體ZJSCDetectionmethodsforMacrobrachI本文件按照GB/T1.1—2020《標準化工作導(dǎo)則第1部分：標準化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構(gòu)不承擔識別專利的責任。2沼蝦黃病毒檢測方法本文件描述了試劑和材料、儀器設(shè)備，采樣、RNA提取、套式RT-PCR檢測、RT-qPCR檢測、RT-LAMPGB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和沼蝦黃病毒macrobrachiumflavivirus羅氏沼蝦鐵蝦綜合癥的主要病毒性病原，病毒粒子為具囊膜的直徑約55nm的球形顆粒，核酸類型），DEPC：焦乙酸二乙酯（diethylpyrocarbonatDNA：脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacidNTPs：脫氧核糖核苷三磷酸混合物（deoxy-ribonucleosidetriphosphaFAM：羧基熒光素（carboxyfluorescIPV:傳染性早熟病毒（infectM-MLV：莫洛尼鼠白血病病毒（Moloneymurineleukemiavirus）RdRp：RNA依賴的RNA聚合酶（RNA-dependentRNApolymeraRNA：核糖核酸（ribonucleicRNasin：核糖核酸酶抑制劑（RNaseinhibiRT-PCR：逆轉(zhuǎn)錄PCR（reversetranscriptionRT-qPCR：逆轉(zhuǎn)錄實時熒光定量PCR（reversetranscriptionquantitativereal-tim3除非另有說明,在分析中僅使用確認為分析純的試劑和）：5.12瓊脂糖電泳核酸染料：商品化試劑。）：）：）：a)MFV-533F1：5′-GAAGTCAGAGCGACAGb)MFV-533R1：5′-TGGGCGATCCCTCCTGTTc)MFV-474F2：5′-TTGGGTTTGTTTGAGGd)MFV-474R2：5′-CCTCCTGTTTCGATGAa)MFV-Tq140F：5′-AGGAGAGGGTTTTGGb)MFV-Tq140R：5′-CTGGATTGGAAGGGAACTCTG-c)MFV-TqMAN：5′-6-FAM-CCGCGACACTTACAACTGCF3、MFV-B3：2μmol/L，MFV-LpF：）；MFV-FIP：5′-CCTCCTGTGCTTCACTATGACTTTAGACAGCCTCTATCTACTTC-3′；MFV-BIP：5′-GATATCACGGACGGCGAGTTTATAGCATCAGACAGCGAT-3′；MFV-F3：5′-GAACCAGTGACTAGACCA-3′；MFV-B3：5′-TCTGTCATCACATCCACA-3′；MFV-LpF：5′-TGTGACAATCGCCATAACA-3′。46.5低溫高速離心機：4℃,轉(zhuǎn)速≥12000r/min?；蟮淖形r、稚蝦和出現(xiàn)臨床癥狀的成蝦，臨床癥非致死性方式取樣的親蝦，可采集游泳足或鰓片。組織樣品0℃~4℃低溫狀態(tài)運送至實驗室。μL10μM引物MFV533R1，2.5μL無RNA酶水和2μL待測樣品RNA模板（1ng/μL～1000ng/μL）?；靹蚝?，迅速置于冰中。合成的cDNA可立即用于PCR擴增，或保存于-20℃?zhèn)溆?。也可采用等效的商品化cDNA合μL、MgCl23μL、引物MFV533F15在冰盒上配制50μL第二輪PCR反應(yīng)體系。在反應(yīng)管中加入：水37μL、10×μL、MgCl23μL、引物MFV474F21μL、引物MFV474R21μL、第一輪PCR產(chǎn)物1μL、TaqDNA聚合酶1μL。9.4瓊脂糖電泳制備瓊脂糖凝膠。將5μLPCR擴增產(chǎn)物和1μL6×載樣緩沖液混勻后加入到加樣孔中，同時設(shè)立DNA分子量標準對照。電泳時，當載樣緩沖液中的溴酚藍指示劑色帶遷移至瓊脂糖凝膠2/3處時停止電泳，在9.5結(jié)果判定帶，陰性對照在533bp和474bp處均無條帶，且空白對照不出現(xiàn)任何條帶，實驗有效。dNTPs1μL、MgCl22μL、引物MFV-Tq140F1μL、引物MF的cDNA4μL、Hot-StartTaqDNA聚合酶1μL?；靹颍糜跓晒舛縋CR儀中。按以下程序進行qPCR擴確定Ct值。也可采用等效的商品化qPCR試劑盒或一步法RT-qPCR試10.3.1若陰性對照Ct值＞37且無典型“S”形擴增曲線，陽性對照Ct值≤37，并出現(xiàn)典型“S”10.3.2若樣品的Ct值≤37，且出10.3.4若樣品無典型“S”形擴增曲線，結(jié)6環(huán)。每次循環(huán)收集一次FAM熒光信號。循環(huán)結(jié)束后，確定50μL40mM50μL25μL25μL350μL2.8mM甜菜堿（6M）333.3μL25μL0.64U/μL50μL0.4U/μL66.7μL—2×11.2.1若陰性對照和空白對照無——套式RT-PCR檢測結(jié)果為陽性，且測序結(jié)果正7A.1疾病描述A.2病原特征個新屬，為球形、直徑約55nm、具囊膜的病毒。其基因組為正義單鏈RNA，全長約12.57Kb，存在一個“程序性核糖體移位（programmedribosomalframeshifting,PRF）”位點。其主要表現(xiàn)為生長緩慢、性腺發(fā)育提前、脫殼延緩、殼色深且硬，并具有傳染性的特征。養(yǎng)殖60d~倍以上，第二步足前端出現(xiàn)淡藍色甚至藍色的指節(jié)，指關(guān)節(jié)外側(cè)有8B.1MFV套式RT-PCR引物在靶基因中的位置（GenBank登錄號：MT301AATGGGGAGGGGACTAACCGAAGTCAGAGCGACAGCGAGAGCCTMFV-533F1361TGTAAGCTTTTGGGTTTGTTTGAGGTGTGAAAGTTTTGGGACGAMFV-474F2421TTAGCTATCCGTGGTGTGGAACCTAAGTAAGAGACAGCCG481TGTAAGCCCAGCTTAGGCAACCAGGTGACTCTCATTACCG541GGCTGAAGGGGCGGGCCTCACACTTGGCTCTTGTTTATGGTG601TAATGCTTCTCATGATGAACTAGCGGGGTGTTAC661AAGTCAGTGTGCTCATGAGAACCTGATTTGGAGT721AGTTCCTCCGTCAGTGGCCCTCTTTGTGCTTGGGGACTTC781CTTAAACCAGAGCGTAGCAGTATCCCC841AGGGATCGCCCAGCTCGCAACTGGGGTACGCCCTAGGGAB.2MFVRT-qPCR引物和探針在靶基因中的位置（GenBank登錄號：MT64RT-qLAMP引物在靶基因中的位置（GenBank登錄TTCCCAACCCCCTCCAAAGTGGGGGGGGAACCAGTGACTAGACCAAGTTTCCCAACCCCCTCCAAAGTGGGGGGGGAACCAGTGACTAGACCAAGTCTATCTACTTCTGATCATTGTTATGGCGATTGTCACATTGTCAATAGTCAT4-------CTATCTACTTCTGATCATTGTTATGGCGATTGTCACATTGTCAATAGTCAT4----------------叫------------CAGGAGGAAGTC