步驟三、轉膜3

膜的選擇：NC，PVDF，尼龍膜

轉膜方法：半干轉、濕轉

轉膜確認當前第1頁\共有50頁\編于星期六\11點原料是基礎--膜選擇種類NCPVDF尼龍膜選擇標準a.膜與目的蛋白分子的結合能力（也就是單位面積的膜能結合蛋白的載量），以及膜的孔徑（也就是攔截蛋白的大?。籦.不影響后續(xù)的顯色檢測（也就是適合用于所選的顯色方法，信噪比好）；c.后繼實驗有其他要求，比如要做蛋白測序或者質譜分析，還要根據不同目的來挑選不同的轉移膜當前第2頁\共有50頁\編于星期六\11點膜的選擇當前第3頁\共有50頁\編于星期六\11點轉移方法半干轉用濾紙吸buffer來做轉移體系的轉移方法；適合轉移小分子量的蛋白；半干轉的電流大小是按照面積來算的：1.2mA/cm2，時間是根據蛋白分子大小定的；56mA/膜1h濕轉將膜、膠、濾紙整個浸泡在buffer的Tank里轉移的方法；適合轉移大分子量（100KD以上）蛋白；濕轉電流是恒定的，時間也是根據分子量而定；300mA

1h當前第4頁\共有50頁\編于星期六\11點封閉+陽極-陰極多孔墊片濾紙凝膠膜濾紙

墊片

2層濾紙

膜（左上角標記）凝膠（Marker靠左）

2層濾紙墊片白色夾板（正極）黑色夾板（負極）300mA1h56mA/膜1h轉移操作當前第5頁\共有50頁\編于星期六\11點

轉膜后確認麗春紅：轉膜后直接把纖維素膜浸到麗春紅染色液里在搖床上搖,就能把蛋白質染成紅色了,肉眼可見.麗春紅帶負電荷,可以與帶正電荷的氨基酸殘基結合,同時麗春紅也可以與蛋白的非極性區(qū)相結合,從而形成紅色的條帶.

可逆染色：麗春紅對蛋白的染色是可逆的,染色后可以用蒸餾水,PBS或其它適當溶液洗去.與下游WB檢測完全兼容，無任何干擾蛋白質預染Markers實時監(jiān)測分子量參照當前第6頁\共有50頁\編于星期六\11點封閉去除非特異結合位點：BlockingBuffer：3%BSA

5%MilkRoomTemperature1h.

當前第7頁\共有50頁\編于星期六\11點一抗的選擇單克隆抗體多克隆抗體二抗的選擇

HRP，AP，生物素，熒光素，羅丹明標記注意：抗體的稀釋倍數是由底物和待檢測蛋白質的豐度決定的，為了獲得最佳實驗結果，強烈推薦進行預實驗，以確定具體的實驗參數.抗體孵育當前第8頁\共有50頁\編于星期六\11點抗體的選擇作為western來講，理論上單抗比多抗的特異性要好，但單抗種類較少一般價格偏高，所以一般來說多抗足夠了。用于western的抗體和用于ELISA的抗體，一般來說用于western的抗體識別的是氨基酸序列特異性；而可用于ELISA的抗體則要看抗原種類，有些是識別氨基酸序列特異性，有些是識別構象特異性。所以一般根據抗體說明書來確定。做免疫印跡時選擇抗體主要應考慮兩個問題，一是所選抗體是否能識別凝膠電泳后轉印至膜上的變性蛋白，另一個是所選抗體是否會引起交叉反應條帶。當前第9頁\共有50頁\編于星期六\11點HRP（辣根過氧化酶)AP（堿性磷酸酶）大小40kD140kD最佳酶活性PH：5－7PH：8－10酶活和二抗特異性好于AP抑制劑氰化物，硫化物疊氮鈉氰化物，砷酸鹽，有機磷，二價陽離子螯合劑穩(wěn)定性零度以下穩(wěn)定零度以下不穩(wěn)定底物很多部分動力學特性快速慢價格便宜昂貴發(fā)光底物

ECL顯色底物TMB，CN，DABNBT，BCIP，NBT/BCIP兩種常用檢測酶系統(tǒng)的比較ECL：化學發(fā)光法當前第10頁\共有50頁\編于星期六\11點

檢測方法化學顯色法方便、便宜、有毒、靈敏度較低、費抗體、反應慢、線性窄、不易保存、不能重新剝離檢測化學發(fā)光法靈敏、快速、節(jié)省抗體、反應快、線性寬、無害、特異性高、可重新剝離檢測當前第11頁\共有50頁\編于星期六\11點八仙過海，各“顯”神通--顯色方法同位素法

靈敏度高、不安全、環(huán)境污染、不方便和半衰期短

熒光底物法

Krypton?熒光底物當前第12頁\共有50頁\編于星期六\11點SDS電泳常見問題分析當前第13頁\共有50頁\編于星期六\11點高背景當前第14頁\共有50頁\編于星期六\11點條帶弱當前第15頁\共有50頁\編于星期六\11點其他當前第16頁\共有50頁\編于星期六\11點推薦對照設置

內參對照beta-actin(肌動蛋白)/beta-tubulin(微管蛋白)/GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)1.是檢測整個WB實驗過程及體系是否正常工作，如果一個實驗連內參照都出不料陽性結果的話（在內參抗體有效的情況下），那么這個體系就是存在問題的了。

2.半定量的標準：內參一般選擇的管家基因編碼表達的蛋白，在很多組織和細胞中中都是穩(wěn)定表達的，因此可以作為檢測靶蛋白表達量的標準。陽性對照檢測一抗是否正常陰性對照檢測一抗特異性空白對照不加一抗，只加二抗，檢測二抗是否發(fā)生交叉反應

當前第17頁\共有50頁\編于星期六\11點PerfectData

SDS

轉膜

封閉一抗顯色或化學發(fā)光

二抗

蛋白樣品制備

洗膜

WesternBlot當前第18頁\共有50頁\編于星期六\11點FurtherReadings生物秀WesternBlotting專題

Millipore的蛋白印跡手冊

Bio-Rad的westernBlotting操作手冊

Westernblot問題解答專帖當前第19頁\共有50頁\編于星期六\11點4.3蛋白質的測序當前第20頁\共有50頁\編于星期六\11點直接測定法

化學測定法質譜間接測定法。先得到某一種蛋白質基因的核苷酸序列，然后根據通用的遺傳密碼表間接推導出由其決定的氨基酸序列。蛋白質一級結構的測定當前第21頁\共有50頁\編于星期六\11點蛋白質一級結構直接測定法的主要步驟當前第22頁\共有50頁\編于星期六\11點（一）、蛋白質測序策略(2)

多肽鏈的拆分當前第23頁\共有50頁\編于星期六\11點（一）、蛋白質測序策略幾條多肽鏈借助非共價鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體?？捎?mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開多肽鏈(亞基)。當前第24頁\共有50頁\編于星期六\11點（一）、蛋白質測序策略(3)

斷開二硫鍵在8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍存在下，用過量的

-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護生成的巰基，防止重新被氧化。當前第25頁\共有50頁\編于星期六\11點當前第26頁\共有50頁\編于星期六\11點（一）、蛋白質測序策略(4)測定每條多肽鏈的AA組成，并計算出AA成分的分子比(5)分析多肽鏈的N-末端和C-末端(6)多肽鏈斷裂成多個肽段采用兩/多種不同的斷裂方法將多肽斷裂成兩套或多套肽段，并將其分離。當前第27頁\共有50頁\編于星期六\11點（一）、蛋白質測序策略(7)測定每個肽段的氨基酸順序(8)確定肽段在多肽鏈中的次序

利用兩/多套肽段的AA順序彼此間的交錯重疊，拼湊出整條多肽鏈的AA順序。當前第28頁\共有50頁\編于星期六\11點（一）、蛋白質測序策略(9)確定原多肽鏈中二硫鍵的位置。當前第29頁\共有50頁\編于星期六\11點蛋白質順序測定的基本戰(zhàn)略

將肽段順序進行疊聯以確定完整的順序將肽段分離并測出順序專一性裂解末端氨基酸測定二硫鍵拆開純蛋白質當前第30頁\共有50頁\編于星期六\11點胃蛋白酶處理沒有斷開二硫鍵的多肽鏈（最適pH約2，此時二硫鍵不斷開）（在二硫鍵保持完整的條件下，將蛋白質特異切割成肽段。）經電泳分離各肽段用過甲酸斷開二硫鍵，含有-S-S-的肽段帶電性質發(fā)生變化，轉向90℃二次電泳，曾含二硫鍵的肽段遷移率發(fā)生變化然后同其它方法分析的肽段進行比較，確定二硫鍵的位置二硫鍵位置的確定當前第31頁\共有50頁\編于星期六\11點二硫鍵位置的確定對角線電泳當前第32頁\共有50頁\編于星期六\11點Sanger反應1、末端分析

二硝基氟苯（DNFB）法O2NFNO2+

H2NCHCROHNCHCROO2NNO2H+H2OO2NNO2HNCHCROOH+氨基酸DNFBN-端氨基酸DNP衍生物DNP-氨基酸末端氨基酸殘基的鑒定N二硝基苯衍生物黃色當前第33頁\共有50頁\編于星期六\11點二甲氨基萘磺酰-AA有強熒光，檢測靈敏度高

丹磺酰氯（DNS）法末端氨基酸殘基的鑒定、末端分析1N(DNS-aa)當前第34頁\共有50頁\編于星期六\11點

苯異硫氰酸酯法（PITC法、Edman降解法）末端氨基酸殘基的鑒定、末端分析1N—N=C=S+N—CH—COOHHHRPITC—N—C—N—CH—COOHHHRSPTC-氨基酸pH8.3苯異硫氰酸酯PITC當前第35頁\共有50頁\編于星期六\11點PITCPTC-肽當前第36頁\共有50頁\編于星期六\11點肽鏈外切酶從多肽鏈N-端逐個向里水解根據不同反應時間測出釋放的AA種類和數量，按反應時間和AA殘基釋放量作動力學曲線

④氨肽酶法（aminopeptidase,Apase）末端氨基酸殘基的鑒定、末端分析1N當前第37頁\共有50頁\編于星期六\11點末端氨基酸殘基的鑒定肼，又稱聯氨，無色、油狀液體，主要用作火箭和噴氣發(fā)動機的燃料。多肽與無水肼加熱，C-端氨基酸即從肽鏈上解離出來，其余的氨基酸則變成酰肼化物。酰肼化物能夠與苯甲醛縮合成不溶于水的物質而與C-端氨基酸分離。①肼解法（聯氨法）、末端分析2C當前第38頁\共有50頁\編于星期六\11點末端氨基酸殘基的鑒定、末端分析2CC末端AA可用硼氫化鋰還原成α氨基醇②硼氫化鋰還原法當前第39頁\共有50頁\編于星期六\11點末端氨基酸殘基的鑒定肽鏈外切酶:從多肽鏈C-端逐個水解根據不同反應時間釋放出的AA種類和數量確定蛋白質C-末端殘基順序。③羧肽酶法、末端分析2C當前第40頁\共有50頁\編于星期六\11點4種羧肽酶的來源和專一性羧肽酶來源專一性CpA胰臟能釋放除pro、Arg和Lys以外的所有C端氨基酸CpB胰臟主要水解C端為Arg或Lys的肽鍵CpC植物或微生物相當廣泛，幾乎能釋放C端的所有氨基酸CpY面包酵母可釋放C端所有氨基酸當前第41頁\共有50頁\編于星期六\11點1、酶解法:內切酶：胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶外切酶：羧肽酶和氨肽酶多肽鏈的選擇性降解多肽鏈的部分裂解當前第42頁\共有50頁\編于星期六\11點R2=Phe（F）、Trp（W）、Tyr（Y）、Leu（L）、Ile（I）、Met（M）、Val（V）及其它疏水性強的AA水解速度較快肽鏈水解位點R2=Pro或Gly，不水解R1或R3=Pro，抑制水解嗜熱菌蛋白酶（thermolysin)當前第43頁\共有50頁\編于星期六\11點R1=Lys（K）和Arg（R）專一性較強，水解速度快R2=Pro（抑制）肽鏈水解位點胰蛋白酶