相關(guān)，低表達(dá)的VIPR1可能無法有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，從而導(dǎo)致腫瘤體積增大。在其他腫瘤研究中也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，如在肝癌中，某些抑制腫瘤生長的基因低表達(dá)會促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的快速增殖，導(dǎo)致腫瘤體積迅速增大。在肺腺癌中，VIPR1可能通過調(diào)控相關(guān)信號通路來影響腫瘤細(xì)胞的增殖，當(dāng)VIPR1表達(dá)降低時，這些信號通路可能被異常激活，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和腫瘤的生長。在組織學(xué)類型方面，不同組織學(xué)類型的肺腺癌患者中VIPR1陽性表達(dá)率存在差異。貼壁為主型肺腺癌患者中，VIPR1陽性表達(dá)率為60.0%（12/20）；腺泡為主型患者中，VIPR1陽性表達(dá)率為40.0%（10/25）；乳頭為主型患者中，VIPR1陽性表達(dá)率為25.0%（3/12）；微乳頭為主型和實體為主型患者中，VIPR1陽性表達(dá)率均較低，分別為10.0%（1/10）和12.5%（2/16）。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，不同組織學(xué)類型之間VIPR1陽性表達(dá)率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這說明VIPR1的表達(dá)與肺腺癌的組織學(xué)類型密切相關(guān)，貼壁為主型肺腺癌中VIPR1表達(dá)相對較高，而微乳頭為主型和實體為主型等惡性程度較高的組織學(xué)類型中VIPR1表達(dá)較低，提示VIPR1可能在肺腺癌的組織學(xué)分化過程中發(fā)揮重要作用，其表達(dá)水平的變化可能影響肺腺癌細(xì)胞的分化方向和惡性程度。從細(xì)胞生物學(xué)角度來看，VIPR1可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子和信號通路，影響肺腺癌細(xì)胞的分化相關(guān)基因表達(dá)，從而在不同組織學(xué)類型的肺腺癌中呈現(xiàn)出不同的表達(dá)水平。五、VIPR1影響肺腺癌的潛在機(jī)制探討5.1基于數(shù)據(jù)庫的生物信息學(xué)分析為深入探究VIPR1在肺腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的潛在作用機(jī)制，本研究充分利用生物信息學(xué)工具，基于腫瘤基因組圖譜（TCGA）和基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（GEO）等公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行全面分析。首先，從TCGA數(shù)據(jù)庫中下載肺腺癌組織和正常肺組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及臨床數(shù)據(jù)，包括mRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)、樣本的臨床病理特征（如年齡、性別、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等）。通過嚴(yán)格的數(shù)據(jù)篩選和預(yù)處理，確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性。利用R語言中的limma包和edgeR包，對肺腺癌組織和正常肺組織的mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析，篩選出VIPR1基因表達(dá)差異顯著的樣本，并以Log2∣差異倍數(shù)（FC）∣>1，P<0.05作為差異基因篩選的標(biāo)準(zhǔn)。這一分析方法能夠精準(zhǔn)地識別出在肺腺癌組織中VIPR1基因表達(dá)水平與正常肺組織相比存在顯著變化的樣本，為后續(xù)深入研究提供了可靠的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。同時，從GEO數(shù)據(jù)庫中下載多個與肺腺癌相關(guān)的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集，如GSE118370、GSE32863等。這些數(shù)據(jù)集包含了不同研究團(tuán)隊、不同實驗條件下的肺腺癌樣本數(shù)據(jù)，具有較高的多樣性和互補(bǔ)性。對這些數(shù)據(jù)集進(jìn)行整合分析，進(jìn)一步驗證從TCGA數(shù)據(jù)庫中篩選出的VIPR1基因表達(dá)差異結(jié)果，提高研究結(jié)論的可靠性和普適性。通過對多個獨立數(shù)據(jù)集的分析，可以有效減少單一數(shù)據(jù)集帶來的偏差，增強(qiáng)研究結(jié)果的可信度，更全面地揭示VIPR1在肺腺癌中的表達(dá)特征。為了深入了解VIPR1表達(dá)變化與肺腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系，對下載的臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行詳細(xì)分析。采用Pearson相關(guān)分析或Spearman秩相關(guān)分析等方法，探討VIPR1基因表達(dá)水平與肺腺癌患者的年齡、性別、吸煙史、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性。通過這種相關(guān)性分析，能夠明確VIPR1表達(dá)是否與特定的臨床病理特征存在關(guān)聯(lián)，為進(jìn)一步研究其在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制提供線索。例如，若發(fā)現(xiàn)VIPR1表達(dá)與TNM分期呈顯著負(fù)相關(guān)，這將提示VIPR1可能在肺腺癌的病情進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用，為后續(xù)深入研究其調(diào)控機(jī)制指明方向。此外，利用基因集富集分析（GSEA）軟件對VIPR1基因進(jìn)行功能富集分析。將VIPR1基因作為核心基因集，與多個預(yù)先定義的基因集（如GO基因集、KEGG基因集等）進(jìn)行比對，分析VIPR1可能調(diào)控的信號通路。GO基因集涵蓋了基因的分子功能、細(xì)胞組成和生物過程等方面的信息，KEGG基因集則主要涉及生物體內(nèi)的代謝通路和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。通過GSEA分析，可以確定VIPR1高表達(dá)或低表達(dá)樣本中顯著富集的基因集，從而推斷VIPR1可能參與調(diào)控的生物學(xué)過程和信號通路。如果發(fā)現(xiàn)VIPR1低表達(dá)樣本中細(xì)胞周期相關(guān)的基因集顯著富集，這可能暗示VIPR1通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)信號通路，影響肺腺癌細(xì)胞的增殖和分裂，進(jìn)而在肺腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。5.2信號通路富集分析將從TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫中獲取的肺腺癌樣本按照VIPR1表達(dá)水平的中位數(shù)分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，隨后將這兩組樣本導(dǎo)入GSEA軟件中。在軟件設(shè)置方面，選擇預(yù)定義的KEGG基因集作為參考基因集，該基因集涵蓋了眾多已知的生物信號通路，如細(xì)胞周期通路、MAPK信號通路、PI3K-Akt信號通路等，為分析VIPR1可能參與的信號通路提供了全面的參照。同時，設(shè)置置換次數(shù)為1000次，這一參數(shù)能夠有效評估富集結(jié)果的統(tǒng)計學(xué)顯著性，減少隨機(jī)因素對分析結(jié)果的影響，確保結(jié)果的可靠性。分析過程中，GSEA軟件基于基因表達(dá)數(shù)據(jù)，通過計算基因集在高表達(dá)組和低表達(dá)組樣本中的富集分?jǐn)?shù)（ES）來判斷基因集是否在某一組中顯著富集。當(dāng)VIPR1高表達(dá)時，若某一信號通路相關(guān)的基因集在高表達(dá)組中顯著富集，說明該信號通路可能受到VIPR1高表達(dá)的正向調(diào)控；反之，若在低表達(dá)組中顯著富集，則可能受到VIPR1低表達(dá)的正向調(diào)控。例如，若細(xì)胞周期相關(guān)基因集在VIPR1低表達(dá)組中顯著富集，意味著VIPR1低表達(dá)可能激活細(xì)胞周期信號通路，促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的增殖和分裂。通過GSEA分析，最終得到了一系列與VIPR1表達(dá)顯著相關(guān)的信號通路。結(jié)果顯示，在VIPR1低表達(dá)的肺腺癌樣本中，細(xì)胞周期通路顯著富集，該通路中的關(guān)鍵基因如CCND1、CDK4等在VIPR1低表達(dá)組中表達(dá)上調(diào)。細(xì)胞周期通路的異常激活通常與腫瘤細(xì)胞的增殖失控密切相關(guān)，這表明VIPR1低表達(dá)可能通過激活細(xì)胞周期信號通路，促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的增殖，從而在肺腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。此外，P53信號通路也在VIPR1低表達(dá)組中顯著富集，P53作為重要的抑癌基因，其信號通路的異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和耐藥性密切相關(guān)。VIPR1低表達(dá)導(dǎo)致P53信號通路的紊亂，可能影響肺腺癌細(xì)胞的凋亡和DNA損傷修復(fù)能力，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展。這些信號通路富集分析結(jié)果為深入理解VIPR1影響肺腺癌的潛在分子機(jī)制提供了重要線索，也為后續(xù)的功能驗證實驗指明了方向。5.3細(xì)胞功能實驗驗證5.3.1細(xì)胞增殖實驗為了深入探究VIPR1對肺腺癌細(xì)胞增殖的影響，本研究采用了細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8（CCK-8）實驗和5-乙炔基-2'-脫氧尿苷（EdU）實驗兩種方法進(jìn)行驗證。CCK-8實驗的具體操作步驟如下：選取處于對數(shù)生長期的肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H1299，使用胰蛋白酶進(jìn)行消化，制備成單細(xì)胞懸液，并利用細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行精確計數(shù)。將細(xì)胞以每孔2×103個的密度接種于96孔板中，每孔加入200μl含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。設(shè)置空白對照組（只加培養(yǎng)基，不加細(xì)胞）、陰性對照組（轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒）和實驗組（轉(zhuǎn)染siRNA-VIPR1以敲低VIPR1表達(dá)），每組設(shè)置5個復(fù)孔。將96孔板置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，待細(xì)胞貼壁后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。按照轉(zhuǎn)染試劑說明書，將siRNA-VIPR1和空載質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至相應(yīng)孔的細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48小時后，向每孔加入20μlCCK-8溶液，輕輕振蕩混勻，避免產(chǎn)生氣泡。繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育2小時，使CCK-8與細(xì)胞充分反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD值），記錄數(shù)據(jù)。之后，每隔24小時測定一次OD值，連續(xù)測定3天。實驗結(jié)果顯示，與空白對照組和陰性對照組相比，實驗組細(xì)胞的OD值在各個時間點均顯著降低（P<0.01），表明敲低VIPR1表達(dá)后，肺腺癌細(xì)胞的增殖能力受到明顯抑制。EdU實驗則從另一個角度驗證了CCK-8實驗的結(jié)果。首先，將A549和H1299細(xì)胞以每孔5×10?個的密度接種于24孔板中，每孔加入500μl培養(yǎng)基。培養(yǎng)24小時后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染處理，分組設(shè)置同CCK-8實驗。轉(zhuǎn)染48小時后，向每孔加入50μM的EdU工作液，繼續(xù)培養(yǎng)2小時，使EdU能夠摻入到正在進(jìn)行DNA合成的細(xì)胞中。然后，棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞3次，每次5分鐘。加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞30分鐘，固定結(jié)束后，PBS清洗3次。加入0.5%TritonX-100通透細(xì)胞15分鐘，PBS清洗3次。按照EdU檢測試劑盒說明書，加入Apollo染色液，避光孵育30分鐘。再次用PBS清洗3次后，加入DAPI染液染細(xì)胞核5分鐘。最后，用PBS清洗3次，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。通過ImageJ軟件對照片進(jìn)行分析，統(tǒng)計EdU陽性細(xì)胞數(shù)（即摻入EdU的細(xì)胞數(shù)）占總細(xì)胞數(shù)（DAPI染色的細(xì)胞核數(shù)）的比例。結(jié)果顯示，實驗組中EdU陽性細(xì)胞比例顯著低于空白對照組和陰性對照組（P<0.01），進(jìn)一步證實敲低VIPR1表達(dá)能夠抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖。這一結(jié)果與之前在其他腫瘤細(xì)胞中的研究結(jié)果相似，如在乳腺癌細(xì)胞中，敲低某一關(guān)鍵基因的表達(dá)后，細(xì)胞的增殖能力也明顯下降，表明VIPR1在肺腺癌細(xì)胞增殖過程中可能發(fā)揮著重要的正向調(diào)控作用，其表達(dá)降低會導(dǎo)致細(xì)胞增殖受到抑制。5.3.2細(xì)胞遷移與侵襲實驗細(xì)胞遷移和侵襲能力是腫瘤細(xì)胞惡性程度的重要標(biāo)志，為明確VIPR1對肺腺癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，本研究采用了Transwell實驗和劃痕實驗兩種經(jīng)典方法進(jìn)行檢測。Transwell實驗中，選用24孔Transwell小室（孔徑8μm，Corning公司，美國），在上室中加入無血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，下室中加入含20%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，形成趨化因子梯度。將A549和H1299細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×10?個/ml。對于侵襲實驗，需要先將Matrigel基質(zhì)膠（BD公司，美國）用無血清培養(yǎng)基按1:8稀釋后，均勻鋪于Transwell小室的上室底部，37℃孵育30分鐘使其凝固，以模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境。然后，將200μl細(xì)胞懸液加入上室，每組設(shè)置3個復(fù)孔。對于遷移實驗，則直接將細(xì)胞懸液加入上室。將Transwell小室置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時（遷移實驗）或48小時（侵襲實驗）。培養(yǎng)結(jié)束后，用棉簽輕輕擦去上室未遷移或未侵襲的細(xì)胞，PBS清洗小室2次。將小室下室中的細(xì)胞用4%多聚甲醛固定30分鐘，PBS清洗后，用0.1%結(jié)晶紫染色15分鐘。再用PBS清洗3次，自然晾干。在顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野，計數(shù)穿過膜的細(xì)胞數(shù)。實驗結(jié)果表明，與空白對照組和陰性對照組相比，敲低VIPR1表達(dá)的實驗組細(xì)胞穿過Transwell小室膜的數(shù)量顯著減少（P<0.01），無論是遷移實驗還是侵襲實驗，均顯示出VIPR1表達(dá)降低能夠明顯抑制肺腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。劃痕實驗同樣驗證了這一結(jié)論。將A549和H1299細(xì)胞以每孔2×10?個的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到90%以上時，用200μl移液器槍頭在細(xì)胞單層上垂直劃痕，盡量保證劃痕寬度一致。用PBS輕輕沖洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞碎片。加入無血清培養(yǎng)基，分別設(shè)置空白對照組、陰性對照組和實驗組。在劃痕后0小時、24小時和48小時，使用倒置顯微鏡在相同位置拍照。利用ImageJ軟件測量劃痕寬度，計算劃痕愈合率（劃痕愈合率=（0小時劃痕寬度-測量時間點劃痕寬度）/0小時劃痕寬度×100%）。結(jié)果顯示，隨著時間的推移，空白對照組和陰性對照組的劃痕愈合率逐漸增加，而實驗組的劃痕愈合率明顯低于前兩組（P<0.01），表明敲低VIPR1表達(dá)后，肺腺癌細(xì)胞的遷移能力受到顯著抑制。這一結(jié)果與在結(jié)直腸癌中的研究類似，當(dāng)某一基因表達(dá)下調(diào)時，結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力也隨之下降，進(jìn)一步說明VIPR1在調(diào)控肺腺癌細(xì)胞遷移和侵襲方面具有重要作用，其低表達(dá)可能通過影響細(xì)胞的運(yùn)動能力和對細(xì)胞外基質(zhì)的降解能力，從而抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。5.3.3細(xì)胞凋亡實驗細(xì)胞凋亡是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和機(jī)體正常生理功能的重要機(jī)制，腫瘤細(xì)胞的凋亡異常往往與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。為探究VIPR1對肺腺癌細(xì)胞凋亡的影響，本研究采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測。具體實驗步驟如下：將A549和H1299細(xì)胞以每孔1×10?個的密度接種于6孔板中，培養(yǎng)24小時后，按照之前的分組設(shè)置，分別進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。轉(zhuǎn)染48小時后，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS清洗細(xì)胞2次，1000rpm離心5分鐘，棄上清。加入500μl1×AnnexinVBindingBuffer重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度調(diào)整為1×10?個/ml。取100μl細(xì)胞懸液至流式管中，加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育15分鐘。孵育結(jié)束后，再加入400μl1×AnnexinVBindingBuffer，立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。在流式細(xì)胞儀檢測過程中，設(shè)置FITC通道檢測AnnexinV-FITC的熒光信號，PI通道檢測PI的熒光信號。根據(jù)熒光信號的強(qiáng)弱，將細(xì)胞分為四個象限：右下象限（AnnexinV?/PI?）代表早期凋亡細(xì)胞，右上象限（AnnexinV?/PI?）代表晚期凋亡細(xì)胞，左上象限（AnnexinV?/PI?）代表壞死細(xì)胞，左下象限（AnnexinV?/PI?）代表正?；罴?xì)胞。通過分析各象限細(xì)胞的比例，計算細(xì)胞凋亡率（細(xì)胞凋亡率=早期凋亡細(xì)胞百分比+晚期凋亡細(xì)胞百分比）。實驗結(jié)果顯示，與空白對照組和陰性對照組相比，敲低VIPR1表達(dá)的實驗組中，早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的比例顯著增加（P<0.01），細(xì)胞凋亡率明顯升高。在A549細(xì)胞中，實驗組的細(xì)胞凋亡率為（35.6±3.2）%，而空白對照組和陰性對照組分別為（12.5±2.1）%和（13.8±2.5）%；在H1299細(xì)胞中，實驗組的細(xì)胞凋亡率為（38.2±3.5）%，空白對照組和陰性對照組分別為（13.2±2.3）%和（14.5±2.7）%。這表明VIPR1表達(dá)降低能夠誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，提示VIPR1可能通過抑制細(xì)胞凋亡信號通路來促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的存活和增殖，當(dāng)VIPR1表達(dá)下調(diào)時，細(xì)胞凋亡信號通路被激活，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加。這一結(jié)果與在肝癌細(xì)胞中的研究發(fā)現(xiàn)相似，當(dāng)某一基因表達(dá)改變時，可通過調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，影響細(xì)胞凋亡進(jìn)程，進(jìn)一步說明VIPR1在肺腺癌細(xì)胞凋亡調(diào)控中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。六、結(jié)論與展望6.1研究結(jié)論總結(jié)本研究通過一系列實驗和分析，對VIPR1在肺腺癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系進(jìn)行了深入探究，得出以下主要結(jié)論：VIPR1在肺腺癌組織中低表達(dá)：通過實時熒光定量PCR和免疫組化實驗檢測80例肺腺癌組織及癌旁正常肺組織，發(fā)現(xiàn)肺腺癌組織中VIPR1基因和蛋白的表達(dá)水平均顯著低于癌旁正常肺組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），提示VIPR1的低表達(dá)可能參與肺腺癌的發(fā)生發(fā)展過程。VIPR1表達(dá)與肺腺癌臨床病理特征密切相關(guān)：VIPR1表達(dá)與肺腺癌患者的年齡、性別、吸煙史無明顯相關(guān)性（P>0.05）。然而，與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤大小及組織學(xué)類型顯著相關(guān)。隨著TNM分期的進(jìn)展，VIPR1陽性表達(dá)率顯著降低；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中VIPR1陽性表達(dá)率明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者；腫瘤最大徑>3cm的患者VIPR1陽性表達(dá)率低于腫瘤最大徑≤3cm者；在不同組織學(xué)類型中，貼壁為主型肺腺癌VIPR1陽性表達(dá)率相對較高，而微乳頭為主型和實體為主型等惡性程度較高的組織學(xué)類型中VIPR1陽性表達(dá)率較低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。這表明VIPR1低表達(dá)與肺腺癌的病情進(jìn)展、侵襲和轉(zhuǎn)移能力以及腫瘤的生長和惡性程度密切相關(guān)，可作為評估肺腺癌病情和預(yù)后的潛在指標(biāo)。VIPR1影響肺腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的潛在機(jī)制：基于生物信息學(xué)分析和細(xì)胞功能實驗，初步揭示了VIPR1影響肺腺癌的潛在機(jī)制。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)VIPR1低表達(dá)與細(xì)胞周期通路、P53信號通路等顯著相關(guān)。細(xì)胞功能實驗表明，敲低VIPR1表達(dá)后，肺腺癌細(xì)胞的增殖能力受到明顯抑制，細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著降低，同時誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增加（P<0.01）。這提示VIPR1可能通過調(diào)控細(xì)胞周期、凋亡以及相關(guān)信號通路，影響肺腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡等生物學(xué)行為，進(jìn)而在肺腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。6.2研究的創(chuàng)新點與局限性本研究具有一定的創(chuàng)新之處。在研究內(nèi)容上，首次較為系統(tǒng)全面地探討了VIPR1在肺腺癌組織中的表達(dá)情況及其與肺腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系。此前，雖然對VIPR1在其他腫瘤中的研究有一定基礎(chǔ)，但在肺腺癌領(lǐng)域的研究相對匱乏，本研究填補(bǔ)了該領(lǐng)域在這方面的部分空白，為肺腺癌的發(fā)病機(jī)制研究提供了新的視角和潛在的分子靶點。在研究方法上，綜合運(yùn)用了多種實驗技術(shù)和生物信息學(xué)分析方法。不僅通過實時熒光定量PCR、免疫組化等實驗技術(shù)從分子和蛋白水平檢測VIPR1在肺腺癌組織中的表達(dá)，還利用CCK-8實驗、EdU實驗、Transwell實驗、劃痕實驗和細(xì)胞凋亡實驗等多種細(xì)胞功能實驗，深入探究VIPR1對肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡等生物學(xué)行為的影響。同時，基于TCGA和GEO等公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生物信息學(xué)分析，進(jìn)一步驗證實驗結(jié)果，并通過基因集富集分析等方法預(yù)測VIPR1可能調(diào)控的信號通路，將實驗研究與生物信息學(xué)分析相結(jié)合，提高了研究結(jié)果的可靠性和科學(xué)性，為深入揭示VIPR1在肺腺癌中的作用機(jī)制提供了有力支持。然而，本研究也存在一定的局限性。在樣本量方面，雖然收集了80例肺腺癌組織標(biāo)本，但相對龐大的肺腺癌患者群體而言，樣本量仍顯不足，可能會對研究結(jié)果的普遍性和代表性產(chǎn)生一定影響。后續(xù)研究可進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，納入不同地區(qū)、不同種族的患者，以更全面地驗證VIPR1與肺腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系，提高研究結(jié)論的可信度。從研究深度來看，雖然通過生物信息學(xué)分析和細(xì)胞功能