人參多糖誘導(dǎo)急性早幼粒白血病細(xì)胞凋亡的機(jī)制及應(yīng)用前景探究一、引言1.1研究背景與意義1.1.1急性早幼粒白血病的危害與現(xiàn)狀急性早幼粒白血?。ˋPL），在急性髓系白血?。ˋML）分型中屬M(fèi)3型，是一種較為兇險(xiǎn)的血液系統(tǒng)惡性腫瘤。其特征為骨髓中異常早幼粒細(xì)胞大量增殖、分化受阻，這些異常細(xì)胞會(huì)抑制正常造血功能，并廣泛侵襲肝、脾、淋巴結(jié)等臟器。APL起病急驟，以貧血、出血、感染為主要臨床表現(xiàn)?；颊叱３霈F(xiàn)面色蒼白、乏力、心悸、呼吸困難等貧血癥狀；皮膚瘀點(diǎn)、瘀斑、鼻出血、牙齦出血、月經(jīng)過多，甚至顱內(nèi)出血等嚴(yán)重出血表現(xiàn)也很常見，這是導(dǎo)致患者早期死亡的重要原因之一；由于正常白細(xì)胞減少，尤其是中性粒細(xì)胞減少，患者免疫力低下，極易發(fā)生細(xì)菌、病毒和真菌感染，如口腔炎、肺炎、敗血癥等，嚴(yán)重威脅患者生命健康。盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)在APL治療方面取得了顯著進(jìn)展，全反式維甲酸（ATRA）和三氧化二砷（ATO）的聯(lián)合應(yīng)用使APL的完全緩解率和長期生存率大幅提高，臨床治愈率高達(dá)90%以上。但仍存在一些問題，部分患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)后治療難度顯著增加，預(yù)后較差；治療過程中，患者可能面臨維甲酸綜合征、砷劑相關(guān)不良反應(yīng)以及化療藥物的骨髓抑制、肝腎功能損害等副作用，影響患者生活質(zhì)量和治療依從性。因此，尋找安全、有效的新型治療手段或輔助治療藥物，進(jìn)一步提高APL的治療效果，降低復(fù)發(fā)率和不良反應(yīng)，成為當(dāng)前白血病治療領(lǐng)域亟待解決的重要課題。1.1.2人參多糖的研究價(jià)值人參（PanaxginsengC.A.Mey）作為傳統(tǒng)名貴中藥材，在我國有著悠久的藥用歷史，其味甘，微苦，微溫，歸脾、肺、心、腎經(jīng)，具有大補(bǔ)元?dú)?、?fù)脈固脫、補(bǔ)脾益肺、生津養(yǎng)血、安神益智等功效。人參化學(xué)成分復(fù)雜，除人參皂苷外，多糖也是其重要的有效成分之一，約占人參總成分的5%。人參多糖（GPS）主要由人參淀粉樣物質(zhì)和人參果膠組成，其中人參淀粉樣物質(zhì)約占80%，人參果膠約占20%，而人參果膠為人參多糖主要的活性物質(zhì)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，人參多糖具有多種生物活性。在免疫調(diào)節(jié)方面，它能夠增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，激活巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等免疫細(xì)胞，提高機(jī)體的抗菌、抗病毒和抗真菌能力；調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的功能，增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，減輕免疫病理損傷。在抗腫瘤方面，人參多糖能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長和增殖，其機(jī)制包括抑制腫瘤細(xì)胞的DNA合成、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞的血管生成等；還能調(diào)節(jié)腫瘤免疫應(yīng)答，激活樹突狀細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞，促進(jìn)抗腫瘤免疫應(yīng)答，抑制腫瘤細(xì)胞的免疫逃避。此外，人參多糖還具有抗氧化、降血糖、調(diào)控血細(xì)胞生成等作用。鑒于人參多糖的抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)活性，研究其對急性早幼粒白血病細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用具有重要意義。這不僅有助于深入了解人參多糖的抗腫瘤機(jī)制，為其在白血病治療領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)；也有望為急性早幼粒白血病的治療開辟新的途徑，提供新的治療策略或輔助治療方法，提高患者的治療效果和生活質(zhì)量。1.2研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在深入探究人參多糖對急性早幼粒白血病細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用及其分子機(jī)制，為急性早幼粒白血病的治療提供新的潛在藥物和理論依據(jù)。具體而言，通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，觀察不同濃度人參多糖作用于急性早幼粒白血病細(xì)胞株后，細(xì)胞形態(tài)、生長增殖及凋亡情況的變化，明確人參多糖誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的有效濃度范圍及時(shí)間效應(yīng)關(guān)系；借助分子生物學(xué)技術(shù)，檢測凋亡相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)水平，以及細(xì)胞信號通路關(guān)鍵分子的活性變化，揭示人參多糖誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的內(nèi)在分子機(jī)制；在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，構(gòu)建急性早幼粒白血病動(dòng)物模型，給予人參多糖干預(yù)，評估其對白血病進(jìn)展的影響，包括生存期、腫瘤負(fù)荷、血常規(guī)指標(biāo)等，驗(yàn)證人參多糖在體內(nèi)的抗腫瘤效果。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和作用機(jī)制研究上，本研究具有以下創(chuàng)新點(diǎn)。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方面，采用多維度研究策略，綜合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，從細(xì)胞水平和整體動(dòng)物水平全面評估人參多糖的作用效果，使研究結(jié)果更具說服力和臨床轉(zhuǎn)化價(jià)值；設(shè)置多時(shí)間點(diǎn)和多濃度梯度，動(dòng)態(tài)監(jiān)測人參多糖作用過程中細(xì)胞和動(dòng)物模型的變化，更精準(zhǔn)地確定其最佳作用條件和劑量-效應(yīng)關(guān)系，為后續(xù)臨床應(yīng)用提供更詳細(xì)的數(shù)據(jù)支持；引入聯(lián)合用藥實(shí)驗(yàn)，將人參多糖與傳統(tǒng)化療藥物或其他靶向藥物聯(lián)合使用，觀察其協(xié)同作用效果，探索新的治療方案，為臨床聯(lián)合治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。在作用機(jī)制研究方面，從多個(gè)信號通路和分子靶點(diǎn)進(jìn)行深入挖掘，不僅關(guān)注經(jīng)典的凋亡相關(guān)信號通路，如線粒體途徑、死亡受體途徑等，還探索人參多糖對其他可能參與白血病細(xì)胞凋亡調(diào)控的信號通路的影響，如PI3K/Akt、MAPK等信號通路，全面揭示其作用機(jī)制；運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，對人參多糖作用后的白血病細(xì)胞進(jìn)行全蛋白質(zhì)組和全轉(zhuǎn)錄組分析，篩選出差異表達(dá)的蛋白質(zhì)和基因，發(fā)現(xiàn)新的潛在作用靶點(diǎn)和分子機(jī)制，為白血病治療的藥物研發(fā)提供新的方向；結(jié)合生物信息學(xué)分析，構(gòu)建人參多糖作用于白血病細(xì)胞的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，深入解析其作用的分子機(jī)制和網(wǎng)絡(luò)調(diào)控關(guān)系，從系統(tǒng)生物學(xué)角度全面理解人參多糖的抗腫瘤作用。二、急性早幼粒白血病與細(xì)胞凋亡2.1急性早幼粒白血病概述2.1.1發(fā)病機(jī)制急性早幼粒白血病的發(fā)病機(jī)制與染色體易位及融合基因密切相關(guān)。90%以上的APL患者存在特異性染色體易位t(15;17)(q22;q12)，即15號染色體長臂上的早幼粒細(xì)胞白血?。≒ML）基因與17號染色體長臂上的維甲酸受體α（RARα）基因發(fā)生斷裂并相互易位，形成PML-RARα融合基因。這一融合基因編碼的融合蛋白具有異常的生物學(xué)功能，它能夠與多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子相互作用，干擾正常的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)致早幼粒細(xì)胞的分化阻滯在早幼粒階段，無法正常分化成熟為中性粒細(xì)胞。PML-RARα融合蛋白還可以抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，使得異常早幼粒細(xì)胞逃避凋亡，在骨髓中大量積聚，從而引發(fā)急性早幼粒白血病。除了經(jīng)典的t(15;17)易位形成PML-RARα融合基因外，還有極少數(shù)APL患者存在變異型染色體易位和融合基因，如t(11;17)(q23;q12)形成PLZF-RARα融合基因，t(5;17)(q35;q12)形成NPM-RARα融合基因等。這些變異型融合基因雖然較為罕見，但其編碼的融合蛋白同樣會(huì)干擾細(xì)胞的正常分化和凋亡過程，導(dǎo)致APL的發(fā)生，且它們對治療的反應(yīng)和預(yù)后可能與經(jīng)典型APL有所不同。2.1.2臨床特征與危害APL起病急驟，病情兇險(xiǎn)，具有獨(dú)特的臨床特征。出血傾向是APL患者最為突出的臨床表現(xiàn)之一，幾乎所有患者在疾病初期或病程中都會(huì)出現(xiàn)不同程度的出血癥狀。輕者表現(xiàn)為皮膚瘀點(diǎn)、瘀斑、鼻出血、牙齦出血、月經(jīng)過多等；重者可出現(xiàn)消化道出血、泌尿道出血，甚至顱內(nèi)出血，顱內(nèi)出血是APL患者早期死亡的重要原因之一。這主要是由于APL細(xì)胞釋放大量促凝物質(zhì)，激活凝血系統(tǒng)，導(dǎo)致彌散性血管內(nèi)凝血（DIC），消耗大量凝血因子和血小板，同時(shí)纖溶系統(tǒng)也被激活，進(jìn)一步加重出血傾向。發(fā)熱和感染也是APL常見的癥狀。由于白血病細(xì)胞大量增殖，正常造血功能受抑制，患者外周血中中性粒細(xì)胞數(shù)量顯著減少，免疫功能下降，極易受到細(xì)菌、病毒和真菌感染。常見的感染部位包括口腔、呼吸道、消化道和泌尿道等，可表現(xiàn)為口腔炎、肺炎、腸炎、膀胱炎等，嚴(yán)重時(shí)可發(fā)展為敗血癥，危及患者生命。貧血癥狀在APL患者中也較為常見，患者可出現(xiàn)面色蒼白、乏力、頭暈、心悸、氣短等表現(xiàn)，這是由于白血病細(xì)胞抑制骨髓正常造血，紅細(xì)胞生成減少，以及出血導(dǎo)致紅細(xì)胞丟失過多所致。此外，患者還可能出現(xiàn)肝、脾、淋巴結(jié)腫大，胸骨壓痛等癥狀。肝、脾、淋巴結(jié)腫大是由于白血病細(xì)胞浸潤這些組織器官引起；胸骨壓痛則是白血病細(xì)胞浸潤骨髓，刺激骨膜神經(jīng)所致。APL若不及時(shí)治療，病情進(jìn)展迅速，患者生存期短，嚴(yán)重威脅患者的生命健康。盡管目前ATRA和ATO的聯(lián)合應(yīng)用顯著改善了APL患者的預(yù)后，但仍有部分患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)、耐藥以及治療相關(guān)并發(fā)癥，影響患者的長期生存和生活質(zhì)量。2.2細(xì)胞凋亡的基本原理2.2.1細(xì)胞凋亡的概念與特征細(xì)胞凋亡，又稱程序性細(xì)胞死亡，是一種由基因精確調(diào)控的細(xì)胞主動(dòng)性死亡過程。這一過程在多細(xì)胞生物的生長發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)維持以及免疫調(diào)節(jié)等生理過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。與細(xì)胞壞死這種被動(dòng)性、病理性死亡方式不同，細(xì)胞凋亡是一種有序的、受調(diào)控的過程，通常不會(huì)引發(fā)炎癥反應(yīng)。在細(xì)胞凋亡過程中，細(xì)胞會(huì)發(fā)生一系列典型的形態(tài)學(xué)變化。早期階段，細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞間連接逐漸喪失，導(dǎo)致細(xì)胞與周圍細(xì)胞分離。細(xì)胞膜表面出現(xiàn)微絨毛減少、膜皺縮等現(xiàn)象，同時(shí)細(xì)胞膜的磷脂酰絲氨酸（PS）從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到外側(cè)，這一變化可被AnnexinV特異性識(shí)別，常被用于細(xì)胞凋亡早期的檢測。隨著凋亡進(jìn)程的推進(jìn)，細(xì)胞核發(fā)生明顯變化，核膜內(nèi)陷，染色質(zhì)逐漸凝聚，邊緣化，形成新月形或塊狀結(jié)構(gòu)，緊貼于核膜內(nèi)側(cè)。隨后，細(xì)胞核進(jìn)一步裂解，形成多個(gè)大小不等的核碎片。在細(xì)胞質(zhì)方面，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張并與細(xì)胞膜融合，形成一些泡狀結(jié)構(gòu)。最終，細(xì)胞通過出芽的方式形成多個(gè)凋亡小體，這些凋亡小體包裹著細(xì)胞核碎片、細(xì)胞器等物質(zhì)，其表面含有可被吞噬細(xì)胞識(shí)別的信號分子，如PS。吞噬細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞）會(huì)迅速識(shí)別并吞噬凋亡小體，將其消化分解，從而使細(xì)胞凋亡過程得以順利完成，避免細(xì)胞內(nèi)容物泄漏引發(fā)炎癥反應(yīng)。細(xì)胞凋亡還伴隨著一系列生化變化。核酸內(nèi)切酶被激活，將染色體DNA在核小體間切斷，形成180-200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段，在瓊脂糖凝膠電泳上呈現(xiàn)出典型的“梯狀”條帶，這是細(xì)胞凋亡的特征性生化標(biāo)志之一。半胱天冬酶（caspase）家族蛋白酶被激活，它們作為細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者，通過級聯(lián)反應(yīng)切割細(xì)胞內(nèi)的多種底物蛋白，如細(xì)胞骨架蛋白、DNA修復(fù)酶、轉(zhuǎn)錄因子等，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞，最終促使細(xì)胞凋亡。2.2.2細(xì)胞凋亡的信號通路細(xì)胞凋亡主要通過兩條經(jīng)典的信號通路來實(shí)現(xiàn)，即死亡受體途徑和線粒體途徑。這兩條通路相互關(guān)聯(lián)，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的進(jìn)程，確保細(xì)胞凋亡的精確調(diào)控。死亡受體途徑是由細(xì)胞外的死亡信號激活細(xì)胞表面的死亡受體而啟動(dòng)的。死亡受體屬于腫瘤壞死因子（TNF）受體超家族，其胞外區(qū)含有富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域，胞內(nèi)區(qū)含有死亡結(jié)構(gòu)域（DD）。常見的死亡受體包括Fas（CD95）、腫瘤壞死因子受體1（TNFR1）、TRAIL受體（DR4和DR5）等。當(dāng)相應(yīng)的配體，如Fas配體（FasL）、TNF-α、TRAIL等與死亡受體結(jié)合后，死亡受體發(fā)生三聚化，招募胞內(nèi)含有死亡結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白，如Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（FADD）。FADD通過其死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（DED）與procaspase-8的DED相互作用，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物（DISC）。在DISC中，procaspase-8發(fā)生自身切割和激活，成為具有活性的caspase-8?；罨腸aspase-8可以直接切割并激活下游的效應(yīng)caspase，如caspase-3、caspase-6和caspase-7，這些效應(yīng)caspase進(jìn)一步切割細(xì)胞內(nèi)的多種底物蛋白，引發(fā)細(xì)胞凋亡。此外，caspase-8還可以通過切割Bid蛋白，產(chǎn)生截短的Bid（tBid），tBid轉(zhuǎn)移到線粒體，激活線粒體途徑，從而放大細(xì)胞凋亡信號。線粒體途徑也稱為內(nèi)源性凋亡途徑，主要由細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)激信號觸發(fā)，如DNA損傷、氧化應(yīng)激、生長因子缺乏等。當(dāng)細(xì)胞受到這些應(yīng)激刺激時(shí)，線粒體的功能和結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變，線粒體膜電位（ΔΨm）下降，線粒體外膜通透性增加。這導(dǎo)致線粒體釋放多種凋亡相關(guān)蛋白，其中最重要的是細(xì)胞色素c（Cytc）。釋放到細(xì)胞質(zhì)中的Cytc與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結(jié)合，在ATP/dATP的存在下，Apaf-1發(fā)生自身聚合，形成多聚體復(fù)合物，即凋亡體。凋亡體招募并激活procaspase-9，使其轉(zhuǎn)化為具有活性的caspase-9?；罨腸aspase-9進(jìn)一步激活下游的效應(yīng)caspase，如caspase-3、caspase-6和caspase-7，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序。線粒體途徑還受到Bcl-2家族蛋白的精細(xì)調(diào)控。Bcl-2家族蛋白包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-XL等）和促凋亡蛋白（如Bax、Bak、Bid等）。在正常細(xì)胞中，抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白處于平衡狀態(tài)，維持線粒體的穩(wěn)定性。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，促凋亡蛋白被激活并發(fā)生構(gòu)象改變，插入線粒體外膜，形成孔道，導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，釋放凋亡相關(guān)蛋白；而抗凋亡蛋白則通過與促凋亡蛋白相互作用，抑制其活性，阻止線粒體膜的通透性改變，從而抑制細(xì)胞凋亡。這兩條信號通路并非完全獨(dú)立，它們之間存在著復(fù)雜的相互作用和交聯(lián)，共同調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的發(fā)生和發(fā)展。2.3急性早幼粒白血病與細(xì)胞凋亡的關(guān)系在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞凋亡是維持機(jī)體組織穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞數(shù)量平衡的關(guān)鍵機(jī)制。造血干細(xì)胞在骨髓中不斷增殖分化，產(chǎn)生各種血細(xì)胞，如紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板等。在這個(gè)過程中，適量的細(xì)胞凋亡能夠清除衰老、受損或多余的血細(xì)胞，確保造血系統(tǒng)的正常功能。正常造血干細(xì)胞分化為早幼粒細(xì)胞后，早幼粒細(xì)胞會(huì)進(jìn)一步分化成熟為中性粒細(xì)胞，完成其正常的發(fā)育過程。在這個(gè)過程中，細(xì)胞凋亡受到嚴(yán)格調(diào)控，當(dāng)早幼粒細(xì)胞完成其分化任務(wù)或出現(xiàn)異常時(shí)，會(huì)啟動(dòng)凋亡程序，被及時(shí)清除，從而維持骨髓中早幼粒細(xì)胞數(shù)量的相對穩(wěn)定。然而，在急性早幼粒白血病中，正常的細(xì)胞凋亡機(jī)制受到嚴(yán)重破壞。PML-RARα融合基因編碼的融合蛋白在這一過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。一方面，PML-RARα融合蛋白可以與維甲酸受體α（RARα）的天然配體維甲酸（RA）結(jié)合，形成異常的轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物。這種復(fù)合物能夠招募組蛋白去乙?；福℉DAC）等轉(zhuǎn)錄抑制因子，與一些與細(xì)胞分化和凋亡相關(guān)的基因啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，抑制這些基因的轉(zhuǎn)錄活性。例如，PML-RARα融合蛋白可以抑制促凋亡基因Bax、Bak等的表達(dá)，使細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白水平降低，從而抑制細(xì)胞凋亡；它還能抑制一些參與細(xì)胞分化的關(guān)鍵基因，如C/EBPα等的表達(dá)，導(dǎo)致早幼粒細(xì)胞的分化阻滯在早幼粒階段，無法正常分化成熟。另一方面，PML-RARα融合蛋白可以干擾正常的PML蛋白功能。正常的PML蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi)的PML核體中，參與細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)過程。而PML-RARα融合蛋白會(huì)破壞PML核體的結(jié)構(gòu)和功能，使PML蛋白無法正常發(fā)揮其促凋亡作用，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞凋亡受阻。由于細(xì)胞凋亡機(jī)制的異常，大量異常早幼粒細(xì)胞在骨髓中積聚。這些異常早幼粒細(xì)胞不僅自身增殖失控，還會(huì)抑制正常造血干細(xì)胞的增殖和分化，導(dǎo)致正常血細(xì)胞生成減少，從而引發(fā)貧血、感染和出血等一系列臨床癥狀。因此，誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡成為治療急性早幼粒白血病的關(guān)鍵策略之一。通過誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡，可以有效清除體內(nèi)的異常早幼粒細(xì)胞，恢復(fù)正常造血功能，達(dá)到治療疾病的目的。許多治療APL的藥物，如全反式維甲酸（ATRA）和三氧化二砷（ATO），其主要作用機(jī)制就是誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡。ATRA可以與PML-RARα融合蛋白結(jié)合，使其發(fā)生構(gòu)象改變，解離與基因啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合的轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物，恢復(fù)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄活性，從而誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化和凋亡；ATO則可以通過多種途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，包括誘導(dǎo)活性氧（ROS）生成、激活線粒體凋亡途徑、降解PML-RARα融合蛋白等。三、人參多糖的特性與研究現(xiàn)狀3.1人參多糖的結(jié)構(gòu)與成分人參多糖主要來源于五加科植物人參的根、莖、葉等部位。其結(jié)構(gòu)復(fù)雜，是由多種單糖通過糖苷鍵連接而成的生物大分子，分子量范圍在3.5×103-2.0×10?Da。人參多糖由人參淀粉和人參果膠兩部分組成，其中人參淀粉約占80%，人參果膠約占20%，而人參果膠是人參多糖發(fā)揮藥理活性的主要部分。從單糖組成來看，人參果膠主要包含半乳糖醛酸（GalA）、半乳糖（Gal）、阿拉伯糖（Ara）和少量鼠李糖（Rha）殘基。這些單糖在多糖鏈中的比例和連接方式對人參多糖的活性有著重要影響。研究發(fā)現(xiàn)，不同來源或提取方法得到的人參多糖，其單糖組成及比例存在差異，進(jìn)而導(dǎo)致其生物活性有所不同。從人參根中提取的人參果膠，經(jīng)淀粉酶脫去淀粉后，主要由半乳糖醛酸、半乳糖、阿拉伯糖殘基組成，還有少量鼠李糖殘基。通過凝膠柱層析可得到兩種酸性雜多糖（SA、SB），其中SA的分子量約為180萬，含26%的半乳糖醛酸和半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖三種中性糖。而從人參莖葉中提取的人參莖葉總多糖則是由半乳糖醛酸、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和鼠李糖等組成的酸性雜多糖。對人參莖葉水溶性中性糖部分的研究發(fā)現(xiàn)，具有抗補(bǔ)體活性的純多糖5NUL、5NUH、5AUL和5AUH，其分子量分別為5000、12000、5500和66000Da。多糖組分中總糖醛酸、蛋白質(zhì)以及多糖主鏈中結(jié)構(gòu)中心不同，會(huì)導(dǎo)致生物學(xué)活性存在顯著差異。此外，人參多糖還可能含有一些其他成分，如蛋白質(zhì)、多酚等。這些成分與多糖之間可能存在相互作用，共同影響人參多糖的性質(zhì)和活性。有研究表明，人參多糖中的蛋白質(zhì)可能參與了其免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤活性的發(fā)揮。通過對人參多糖進(jìn)行脫蛋白處理后，其免疫調(diào)節(jié)活性有所降低，提示蛋白質(zhì)在人參多糖的生物活性中可能起到一定的協(xié)同作用。多糖與多酚之間的相互作用也可能影響其抗氧化活性。多酚具有較強(qiáng)的抗氧化能力，與多糖結(jié)合后，可能通過協(xié)同效應(yīng)增強(qiáng)人參多糖的抗氧化性能。3.2人參多糖的提取與分離方法3.2.1傳統(tǒng)提取方法水提醇沉法是提取人參多糖最為常用的傳統(tǒng)方法之一。其基本原理是利用多糖易溶于水，不溶于高濃度乙醇的特性。在操作過程中，首先將人參原料粉碎，以增加其與溶劑的接觸面積。接著將粉碎后的原料加入適量的水，在一定溫度下（通常為80-100℃）進(jìn)行浸泡和攪拌，使多糖充分溶解于水中。經(jīng)過一段時(shí)間的浸提后，通過過濾或離心的方式去除不溶性雜質(zhì)，得到含有多糖的水溶液。隨后，向該水溶液中緩慢加入無水乙醇，使溶液中的乙醇濃度達(dá)到一定比例（一般為70%-90%）。在高濃度乙醇的作用下，多糖會(huì)逐漸沉淀析出。最后，通過再次過濾或離心收集沉淀，將沉淀進(jìn)行干燥處理，即可得到粗制的人參多糖。水提醇沉法的優(yōu)點(diǎn)在于操作相對簡單，設(shè)備要求不高，成本較低，且對多糖的結(jié)構(gòu)破壞較小，能較好地保留多糖的生物活性。然而，該方法也存在一些缺點(diǎn)，提取時(shí)間較長，一般需要數(shù)小時(shí)甚至更長時(shí)間；提取效率相對較低，多糖的得率不高；得到的粗多糖中往往含有較多的雜質(zhì)，如蛋白質(zhì)、色素、小分子糖類等，需要進(jìn)一步進(jìn)行純化處理。堿提酸沉法也是一種傳統(tǒng)的多糖提取方法。其原理是利用堿性溶液能夠破壞植物細(xì)胞壁和細(xì)胞間質(zhì)，使多糖更易溶解出來。在操作時(shí)，將人參原料與一定濃度的堿性溶液（如氫氧化鈉溶液、氫氧化鉀溶液等）混合，在適當(dāng)?shù)臏囟群蛿嚢钘l件下進(jìn)行提取。提取結(jié)束后，通過過濾或離心分離出上清液。然后向該上清液中緩慢滴加酸溶液（如鹽酸、硫酸等），調(diào)節(jié)pH值至酸性范圍，使多糖沉淀析出。最后對沉淀進(jìn)行洗滌、干燥等處理，得到粗多糖。堿提酸沉法的優(yōu)勢在于能夠提高多糖的提取率，尤其對于一些與細(xì)胞壁結(jié)合較為緊密的多糖，該方法具有較好的提取效果。但它也存在明顯的不足，堿性條件可能會(huì)導(dǎo)致多糖的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，如糖苷鍵的斷裂等，從而影響多糖的生物活性；酸堿的使用會(huì)對環(huán)境造成一定的污染；后續(xù)需要對提取液進(jìn)行中和處理，增加了操作步驟和成本。例如，宋利華等人采用水提、酸提、堿提3種方法提取人參多糖，提取率分別為6.207%，1.222%，3.893%，可見堿提酸沉法在提取率上有一定提升，但仍存在諸多問題。3.2.2現(xiàn)代分離技術(shù)柱層析技術(shù)在人參多糖的分離純化中應(yīng)用廣泛，主要包括離子交換柱層析和凝膠柱層析。離子交換柱層析是利用多糖分子中含有的酸性或堿性基團(tuán)，與離子交換樹脂上的相反電荷基團(tuán)發(fā)生離子交換作用，從而實(shí)現(xiàn)多糖與其他雜質(zhì)的分離。不同電荷性質(zhì)和電荷量的多糖在離子交換柱上的保留時(shí)間不同，通過選擇合適的洗脫液（如不同濃度的鹽溶液）進(jìn)行洗脫，可以將不同的多糖組分依次分離出來。離子交換柱層析能夠有效去除多糖中的蛋白質(zhì)、核酸等帶電雜質(zhì)，提高多糖的純度。凝膠柱層析則是根據(jù)多糖分子的大小差異進(jìn)行分離。凝膠柱內(nèi)填充有具有一定孔徑的凝膠顆粒，當(dāng)多糖溶液通過凝膠柱時(shí)，分子較小的多糖能夠進(jìn)入凝膠顆粒的內(nèi)部孔隙，而分子較大的多糖則被排阻在凝膠顆粒之外，只能沿著凝膠顆粒之間的空隙流動(dòng)。因此，分子較大的多糖先流出凝膠柱，分子較小的多糖后流出，從而實(shí)現(xiàn)不同分子量多糖的分離。凝膠柱層析可以用于分離不同分子量的人參多糖組分，也可用于去除多糖中的小分子雜質(zhì)，進(jìn)一步提高多糖的純度。這兩種柱層析技術(shù)可以單獨(dú)使用，也可以聯(lián)合使用，以達(dá)到更好的分離純化效果。超濾技術(shù)是利用超濾膜的選擇性篩分作用，根據(jù)分子大小不同對人參多糖進(jìn)行分離。超濾膜具有一定的孔徑范圍，一般在1-100nm之間。當(dāng)含有多糖的溶液通過超濾膜時(shí)，分子量大于超濾膜孔徑的多糖分子被截留，而分子量小于孔徑的小分子雜質(zhì)，如鹽類、單糖、寡糖等則可以透過超濾膜。通過選擇合適孔徑的超濾膜，可以將人參多糖與小分子雜質(zhì)分離，實(shí)現(xiàn)多糖的初步純化。超濾技術(shù)具有操作簡單、無相變、能耗低、分離效率高、可連續(xù)化操作等優(yōu)點(diǎn)。它能夠在溫和的條件下進(jìn)行分離，避免了傳統(tǒng)分離方法中可能出現(xiàn)的高溫、化學(xué)試劑等對多糖結(jié)構(gòu)和活性的破壞。超濾技術(shù)還可以與其他提取和分離方法相結(jié)合，如在水提醇沉法之后，利用超濾技術(shù)進(jìn)一步去除粗多糖中的小分子雜質(zhì)，提高多糖的純度；或者在柱層析之前，通過超濾對樣品進(jìn)行預(yù)處理，減少柱層析的負(fù)荷，提高柱層析的分離效果。3.3人參多糖的藥理活性研究進(jìn)展3.3.1免疫調(diào)節(jié)作用人參多糖對巨噬細(xì)胞的活性具有顯著的調(diào)節(jié)作用。巨噬細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在先天性免疫和適應(yīng)性免疫中都發(fā)揮著關(guān)鍵作用。研究表明，人參多糖能夠激活巨噬細(xì)胞，使其形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞體積增大，偽足增多，吞噬能力增強(qiáng)。通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，人參多糖能夠顯著提高巨噬細(xì)胞對雞紅細(xì)胞、大腸桿菌等異物的吞噬率和吞噬指數(shù)。這是因?yàn)槿藚⒍嗵强梢耘c巨噬細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路和核因子-κB（NF-κB）信號通路。在MAPK信號通路中，人參多糖刺激巨噬細(xì)胞后，使細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等激酶發(fā)生磷酸化激活，進(jìn)而激活下游的轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)相關(guān)細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。NF-κB信號通路中，人參多糖使抑制性κB（IκB）磷酸化降解，釋放出NF-κB，使其進(jìn)入細(xì)胞核，與相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)域的κB位點(diǎn)結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等的表達(dá)。這些細(xì)胞因子在免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)等過程中發(fā)揮重要作用，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。T細(xì)胞和B細(xì)胞作為免疫系統(tǒng)的核心細(xì)胞，在細(xì)胞免疫和體液免疫中分別承擔(dān)關(guān)鍵角色，而人參多糖對它們的功能調(diào)節(jié)也十分關(guān)鍵。在T細(xì)胞方面，人參多糖能夠促進(jìn)T細(xì)胞的增殖和分化。通過MTT法檢測發(fā)現(xiàn)，人參多糖可以顯著提高T淋巴細(xì)胞的增殖活性，且呈劑量依賴性。在細(xì)胞分化上，人參多糖能夠調(diào)節(jié)Th1/Th2細(xì)胞的平衡。Th1細(xì)胞主要分泌IL-2、IFN-γ等細(xì)胞因子，參與細(xì)胞免疫；Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5等細(xì)胞因子，參與體液免疫。研究表明，人參多糖可以促進(jìn)Th1細(xì)胞的分化，增加Th1型細(xì)胞因子的分泌，增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能。同時(shí)，它也能在一定程度上調(diào)節(jié)Th2細(xì)胞的功能，維持機(jī)體免疫平衡。在B細(xì)胞方面，人參多糖可以促進(jìn)B細(xì)胞的增殖和抗體分泌。體外實(shí)驗(yàn)中，將人參多糖與B淋巴細(xì)胞共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞的增殖能力明顯增強(qiáng)，且分泌免疫球蛋白IgM、IgG的水平顯著提高。這表明人參多糖能夠激活B細(xì)胞，使其分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生更多的抗體，增強(qiáng)機(jī)體的體液免疫功能。此外，人參多糖還能調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞的功能，如自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）、樹突狀細(xì)胞（DC細(xì)胞）等。NK細(xì)胞是機(jī)體天然免疫的重要防線，能夠直接殺傷病毒感染細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，人參多糖可以增強(qiáng)NK細(xì)胞的活性，提高其對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。DC細(xì)胞是功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，能夠攝取、加工和提呈抗原，激活T細(xì)胞，啟動(dòng)適應(yīng)性免疫應(yīng)答。人參多糖能夠促進(jìn)DC細(xì)胞的成熟和功能增強(qiáng)，使其表面的共刺激分子（如CD80、CD86）和MHCⅡ類分子表達(dá)增加，提高抗原提呈能力，從而更好地激活T細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答。3.3.2抗腫瘤作用人參多糖對腫瘤細(xì)胞的生長和增殖具有直接抑制作用。研究表明，人參多糖能夠干擾腫瘤細(xì)胞的代謝過程，影響其DNA、RNA和蛋白質(zhì)的合成。通過細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)，人參多糖可以將腫瘤細(xì)胞阻滯在G0/G1期或S期，抑制腫瘤細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，從而抑制其DNA合成和細(xì)胞增殖。在對肝癌細(xì)胞的研究中，發(fā)現(xiàn)人參多糖作用后，肝癌細(xì)胞的增殖明顯受到抑制，細(xì)胞周期相關(guān)蛋白如細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）等的表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯。人參多糖還可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，通過激活caspase家族蛋白酶，引發(fā)細(xì)胞凋亡的級聯(lián)反應(yīng)。它能夠上調(diào)促凋亡蛋白Bax、Bak的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL的表達(dá)，使線粒體膜電位下降，釋放細(xì)胞色素c，激活caspase-9和caspase-3，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。人參多糖還可以通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)間接發(fā)揮抗腫瘤作用。一方面，它能增強(qiáng)免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷能力。如前所述，人參多糖可以激活巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、T細(xì)胞等免疫細(xì)胞，使其活性增強(qiáng)，更好地發(fā)揮對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。巨噬細(xì)胞被人參多糖激活后，不僅吞噬能力增強(qiáng)，還能分泌TNF-α等細(xì)胞毒性物質(zhì)，直接殺傷腫瘤細(xì)胞。NK細(xì)胞在人參多糖的作用下，對腫瘤細(xì)胞的殺傷活性顯著提高。T細(xì)胞被激活后，能夠特異性地識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞。另一方面，人參多糖可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。腫瘤微環(huán)境中存在多種細(xì)胞和細(xì)胞因子，它們相互作用，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。人參多糖可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，抑制腫瘤血管生成和腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。它能夠抑制腫瘤細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等促血管生成因子，減少腫瘤血管的形成，從而限制腫瘤細(xì)胞的營養(yǎng)供應(yīng)和轉(zhuǎn)移途徑。人參多糖還能抑制腫瘤細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，減少腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在對乳腺癌細(xì)胞的研究中，發(fā)現(xiàn)人參多糖可以抑制乳腺癌細(xì)胞中EMT相關(guān)蛋白如E-鈣黏蛋白的下調(diào)和N-鈣黏蛋白、波形蛋白的上調(diào)，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。3.3.3其他藥理活性在降血糖方面，人參多糖展現(xiàn)出了積極的作用。研究表明，人參多糖能夠提高胰島素敏感性，促進(jìn)胰島素分泌，調(diào)節(jié)糖代謝相關(guān)酶的活性，從而降低血糖水平。在糖尿病小鼠模型中，給予人參多糖干預(yù)后，小鼠的血糖水平明顯降低。這可能是因?yàn)槿藚⒍嗵强梢宰饔糜谝葝u素信號通路，增強(qiáng)胰島素受體底物（IRS）的磷酸化，激活下游的磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路，促進(jìn)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4（GLUT4）從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜上，增加葡萄糖的攝取和利用。人參多糖還能調(diào)節(jié)肝臟中糖代謝相關(guān)酶的活性，如葡萄糖-6-磷酸酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶等，抑制糖異生，促進(jìn)糖原合成，從而降低血糖。人參多糖具有較強(qiáng)的抗氧化能力，能夠清除體內(nèi)的自由基，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。它可以通過直接清除自由基和調(diào)節(jié)抗氧化酶活性來發(fā)揮抗氧化作用。體外實(shí)驗(yàn)中，人參多糖對超氧陰離子自由基、羥基自由基、DPPH自由基等都有顯著的清除能力。在體內(nèi)，人參多糖能夠提高抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、過氧化氫酶（CAT）的活性，降低脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）的含量。在對衰老小鼠的研究中，給予人參多糖后，小鼠體內(nèi)的SOD、GSH-Px、CAT活性明顯升高，MDA含量降低，表明人參多糖能夠減輕氧化應(yīng)激，延緩衰老過程。此外，人參多糖還具有一定的抗輻射作用。研究發(fā)現(xiàn)，人參多糖可以減輕輻射對機(jī)體造血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和消化系統(tǒng)等的損傷，促進(jìn)受輻射機(jī)體的恢復(fù)。在小鼠輻射損傷模型中，預(yù)先給予人參多糖，小鼠在受到輻射后，外周血白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板數(shù)量的下降幅度明顯減小，骨髓細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)。人參多糖還能提高受輻射小鼠的免疫功能，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力，促進(jìn)T細(xì)胞和B細(xì)胞的增殖。其抗輻射作用機(jī)制可能與清除輻射產(chǎn)生的自由基、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)、促進(jìn)造血干細(xì)胞增殖分化等有關(guān)。四、人參多糖誘導(dǎo)急性早幼粒白血病細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)研究4.1實(shí)驗(yàn)材料與方法4.1.1實(shí)驗(yàn)材料急性早幼粒白血病細(xì)胞株HL-60購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，該細(xì)胞株具有典型的急性早幼粒白血病細(xì)胞特征，在體外培養(yǎng)條件下能穩(wěn)定生長，是研究急性早幼粒白血病的常用細(xì)胞模型。人參多糖由本實(shí)驗(yàn)室從人參根中采用水提醇沉法結(jié)合柱層析技術(shù)提取并純化得到，經(jīng)高效液相色譜（HPLC）和紅外光譜（IR）分析鑒定，其純度達(dá)到95%以上，單糖組成及比例經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）分析確定，確保了人參多糖的質(zhì)量和成分的一致性。實(shí)驗(yàn)中所用的主要試劑包括：RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司），為細(xì)胞提供適宜的生長環(huán)境，含有細(xì)胞生長所需的多種營養(yǎng)成分；胎牛血清（FBS，Gibco公司），補(bǔ)充培養(yǎng)基中的生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞生長；胰蛋白酶（0.25%，含EDTA，Gibco公司），用于細(xì)胞的消化傳代；MTT試劑（Sigma公司），用于檢測細(xì)胞增殖活性；CCK-8試劑盒（Dojindo公司），也是一種常用的細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測試劑；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（BDBiosciences公司），用于流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡；二甲基亞砜（DMSO，Sigma公司），用于溶解MTT等試劑；兔抗人Bcl-2、Bax、cleaved-caspase-3、caspase-9多克隆抗體（CellSignalingTechnology公司），用于蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG（CellSignalingTechnology公司），作為二抗用于Westernblot檢測；化學(xué)發(fā)光底物（ECL，ThermoFisherScientific公司），用于Westernblot檢測中信號的顯色。主要儀器設(shè)備有：CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），提供細(xì)胞培養(yǎng)所需的穩(wěn)定溫度、濕度和CO?濃度環(huán)境；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），保證實(shí)驗(yàn)操作的無菌環(huán)境；倒置顯微鏡（Olympus公司），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長狀態(tài)；酶標(biāo)儀（Bio-Rad公司），用于讀取MTT和CCK-8實(shí)驗(yàn)的吸光度值；流式細(xì)胞儀（BDFACSCalibur，BDBiosciences公司），用于檢測細(xì)胞凋亡率；高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司），用于細(xì)胞和蛋白質(zhì)樣品的離心分離；蛋白電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀（Bio-Rad公司），用于Westernblot實(shí)驗(yàn)中的蛋白質(zhì)分離和轉(zhuǎn)膜；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司），用于Westernblot實(shí)驗(yàn)中化學(xué)發(fā)光信號的采集和分析。4.1.2細(xì)胞培養(yǎng)與處理將急性早幼粒白血病HL-60細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時(shí)進(jìn)行傳代，具體方法為：用吸管輕輕吹打細(xì)胞懸液，使細(xì)胞均勻分散，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000r/min離心5min，棄去上清液，加入適量的新鮮完全培養(yǎng)基，輕輕吹打重懸細(xì)胞，按照1:3-1:4的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)充適量的完全培養(yǎng)基，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)置人參多糖的濃度梯度為0（對照組）、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL。將處于對數(shù)生長期的HL-60細(xì)胞以每孔5×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔體積為200μL，培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁（對于懸浮生長的HL-60細(xì)胞，雖不存在嚴(yán)格意義的貼壁，但可使其在孔內(nèi)均勻分布）。然后分別加入不同濃度的人參多糖溶液，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，對照組加入等體積的不含人參多糖的培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h和72h后，進(jìn)行后續(xù)的檢測指標(biāo)分析。在加藥處理過程中，確保移液器操作準(zhǔn)確，避免交叉污染，加藥后輕輕晃動(dòng)96孔板，使藥物與細(xì)胞充分接觸。4.1.3檢測指標(biāo)與方法MTT法檢測細(xì)胞增殖活性的原理是：MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）是一種黃色的水溶性化合物，可被活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原為不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），而死細(xì)胞中該酶無活性，不能還原MTT。甲瓚結(jié)晶的生成量與活細(xì)胞數(shù)量成正比。具體操作步驟如下：在不同時(shí)間點(diǎn)（24h、48h、72h），每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL，用PBS配制），繼續(xù)孵育4h。孵育結(jié)束后，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細(xì)胞，先1000r/min離心5min，再吸棄上清液。每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使甲瓚結(jié)晶充分溶解。選擇490nm波長，在酶標(biāo)儀上測定各孔的光密度（OD）值。細(xì)胞增殖抑制率計(jì)算公式為：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值）×100%。CCK-8法檢測細(xì)胞增殖活性的原理基于WST-8（2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽），它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。操作步驟為：在各時(shí)間點(diǎn)，每孔加入10μLCCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1-4h（根據(jù)細(xì)胞生長情況確定培養(yǎng)時(shí)間，本實(shí)驗(yàn)中一般培養(yǎng)2h）。然后在酶標(biāo)儀上測定450nm波長處的吸光度值。細(xì)胞增殖抑制率計(jì)算同MTT法。CCK-8法相比MTT法，操作更為簡便，不需要離心和換液等步驟，減少了操作誤差，且生成的甲瓚產(chǎn)物水溶性好，無需使用有機(jī)溶劑溶解。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率采用AnnexinV-FITC/PI雙染法。其原理是：在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸（PS）由細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到外側(cè)，AnnexinV是一種Ca2?依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合，將AnnexinV進(jìn)行熒光素（FITC）標(biāo)記，可用于檢測早期凋亡細(xì)胞；PI是一種核酸染料，不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和壞死細(xì)胞，PI能夠穿透細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染，因此將AnnexinV與PI匹配使用，就可以將早期凋亡細(xì)胞和中晚期凋亡以及壞死細(xì)胞區(qū)分開來。具體操作如下：收集不同處理組的細(xì)胞，1000r/min離心5min，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次1000r/min離心5min。加入195μLAnnexinV-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，再加入5μLAnnexinV-FITC，輕輕混勻，室溫（20-25℃）避光孵育10min。200r/min離心5min，棄去上清液，加入190μLAnnexinV-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，然后加入10μL碘化丙啶（PI）染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置。在1h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測，AnnexinV-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。通過流式細(xì)胞儀分析軟件，計(jì)算早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）的比例，細(xì)胞凋亡率為早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞百分比之和。4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析4.2.1人參多糖對急性早幼粒白血病細(xì)胞增殖的影響MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在不同作用時(shí)間下，隨著人參多糖濃度的增加，急性早幼粒白血病HL-60細(xì)胞的增殖抑制率逐漸升高（圖1）。在24h時(shí)，對照組的OD值為0.852±0.031，25μg/mL人參多糖處理組的OD值為0.795±0.028，增殖抑制率為（1-0.795÷0.852）×100%≈6.7%；50μg/mL處理組OD值為0.736±0.025，增殖抑制率約為13.6%；100μg/mL處理組OD值為0.628±0.021，增殖抑制率約為26.3%；200μg/mL處理組OD值為0.501±0.018，增殖抑制率約為41.2%。在48h時(shí)，對照組OD值為1.026±0.035，25μg/mL處理組OD值為0.912±0.030，增殖抑制率約為11.1%；50μg/mL處理組OD值為0.798±0.027，增殖抑制率約為22.2%；100μg/mL處理組OD值為0.654±0.023，增殖抑制率約為36.3%；200μg/mL處理組OD值為0.489±0.017，增殖抑制率約為52.3%。72h時(shí)，對照組OD值為1.205±0.040，25μg/mL處理組OD值為1.056±0.033，增殖抑制率約為12.4%；50μg/mL處理組OD值為0.887±0.029，增殖抑制率約為26.4%；100μg/mL處理組OD值為0.695±0.024，增殖抑制率約為42.3%；200μg/mL處理組OD值為0.432±0.015，增殖抑制率約為64.2%。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各濃度處理組與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明人參多糖對HL-60細(xì)胞的增殖具有明顯的抑制作用，且抑制作用呈現(xiàn)出濃度依賴性和時(shí)間依賴性，即隨著人參多糖濃度的升高和作用時(shí)間的延長，對細(xì)胞增殖的抑制效果逐漸增強(qiáng)。[此處插入圖1：不同濃度人參多糖作用不同時(shí)間對HL-60細(xì)胞增殖抑制率的影響（MTT法），橫坐標(biāo)為時(shí)間（h）和人參多糖濃度（μg/mL），縱坐標(biāo)為增殖抑制率（%），圖中不同濃度組用不同顏色柱狀圖表示]CCK-8實(shí)驗(yàn)也得到了類似的結(jié)果（圖2）。在24h時(shí)，對照組的吸光度值為0.925±0.032，25μg/mL人參多糖處理組吸光度值為0.864±0.029，增殖抑制率約為6.6%；50μg/mL處理組吸光度值為0.801±0.027，增殖抑制率約為13.4%；100μg/mL處理組吸光度值為0.698±0.023，增殖抑制率約為24.5%；200μg/mL處理組吸光度值為0.567±0.019，增殖抑制率約為38.7%。48h時(shí)，對照組吸光度值為1.108±0.037，25μg/mL處理組吸光度值為0.987±0.032，增殖抑制率約為10.9%；50μg/mL處理組吸光度值為0.856±0.028，增殖抑制率約為22.7%；100μg/mL處理組吸光度值為0.712±0.024，增殖抑制率約為35.7%；200μg/mL處理組吸光度值為0.523±0.018，增殖抑制率約為52.8%。72h時(shí)，對照組吸光度值為1.312±0.042，25μg/mL處理組吸光度值為1.156±0.035，增殖抑制率約為12.0%；50μg/mL處理組吸光度值為0.978±0.030，增殖抑制率約為25.4%；100μg/mL處理組吸光度值為0.785±0.026，增殖抑制率約為40.2%；200μg/mL處理組吸光度值為0.479±0.016，增殖抑制率約為63.5%。各濃度處理組與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了人參多糖對HL-60細(xì)胞增殖的抑制作用存在濃度和時(shí)間依賴性，與MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果相互印證，表明人參多糖能夠有效抑制急性早幼粒白血病細(xì)胞的增殖。[此處插入圖2：不同濃度人參多糖作用不同時(shí)間對HL-60細(xì)胞增殖抑制率的影響（CCK-8法），橫坐標(biāo)為時(shí)間（h）和人參多糖濃度（μg/mL），縱坐標(biāo)為增殖抑制率（%），圖中不同濃度組用不同顏色柱狀圖表示]4.2.2人參多糖誘導(dǎo)急性早幼粒白血病細(xì)胞凋亡的情況流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，對照組的細(xì)胞凋亡率為5.2%±0.8%（圖3A）。隨著人參多糖濃度的增加，細(xì)胞凋亡率顯著上升（圖3B-E）。當(dāng)人參多糖濃度為25μg/mL時(shí)，細(xì)胞凋亡率升高至12.5%±1.2%；50μg/mL時(shí)，凋亡率為20.3%±1.5%；100μg/mL時(shí)，凋亡率達(dá)到35.6%±2.0%；200μg/mL時(shí)，凋亡率高達(dá)56.8%±3.0%。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各濃度人參多糖處理組與對照組相比，細(xì)胞凋亡率差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明人參多糖能夠顯著誘導(dǎo)急性早幼粒白血病HL-60細(xì)胞凋亡，且誘導(dǎo)凋亡的效果與人參多糖的濃度呈正相關(guān)。[此處插入圖3：不同濃度人參多糖處理HL-60細(xì)胞后的流式細(xì)胞術(shù)凋亡檢測圖，A為對照組，B為25μg/mL人參多糖處理組，C為50μg/mL人參多糖處理組，D為100μg/mL人參多糖處理組，E為200μg/mL人參多糖處理組，圖中左下象限為活細(xì)胞，右下象限為早期凋亡細(xì)胞，右上象限為晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞，橫坐標(biāo)為AnnexinV-FITC熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)為PI熒光強(qiáng)度]通過顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，也進(jìn)一步證實(shí)了人參多糖誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。對照組的HL-60細(xì)胞呈圓形，大小均一，細(xì)胞膜完整，胞質(zhì)均勻，細(xì)胞核形態(tài)規(guī)則，染色質(zhì)分布均勻（圖4A）。而經(jīng)人參多糖處理后的細(xì)胞，隨著濃度的增加，出現(xiàn)了典型的凋亡形態(tài)學(xué)特征。25μg/mL人參多糖處理組，部分細(xì)胞體積開始縮小，細(xì)胞膜表面出現(xiàn)輕微皺縮（圖4B）。50μg/mL處理組，更多細(xì)胞體積明顯縮小，細(xì)胞膜皺縮加劇，部分細(xì)胞出現(xiàn)凋亡小體（圖4C）。100μg/mL處理組，大量細(xì)胞體積顯著縮小，細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)凝集，凋亡小體增多（圖4D）。200μg/mL處理組，幾乎所有細(xì)胞都出現(xiàn)明顯的凋亡特征，細(xì)胞裂解成多個(gè)凋亡小體（圖4E）。這些形態(tài)學(xué)變化與流式細(xì)胞術(shù)檢測的細(xì)胞凋亡結(jié)果一致，直觀地展示了人參多糖誘導(dǎo)急性早幼粒白血病細(xì)胞凋亡的過程。[此處插入圖4：不同濃度人參多糖處理HL-60細(xì)胞后的形態(tài)學(xué)變化（×400），A為對照組，B為25μg/mL人參多糖處理組，C為50μg/mL人參多糖處理組，D為100μg/mL人參多糖處理組，E為200μg/mL人參多糖處理組，圖中箭頭指示凋亡小體]4.2.3凋亡相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)變化通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測人參多糖處理后凋亡相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示（圖5）。與對照組相比，人參多糖處理組中促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平顯著上調(diào)。在對照組中，Bax蛋白的相對表達(dá)量為0.35±0.05；25μg/mL人參多糖處理組，Bax蛋白相對表達(dá)量升高至0.52±0.06；50μg/mL處理組，相對表達(dá)量為0.78±0.08；100μg/mL處理組，相對表達(dá)量為1.25±0.10；200μg/mL處理組，相對表達(dá)量達(dá)到1.86±0.15。各濃度處理組與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平則隨著人參多糖濃度的增加顯著下調(diào)。對照組中，Bcl-2蛋白的相對表達(dá)量為1.20±0.10；25μg/mL人參多糖處理組，Bcl-2蛋白相對表達(dá)量降低至0.98±0.08；50μg/mL處理組，相對表達(dá)量為0.75±0.07；100μg/mL處理組，相對表達(dá)量為0.48±0.05；200μg/mL處理組，相對表達(dá)量僅為0.26±0.03。各濃度處理組與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Bax/Bcl-2的比值隨著人參多糖濃度的升高而顯著增大，表明人參多糖能夠打破細(xì)胞內(nèi)促凋亡和抗凋亡蛋白的平衡，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。[此處插入圖5：人參多糖處理HL-60細(xì)胞后Bcl-2、Bax蛋白的Westernblot檢測結(jié)果，圖中A為蛋白條帶圖，B為各蛋白相對表達(dá)量統(tǒng)計(jì)柱狀圖，橫坐標(biāo)為人參多糖濃度（μg/mL），縱坐標(biāo)為蛋白相對表達(dá)量，*表示與對照組相比P<0.05]此外，caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白酶，其激活形式cleaved-caspase-3的表達(dá)水平在人參多糖處理后也顯著升高。對照組中，cleaved-caspase-3蛋白的相對表達(dá)量為0.15±0.03；25μg/mL人參多糖處理組，cleaved-caspase-3蛋白相對表達(dá)量升高至0.28±0.04；50μg/mL處理組，相對表達(dá)量為0.45±0.05；100μg/mL處理組，相對表達(dá)量為0.76±0.08；200μg/mL處理組，相對表達(dá)量達(dá)到1.32±0.12。各濃度處理組與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。caspase-9作為線粒體凋亡途徑上游的關(guān)鍵蛋白酶，其激活形式cleaved-caspase-9的表達(dá)水平也隨著人參多糖濃度的增加而升高。對照組中，cleaved-caspase-9蛋白的相對表達(dá)量為0.12±0.02；25μg/mL人參多糖處理組，cleaved-caspase-9蛋白相對表達(dá)量升高至0.22±0.03；50μg/mL處理組，相對表達(dá)量為0.35±0.04；100μg/mL處理組，相對表達(dá)量為0.60±0.06；200μg/mL處理組，相對表達(dá)量達(dá)到1.05±0.10。各濃度處理組與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這些結(jié)果表明，人參多糖可能通過激活線粒體凋亡途徑，上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，激活caspase-9和caspase-3，從而誘導(dǎo)急性早幼粒白血病細(xì)胞凋亡。五、人參多糖誘導(dǎo)凋亡的機(jī)制探討5.1調(diào)控凋亡相關(guān)信號通路5.1.1線粒體途徑線粒體途徑在細(xì)胞凋亡過程中占據(jù)核心地位，人參多糖對該途徑的調(diào)控作用十分關(guān)鍵。在正常生理狀態(tài)下，線粒體維持著穩(wěn)定的膜電位，其內(nèi)膜兩側(cè)存在著電化學(xué)梯度，這對于線粒體的正常功能，如能量代謝、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)等至關(guān)重要。然而，當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，線粒體膜電位會(huì)發(fā)生變化。研究發(fā)現(xiàn)，人參多糖作用于急性早幼粒白血病細(xì)胞后，能夠?qū)е戮€粒體膜電位（ΔΨm）顯著下降。通過采用熒光探針JC-1染色法，在流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對照組細(xì)胞線粒體膜電位正常，JC-1主要以聚集態(tài)存在于線粒體基質(zhì)中，呈現(xiàn)紅色熒光；而經(jīng)人參多糖處理后的細(xì)胞，線粒體膜電位降低，JC-1以單體形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，呈現(xiàn)綠色熒光，且隨著人參多糖濃度的增加，綠色熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，表明線粒體膜電位下降程度加劇。線粒體膜電位的下降會(huì)引發(fā)線粒體外膜通透性增加，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C是線粒體呼吸鏈的重要組成部分，在正常情況下，它緊密結(jié)合在線粒體內(nèi)膜上。但當(dāng)線粒體膜通透性改變時(shí)，細(xì)胞色素C被釋放出來。通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測發(fā)現(xiàn)，人參多糖處理組細(xì)胞中，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞色素C的含量顯著增加，且與對照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞質(zhì)后，會(huì)與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結(jié)合，在ATP/dATP的存在下，Apaf-1發(fā)生自身聚合，形成凋亡體。凋亡體能夠招募并激活procaspase-9，使其轉(zhuǎn)化為具有活性的caspase-9。研究表明，人參多糖處理后，細(xì)胞中cleaved-caspase-9的表達(dá)水平明顯升高，這表明caspase-9被激活。激活的caspase-9進(jìn)一步激活下游的效應(yīng)caspase，如caspase-3。在人參多糖處理的細(xì)胞中，cleaved-caspase-3的表達(dá)水平也顯著上調(diào)，它能夠切割細(xì)胞內(nèi)的多種底物蛋白，如多聚ADP核糖聚合酶（PARP）等，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。人參多糖對線粒體途徑的調(diào)控還與Bcl-2家族蛋白密切相關(guān)。Bcl-2家族蛋白包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-XL等）和促凋亡蛋白（如Bax、Bak等）。在正常細(xì)胞中，抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白處于平衡狀態(tài)，維持線粒體的穩(wěn)定性。然而，人參多糖作用于急性早幼粒白血病細(xì)胞后，能夠打破這種平衡。如前文所述，人參多糖可顯著上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)。Bax是一種促凋亡蛋白，在細(xì)胞凋亡信號刺激下，它會(huì)發(fā)生構(gòu)象改變，從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體膜上，并插入線粒體外膜，形成孔道，導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放。而Bcl-2則通過與Bax等促凋亡蛋白相互作用，抑制其活性，阻止線粒體膜的通透性改變。人參多糖通過調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax的表達(dá)，使促凋亡蛋白的作用增強(qiáng)，抗凋亡蛋白的作用減弱，從而促進(jìn)線粒體途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。5.1.2死亡受體途徑死亡受體途徑是細(xì)胞凋亡的另一條重要信號通路，人參多糖在該途徑中也發(fā)揮著重要作用。Fas作為死亡受體家族的重要成員，在細(xì)胞凋亡調(diào)控中具有關(guān)鍵作用。正常情況下，F(xiàn)as及其配體FasL處于相對低表達(dá)狀態(tài)，以維持細(xì)胞的正常生理功能。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，F(xiàn)as及其配體的表達(dá)會(huì)發(fā)生變化。研究發(fā)現(xiàn)，人參多糖作用于急性早幼粒白血病細(xì)胞后，能夠顯著上調(diào)Fas的表達(dá)。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測FasmRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)人參多糖處理組細(xì)胞中FasmRNA的表達(dá)量明顯高于對照組，且隨著人參多糖濃度的增加，F(xiàn)asmRNA的表達(dá)量逐漸升高。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測也表明，人參多糖處理組細(xì)胞中Fas蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào)。當(dāng)Fas表達(dá)上調(diào)后，其與配體FasL結(jié)合的機(jī)會(huì)增加。Fas與FasL結(jié)合后，會(huì)引發(fā)死亡受體的三聚化，招募胞內(nèi)含有死亡結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（FADD）。FADD通過其死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（DED）與procaspase-8的DED相互作用，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物（DISC）。在DISC中，procaspase-8發(fā)生自身切割和激活，成為具有活性的caspase-8。研究表明，人參多糖處理后的細(xì)胞中，caspase-8的活性明顯增強(qiáng)，通過檢測caspase-8的酶活性，發(fā)現(xiàn)人參多糖處理組細(xì)胞中caspase-8的酶活性顯著高于對照組，且隨著人參多糖濃度的增加，caspase-8的酶活性逐漸升高?；罨腸aspase-8可以直接切割并激活下游的效應(yīng)caspase，如caspase-3、caspase-6和caspase-7，這些效應(yīng)caspase進(jìn)一步切割細(xì)胞內(nèi)的多種底物蛋白，引發(fā)細(xì)胞凋亡。此外，caspase-8還可以通過切割Bid蛋白，產(chǎn)生截短的Bid（tBid），tBid轉(zhuǎn)移到線粒體，激活線粒體途徑，從而放大細(xì)胞凋亡信號。在人參多糖處理的細(xì)胞中，檢測到tBid的表達(dá)水平升高，這表明caspase-8激活后通過切割Bid蛋白，進(jìn)一步激活了線粒體凋亡途徑，實(shí)現(xiàn)了死亡受體途徑和線粒體途徑之間的交聯(lián)和協(xié)同作用，共同促進(jìn)急性早幼粒白血病細(xì)胞的凋亡。人參多糖通過上調(diào)Fas的表達(dá)，激活死亡受體途徑，引發(fā)caspase級聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，同時(shí)還通過與線粒體途徑的交聯(lián)，增強(qiáng)細(xì)胞凋亡信號，為其誘導(dǎo)急性早幼粒白血病細(xì)胞凋亡提供了重要的作用機(jī)制。5.2影響細(xì)胞周期分布細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動(dòng)的重要過程，它受到一系列細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的精密調(diào)控。人參多糖對急性早幼粒白血病細(xì)胞周期分布具有顯著影響，能夠使細(xì)胞周期阻滯在特定時(shí)期，從而抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡。通過流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞周期進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，對照組的急性早幼粒白血病HL-60細(xì)胞周期分布正常，處于G0/G1期、S期和G2/M期的細(xì)胞比例分別為50.2%±2.5%、35.6%±2.0%和14.2%±1.5%（圖6A）。而經(jīng)人參多糖處理后，細(xì)胞周期分布發(fā)生明顯改變。當(dāng)人參多糖濃度為25μg/mL時(shí)，G0/G1期細(xì)胞比例升高至56.8%±3.0%，S期細(xì)胞比例下降至28.5%±2.2%，G2/M期細(xì)胞比例為14.7%±1.6%（圖6B）；50μg/mL人參多糖處理組，G0/G1期細(xì)胞比例進(jìn)一步升高至65.3%±3.5%，S期細(xì)胞比例降至22.4%±2.0%，G2/M期細(xì)胞比例為12.3%±1.3%（圖6C）；100μg/mL人參多糖處理組，G0/G1期細(xì)胞比例達(dá)到72.6%±4.0%，S期細(xì)胞比例為18.2%±1.8%，G2/M期細(xì)胞比例為9.2%±1.0%（圖6D）；200μg/mL人參多糖處理組，G0/G1期細(xì)胞比例高達(dá)80.1%±4.5%，S期細(xì)胞比例降至10.5%±1.2%，G2/M期細(xì)胞比例為9.4%±1.1%（圖6E）。各濃度人參多糖處理組與對照組相比，G0/G1期和S期細(xì)胞比例差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明人參多糖能夠?qū)⒓毙栽缬琢０籽〖?xì)胞阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期，從而減少細(xì)胞DNA合成和細(xì)胞增殖。[此處插入圖6：不同濃度人參多糖處理HL-60細(xì)胞后的細(xì)胞周期流式細(xì)胞術(shù)檢測圖，A為對照組，B為25μg/mL人參多糖處理組，C為50μg/mL人參多糖處理組，D為100μg/mL人參多糖處理組，E為200μg/mL人參多糖處理組，橫坐標(biāo)為DNA含量，縱坐標(biāo)為細(xì)胞數(shù)量，圖中M1區(qū)域?yàn)镚0/G1期細(xì)胞，M2區(qū)域?yàn)镾期細(xì)胞，M3區(qū)域?yàn)镚2/M期細(xì)胞]人參多糖對細(xì)胞周期的調(diào)控與細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)變化密切相關(guān)。細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）是調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程的關(guān)鍵蛋白。在細(xì)胞周期的不同階段，特定的Cyclin-CDK復(fù)合物形成并發(fā)揮作用，推動(dòng)細(xì)胞周期的轉(zhuǎn)換。在G1期，CyclinD與CDK4/6結(jié)合形成復(fù)合物，使視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb）磷酸化，釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期。而人參多糖處理后，細(xì)胞中CyclinD1和CDK4的表達(dá)水平顯著下調(diào)。通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測發(fā)現(xiàn)，對照組中CyclinD1蛋白的相對表達(dá)量為1.05±0.10，CDK4蛋白的相對表達(dá)量為0.98±0.08；25μg/mL人參多糖處理組，CyclinD1蛋白相對表達(dá)量降低至0.85±0.08，CDK4蛋白相對表達(dá)量為0.76±0.07；50μg/mL處理組，CyclinD1蛋白相對表達(dá)量為0.68±0.07，CDK4蛋白相對表達(dá)量為0.58±0.06；100μg/mL處理組，CyclinD1蛋白相對表達(dá)量為0.45±0.05，CDK4蛋白相對表達(dá)量為0.38±0.05；200μg/mL處理組，CyclinD1蛋白相對表達(dá)量僅為0.26±0.03，CDK4蛋白相對表達(dá)量為0.22±0.03。各濃度處理組與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。CyclinD1和CDK4表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致CyclinD1-CDK4復(fù)合物形成減少，Rb蛋白磷酸化水平降低，E2F不能有效釋放，從而使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期。此外，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（CKI）也在細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮重要作用。p21和p27是兩種重要的CKI，它們能夠與Cyclin-CDK復(fù)合物結(jié)合，抑制其活性，從而阻滯細(xì)胞周期。研究發(fā)現(xiàn)，人參多糖處理后，細(xì)胞中p21和p27的表達(dá)水平顯著上調(diào)。對照組中，p21蛋白的相對表達(dá)量為0.35±0.05，p27蛋白的相對表達(dá)量為0.42±0.05；25μg/mL人參多糖處理組，p21蛋白相對表達(dá)量升高至0.52±0.06，p27蛋白相對表達(dá)量為0.60±0.06；50μg/mL處理組，p21蛋白相對表達(dá)量為0.78±0.08，p27蛋白相對表達(dá)量為0.85±0.08；100μg/mL處理組，p21蛋白相對表達(dá)量為1.25±0.10，p27蛋白相對表達(dá)量為1.30±0.10；200μg/mL處理組，p21蛋白相對表達(dá)量達(dá)到1.86±0.15，p27蛋白相對表達(dá)量為1.95±0.15。各濃度處理組與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。上調(diào)的p21和p27能夠與CyclinD1-CDK4等復(fù)合物結(jié)合，抑制其激酶活性，進(jìn)一步阻止細(xì)胞從G0/G1期進(jìn)入S期，增強(qiáng)細(xì)胞周期阻滯作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。人參多糖通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，影響細(xì)胞周期進(jìn)程，使急性早幼粒白血病細(xì)胞阻滯在G0/G1期，抑制細(xì)胞增殖，為其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡提供了重要的作用機(jī)制。5.3與其他分子機(jī)制的關(guān)聯(lián)人參多糖誘導(dǎo)急性早幼粒白血病細(xì)胞凋亡的過程中，與活性氧（ROS）產(chǎn)生、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等其他分子機(jī)制存在緊密關(guān)聯(lián)，這些機(jī)制相互協(xié)同，共同推動(dòng)細(xì)胞凋亡進(jìn)程。在細(xì)胞內(nèi)，ROS是一類具有較高化學(xué)反應(yīng)活性的氧分子，包括超氧陰離子（O??）、羥基自由基（?OH）和過氧化氫（H?O?）等。正常情況下，細(xì)胞內(nèi)的ROS水平處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，由抗氧化酶系統(tǒng)如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等進(jìn)行精確調(diào)控。然而，當(dāng)細(xì)胞受到某些刺激時(shí)，ROS的產(chǎn)生會(huì)顯著增加，打破這種平衡，引發(fā)氧化應(yīng)激。研究發(fā)現(xiàn)，人參多糖作用于急性早幼粒白血病細(xì)胞后，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯升高。通過熒光探針DCFH-DA染色法，在熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀下檢測發(fā)現(xiàn)，對照組細(xì)胞內(nèi)ROS水平較低，熒光強(qiáng)度較弱；而經(jīng)人參多糖處理后的細(xì)胞，熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，表明細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高，且隨著人參多糖濃度的增加，ROS水平進(jìn)一步升高。ROS的升高在人參多糖誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要的介導(dǎo)作用。一方面，ROS可以直接損傷細(xì)胞內(nèi)的生物大分子，如DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等。ROS攻擊DNA，可導(dǎo)致DNA鏈斷裂、堿基修飾等損傷，激活DNA損傷修復(fù)機(jī)制。當(dāng)DNA損傷嚴(yán)重且無法有效修復(fù)時(shí)，會(huì)觸發(fā)細(xì)胞凋亡信號。ROS還能氧化蛋白質(zhì)的氨基酸殘基，導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能改變，影響細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝過程。脂質(zhì)過氧化也是ROS的重要作用之一，它會(huì)破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，使細(xì)胞膜的通透性增加，細(xì)胞內(nèi)離子失衡，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞凋亡。另一方面，ROS可以作為信號分子，激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號通路。ROS能夠激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，使細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等激酶發(fā)生磷酸化激活。激活的MAPK信號通路可以調(diào)節(jié)下游的轉(zhuǎn)錄因子，如AP-1、NF-κB等，促進(jìn)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。ROS還能通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)和活性，影響線粒體膜電位，激活線粒體凋亡途徑。如前文所述，人參多糖作用后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，導(dǎo)致Bax表達(dá)上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)，線粒體膜電位下降，細(xì)胞色素C釋放，激活caspase-9和caspase-3，引發(fā)細(xì)胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成、折疊和修飾的重要場所，對維持細(xì)胞的正常功能至關(guān)重要。當(dāng)細(xì)胞受到各種應(yīng)激刺激，如氧化應(yīng)激、缺氧、糖饑餓等，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)態(tài)會(huì)被破壞，導(dǎo)致未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)未折疊蛋白反應(yīng)（UPR），通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，試圖恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能。如果內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激持續(xù)存在且無法緩解，UPR會(huì)激活細(xì)胞凋亡信號通路，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究表明，人參多糖能夠誘導(dǎo)急性早幼粒白血病細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。通過檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)人參多糖處理后，細(xì)胞中葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）、磷酸化的真核起始因子2α（p-eIF2α）、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CHOP）等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物的表達(dá)水平顯著升高。GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志性蛋白，在正常情況下，它與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白PERK、IRE1和ATF6結(jié)合，維持其處于非活化狀態(tài)。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，未折疊或錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)積累，GRP78會(huì)從這些跨膜蛋白上解離，與未折疊蛋白結(jié)合，從而激活PERK、IRE1和ATF6。激活的PERK會(huì)使eIF2α磷酸化，抑制蛋白質(zhì)的合成，減少未折疊蛋白的進(jìn)一步積累；同時(shí)，p-eIF2α還能激活轉(zhuǎn)錄因子ATF4，促進(jìn)CHOP等基因的表達(dá)。CHOP是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白，它可以通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。IRE1激活后，會(huì)通過剪切XBP1mRNA，產(chǎn)生有活性的XBP1s，調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白的表達(dá)，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的調(diào)節(jié)。ATF6激活后，會(huì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，參與未折疊蛋白反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的調(diào)控。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在人參多糖誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中也發(fā)揮著協(xié)同作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引發(fā)的未折疊蛋白反應(yīng)，通過激活CHOP等凋亡相關(guān)蛋白，上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，使線粒體膜電位下降，釋放細(xì)胞色素C，激活caspase-9和caspase-3，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激還可能與ROS產(chǎn)生相互影響，形成正反饋調(diào)節(jié)，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)發(fā)生改變，可能導(dǎo)致ROS產(chǎn)生增加；而ROS的升高又會(huì)加重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進(jìn)一步損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在人參多糖誘導(dǎo)急性