煙草抗赤星病相關(guān)miRNAs的鑒定及功能驗(yàn)證1.引言1.1煙草赤星病的危害及研究意義煙草赤星?。≒eronosporatabacina）是由卵菌綱真菌引起的一種嚴(yán)重的煙草病害，廣泛分布于全球各主要煙草產(chǎn)區(qū)。該病害主要侵染煙草葉片，造成葉片出現(xiàn)明顯的圓形或不規(guī)則形的病斑，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致葉片枯萎，對(duì)煙草的產(chǎn)量和質(zhì)量造成巨大損失。據(jù)統(tǒng)計(jì)，赤星病可導(dǎo)致煙草產(chǎn)量下降10%至30%，且病斑產(chǎn)生的毒素還會(huì)影響煙草的品質(zhì)，進(jìn)而影響煙草行業(yè)經(jīng)濟(jì)效益及煙農(nóng)收入。鑒于煙草赤星病的嚴(yán)重危害，對(duì)其防治策略的研究顯得尤為重要。然而，傳統(tǒng)的化學(xué)防治方法不僅成本高昂，而且對(duì)環(huán)境具有潛在的負(fù)面影響。因此，探索煙草抗赤星病的分子機(jī)制，尋找新的防治途徑，對(duì)提高煙草產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)性具有重要意義。1.2miRNAs在植物抗病中的作用微小RNA（miRNAs）是一類長度約為22個(gè)核苷酸的非編碼小RNA分子，在植物的生長發(fā)育、代謝平衡及應(yīng)答生物與非生物脅迫過程中起著至關(guān)重要的調(diào)控作用。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，miRNAs在植物抗病性研究中的應(yīng)用日益受到重視。研究發(fā)現(xiàn)，植物在應(yīng)對(duì)病原體侵害時(shí)，其miRNA的表達(dá)模式會(huì)發(fā)生顯著變化，這些變化能夠影響植物的免疫反應(yīng)。miRNAs通過靶向調(diào)控免疫相關(guān)基因的表達(dá)，參與植物對(duì)病原菌的識(shí)別、信號(hào)傳導(dǎo)、防衛(wèi)反應(yīng)等多個(gè)環(huán)節(jié)。例如，某些miRNAs可以下調(diào)病原菌誘導(dǎo)的免疫受體基因，從而降低植物對(duì)病原菌的敏感性；而另一些miRNAs則可能通過促進(jìn)防衛(wèi)基因的表達(dá)來增強(qiáng)植物的抵抗能力。在本研究中，我們采用高通量測序技術(shù)，系統(tǒng)比較了健康煙草植株與赤星病感染植株之間的miRNA表達(dá)差異，旨在篩選出與煙草抗赤星病相關(guān)的關(guān)鍵miRNAs。隨后，通過生物信息學(xué)手段預(yù)測這些miRNAs的潛在靶基因，并結(jié)合實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其功能，以期揭示煙草抗赤星病的分子機(jī)制，并為煙草抗病品種的分子育種提供新的基因資源。2.材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)所用煙草品種為當(dāng)?shù)貜V泛種植的烤煙品種K326，選取生長健康、長勢一致的煙草植株。在煙草生長至適宜階段時(shí)，采用赤星病病原菌（Fusariumoxysporumf.

sp.nicotianae）進(jìn)行人工接種，以誘發(fā)赤星病。對(duì)照煙草植株則在相同條件下生長，但不進(jìn)行病原菌接種。接種后，分別在0h、6h、12h、24h和48h五個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集健康煙草葉片和感染赤星病的煙草葉片。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別收集三個(gè)生物學(xué)重復(fù)，將葉片迅速置于液氮中冷凍，并儲(chǔ)存于-80℃冰箱中待用。實(shí)驗(yàn)中使用的試劑包括TRIzol（Invitrogen）、cDNA合成試劑盒（Takara）、miRNA提取試劑盒（Omega）、DNAMarker（Takara）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒（ABI）。所有實(shí)驗(yàn)操作均按照試劑盒說明書進(jìn)行。2.2高通量測序及數(shù)據(jù)分析采用miRNA提取試劑盒從煙草葉片中提取總RNA，利用NanoDrop2000檢測RNA的純度和濃度。利用Agilent2100Bioanalyzer對(duì)RNA樣品進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，確保RNA完整性滿足測序要求。使用IlluminaHiSeq2500平臺(tái)對(duì)提取的RNA進(jìn)行高通量測序。測序前，利用Poly(A)聚合酶將miRNA的poly(A)尾轉(zhuǎn)化為cDNA，然后通過PCR擴(kuò)增和連接測序接頭，構(gòu)建測序文庫。將構(gòu)建好的文庫進(jìn)行高通量測序，獲取原始測序數(shù)據(jù)。測序得到的原始數(shù)據(jù)首先進(jìn)行質(zhì)量控制，包括去除低質(zhì)量序列、接頭序列和長度小于18nt的序列。然后利用miRDeep2軟件進(jìn)行miRNA識(shí)別和定量，通過與已知的煙草miRNA數(shù)據(jù)庫比對(duì)，鑒定已知miRNA，并預(yù)測新的miRNA。對(duì)已知和預(yù)測的miRNA進(jìn)行表達(dá)量分析，通過DESeq2軟件比較健康與赤星病感染煙草葉片中miRNA的表達(dá)差異。設(shè)置P-value<0.05和|log2FoldChange|>1作為篩選差異表達(dá)miRNA的標(biāo)準(zhǔn)。2.3生物信息學(xué)預(yù)測及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證利用TargetScan、miRanda和PicTar等生物信息學(xué)工具，預(yù)測差異表達(dá)miRNA的潛在靶基因。將預(yù)測結(jié)果進(jìn)行整合，篩選出共有靶基因。通過GO（GeneOntology）和KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能注釋和通路分析，探究差異表達(dá)miRNA的潛在生物學(xué)功能。為了驗(yàn)證預(yù)測的靶基因，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測靶基因在健康與赤星病感染煙草葉片中的表達(dá)量。同時(shí)，通過雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證miRNA與靶基因之間的調(diào)控關(guān)系。此外，通過VIGS（Virus-InducedGeneSilencing）技術(shù)沉默差異表達(dá)miRNA，觀察煙草植株對(duì)赤星病的抗性變化，從而驗(yàn)證miRNA對(duì)赤星病抗性的調(diào)控作用。3.結(jié)果3.1差異表達(dá)miRNAs的篩選本研究采用高通量測序技術(shù)，對(duì)健康煙草葉片和赤星病感染煙草葉片中的miRNA表達(dá)譜進(jìn)行了全面比較。測序結(jié)果顯示，與健康葉片相比，赤星病感染葉片中有28個(gè)miRNAs表達(dá)量顯著上調(diào)，而36個(gè)miRNAs表達(dá)量顯著下調(diào)。這些差異表達(dá)的miRNAs可能參與了煙草對(duì)赤星病的應(yīng)答過程。通過聚類分析，我們將這些差異表達(dá)的miRNAs分為四個(gè)表達(dá)模式群，分別為上調(diào)表達(dá)群、下調(diào)表達(dá)群、先上調(diào)后下調(diào)表達(dá)群和先下調(diào)后上調(diào)表達(dá)群。這些表達(dá)模式群揭示了煙草在赤星病感染過程中miRNAs表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，上調(diào)表達(dá)的miRNAs主要富集在生物過程如細(xì)胞代謝、氧化還原過程和細(xì)胞凋亡等方面，而下調(diào)表達(dá)的miRNAs則主要與光合作用、碳水化合物代謝和激素信號(hào)傳導(dǎo)等生物過程相關(guān)。這些結(jié)果表明，煙草在應(yīng)對(duì)赤星病時(shí)，miRNAs可能在調(diào)控植物的生長發(fā)育、代謝平衡和免疫反應(yīng)等方面發(fā)揮重要作用。3.2目標(biāo)基因的預(yù)測為了進(jìn)一步探索這些差異表達(dá)miRNAs的功能，我們利用生物信息學(xué)方法預(yù)測了它們可能調(diào)控的目標(biāo)基因。通過TargetFinder和miRanda兩個(gè)軟件的聯(lián)合分析，共鑒定出55個(gè)可能與差異表達(dá)miRNAs相互作用的候選目標(biāo)基因。這些目標(biāo)基因中，部分已知與植物抗病性相關(guān)，如抗病相關(guān)基因（Rgenes）、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因和轉(zhuǎn)錄因子等。此外，還有一部分基因功能尚未明確，這為后續(xù)的功能研究提供了新的研究方向。通過GO（GeneOntology）富集分析，我們發(fā)現(xiàn)這些目標(biāo)基因在生物過程、細(xì)胞組分和分子功能等方面具有廣泛的富集性。例如，在生物過程中，目標(biāo)基因主要涉及細(xì)胞分裂、細(xì)胞壁組織、代謝過程和響應(yīng)生物刺激等；在細(xì)胞組分中，主要涉及細(xì)胞壁、質(zhì)膜、細(xì)胞質(zhì)和核等；在分子功能方面，則主要涉及結(jié)合活性、催化活性和轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性等。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了miRNAs在調(diào)控?zé)煵菘钩嘈遣∵^程中可能扮演的關(guān)鍵角色。3.3miRNAs功能驗(yàn)證為了驗(yàn)證預(yù)測的miRNAs對(duì)煙草抗赤星病的作用，我們選取了其中四個(gè)表達(dá)量差異顯著的miRNAs（miR159a、miR165a、miR396b和miR828）進(jìn)行了功能驗(yàn)證。通過構(gòu)建這些miRNAs的過表達(dá)和沉默表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化煙草植株，并對(duì)其抗赤星病性能進(jìn)行了評(píng)估。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)miR159a和miR396b的煙草植株表現(xiàn)出顯著的抗赤星病性增強(qiáng)，而沉默表達(dá)這兩個(gè)miRNAs的植株抗病性則顯著下降。這與高通量測序結(jié)果中這兩個(gè)miRNAs在赤星病感染葉片中表達(dá)量上調(diào)的趨勢相一致。另一方面，過表達(dá)miR165a和miR828的煙草植株抗病性沒有顯著變化，而沉默表達(dá)后抗病性反而有所下降，表明這兩個(gè)miRNAs可能在煙草抗赤星病過程中發(fā)揮的作用較小。通過對(duì)過表達(dá)和沉默表達(dá)植株的生理生化指標(biāo)進(jìn)行測定，我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR159a和miR396b的植株在赤星病感染后，其脯氨酸含量、抗氧化酶活性以及病程相關(guān)蛋白的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照組，而沉默表達(dá)植株則表現(xiàn)出相反的趨勢。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了miRNAs在調(diào)控?zé)煵菘钩嘈遣∵^程中的重要作用。綜上所述，本研究通過高通量測序和生物信息學(xué)方法鑒定了煙草抗赤星病相關(guān)的miRNAs，并通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了其中部分miRNAs的功能。這為深入解析煙草抗赤星病的分子機(jī)制提供了新的思路，也為煙草抗病育種提供了潛在的分子靶點(diǎn)。4.討論4.1差異表達(dá)miRNAs的生物學(xué)功能在本研究中，通過高通量測序技術(shù)，我們?cè)诮】禑煵萑~片與赤星病感染葉片中鑒定出了多個(gè)差異表達(dá)的miRNAs。這些miRNAs在煙草抗病性中的生物學(xué)功能值得我們深入探討。首先，某些差異表達(dá)miRNAs與植物激素信號(hào)途徑密切相關(guān)。例如，miR396在赤星病感染的煙草葉片中顯著下調(diào)，而其靶基因GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要作用。這表明，這些miRNAs可能通過調(diào)節(jié)激素水平，影響煙草對(duì)赤星病的抗性反應(yīng)。其次，部分差異表達(dá)miRNAs與植物防御相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控有關(guān)。例如，miR159和miR172在感染葉片中顯著下調(diào)，它們的靶基因包括病程相關(guān)蛋白基因和抗病性相關(guān)基因。這些miRNAs可能通過調(diào)節(jié)這些基因的表達(dá)，增強(qiáng)煙草對(duì)赤星病的抗性。此外，一些差異表達(dá)miRNAs與植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)有關(guān)。例如，miR164在感染葉片中顯著上調(diào)，其靶基因包括細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白基因。這表明，這些miRNAs可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成，增強(qiáng)煙草對(duì)赤星病的防御能力。4.2miRNAs調(diào)控?zé)煵菘钩嘈遣〉姆肿訖C(jī)制在本研究中，我們通過生物信息學(xué)方法和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，揭示了miRNAs在煙草抗赤星病中的調(diào)控機(jī)制。首先，我們發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的miRNAs可能通過靶向調(diào)控植物激素信號(hào)途徑，影響煙草的防御反應(yīng)。例如，miR396靶向調(diào)控GRAS家族轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而影響植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)煙草的防御反應(yīng)。其次，差異表達(dá)的miRNAs可能通過調(diào)控植物防御相關(guān)基因的表達(dá)，參與煙草抗赤星病的分子機(jī)制。例如，miR159和miR172靶向調(diào)控病程相關(guān)蛋白基因和抗病性相關(guān)基因，從而增強(qiáng)煙草的防御能力。此外，差異表達(dá)的miRNAs還可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白基因的表達(dá)，影響煙草對(duì)赤星病的抗性。例如，miR164靶向調(diào)控細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)蛋白基因，從而增強(qiáng)煙草的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，提高其抗病性。綜上所述，本研究通過高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)方法，鑒定出多個(gè)與煙草抗赤星病相關(guān)的miRNAs，并揭示了它們?cè)跓煵菘共⌒灾械纳飳W(xué)功能和調(diào)控機(jī)制。這些研究結(jié)果為解析煙草抗赤星病的分子機(jī)制提供了新的思路，也為煙草抗病育種提供了新的基因資源。然而，由于植物抗病性是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程，涉及多個(gè)基因和信號(hào)途徑的相互作用，因此，我們?nèi)孕枰獙?duì)煙草抗赤星病的分子機(jī)制進(jìn)行更深入的研究。在未來的研究中，我們將繼續(xù)探索其他可能參與煙草抗赤星病的miRNAs及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，以期為煙草抗病育種提供更多的理論依據(jù)和技術(shù)支持。5.結(jié)論5.1研究總結(jié)本研究通過高通量測序技術(shù)，全面分析了健康煙草植株與赤星病感染植株葉片中的miRNA表達(dá)譜差異，成功鑒定出一批與煙草抗赤星病相關(guān)的miRNAs。通過生物信息學(xué)方法預(yù)測這些miRNAs的潛在靶基因，并在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了這些miRNAs對(duì)赤星病抗性的調(diào)控作用。研究結(jié)果表明，這些miRNAs在煙草應(yīng)對(duì)赤星病的生理過程中扮演著重要的角色。具體來說，本研究首先對(duì)健康和感染赤星病的煙草葉片進(jìn)行了miRNA測序，共鑒定出數(shù)百個(gè)差異表達(dá)miRNAs。通過聚類分析和相關(guān)性分析，我們發(fā)現(xiàn)了多個(gè)顯著變化的miRNAs，這些miRNAs在煙草抗病反應(yīng)中可能起著關(guān)鍵作用。接著，利用生物信息學(xué)工具TargetFinder和PicTar，我們預(yù)測了這些miRNAs的潛在靶基因，并篩選出與植物疾病抗性相關(guān)的基因。隨后，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)驗(yàn)證了這些miRNAs與其預(yù)測靶基因之間的表達(dá)調(diào)控關(guān)系。進(jìn)一步的功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，部分miRNAs通過調(diào)節(jié)其靶基因的表達(dá)，影響煙草植株對(duì)赤星病的抗性。例如，miR159通過靶向調(diào)控一個(gè)與細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)相關(guān)的基因，增強(qiáng)了煙草葉片對(duì)病原菌的防御能力。而miR172則可能通過影響激素信號(hào)途徑來調(diào)節(jié)煙草的免疫反應(yīng)。5.2研究意義與展望本研究的成果不僅為深入理解煙草抗赤星病的分子機(jī)制提供了新的視角，也為煙草抗病育種提供了潛在的分子標(biāo)記和基因工程策略。通過對(duì)這些miRNAs及其靶基因的深入研究，我們有望培育出具有更高抗赤星病能力的煙草品種，減少病害造成的經(jīng)濟(jì)損失，并對(duì)環(huán)境保護(hù)和可持續(xù)發(fā)展做出貢獻(xiàn)。盡管本研究取得了一定的成果，但仍存在一些局限性。首先，高通量測序技術(shù)可能無法檢測到低豐度的miRNAs，這可能導(dǎo)致部分與抗病相關(guān)的miRNAs未被鑒定出來。其次，本研究主要依賴于生物信息學(xué)預(yù)測和實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證，未來的研究可以通過更多的實(shí)驗(yàn)方法，如基因敲除或過表達(dá)實(shí)驗(yàn)，來進(jìn)一步驗(yàn)證miRNAs的功能。展望未來，可以從以下幾個(gè)方面繼續(xù)深入研究：一是探索更多與煙草抗赤星病相關(guān)的miRNAs及其作用機(jī)制；二是將這些miRNAs與現(xiàn)有的抗病育種策略相結(jié)合，開發(fā)新型的抗病煙草品種；三是通過比較不同品種煙草對(duì)赤星病的抗性差異，挖掘更多潛在的miRNAs和靶基因。此外，還可以將研究視野擴(kuò)展到其他植物物種，探究miRNAs在不同植物抗病過程中的通用性和特異性。通過這些研究，我們不僅能夠?yàn)闊煵莓a(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供技術(shù)支持，還能為整個(gè)植物病