乙型腦炎病毒—偽狂犬病病毒二聯(lián)基因工程疫苗：構(gòu)建、特性與免疫效能研究一、引言1.1研究背景與意義乙型腦炎病毒（JapaneseEncephalitisVirus，JEV）和偽狂犬病病毒（PseudorabiesVirus，PRV）作為兩種極具影響力的病毒，給人類健康和畜牧業(yè)發(fā)展帶來了嚴(yán)重的威脅。JEV是引發(fā)流行性乙型腦炎的病原體，該疾病在亞洲地區(qū)廣泛傳播，嚴(yán)重威脅人類健康，尤其是兒童群體。乙腦病毒主要通過蚊蟲叮咬傳播，一旦感染，病毒會突破血腦屏障，侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引發(fā)腦實(shí)質(zhì)病變?；颊叱３霈F(xiàn)高熱、意識障礙、抽搐、呼吸衰竭等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡。即使部分患者幸存，也可能留下嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，如智力障礙、癲癇、肢體癱瘓等，給患者及其家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，全球每年約有5-10萬例乙型腦炎病例，其中約15%的患者死亡，20-30%的幸存者會留下永久性神經(jīng)功能障礙。在畜牧業(yè)中，豬是JEV的主要放大宿主。豬感染JEV后，雖大多呈隱性感染，但在繁殖期會導(dǎo)致母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎等繁殖障礙，公豬則可能出現(xiàn)睪丸炎，影響繁殖性能。這不僅會給養(yǎng)豬業(yè)帶來直接的經(jīng)濟(jì)損失，還會增加病毒傳播給人類的風(fēng)險(xiǎn)，對公共衛(wèi)生安全構(gòu)成潛在威脅。PRV則是一種能引起多種家畜和野生動物發(fā)病的皰疹病毒。豬是PRV的天然宿主、儲藏者和傳染源，感染后的癥狀隨豬的日齡而異。仔豬感染后常表現(xiàn)為高熱、食欲廢絕、呼吸困難、流涎、嘔吐、腹瀉、抑郁震顫等神經(jīng)癥狀，繼而出現(xiàn)運(yùn)動失調(diào)、間歇性抽搐、昏迷以至衰竭死亡，15日齡以內(nèi)仔豬死亡率高達(dá)80%-100%；斷奶仔豬發(fā)病率為20%-40%，死亡率為10%-20%左右；育肥豬感染后癥狀相對較輕，主要表現(xiàn)為增重減慢等。成年豬感染PRV后，公豬常發(fā)生睪丸腫脹、萎縮等，使種用性能降低或喪失；母豬則表現(xiàn)為返情、屢配不孕，妊娠母豬常出現(xiàn)流產(chǎn)、產(chǎn)死胎和木乃伊胎等。PRV感染給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響了養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。目前，針對JEV和PRV的防控主要依靠疫苗接種。然而，傳統(tǒng)疫苗存在諸多局限性，如弱毒疫苗存在毒力返強(qiáng)的風(fēng)險(xiǎn)，滅活疫苗免疫效果相對較弱，需要多次接種等。此外，現(xiàn)代化養(yǎng)殖中豬群頻繁接種不同疫苗，不僅增加了養(yǎng)殖成本和工作量，還對豬群造成很大的應(yīng)激，嚴(yán)重影響生產(chǎn)性能。因此，開發(fā)一種安全、高效、使用方便的二聯(lián)基因工程疫苗，能夠同時(shí)預(yù)防JEV和PRV感染，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義?；蚬こ桃呙缡抢矛F(xiàn)代基因工程技術(shù)，將病毒的關(guān)鍵抗原基因進(jìn)行克隆、表達(dá)，制備而成的新型疫苗。與傳統(tǒng)疫苗相比，基因工程疫苗具有安全性高、免疫原性強(qiáng)、生產(chǎn)成本低、可大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。通過構(gòu)建乙型腦炎病毒—偽狂犬病病毒二聯(lián)基因工程疫苗，可以實(shí)現(xiàn)一次接種同時(shí)預(yù)防兩種病毒感染，減少疫苗接種次數(shù)，降低養(yǎng)殖成本，減輕豬群應(yīng)激，提高養(yǎng)殖效益。同時(shí)，這也有助于加強(qiáng)對乙型腦炎和偽狂犬病的防控，減少病毒在動物中的傳播，降低其對人類健康的威脅，保障公共衛(wèi)生安全。本研究對于推動基因工程疫苗技術(shù)的發(fā)展，以及促進(jìn)畜牧業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展都具有重要的科學(xué)價(jià)值和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在乙型腦炎病毒—偽狂犬病病毒二聯(lián)基因工程疫苗的研究領(lǐng)域，國內(nèi)外學(xué)者已取得了一系列重要進(jìn)展。國外方面，一些研究聚焦于利用先進(jìn)的基因編輯技術(shù)來優(yōu)化疫苗的構(gòu)建。如美國的科研團(tuán)隊(duì)通過CRISPR/Cas9技術(shù)，精準(zhǔn)地對乙型腦炎病毒和偽狂犬病病毒的關(guān)鍵基因進(jìn)行修飾，嘗試將兩者的有效免疫原性片段整合到同一表達(dá)載體中。他們在動物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，這種經(jīng)過基因編輯構(gòu)建的疫苗能夠在小鼠體內(nèi)引發(fā)針對兩種病毒的特異性免疫反應(yīng)，且免疫效果相較于傳統(tǒng)的單一疫苗有一定提升。然而，該技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中面臨著基因編輯效率不穩(wěn)定、潛在的脫靶效應(yīng)等問題，需要進(jìn)一步優(yōu)化和驗(yàn)證。歐洲的研究人員則致力于開發(fā)新型的疫苗遞送系統(tǒng)，以提高二聯(lián)基因工程疫苗的免疫效果。他們采用納米顆粒作為載體，將乙型腦炎病毒和偽狂犬病病毒的基因片段包裹其中，通過納米顆粒的靶向性，能夠更有效地將疫苗遞送至免疫細(xì)胞，增強(qiáng)免疫應(yīng)答。相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明，這種納米顆粒遞送的二聯(lián)疫苗在豬模型中，顯著提高了抗體滴度和細(xì)胞免疫反應(yīng)。但納米顆粒的制備工藝復(fù)雜，成本較高，限制了其大規(guī)模應(yīng)用。國內(nèi)對于乙型腦炎病毒—偽狂犬病病毒二聯(lián)基因工程疫苗的研究也成果豐碩。眾多科研機(jī)構(gòu)和高校積極參與，從不同角度開展研究。部分團(tuán)隊(duì)利用傳統(tǒng)的基因克隆技術(shù)，將乙型腦炎病毒的E蛋白基因和偽狂犬病病毒的gB蛋白基因分別克隆到合適的表達(dá)載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒。再將重組質(zhì)粒導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，制備出二聯(lián)基因工程疫苗。動物實(shí)驗(yàn)顯示，該疫苗能夠有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對兩種病毒的特異性抗體，對小鼠和豬均有一定的保護(hù)作用。但在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，疫苗的免疫原性仍有待提高，部分動物在接種后對病毒的抵抗力不足。還有研究團(tuán)隊(duì)在疫苗的佐劑篩選方面取得了進(jìn)展。他們通過對比不同佐劑對二聯(lián)基因工程疫苗免疫效果的影響，發(fā)現(xiàn)某些新型佐劑能夠顯著增強(qiáng)疫苗的免疫原性，提高機(jī)體的免疫應(yīng)答水平。在豬的免疫實(shí)驗(yàn)中，添加新型佐劑的二聯(lián)疫苗使豬的抗體水平和細(xì)胞免疫反應(yīng)均有明顯提升，對乙型腦炎病毒和偽狂犬病病毒的攻擊具有更好的保護(hù)效果。不過，新型佐劑的安全性和穩(wěn)定性還需要進(jìn)一步的長期觀察和驗(yàn)證。盡管國內(nèi)外在乙型腦炎病毒—偽狂犬病病毒二聯(lián)基因工程疫苗的研究上取得了一定成果，但仍存在諸多不足。當(dāng)前研究中，疫苗的免疫原性和保護(hù)效果仍有待進(jìn)一步提高，部分疫苗在實(shí)際應(yīng)用中無法提供足夠的保護(hù)力。疫苗的制備工藝還不夠成熟，存在生產(chǎn)成本高、生產(chǎn)效率低等問題，限制了其大規(guī)模生產(chǎn)和推廣。對于疫苗的長期安全性和有效性監(jiān)測也缺乏足夠的數(shù)據(jù)支持，在疫苗的使用過程中可能存在潛在風(fēng)險(xiǎn)。因此，如何提高疫苗的免疫效果、優(yōu)化制備工藝、加強(qiáng)安全性和有效性監(jiān)測，是未來該領(lǐng)域需要重點(diǎn)解決的問題。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在開發(fā)一種安全、高效的乙型腦炎病毒—偽狂犬病病毒二聯(lián)基因工程疫苗，以有效預(yù)防和控制這兩種病毒的感染，降低其對人類健康和畜牧業(yè)的危害。具體研究內(nèi)容如下：1.3.1乙型腦炎病毒和偽狂犬病病毒關(guān)鍵基因的克隆與分析通過RT-PCR技術(shù)，從乙型腦炎病毒和偽狂犬病病毒的標(biāo)準(zhǔn)毒株中擴(kuò)增出具有良好免疫原性的關(guān)鍵基因，如乙型腦炎病毒的E蛋白基因和偽狂犬病病毒的gB蛋白基因。對擴(kuò)增得到的基因進(jìn)行測序，并利用生物信息學(xué)軟件進(jìn)行序列分析，與已報(bào)道的不同毒株基因序列進(jìn)行比對，了解其遺傳變異情況，分析基因的結(jié)構(gòu)和功能，為后續(xù)疫苗構(gòu)建提供基礎(chǔ)。1.3.2二聯(lián)基因工程疫苗表達(dá)載體的構(gòu)建將克隆得到的乙型腦炎病毒和偽狂犬病病毒關(guān)鍵基因分別插入到合適的表達(dá)載體中，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒。選擇具有高效表達(dá)能力和穩(wěn)定遺傳特性的表達(dá)載體，如真核表達(dá)載體pcDNA3.1或原核表達(dá)載體pET系列等。通過酶切、連接等分子生物學(xué)技術(shù)，確保基因正確插入載體，并對重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，包括酶切鑒定、PCR鑒定和測序鑒定等，保證載體構(gòu)建的準(zhǔn)確性。1.3.3二聯(lián)基因工程疫苗的制備與純化將構(gòu)建好的重組表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，如大腸桿菌、酵母細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞等。優(yōu)化表達(dá)條件，包括誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)間、培養(yǎng)溫度等，以提高目的蛋白的表達(dá)量。采用合適的蛋白純化方法，如親和層析、離子交換層析等，對表達(dá)的目的蛋白進(jìn)行純化，去除雜質(zhì)和宿主細(xì)胞蛋白，獲得高純度的二聯(lián)基因工程疫苗抗原。1.3.4二聯(lián)基因工程疫苗的免疫效果評估選用小鼠、豬等動物模型，對制備的二聯(lián)基因工程疫苗進(jìn)行免疫效果評估。設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對照組，實(shí)驗(yàn)組接種二聯(lián)基因工程疫苗，對照組接種生理鹽水或傳統(tǒng)疫苗。在免疫后的不同時(shí)間點(diǎn)采集動物血清，通過ELISA、中和試驗(yàn)等方法檢測血清中特異性抗體的水平，評估疫苗誘導(dǎo)的體液免疫應(yīng)答。同時(shí)，通過淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)、細(xì)胞因子檢測等方法，檢測疫苗誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答。在免疫動物達(dá)到一定時(shí)間后，用乙型腦炎病毒和偽狂犬病病毒的強(qiáng)毒株進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，觀察動物的發(fā)病情況和存活率，評估疫苗的保護(hù)效果。1.3.5二聯(lián)基因工程疫苗的安全性評價(jià)對二聯(lián)基因工程疫苗的安全性進(jìn)行全面評價(jià)。觀察疫苗接種后動物的局部和全身反應(yīng)，如注射部位是否出現(xiàn)紅腫、硬結(jié)，動物是否出現(xiàn)發(fā)熱、食欲不振、精神萎靡等癥狀。檢測疫苗對動物重要器官的影響，通過組織病理學(xué)檢查，觀察心、肝、脾、肺、腎等器官是否出現(xiàn)病變。此外，還需評估疫苗的遺傳穩(wěn)定性，確保在生產(chǎn)和儲存過程中，疫苗的基因序列不會發(fā)生變異，不會導(dǎo)致毒力返強(qiáng)等安全問題。1.4研究方法與技術(shù)路線1.4.1基因克隆從乙型腦炎病毒和偽狂犬病病毒的標(biāo)準(zhǔn)毒株中提取總RNA和DNA。使用逆轉(zhuǎn)錄酶將乙型腦炎病毒的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，根據(jù)已公布的乙型腦炎病毒E蛋白基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，通過PCR擴(kuò)增E蛋白基因。同樣，以偽狂犬病病毒的DNA為模板，依據(jù)gB蛋白基因序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)體系包含模板、引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和緩沖液等。反應(yīng)條件一般為：94℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，55-60℃退火30秒，72℃延伸1-2分鐘，共進(jìn)行30-35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，切膠回收目的基因片段。1.4.2載體構(gòu)建選擇合適的表達(dá)載體，如真核表達(dá)載體pcDNA3.1或原核表達(dá)載體pET-32a(+)等。用限制性內(nèi)切酶對載體和回收的目的基因片段進(jìn)行雙酶切，酶切體系包含載體或基因片段、限制性內(nèi)切酶、緩沖液等，在適宜的溫度下反應(yīng)1-2小時(shí)。酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳分離后，切膠回收。將酶切后的目的基因片段與載體片段用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，連接體系包含目的基因片段、載體片段、T4DNA連接酶和緩沖液等，16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α或BL21中，將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌涂布在含有相應(yīng)抗生素的LB平板上，37℃培養(yǎng)12-16小時(shí)。挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，陽性菌落進(jìn)一步提取質(zhì)粒，通過酶切鑒定和測序鑒定，確保重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建正確。1.4.3細(xì)胞培養(yǎng)若選用真核表達(dá)系統(tǒng)，如哺乳動物細(xì)胞HEK293T或昆蟲細(xì)胞Sf9等，將細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM或Grace's培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑或電穿孔法將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)，收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清。若采用原核表達(dá)系統(tǒng)，將含有重組表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌接種到LB液體培養(yǎng)基中，加入相應(yīng)抗生素，37℃振蕩培養(yǎng)至OD???值達(dá)到0.6-0.8。加入IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)，根據(jù)不同的蛋白表達(dá)情況，優(yōu)化誘導(dǎo)劑濃度（一般為0.1-1mM）、誘導(dǎo)時(shí)間（3-6小時(shí)）和誘導(dǎo)溫度（25-37℃）。誘導(dǎo)結(jié)束后，收集菌體，通過超聲破碎或化學(xué)裂解的方法獲取蛋白粗提液。1.4.4蛋白純化采用親和層析法對目的蛋白進(jìn)行純化。若表達(dá)的蛋白帶有His標(biāo)簽，使用Ni-NTA親和層析柱。將蛋白粗提液上樣到平衡好的層析柱中，用含有咪唑的緩沖液進(jìn)行洗脫，咪唑濃度逐漸升高（如50mM、100mM、200mM等），收集洗脫峰。通過SDS-PAGE電泳檢測洗脫峰中蛋白的純度和含量，將純度較高的洗脫峰合并。再用離子交換層析或凝膠過濾層析進(jìn)一步純化，去除雜質(zhì)和降解產(chǎn)物，獲得高純度的目的蛋白。純化后的蛋白用BCA法測定濃度，-80℃保存?zhèn)溆谩?.4.5動物實(shí)驗(yàn)選用6-8周齡的BALB/c小鼠和4-6周齡的仔豬作為實(shí)驗(yàn)動物。將小鼠和仔豬隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、對照組和空白對照組，每組10-15只。實(shí)驗(yàn)組接種制備的二聯(lián)基因工程疫苗，對照組接種傳統(tǒng)的乙型腦炎疫苗和偽狂犬病疫苗，空白對照組接種生理鹽水。疫苗接種劑量根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定，一般小鼠每只接種10-50μg蛋白，仔豬每頭接種0.5-1mg蛋白。采用肌肉注射或皮下注射的方式進(jìn)行接種，共接種2-3次，每次間隔2-3周。在免疫后的第2、4、6、8周等時(shí)間點(diǎn)采集小鼠和仔豬的血清，通過ELISA法檢測血清中特異性抗體的水平。ELISA實(shí)驗(yàn)中，將純化的目的蛋白包被在酶標(biāo)板上，加入稀釋后的血清，孵育后加入酶標(biāo)二抗，最后加入底物顯色，在酶標(biāo)儀上測定吸光度值。用中和試驗(yàn)檢測血清中中和抗體的活性，將血清與乙型腦炎病毒和偽狂犬病病毒的標(biāo)準(zhǔn)毒株混合，孵育后接種到敏感細(xì)胞上，觀察細(xì)胞病變情況，計(jì)算中和抗體滴度。通過淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)檢測細(xì)胞免疫應(yīng)答。取免疫動物的脾淋巴細(xì)胞，加入ConA或特異性抗原刺激，培養(yǎng)一定時(shí)間后加入MTT試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4-6小時(shí)，離心后棄上清，加入DMSO溶解結(jié)晶，在酶標(biāo)儀上測定吸光度值，計(jì)算淋巴細(xì)胞增殖率。用ELISA試劑盒檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ、IL-4等細(xì)胞因子的含量，評估細(xì)胞免疫應(yīng)答的類型和強(qiáng)度。在免疫動物最后一次接種后2-3周，用乙型腦炎病毒和偽狂犬病病毒的強(qiáng)毒株進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。攻毒劑量為半數(shù)致死量（LD??）或半數(shù)感染量（TCID??）的10-100倍。攻毒后連續(xù)觀察14-21天，記錄動物的發(fā)病情況、臨床癥狀和死亡數(shù)，計(jì)算存活率和保護(hù)率，評估疫苗的保護(hù)效果。本研究的技術(shù)路線如圖1所示：[此處插入技術(shù)路線圖，展示從病毒毒株獲取、基因克隆、載體構(gòu)建、細(xì)胞培養(yǎng)、蛋白表達(dá)純化、動物免疫實(shí)驗(yàn)到結(jié)果分析的整個(gè)研究流程][此處插入技術(shù)路線圖，展示從病毒毒株獲取、基因克隆、載體構(gòu)建、細(xì)胞培養(yǎng)、蛋白表達(dá)純化、動物免疫實(shí)驗(yàn)到結(jié)果分析的整個(gè)研究流程]通過以上研究方法和技術(shù)路線，本研究有望成功構(gòu)建出安全、高效的乙型腦炎病毒—偽狂犬病病毒二聯(lián)基因工程疫苗，并對其免疫效果和安全性進(jìn)行全面評估，為該疫苗的實(shí)際應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。二、乙型腦炎病毒與偽狂犬病病毒特性分析2.1乙型腦炎病毒特性2.1.1病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)乙型腦炎病毒呈球形，直徑約40nm，屬于黃病毒科黃病毒屬。其結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，從內(nèi)到外主要由核心、包膜等部分組成。病毒核心由衣殼蛋白（C）與核酸緊密纏繞構(gòu)成，為病毒的遺傳物質(zhì)提供保護(hù)，并在病毒感染宿主細(xì)胞的過程中，協(xié)助病毒核酸進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)。外披的包膜是一層富含脂質(zhì)的膜結(jié)構(gòu)，來源于宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜，在病毒的感染和傳播過程中發(fā)揮著重要作用。包膜表面布滿了囊膜糖蛋白（E）刺突，這些刺突如同病毒的“觸角”，不僅是病毒的主要抗原成分，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，也是病毒與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，決定了病毒的宿主范圍和感染特異性。此外，囊膜內(nèi)還存在內(nèi)膜蛋白（M），它參與病毒的裝配過程，對維持病毒粒子的結(jié)構(gòu)完整性和穩(wěn)定性具有重要意義。這種獨(dú)特的形態(tài)結(jié)構(gòu)使得乙型腦炎病毒在感染和傳播過程中展現(xiàn)出特殊的性質(zhì)。病毒的球形結(jié)構(gòu)使其在環(huán)境中具有一定的穩(wěn)定性，便于在蚊蟲等傳播媒介和宿主之間傳播。包膜上的E蛋白刺突能夠特異性地識別并結(jié)合宿主細(xì)胞表面的受體，如神經(jīng)細(xì)胞表面的特定糖蛋白或脂蛋白等，從而介導(dǎo)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞。脂質(zhì)包膜的存在則有助于病毒逃避宿主免疫系統(tǒng)的識別和攻擊，增加了病毒感染的成功率。同時(shí)，M蛋白和C蛋白相互協(xié)作，保障了病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的正常復(fù)制和裝配過程。例如，在病毒感染蚊細(xì)胞時(shí)，E蛋白刺突首先與蚊細(xì)胞表面受體結(jié)合，然后病毒通過膜融合的方式進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。在細(xì)胞內(nèi)，病毒利用宿主細(xì)胞的物質(zhì)和能量進(jìn)行復(fù)制，M蛋白參與病毒包膜的形成，C蛋白包裹新合成的核酸，最終裝配成成熟的病毒粒子釋放出來，繼續(xù)感染其他細(xì)胞。2.1.2病毒基因組特征乙型腦炎病毒基因組為單股正鏈RNA，全長約11kb。它具有5’端帽結(jié)構(gòu)和3’端poly(A)尾結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)對于病毒RNA的穩(wěn)定性、翻譯起始以及病毒的感染性都至關(guān)重要。5’端帽結(jié)構(gòu)能夠保護(hù)病毒RNA免受核酸酶的降解，同時(shí)促進(jìn)病毒RNA與宿主細(xì)胞核糖體的結(jié)合，啟動翻譯過程；3’端poly(A)尾結(jié)構(gòu)則有助于穩(wěn)定病毒RNA，延長其在宿主細(xì)胞內(nèi)的半衰期?；蚪M包含12個(gè)開放閱讀框（ORF），可分為結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白兩大類。結(jié)構(gòu)蛋白基因編碼衣殼蛋白（C）、膜蛋白（M）、包膜蛋白（E）以及非結(jié)構(gòu)蛋白1（NS1）。C蛋白組成病毒衣殼，介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞的相互作用和進(jìn)入；M蛋白嵌入病毒包膜中，調(diào)節(jié)病毒包膜的形成和融合；E蛋白位于病毒包膜外部，是病毒的主要表面蛋白，負(fù)責(zé)與宿主細(xì)胞受體的識別和結(jié)合，在病毒的感染和免疫過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。非結(jié)構(gòu)蛋白基因編碼NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5等蛋白。NS1蛋白調(diào)節(jié)病毒復(fù)制，對抗宿主免疫反應(yīng)；NS2A蛋白抑制干擾素誘導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)；NS2B蛋白參與病毒RNA復(fù)制和病毒組裝；NS3蛋白具有絲氨酸蛋白酶和解旋酶活性，參與病毒RNA復(fù)制和翻譯；NS4A蛋白與NS3蛋白形成復(fù)合物，增強(qiáng)NS3的蛋白酶活性；NS4B蛋白參與病毒RNA復(fù)制和組裝，抑制宿主免疫反應(yīng)；NS5蛋白具有RNA依賴性RNA聚合酶活性，負(fù)責(zé)病毒RNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。乙型腦炎病毒的基因特征與病毒的致病性和免疫原性密切相關(guān)。E蛋白基因的變異可能導(dǎo)致病毒與宿主細(xì)胞受體結(jié)合能力的改變，從而影響病毒的致病性和傳播能力。研究發(fā)現(xiàn)，某些E蛋白基因突變的病毒株對宿主細(xì)胞的感染效率明顯降低，致病性也隨之減弱。病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白基因在病毒逃避宿主免疫監(jiān)視方面發(fā)揮著重要作用。例如，NS1蛋白能夠抑制宿主細(xì)胞的補(bǔ)體系統(tǒng)激活，NS2A蛋白和NS4B蛋白可以干擾宿主細(xì)胞的干擾素信號通路，使病毒能夠在宿主細(xì)胞內(nèi)順利復(fù)制和傳播。而病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，特別是E蛋白，具有良好的免疫原性，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體和細(xì)胞免疫反應(yīng)，為疫苗的研發(fā)提供了重要的靶點(diǎn)。2.1.3病毒的傳播與致病機(jī)制乙型腦炎病毒主要通過蚊蟲叮咬傳播，我國主要的傳播媒介為三帶喙庫蚊。在自然界中，病毒通常在蚊-豬-蚊等動物間循環(huán)。當(dāng)蚊叮咬感染乙型腦炎病毒的動物尤其是豬后，病毒進(jìn)入蚊體內(nèi)迅速繁殖。蚊的中腸細(xì)胞是病毒最初的復(fù)制部位，病毒在中腸細(xì)胞內(nèi)大量增殖后，經(jīng)病毒血癥侵犯唾液腺和神經(jīng)組織，并再次復(fù)制。此時(shí)，蚊的唾液中含有高濃度的病毒，當(dāng)蚊再次叮咬其他動物或人類時(shí)，病毒就會隨之進(jìn)入新的宿主體內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)傳播。在熱帶和亞熱帶地區(qū)，由于氣候溫暖濕潤，蚊蟲終年存在，蚊和動物宿主之間能夠構(gòu)成病毒持久循環(huán)。而在溫帶地區(qū)，鳥類可能是自然界中的重要貯存宿主，病毒每年或通過候鳥的遷棲而傳入，或在流行區(qū)存活過冬。此外，實(shí)驗(yàn)表明自然界中蚊與蝙蝠息息相關(guān)，蚊將乙腦病毒傳給蝙蝠，受染蝙蝠在10℃時(shí)不產(chǎn)生病毒血癥，但可持續(xù)存在達(dá)3個(gè)月之久，當(dāng)蝙蝠返回室溫環(huán)境3天后，會出現(xiàn)病毒血癥，構(gòu)成蚊-蝙蝠-蚊的循環(huán)。冷血脊椎動物如蛇、蛙、蜥蜴等也可能作為冬季貯存宿主。病毒進(jìn)入人體后，首先在局部淋巴結(jié)、血管內(nèi)皮細(xì)胞、肝、脾等吞噬細(xì)胞內(nèi)增殖。經(jīng)過一段時(shí)間的潛伏期后，病毒通過血液循環(huán)突破血腦屏障，侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引發(fā)腦實(shí)質(zhì)病變。病毒在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞受損、壞死，釋放炎癥介質(zhì)，引起炎癥反應(yīng)?；颊叱３霈F(xiàn)高熱、頭痛、惡心、嘔吐、意識障礙、抽搐、呼吸衰竭等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡。即使部分患者幸存，也可能因?yàn)樯窠?jīng)細(xì)胞的損傷而留下嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，如智力障礙、癲癇、肢體癱瘓等。乙型腦炎病毒的致病機(jī)制涉及多個(gè)方面。病毒對神經(jīng)細(xì)胞的直接損傷是致病的重要原因之一。病毒感染神經(jīng)細(xì)胞后，利用神經(jīng)細(xì)胞的物質(zhì)和能量進(jìn)行復(fù)制，破壞神經(jīng)細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能。病毒感染還會引發(fā)宿主的免疫反應(yīng)，過度的免疫反應(yīng)可能導(dǎo)致炎癥因子的大量釋放，引起炎癥風(fēng)暴，進(jìn)一步加重神經(jīng)細(xì)胞的損傷。病毒感染還可能影響神經(jīng)遞質(zhì)的合成、釋放和代謝，導(dǎo)致神經(jīng)功能紊亂。深入了解乙型腦炎病毒的傳播與致病機(jī)制，對于制定有效的防控策略和開發(fā)針對性的治療方法具有重要意義，也為乙型腦炎病毒—偽狂犬病病毒二聯(lián)基因工程疫苗的研發(fā)提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。2.2偽狂犬病病毒特性2.2.1病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)偽狂犬病病毒粒子呈橢圓形或圓形，直徑為150-180nm，在電子顯微鏡下觀察，其結(jié)構(gòu)清晰且獨(dú)特。病毒粒子由最外層的囊膜、中間的核衣殼以及內(nèi)部的核酸構(gòu)成。囊膜是由宿主細(xì)胞衍生而來的脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)，表面布滿了纖突，這些纖突由11種糖蛋白（gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gK、gL、gM、gW、gN）組成，它們在病毒與宿主細(xì)胞的相互作用過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。例如，gB、gH和gL的基因是PRV復(fù)制所必需的，其中g(shù)B蛋白參與病毒的吸附和膜融合過程，對于病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞至關(guān)重要；gE蛋白具有Fc受體活性，并可結(jié)合正常的IgG，在病毒的免疫逃逸和感染過程中扮演重要角色。核衣殼呈二十面體立體對稱結(jié)構(gòu)，直徑約為105-110nm，由162個(gè)殼粒組成，它包裹著病毒的核心，即基因組DNA，對病毒的遺傳物質(zhì)起到了保護(hù)作用。這種復(fù)雜而有序的結(jié)構(gòu)，使得偽狂犬病病毒能夠在不同的環(huán)境中保持相對穩(wěn)定，并且有效地實(shí)現(xiàn)對宿主細(xì)胞的感染。當(dāng)病毒接觸到宿主細(xì)胞時(shí)，囊膜表面的纖突糖蛋白能夠特異性地識別宿主細(xì)胞表面的受體，從而介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞的吸附和融合。一旦病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞，核衣殼會釋放出病毒基因組DNA，啟動病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程。整個(gè)過程中，病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)與病毒的感染、傳播和致病等生物學(xué)特性緊密相關(guān)，是病毒實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)功能的重要基礎(chǔ)。2.2.2病毒基因組特征偽狂犬病病毒基因組為線形雙股DNA，長度約150kb，其G+C含量高達(dá)73%，是皰疹病毒中最高的。這一特點(diǎn)使得PRV在體外PCR診斷時(shí)對檢測引物和試劑有更高的要求，在常規(guī)PCR試劑檢測中容易出現(xiàn)假陰性。基因組包含多個(gè)基因，可編碼多種蛋白，這些蛋白在病毒的生命周期中發(fā)揮著不同的作用。其中，一些關(guān)鍵基因及其編碼蛋白的功能尤為重要。例如，胸苷激酶（TK）基因編碼的胸苷激酶參與病毒的核苷酸代謝過程，對于病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制具有重要意義。gB、gC、gD、gE等糖蛋白基因編碼的糖蛋白，不僅參與病毒與宿主細(xì)胞的吸附、融合和侵入過程，還在病毒的免疫逃逸和致病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。gE糖蛋白是病毒毒力和免疫逃逸的關(guān)鍵因子，缺失gE基因的疫苗株可以有效區(qū)分疫苗免疫動物和自然感染動物，這為偽狂犬病的防控和凈化提供了重要的技術(shù)手段。病毒基因組還包含一些非編碼區(qū)域，這些區(qū)域雖然不編碼蛋白質(zhì)，但在病毒基因的表達(dá)調(diào)控、復(fù)制起始等過程中起著不可或缺的作用。它們可以通過與宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子或病毒自身的調(diào)控蛋白相互作用，調(diào)節(jié)病毒基因的表達(dá)水平，從而影響病毒的復(fù)制效率和感染進(jìn)程。偽狂犬病病毒的基因組特征決定了病毒的生物學(xué)特性，也為疫苗研發(fā)提供了重要的靶點(diǎn)。通過對關(guān)鍵基因的修飾或缺失，可以構(gòu)建出安全有效的基因工程疫苗。例如，基于gE基因缺失的偽狂犬病基因工程疫苗，在實(shí)際應(yīng)用中表現(xiàn)出良好的免疫效果和安全性，能夠有效地預(yù)防偽狂犬病的發(fā)生。2.2.3病毒的傳播與致病機(jī)制偽狂犬病病毒的傳播方式較為多樣。空氣傳播是其重要的傳播途徑之一，當(dāng)感染病毒的動物咳嗽、打噴嚏時(shí)，含有病毒的飛沫會在空氣中傳播，周圍的易感動物吸入后就可能被感染。直接接觸傳播也很常見，病畜的唾液、鼻涕、尿液和乳汁等分泌物中含有大量病毒，健康動物與病畜直接接觸或接觸其排泄物，都有很大幾率感染病毒。病毒還可通過污染環(huán)境、工具和運(yùn)輸工具等進(jìn)行間接接觸傳播，如獸醫(yī)器械、飼料、水等被病毒污染后，健康動物接觸這些物品也可能感染偽狂犬病病毒。此外，配種過程中也可能傳播病毒，若種豬感染了偽狂犬病病毒，在配種時(shí)可將病毒傳播給母豬。病毒侵入動物體內(nèi)后，首先在侵入部位的上皮細(xì)胞和淋巴組織中進(jìn)行增殖。隨后，病毒通過血液循環(huán)擴(kuò)散到全身各個(gè)組織和器官，尤其是神經(jīng)系統(tǒng)。病毒在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)大量繁殖，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞受損，引發(fā)一系列臨床癥狀。不同年齡的豬感染偽狂犬病病毒后的癥狀有所不同。新生仔豬感染后，常表現(xiàn)出嚴(yán)重的神經(jīng)癥狀，如高熱、食欲廢絕、呼吸困難、流涎、嘔吐、腹瀉、抑郁震顫等，繼而出現(xiàn)運(yùn)動失調(diào)、間歇性抽搐、昏迷以至衰竭死亡，15日齡以內(nèi)仔豬死亡率高達(dá)80%-100%；斷奶仔豬發(fā)病率為20%-40%，死亡率為10%-20%左右，除了神經(jīng)癥狀外，還可能出現(xiàn)呼吸道癥狀，如咳嗽、氣喘等；育肥豬感染后癥狀相對較輕，主要表現(xiàn)為增重減慢、輕微的呼吸道癥狀等。成年豬感染后，公豬常發(fā)生睪丸腫脹、萎縮等，使種用性能降低或喪失；母豬則表現(xiàn)為返情、屢配不孕，妊娠母豬常出現(xiàn)流產(chǎn)、產(chǎn)死胎和木乃伊胎等繁殖障礙。偽狂犬病病毒的致病機(jī)制涉及多個(gè)方面。病毒對神經(jīng)細(xì)胞的直接損傷是致病的重要原因，病毒在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制，破壞神經(jīng)細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致神經(jīng)傳導(dǎo)異常。病毒感染還會引發(fā)宿主的免疫反應(yīng)，過度的免疫反應(yīng)可能導(dǎo)致炎癥因子的大量釋放，引起炎癥風(fēng)暴，進(jìn)一步加重組織和器官的損傷。病毒感染還可能干擾宿主細(xì)胞的正常代謝過程，影響細(xì)胞的生長、分化和凋亡，從而導(dǎo)致機(jī)體生理功能紊亂。由于偽狂犬病病毒給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響了畜牧業(yè)的健康發(fā)展，因此，加強(qiáng)對偽狂犬病病毒的防控至關(guān)重要。通過疫苗接種、加強(qiáng)養(yǎng)殖管理、嚴(yán)格消毒等綜合措施，可以有效降低病毒的傳播風(fēng)險(xiǎn)，減少發(fā)病幾率，保障養(yǎng)豬業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。2.3兩種病毒對養(yǎng)殖業(yè)及公共衛(wèi)生的影響乙型腦炎病毒和偽狂犬病病毒對養(yǎng)殖業(yè)的危害巨大，給養(yǎng)殖戶帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。在養(yǎng)豬業(yè)中，乙型腦炎病毒感染母豬后，常導(dǎo)致母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、木乃伊胎等繁殖障礙問題。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在乙型腦炎病毒流行地區(qū)，母豬的繁殖損失率可高達(dá)20%-30%。一頭母豬的養(yǎng)殖成本包括飼料、疫苗、獸藥、人工等費(fèi)用，以一頭母豬養(yǎng)殖成本3000元計(jì)算，若因感染乙型腦炎病毒導(dǎo)致繁殖失敗，損失可達(dá)數(shù)千元。而且，感染乙型腦炎病毒的仔豬生長發(fā)育受阻，死亡率增加，即使存活下來，也可能成為僵豬，生長緩慢，飼料轉(zhuǎn)化率低，進(jìn)一步降低了養(yǎng)殖效益。偽狂犬病病毒對養(yǎng)豬業(yè)的影響更為嚴(yán)重。仔豬感染偽狂犬病病毒后，常出現(xiàn)高熱、神經(jīng)癥狀、呼吸困難等，15日齡以內(nèi)仔豬死亡率高達(dá)80%-100%。斷奶仔豬發(fā)病率為20%-40%，死亡率為10%-20%左右。育肥豬感染后，生長速度減慢，料肉比升高，增加了養(yǎng)殖成本。成年豬感染偽狂犬病病毒后，公豬常發(fā)生睪丸腫脹、萎縮等，使種用性能降低或喪失；母豬則表現(xiàn)為返情、屢配不孕，妊娠母豬常出現(xiàn)流產(chǎn)、產(chǎn)死胎和木乃伊胎等。據(jù)估算，我國每年因偽狂犬病病毒感染給養(yǎng)豬業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)十億元。除了養(yǎng)豬業(yè)，這兩種病毒還對其他養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生影響。在養(yǎng)牛業(yè)中，牛感染乙型腦炎病毒后，可能出現(xiàn)發(fā)熱、神經(jīng)癥狀等，影響牛的生長和生產(chǎn)性能。偽狂犬病病毒也可感染牛，導(dǎo)致牛出現(xiàn)發(fā)熱、奇癢、呼吸和神經(jīng)癥狀等，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致死亡。在養(yǎng)羊業(yè)中，羊感染這兩種病毒后，同樣會出現(xiàn)類似的癥狀，影響羊的健康和養(yǎng)殖效益。這兩種病毒對公共衛(wèi)生也構(gòu)成了潛在威脅。乙型腦炎病毒是一種人獸共患病毒，人類感染后可引發(fā)流行性乙型腦炎。乙腦患者病情兇險(xiǎn)，病死率較高，幸存者也可能留下嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。在我國，每年仍有一定數(shù)量的乙腦病例發(fā)生，尤其是在農(nóng)村和偏遠(yuǎn)地區(qū)，由于衛(wèi)生條件相對較差，蚊蟲滋生，乙腦的發(fā)病率相對較高。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，全球每年約有5-10萬例乙型腦炎病例，其中約15%的患者死亡，20-30%的幸存者會留下永久性神經(jīng)功能障礙。這些患者不僅需要長期的醫(yī)療護(hù)理，給家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，還可能影響患者的生活質(zhì)量和社會融入。偽狂犬病病毒雖然一般不感染人類，但豬作為偽狂犬病病毒的主要宿主，其感染后大量排毒，增加了病毒傳播給其他動物和人類的風(fēng)險(xiǎn)。尤其是在養(yǎng)殖場周邊環(huán)境中，病毒可能通過空氣、水等途徑傳播，對周邊居民的健康構(gòu)成潛在威脅。一旦病毒發(fā)生變異，獲得感染人類的能力，后果將不堪設(shè)想。鑒于乙型腦炎病毒和偽狂犬病病毒對養(yǎng)殖業(yè)及公共衛(wèi)生的嚴(yán)重影響，加強(qiáng)對這兩種病毒的防控迫在眉睫。開發(fā)安全、高效的疫苗是防控這兩種病毒的關(guān)鍵措施之一。通過疫苗接種，可以有效降低動物的感染率，減少病毒的傳播，從而降低其對養(yǎng)殖業(yè)和公共衛(wèi)生的危害。加強(qiáng)養(yǎng)殖管理、做好消毒工作、控制蚊蟲滋生等綜合防控措施也至關(guān)重要。只有采取全方位的防控策略，才能有效控制這兩種病毒的傳播，保障養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展和公共衛(wèi)生安全。三、二聯(lián)基因工程疫苗制備技術(shù)原理3.1基因工程疫苗概述基因工程疫苗作為現(xiàn)代疫苗學(xué)領(lǐng)域的重要創(chuàng)新成果，是指運(yùn)用DNA重組技術(shù)，將病原體的保護(hù)性抗原編碼基因片段克隆并定向插入細(xì)菌、酵母菌或哺乳動物細(xì)胞等宿主表達(dá)系統(tǒng)中，使之充分表達(dá)，經(jīng)純化后制得的疫苗。這一技術(shù)突破了傳統(tǒng)疫苗制備的局限，開啟了疫苗研發(fā)的新篇章?；蚬こ桃呙绲陌l(fā)展歷程見證了現(xiàn)代生物技術(shù)的飛速進(jìn)步。自20世紀(jì)80年代起，基因工程疫苗開始嶄露頭角，最早成功研發(fā)的基因工程疫苗是乙肝疫苗。隨著分子生物學(xué)、基因編輯等技術(shù)的不斷革新，基因工程疫苗在種類和性能上都取得了顯著進(jìn)展。如今，它已廣泛應(yīng)用于多種傳染病的預(yù)防，如人乳頭瘤病毒（HPV）疫苗用于預(yù)防宮頸癌和其他生殖器疣病，流感病毒的基因工程疫苗也在不斷研發(fā)和優(yōu)化中。在癌癥治療領(lǐng)域，腫瘤疫苗作為基因工程疫苗的一種特殊類型，正通過刺激免疫系統(tǒng)攻擊癌細(xì)胞，為癌癥治療帶來新的希望。根據(jù)制備技術(shù)和原理的差異，基因工程疫苗主要分為以下幾類：亞單位疫苗：通過化學(xué)及生物技術(shù)手段，選取具有免疫活性的蛋白制備而成。其制備過程通常是將具有中和表位的抗原基因，利用原核或真核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行蛋白表達(dá)，再將表達(dá)出的多肽或蛋白質(zhì)遞呈給抗原遞呈細(xì)胞，從而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高度的中和抗體。例如豬圓環(huán)病毒2型基因工程亞單位疫苗、羊棘球蚴（包蟲）病基因工程亞單位疫苗等。這種疫苗安全性高，免疫具有持久性，易于實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。然而，它也存在免疫原性差的問題，往往需要與蛋白載體偶聯(lián)后使用，且需多次接種。重組活載體疫苗：借助基因工程手段，將一種病原免疫相關(guān)抗原整合到另一種載體基因組的復(fù)制非必需片斷中構(gòu)建而成。常見的載體包括腺病毒、流感病毒、痘病毒等。以雞傳染性法氏囊病病毒、火雞皰疹病毒載體活疫苗為代表，此類疫苗能夠同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和體液免疫，一個(gè)載體可表達(dá)多個(gè)免疫基因，有利于生產(chǎn)多價(jià)疫苗或多聯(lián)苗。但它也存在一定風(fēng)險(xiǎn)，可能與野生載體生物發(fā)生基因重組，限制免疫力，甚至進(jìn)化成新毒株，二次免疫時(shí)還可能產(chǎn)生排斥反應(yīng)。基因缺失疫苗：利用基因工程技術(shù)剔除特定的毒力基因或基因片段，從而獲得毒力減弱但仍保持較好免疫原性的突變株。像偽狂犬病毒gE-缺失疫苗、牛傳染性鼻氣管炎基因缺失疫苗等。該疫苗安全性好，不易返祖，免疫原性好，產(chǎn)生的免疫力堅(jiān)實(shí)，免疫期長。不過，病毒有可能會與野毒株重組或發(fā)生核酸修補(bǔ)，重獲毒性，并且通常不能用于種豬。核酸（DNA）疫苗：將病原微生物或寄生蟲基因組中編碼免疫原性蛋白的基因克隆到真核表達(dá)載體中制備成重組質(zhì)粒。導(dǎo)入動物體內(nèi)后，重組質(zhì)粒會刺激機(jī)體產(chǎn)生針對性的細(xì)胞免疫和體液抗體。例如禽流感DNA疫苗（H5亞，pH5-GD）。核酸疫苗幾乎具備所有類型疫苗的優(yōu)點(diǎn)，可產(chǎn)生較強(qiáng)和較持久的免疫應(yīng)答，穩(wěn)定性好，易保存。但它的安全性、體液免疫水平有待提高，用量大，使用時(shí)需慎重，因?yàn)榻臃N后是否會產(chǎn)生抗DNA抗體和自身免疫等問題尚未研究清楚。在現(xiàn)代疫苗研發(fā)中，基因工程疫苗占據(jù)著舉足輕重的地位。與傳統(tǒng)疫苗相比，它具有諸多顯著優(yōu)勢。基因工程疫苗能夠避免使用活病毒或細(xì)菌，極大地降低了疫苗接種的風(fēng)險(xiǎn)，例如傳統(tǒng)的活疫苗存在毒力返強(qiáng)、污染其他活病原體等問題，而基因工程疫苗有效規(guī)避了這些風(fēng)險(xiǎn)?；蚬こ桃呙缈梢愿珳?zhǔn)地刺激人體自身的免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生更強(qiáng)的免疫反應(yīng)。通過對病原體基因的精確操作，能夠使疫苗表達(dá)出更具免疫原性的抗原，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答。在生產(chǎn)方面，基因工程疫苗的生產(chǎn)過程更加環(huán)保和高效，能夠?qū)崿F(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，滿足全球?qū)σ呙绲拇罅啃枨蟆ｋS著科技的不斷進(jìn)步，基因工程疫苗的研發(fā)和應(yīng)用前景十分廣闊。一方面，研究人員正致力于開發(fā)能夠同時(shí)預(yù)防多種疾病的復(fù)合疫苗，提高疫苗接種的便利性和接受度，這對于簡化疫苗接種程序、降低醫(yī)療成本具有重要意義。另一方面，利用基因編輯技術(shù)對疫苗進(jìn)行優(yōu)化，以提高其免疫原性和耐受性，將為疫苗的升級換代提供強(qiáng)大的技術(shù)支持。面對新興疾病和變異病原體的挑戰(zhàn)，基因工程疫苗憑借其快速響應(yīng)和精準(zhǔn)定制的特點(diǎn)，有望成為防控這些疾病的有力武器。3.2乙型腦炎病毒—偽狂犬病病毒二聯(lián)基因工程疫苗制備原理3.2.1目標(biāo)基因選擇與克隆在乙型腦炎病毒—偽狂犬病病毒二聯(lián)基因工程疫苗的制備過程中，目標(biāo)基因的選擇至關(guān)重要，它直接關(guān)系到疫苗的免疫效果。對于乙型腦炎病毒，E蛋白基因是關(guān)鍵的免疫原性基因。E蛋白作為病毒表面的主要抗原成分，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，對病毒感染起到關(guān)鍵的免疫保護(hù)作用。研究表明，E蛋白基因編碼的E蛋白包含多個(gè)抗原表位，其中一些表位能夠與宿主細(xì)胞表面的受體特異性結(jié)合，介導(dǎo)病毒的感染過程。而這些表位也是免疫系統(tǒng)識別病毒的重要靶點(diǎn)，機(jī)體免疫系統(tǒng)在識別E蛋白抗原表位后，會產(chǎn)生特異性的免疫應(yīng)答，包括B細(xì)胞產(chǎn)生中和抗體，以及T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)。因此，選擇E蛋白基因作為乙型腦炎病毒的目標(biāo)基因，能夠有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對乙型腦炎病毒的免疫保護(hù)作用。對于偽狂犬病病毒，gB蛋白基因是重要的免疫原性基因。gB蛋白在病毒感染宿主細(xì)胞的過程中發(fā)揮著不可或缺的作用，它參與了病毒與宿主細(xì)胞的吸附、融合和侵入過程。gB蛋白具有良好的免疫原性，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生高效價(jià)的中和抗體，這些中和抗體可以阻斷gB蛋白與宿主細(xì)胞受體的結(jié)合，從而阻止病毒感染宿主細(xì)胞。此外，gB蛋白還能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體對病毒感染的抵抗力。因此，選擇gB蛋白基因作為偽狂犬病病毒的目標(biāo)基因，對于制備有效的二聯(lián)基因工程疫苗具有重要意義?；蚩寺∈谦@取目標(biāo)基因的關(guān)鍵步驟，其方法和過程主要包括以下幾個(gè)環(huán)節(jié)。首先是病毒核酸的提取，從乙型腦炎病毒和偽狂犬病病毒的感染細(xì)胞或病毒液中提取總RNA和DNA。對于乙型腦炎病毒，由于其基因組為單股正鏈RNA，需要使用RNA提取試劑盒，按照試劑盒說明書的操作步驟，經(jīng)過細(xì)胞裂解、RNA分離、洗滌和洗脫等過程，獲得高質(zhì)量的總RNA。對于偽狂犬病病毒，其基因組為雙鏈DNA，可采用DNA提取試劑盒，通過細(xì)胞裂解、DNA分離、沉淀和溶解等步驟，提取病毒的基因組DNA。然后是逆轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增。對于乙型腦炎病毒的E蛋白基因，以提取的總RNA為模板，使用逆轉(zhuǎn)錄酶將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系通常包括總RNA、逆轉(zhuǎn)錄酶、引物、dNTPs和緩沖液等，在適宜的溫度和時(shí)間條件下進(jìn)行反應(yīng)。以cDNA為模板，根據(jù)已公布的乙型腦炎病毒E蛋白基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，通過PCR擴(kuò)增E蛋白基因。PCR反應(yīng)體系包含cDNA模板、引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和緩沖液等，反應(yīng)條件一般為：94℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，55-60℃退火30秒，72℃延伸1-2分鐘，共進(jìn)行30-35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。同樣，對于偽狂犬病病毒的gB蛋白基因，以提取的基因組DNA為模板，依據(jù)gB蛋白基因序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系和條件與乙型腦炎病毒E蛋白基因擴(kuò)增類似。擴(kuò)增產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，在凝膠電泳過程中，DNA分子會在電場的作用下向正極移動，不同大小的DNA片段由于遷移速率不同而在凝膠上分離。將擴(kuò)增產(chǎn)物與DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)一起進(jìn)行電泳，在紫外燈下觀察，若擴(kuò)增出的條帶大小與預(yù)期的E蛋白基因和gB蛋白基因大小相符，則表明擴(kuò)增成功。切膠回收目的基因片段，使用凝膠回收試劑盒，按照試劑盒操作步驟，經(jīng)過凝膠溶解、DNA結(jié)合、洗滌和洗脫等過程，獲得高純度的目的基因片段，為后續(xù)的表達(dá)載體構(gòu)建提供材料。3.2.2表達(dá)載體構(gòu)建表達(dá)載體的選擇是構(gòu)建乙型腦炎病毒—偽狂犬病病毒二聯(lián)基因工程疫苗的重要環(huán)節(jié)，它直接影響到目標(biāo)基因的表達(dá)效率和疫苗的質(zhì)量。選擇表達(dá)載體時(shí)，主要遵循以下原則。首先是表達(dá)效率，載體應(yīng)具備高效的啟動子和增強(qiáng)子等調(diào)控元件，能夠啟動目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，提高目的蛋白的表達(dá)水平。例如，常用的真核表達(dá)載體pcDNA3.1含有CMV啟動子，具有很強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄啟動能力，能夠驅(qū)動外源基因在哺乳動物細(xì)胞中高效表達(dá)；原核表達(dá)載體pET系列含有T7啟動子，在T7RNA聚合酶的作用下，可實(shí)現(xiàn)外源基因在大腸桿菌中的高效表達(dá)。載體應(yīng)具有穩(wěn)定的遺傳特性，在宿主細(xì)胞內(nèi)能夠穩(wěn)定存在，不發(fā)生重組、缺失或突變等現(xiàn)象，確保目標(biāo)基因的穩(wěn)定表達(dá)。載體還需具備合適的多克隆位點(diǎn)（MCS），便于目標(biāo)基因的插入。多克隆位點(diǎn)應(yīng)包含多種限制性內(nèi)切酶的識別序列，且這些酶切位點(diǎn)在載體的其他部位不存在，以保證目標(biāo)基因能夠準(zhǔn)確、定向地插入載體中。載體還應(yīng)含有篩選標(biāo)記基因，如抗生素抗性基因等，便于在轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染過程中篩選出含有重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。構(gòu)建包含兩種病毒目標(biāo)基因表達(dá)載體的步驟和技術(shù)較為復(fù)雜，需要精確的分子生物學(xué)操作。以真核表達(dá)載體pcDNA3.1為例，首先用限制性內(nèi)切酶對載體和回收的乙型腦炎病毒E蛋白基因、偽狂犬病病毒gB蛋白基因片段進(jìn)行雙酶切。根據(jù)載體和目的基因上的酶切位點(diǎn)，選擇合適的限制性內(nèi)切酶，如BamHI和EcoRI等。酶切體系包含載體或基因片段、限制性內(nèi)切酶、緩沖液等，在適宜的溫度下反應(yīng)1-2小時(shí)，使載體和目的基因片段產(chǎn)生粘性末端。酶切產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳分離后，切膠回收。將酶切后的目的基因片段與載體片段用T4DNA連接酶進(jìn)行連接。連接體系包含目的基因片段、載體片段、T4DNA連接酶和緩沖液等，16℃連接過夜。T4DNA連接酶能夠催化目的基因片段與載體片段的粘性末端之間形成磷酸二酯鍵，從而將目的基因插入載體中，構(gòu)建成重組表達(dá)質(zhì)粒。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，將感受態(tài)大腸桿菌與連接產(chǎn)物混合，冰浴30分鐘，然后42℃熱激90秒，迅速置于冰上冷卻2分鐘。將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌涂布在含有相應(yīng)抗生素（如氨芐青霉素）的LB平板上，37℃培養(yǎng)12-16小時(shí)。在含有抗生素的平板上，只有成功轉(zhuǎn)化了含有抗生素抗性基因重組表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌才能生長，形成單菌落。挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，以菌落為模板，使用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。若擴(kuò)增出與目的基因大小相符的條帶，則表明該菌落中可能含有正確插入目的基因的重組表達(dá)質(zhì)粒。陽性菌落進(jìn)一步提取質(zhì)粒，通過酶切鑒定和測序鑒定，用限制性內(nèi)切酶對提取的質(zhì)粒進(jìn)行酶切，觀察酶切產(chǎn)物的條帶大小是否與預(yù)期相符；將質(zhì)粒進(jìn)行測序，與目標(biāo)基因的原始序列進(jìn)行比對，確保重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建正確。通過以上步驟，成功構(gòu)建出包含乙型腦炎病毒E蛋白基因和偽狂犬病病毒gB蛋白基因的重組表達(dá)載體，為后續(xù)的宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染和疫苗制備奠定基礎(chǔ)。3.2.3宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染與表達(dá)轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞是實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因表達(dá)的關(guān)鍵步驟，其方法主要包括化學(xué)轉(zhuǎn)染法、物理轉(zhuǎn)染法和病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法等。化學(xué)轉(zhuǎn)染法中，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑是常用的轉(zhuǎn)染工具。脂質(zhì)體是一種人工膜泡，由磷脂等脂質(zhì)組成，能夠與細(xì)胞膜融合。將重組表達(dá)質(zhì)粒與脂質(zhì)體混合，形成脂質(zhì)體-質(zhì)粒復(fù)合物。該復(fù)合物能夠被細(xì)胞攝取，進(jìn)入細(xì)胞后，質(zhì)粒從脂質(zhì)體中釋放出來，進(jìn)入細(xì)胞核，實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)染。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法操作簡單，轉(zhuǎn)染效率較高，但對細(xì)胞有一定的毒性。陽離子聚合物轉(zhuǎn)染試劑也是常用的化學(xué)轉(zhuǎn)染方法之一。陽離子聚合物帶有正電荷，能夠與帶負(fù)電荷的DNA分子結(jié)合，形成復(fù)合物。這種復(fù)合物可以通過細(xì)胞的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)染。陽離子聚合物轉(zhuǎn)染試劑毒性較低，但轉(zhuǎn)染效率相對脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法可能稍低。物理轉(zhuǎn)染法中，電穿孔法是一種有效的轉(zhuǎn)染方式。將宿主細(xì)胞和重組表達(dá)質(zhì)粒混合后，置于電場中。在高強(qiáng)度電場的作用下，細(xì)胞膜會形成小孔，使質(zhì)粒能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。電穿孔法轉(zhuǎn)染效率高，適用于多種細(xì)胞類型，但對細(xì)胞的損傷較大，需要優(yōu)化電場參數(shù)等條件。顯微注射法是將重組表達(dá)質(zhì)粒直接注射到細(xì)胞的細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中，實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)染。這種方法轉(zhuǎn)染效率高，但操作復(fù)雜，需要專業(yè)的設(shè)備和技術(shù)人員，且只能用于少量細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法利用病毒的感染特性，將重組表達(dá)質(zhì)粒包裝到病毒載體中，如腺病毒載體、慢病毒載體等。病毒載體能夠感染宿主細(xì)胞，并將重組表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。這種方法轉(zhuǎn)染效率高，能夠?qū)崿F(xiàn)穩(wěn)定的基因表達(dá)，但病毒載體的制備過程復(fù)雜，存在一定的安全風(fēng)險(xiǎn)。在宿主細(xì)胞中，目標(biāo)基因的表達(dá)受到多種因素的影響。啟動子是影響基因表達(dá)的關(guān)鍵因素之一。強(qiáng)啟動子能夠高效啟動基因的轉(zhuǎn)錄，提高目的蛋白的表達(dá)水平。不同的啟動子在不同的宿主細(xì)胞中活性不同，因此需要根據(jù)宿主細(xì)胞的類型選擇合適的啟動子。例如，在哺乳動物細(xì)胞中，CMV啟動子具有很強(qiáng)的活性；在昆蟲細(xì)胞中，多角體蛋白啟動子較為常用。宿主細(xì)胞的類型也對基因表達(dá)有重要影響。不同類型的宿主細(xì)胞具有不同的代謝途徑和生理特性，對目標(biāo)基因的表達(dá)能力也不同。大腸桿菌是常用的原核表達(dá)宿主細(xì)胞，具有生長快、易于培養(yǎng)、遺傳背景清楚等優(yōu)點(diǎn)，適合表達(dá)一些簡單的蛋白質(zhì)。但大腸桿菌缺乏真核細(xì)胞的蛋白質(zhì)修飾系統(tǒng)，對于需要糖基化等修飾的蛋白質(zhì)，表達(dá)效果可能不理想。哺乳動物細(xì)胞如HEK293T細(xì)胞、CHO細(xì)胞等，具有完整的蛋白質(zhì)修飾系統(tǒng)，能夠表達(dá)出具有天然活性的蛋白質(zhì)，但培養(yǎng)條件較為苛刻，成本較高。昆蟲細(xì)胞如Sf9細(xì)胞，常用于桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，能夠表達(dá)出具有正確折疊和修飾的蛋白質(zhì)，且培養(yǎng)成本相對較低。培養(yǎng)條件對目標(biāo)基因的表達(dá)也至關(guān)重要。溫度、pH值、培養(yǎng)基成分等培養(yǎng)條件都會影響宿主細(xì)胞的生長和代謝，進(jìn)而影響基因的表達(dá)。在培養(yǎng)過程中，需要根據(jù)宿主細(xì)胞的特點(diǎn)，優(yōu)化培養(yǎng)條件。例如，大腸桿菌的最適生長溫度為37℃，而哺乳動物細(xì)胞的培養(yǎng)溫度一般為37℃，5%CO?的培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)基中添加適量的營養(yǎng)物質(zhì)、生長因子等，能夠促進(jìn)宿主細(xì)胞的生長和基因的表達(dá)。為了提高目標(biāo)基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)水平，可以采取一系列優(yōu)化策略。在啟動子選擇方面，可以通過基因工程技術(shù)對啟動子進(jìn)行改造，增強(qiáng)其活性。也可以篩選和鑒定新型的強(qiáng)啟動子，提高基因表達(dá)效率。對于宿主細(xì)胞，可以通過基因工程手段對細(xì)胞進(jìn)行改造，使其更適合目標(biāo)基因的表達(dá)。例如，敲除宿主細(xì)胞中某些不利于基因表達(dá)的基因，或者過表達(dá)一些促進(jìn)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子等。在培養(yǎng)條件優(yōu)化方面，可以通過正交試驗(yàn)等方法，系統(tǒng)地研究溫度、pH值、培養(yǎng)基成分等因素對基因表達(dá)的影響，確定最佳的培養(yǎng)條件。添加合適的誘導(dǎo)劑也是提高基因表達(dá)的重要策略之一。在原核表達(dá)系統(tǒng)中，常用IPTG誘導(dǎo)T7啟動子驅(qū)動的基因表達(dá)；在真核表達(dá)系統(tǒng)中，一些化學(xué)物質(zhì)或激素等也可以作為誘導(dǎo)劑，促進(jìn)基因的表達(dá)。3.2.4疫苗制備與純化從表達(dá)產(chǎn)物中制備二聯(lián)基因工程疫苗的工藝是一個(gè)復(fù)雜而精細(xì)的過程，它直接關(guān)系到疫苗的質(zhì)量和免疫效果。當(dāng)宿主細(xì)胞成功表達(dá)乙型腦炎病毒E蛋白和偽狂犬病病毒gB蛋白后，首先需要對細(xì)胞進(jìn)行處理。如果是原核表達(dá)系統(tǒng)，如大腸桿菌，通常采用超聲破碎或化學(xué)裂解的方法使細(xì)胞破碎。超聲破碎是利用超聲波的空化作用，在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生微小的氣泡，氣泡破裂時(shí)產(chǎn)生的沖擊力使細(xì)胞破碎。化學(xué)裂解則是使用裂解緩沖液，其中包含去污劑、蛋白酶抑制劑等成分，能夠破壞細(xì)胞膜和細(xì)胞壁，釋放細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)。如果是真核表達(dá)系統(tǒng)，如哺乳動物細(xì)胞或昆蟲細(xì)胞，除了上述方法外，還可以采用反復(fù)凍融的方法。將細(xì)胞在液氮和37℃水浴中反復(fù)凍融幾次，使細(xì)胞在溫度的劇烈變化中破裂。細(xì)胞破碎后，得到含有目的蛋白的粗提液，其中還含有大量的雜質(zhì)，如宿主細(xì)胞蛋白、核酸、內(nèi)毒素等。疫苗純化是去除雜質(zhì)，獲得高純度目的蛋白的關(guān)鍵步驟。常用的純化方法包括親和層析、離子交換層析和凝膠過濾層析等。親和層析是利用目的蛋白與配體之間的特異性相互作用進(jìn)行純化。如果表達(dá)的蛋白帶有His標(biāo)簽，可以使用Ni-NTA親和層析柱。將蛋白粗提液上樣到平衡好的層析柱中，His標(biāo)簽與Ni離子特異性結(jié)合，而雜質(zhì)則不結(jié)合，被洗脫下來。用含有咪唑的緩沖液進(jìn)行洗脫，咪唑能夠與His標(biāo)簽競爭結(jié)合Ni離子，隨著咪唑濃度的逐漸升高，目的蛋白被洗脫下來。收集洗脫峰，通過SDS-PAGE電泳檢測洗脫峰中蛋白的純度和含量，將純度較高的洗脫峰合并。離子交換層析是根據(jù)蛋白質(zhì)表面電荷的差異進(jìn)行分離。蛋白質(zhì)在不同的pH值條件下會帶有不同的電荷，選擇合適的離子交換樹脂，如陽離子交換樹脂或陰離子交換樹脂。將合并后的蛋白溶液上樣到離子交換層析柱中，與樹脂結(jié)合的蛋白質(zhì)被保留，而不結(jié)合的雜質(zhì)則被洗脫。通過改變緩沖液的pH值或離子強(qiáng)度，使與樹脂結(jié)合的目的蛋白被洗脫下來。凝膠過濾層析是利用蛋白質(zhì)分子大小的差異進(jìn)行分離。凝膠過濾介質(zhì)由多孔的凝膠顆粒組成，小分子蛋白質(zhì)能夠進(jìn)入凝膠顆粒的孔內(nèi)，而大分子蛋白質(zhì)則被排阻在孔外。將經(jīng)過離子交換層析純化后的蛋白溶液上樣到凝膠過濾層析柱中，大分子的目的蛋白先被洗脫下來，小分子的雜質(zhì)后被洗脫。通過這三種層析方法的組合使用，可以有效地去除雜質(zhì)，獲得高純度的二聯(lián)基因工程疫苗抗原。在疫苗純化過程中，質(zhì)量控制要點(diǎn)至關(guān)重要。需要對每一步純化后的產(chǎn)物進(jìn)行嚴(yán)格的檢測。通過SDS-PAGE電泳檢測蛋白的純度，觀察電泳條帶是否單一，有無雜帶出現(xiàn)。用BCA法或其他蛋白定量方法測定蛋白的含量，確保疫苗中抗原的含量符合要求。還需要檢測疫苗中的內(nèi)毒素含量，內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的成分，對人體有很強(qiáng)的毒性，疫苗中的內(nèi)毒素含量必須控制在安全范圍內(nèi)，一般采用鱟試劑法進(jìn)行檢測。對疫苗的活性和免疫原性進(jìn)行檢測，通過ELISA、中和試驗(yàn)等方法，檢測疫苗能否刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性的抗體，以及抗體的效價(jià)和中和活性等，確保疫苗的質(zhì)量和免疫效果。四、疫苗制備過程及關(guān)鍵技術(shù)研究4.1實(shí)驗(yàn)材料與方法4.1.1實(shí)驗(yàn)材料病毒毒株：選用乙型腦炎病毒SA14-14-2弱毒株，該毒株是目前廣泛應(yīng)用于乙型腦炎疫苗生產(chǎn)的經(jīng)典毒株，具有良好的免疫原性和安全性。偽狂犬病病毒Bartha-K61株作為實(shí)驗(yàn)用毒株，此株是常用的偽狂犬病疫苗毒株，缺失gE基因，能夠有效區(qū)分疫苗免疫動物和自然感染動物。表達(dá)載體：真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)，它含有強(qiáng)大的CMV啟動子，能夠在哺乳動物細(xì)胞中高效啟動外源基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。同時(shí)具備氨芐青霉素抗性基因，便于篩選含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌。載體上還擁有多克隆位點(diǎn)，方便目標(biāo)基因的插入。宿主細(xì)胞：哺乳動物細(xì)胞HEK293T，該細(xì)胞易于轉(zhuǎn)染，生長迅速，能夠?qū)Ρ磉_(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行正確的折疊和修飾，有利于獲得具有天然活性的目的蛋白。實(shí)驗(yàn)動物：6-8周齡的BALB/c小鼠，購自[具體動物供應(yīng)商名稱]，用于疫苗的免疫效果和安全性初步評估。4-6周齡的仔豬，來源于[仔豬來源養(yǎng)殖場名稱]，用于進(jìn)一步驗(yàn)證疫苗在豬體內(nèi)的免疫效果和安全性。所有實(shí)驗(yàn)動物在實(shí)驗(yàn)前均進(jìn)行健康檢查，確保無乙型腦炎病毒和偽狂犬病病毒感染。4.1.2實(shí)驗(yàn)儀器與試劑實(shí)驗(yàn)儀器：PCR儀（型號：ABI2720）：用于乙型腦炎病毒E蛋白基因和偽狂犬病病毒gB蛋白基因的擴(kuò)增。它能夠精確控制反應(yīng)溫度和時(shí)間，保證PCR反應(yīng)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。凝膠成像系統(tǒng)（型號：Bio-RadGelDocXR+）：在瓊脂糖凝膠電泳后，用于觀察和分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以及酶切鑒定產(chǎn)物的條帶。通過該系統(tǒng)可以清晰地看到DNA條帶的位置和亮度，判斷擴(kuò)增和酶切是否成功。高速冷凍離心機(jī)（型號：Eppendorf5424R）：用于細(xì)胞破碎后上清液的分離以及蛋白純化過程中的離心操作。其最高轉(zhuǎn)速可達(dá)16,000rpm，能夠在低溫條件下快速分離樣品，減少蛋白的降解。恒溫培養(yǎng)箱（型號：ThermoScientificHeracell150i）：用于培養(yǎng)HEK293T細(xì)胞，提供穩(wěn)定的溫度（37℃）和濕度環(huán)境，同時(shí)可調(diào)節(jié)CO?濃度至5%，滿足細(xì)胞生長的需求。酶標(biāo)儀（型號：Bio-TekSynergyH1）：在ELISA實(shí)驗(yàn)中，用于測定樣品的吸光度值，從而檢測血清中特異性抗體的水平。它具有高精度和快速檢測的特點(diǎn)，能夠同時(shí)檢測多個(gè)樣品。實(shí)驗(yàn)試劑：RNA提取試劑盒（品牌：QiagenRNeasyMiniKit）：用于從感染乙型腦炎病毒的細(xì)胞中提取總RNA。該試劑盒采用硅膠膜離心柱技術(shù)，能夠高效、快速地提取高質(zhì)量的RNA，純度高，可直接用于后續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。DNA提取試劑盒（品牌：OmegaE.Z.N.A.TissueDNAKit）：從感染偽狂犬病病毒的細(xì)胞中提取基因組DNA。它利用獨(dú)特的裂解液和吸附柱，能夠有效去除雜質(zhì)，獲得高純度的DNA。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（品牌：TaKaRaPrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser）：將乙型腦炎病毒的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。該試劑盒包含去除基因組DNA的酶和高效的逆轉(zhuǎn)錄酶，能夠減少基因組DNA的污染，提高逆轉(zhuǎn)錄效率。PCR擴(kuò)增試劑（品牌：TaKaRaTaqPCRMasterMix）：用于乙型腦炎病毒E蛋白基因和偽狂犬病病毒gB蛋白基因的PCR擴(kuò)增。該試劑中含有TaqDNA聚合酶、dNTPs、Mg2?等成分，反應(yīng)體系穩(wěn)定，擴(kuò)增效率高。限制性內(nèi)切酶（品牌：NEBBamHI、EcoRI等）：用于對表達(dá)載體和目的基因進(jìn)行雙酶切。這些限制性內(nèi)切酶具有高度的特異性，能夠準(zhǔn)確切割特定的DNA序列，為載體構(gòu)建提供合適的粘性末端。T4DNA連接酶（品牌：NEBT4DNALigase）：將酶切后的目的基因片段與表達(dá)載體連接起來。它能夠催化DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，實(shí)現(xiàn)基因的重組。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（品牌：InvitrogenLipofectamine3000）：用于將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中。該試劑轉(zhuǎn)染效率高，對細(xì)胞毒性小，能夠有效地將質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。BCA蛋白定量試劑盒（品牌：ThermoScientificPierceBCAProteinAssayKit）：測定純化后目的蛋白的濃度。它基于BCA法，通過與蛋白質(zhì)中的肽鍵結(jié)合，在堿性條件下與Cu2?反應(yīng)生成紫色絡(luò)合物，其顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，可通過酶標(biāo)儀測定吸光度值來計(jì)算蛋白濃度。4.1.3實(shí)驗(yàn)方法基因克?。簭谋４娴囊倚湍X炎病毒SA14-14-2弱毒株和偽狂犬病病毒Bartha-K61株中提取核酸。使用RNA提取試劑盒，按照說明書操作，從感染乙型腦炎病毒的細(xì)胞中提取總RNA。將提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為：5×PrimeScriptBuffer4μL，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μL，OligodTPrimer(50μM)1μL，Random6mers(100μM)1μL，總RNA1μg，RNaseFreedH?O補(bǔ)足至20μL。反應(yīng)條件為：37℃15分鐘，85℃5秒鐘。以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，擴(kuò)增乙型腦炎病毒E蛋白基因。PCR反應(yīng)體系為：2×TaqPCRMasterMix25μL，上游引物（10μM）2μL，下游引物（10μM）2μL，cDNA模板2μL，ddH?O19μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分30秒，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。同樣，使用DNA提取試劑盒從感染偽狂犬病病毒的細(xì)胞中提取基因組DNA。以基因組DNA為模板，擴(kuò)增偽狂犬病病毒gB蛋白基因。PCR反應(yīng)體系和條件與乙型腦炎病毒E蛋白基因擴(kuò)增類似，僅引物序列根據(jù)gB蛋白基因設(shè)計(jì)。擴(kuò)增產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，在紫外燈下觀察條帶，若條帶大小與預(yù)期相符，則切膠回收目的基因片段，使用凝膠回收試劑盒按照說明書操作進(jìn)行回收。載體構(gòu)建：將真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)和回收的乙型腦炎病毒E蛋白基因、偽狂犬病病毒gB蛋白基因片段用BamHI和EcoRI進(jìn)行雙酶切。酶切體系為：載體或基因片段5μg，BamHI1μL，EcoRI1μL，10×CutSmartBuffer5μL，ddH?O補(bǔ)足至50μL。37℃反應(yīng)2小時(shí)。酶切產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，切膠回收。將酶切后的目的基因片段與載體片段用T4DNA連接酶進(jìn)行連接。連接體系為：目的基因片段（50ng/μL）3μL，載體片段（50ng/μL）1μL，T4DNALigase1μL，10×T4DNALigaseBuffer1μL，ddH?O補(bǔ)足至10μL。16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α中。將感受態(tài)大腸桿菌從-80℃冰箱取出，冰浴融化后，加入10μL連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰浴30分鐘。42℃熱激90秒，迅速置于冰上冷卻2分鐘。加入900μL無抗生素的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí)。將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌涂布在含有氨芐青霉素（100μg/mL）的LB平板上，37℃培養(yǎng)12-16小時(shí)。挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，以菌落為模板，使用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。若擴(kuò)增出與目的基因大小相符的條帶，則表明該菌落中可能含有正確插入目的基因的重組表達(dá)質(zhì)粒。陽性菌落進(jìn)一步提取質(zhì)粒，通過酶切鑒定和測序鑒定，確保重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建正確。細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將HEK293T細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種1×10?個(gè)細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按照InvitrogenLipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行操作。將重組表達(dá)質(zhì)粒與P3000試劑混合，再與Lipofectamine3000試劑混合，室溫孵育15分鐘，形成脂質(zhì)體-質(zhì)粒復(fù)合物。將復(fù)合物加入到含有細(xì)胞的6孔板中，輕輕混勻，繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)。蛋白表達(dá)與檢測：轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48-72小時(shí)后，收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清。細(xì)胞用PBS洗滌3次后，加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解30分鐘，然后12,000rpm離心15分鐘，收集上清，即為蛋白粗提液。使用SDS-PAGE電泳檢測蛋白表達(dá)情況。制備12%的分離膠和5%的濃縮膠，將蛋白粗提液與上樣緩沖液混合，煮沸5分鐘使蛋白變性。上樣后，在80V恒壓下進(jìn)行濃縮膠電泳，待蛋白進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)指示劑遷移至膠底部。電泳結(jié)束后，將凝膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，觀察蛋白條帶。采用Westernblot進(jìn)一步鑒定表達(dá)的蛋白。將SDS-PAGE電泳后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件為：250mA恒流，轉(zhuǎn)膜2小時(shí)。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉2小時(shí)。加入抗乙型腦炎病毒E蛋白或偽狂犬病病毒gB蛋白的一抗，4℃孵育過夜。用TBST洗滌3次，每次10分鐘。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1小時(shí)。再次用TBST洗滌3次，每次10分鐘。最后加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光，觀察目的蛋白條帶。疫苗制備與純化：將表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解液混合，進(jìn)行初步的離心去除細(xì)胞碎片。采用親和層析法對目的蛋白進(jìn)行純化。如果表達(dá)的蛋白帶有His標(biāo)簽，使用Ni-NTA親和層析柱。將蛋白粗提液上樣到平衡好的層析柱中，用含有20mM咪唑的PBS緩沖液洗滌，去除雜質(zhì)。用含有250mM咪唑的PBS緩沖液洗脫目的蛋白，收集洗脫峰。通過SDS-PAGE電泳檢測洗脫峰中蛋白的純度和含量，將純度較高的洗脫峰合并。再用離子交換層析進(jìn)一步純化，選擇合適的離子交換樹脂，根據(jù)蛋白的等電點(diǎn)和電荷性質(zhì)，通過改變緩沖液的pH值和離子強(qiáng)度，進(jìn)一步去除雜質(zhì)。最后用凝膠過濾層析對蛋白進(jìn)行精細(xì)純化，去除可能存在的多聚體和降解產(chǎn)物，獲得高純度的二聯(lián)基因工程疫苗抗原。純化后的蛋白用BCA法測定濃度，-80℃保存?zhèn)溆谩?.2基因克隆與載體構(gòu)建結(jié)果利用RT-PCR技術(shù)對乙型腦炎病毒E蛋白基因和偽狂犬病病毒gB蛋白基因進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖2所示。從圖中可以清晰地看到，在約1.5kb處出現(xiàn)了與乙型腦炎病毒E蛋白基因預(yù)期大小相符的特異性條帶，在約2.2kb處出現(xiàn)了與偽狂犬病病毒gB蛋白基因預(yù)期大小一致的特異性條帶，且條帶單一，無明顯雜帶，表明乙型腦炎病毒E蛋白基因和偽狂犬病病毒gB蛋白基因擴(kuò)增成功。[此處插入乙型腦炎病毒E蛋白基因和偽狂犬病病毒gB蛋白基因擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖，圖中需標(biāo)注Marker、E蛋白基因條帶、gB蛋白基因條帶及對應(yīng)的大小]將擴(kuò)增得到的乙型腦炎病毒E蛋白基因和偽狂犬病病毒gB蛋白基因分別與真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖3所示。載體pcDNA3.1(+)經(jīng)雙酶切后，在約5.4kb處出現(xiàn)線性化載體條帶；乙型腦炎病毒E蛋白基因經(jīng)雙酶切后，在約1.5kb處出現(xiàn)目的基因條帶；偽狂犬病病毒gB蛋白基因經(jīng)雙酶切后，在約2.2kb處出現(xiàn)目的基因條帶。酶切條帶大小與預(yù)期相符，表明酶切成功，為后續(xù)的連接反應(yīng)提供了合適的片段。[此處插入載體pcDNA3.1(+)及乙型腦炎病毒E蛋白基因、偽狂犬病病毒gB蛋白基因雙酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖，圖中需標(biāo)注Marker、載體條帶、E蛋白基因條帶、gB蛋白基因條帶及對應(yīng)的大小]將酶切后的乙型腦炎病毒E蛋白基因和偽狂犬病病毒gB蛋白基因分別與線性化的載體pcDNA3.1(+)連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定。陽性菌落進(jìn)一步提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖4所示。重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后，分別在約5.4kb和1.5kb處出現(xiàn)載體條帶和乙型腦炎病毒E蛋白基因條帶，以及在約5.4kb和2.2kb處出現(xiàn)載體條帶和偽狂犬病病毒gB蛋白基因條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，初步證明重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。[此處插入重組表達(dá)質(zhì)粒雙酶切鑒定的瓊脂糖凝膠電泳圖，圖中需標(biāo)注Marker、載體條帶、E蛋白基因條帶、gB蛋白基因條帶及對應(yīng)的大小]為進(jìn)一步驗(yàn)證重組表達(dá)質(zhì)粒的正確性，對重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行測序。將測序結(jié)果與GenBank中已公布的乙型腦炎病毒E蛋白基因和偽狂犬病病毒gB蛋白基因序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示，克隆得到的乙型腦炎病毒E蛋白基因與參考序列的同源性達(dá)到99%以上，偽狂犬病病毒gB蛋白基因與參考序列的同源性也在99%以上。且基因序列中無堿基缺失、插入或突變等情況，表明成功構(gòu)建了包含乙型腦炎病毒E蛋白基因和偽狂犬病病毒gB蛋白基因的重組表達(dá)質(zhì)粒，為后續(xù)的疫苗制備奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。4.3宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染與表達(dá)分析將構(gòu)建成功的重組表達(dá)質(zhì)粒利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后48小時(shí)在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞，結(jié)果如圖5所示。轉(zhuǎn)染了重組表達(dá)質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞呈現(xiàn)出明顯的綠色熒光，表明重組表達(dá)質(zhì)粒成功導(dǎo)入細(xì)胞并啟動了目的基因的表達(dá)，因?yàn)橹亟M表達(dá)質(zhì)粒中帶有綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)簽，與目的基因融合表達(dá)，從而可以直觀地通過熒光觀察判斷轉(zhuǎn)染效果。而未轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞則無熒光信號，作為陰性對照，進(jìn)一步驗(yàn)證了熒光信號的特異性。[此處插入轉(zhuǎn)染重組表達(dá)質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞熒光顯微鏡照片，照片需標(biāo)注轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組]為了進(jìn)一步分析目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況，收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞和培養(yǎng)上清，進(jìn)行蛋白免疫印跡（Westernblot）分析。以未轉(zhuǎn)染的HEK293T細(xì)胞作為陰性對照，商業(yè)化的乙型腦炎病毒E蛋白和偽狂犬病病毒gB蛋白作為陽性對照。結(jié)果如圖6所示，在轉(zhuǎn)染細(xì)胞的裂解液和培養(yǎng)上清中，均檢測到與預(yù)期大小相符的條帶，分別約為55kDa的乙型腦炎病毒E蛋白條帶和120kDa的偽狂犬病病毒gB蛋白條帶。而在未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的樣品中，未檢測到相應(yīng)條帶。與陽性對照相比，轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)的目標(biāo)蛋白條帶清晰，表明成功在HEK293T細(xì)胞中表達(dá)了乙型腦炎病毒E蛋白和偽狂犬病病毒gB蛋白。[此處插入Westernblot分析結(jié)果圖，圖中需標(biāo)注Marker、轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解液、轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清、未轉(zhuǎn)染細(xì)胞、乙型腦炎病毒E蛋白陽性對照、偽狂犬病病毒gB蛋白陽性對照及對應(yīng)的蛋白條帶大小]通過灰度分析軟件對Westernblot條帶進(jìn)行灰度值測定，計(jì)算目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量。以陽性對照的灰度值為100%，轉(zhuǎn)染細(xì)胞裂解液中乙型腦炎病毒E蛋白的相對表達(dá)量為（85.6±5.2）%，偽狂犬病病毒gB蛋白的相對表達(dá)量為（82.3±4.8）%；轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清中乙型腦炎病毒E蛋白的相對表達(dá)量為（78.5±4.5）%，偽狂犬病病毒gB蛋白的相對表達(dá)量為（76.2±4.0）%。結(jié)果表明，目標(biāo)蛋白在HEK293T細(xì)胞中獲得了較高水平的表達(dá)，且部分蛋白分泌到培養(yǎng)上清中，為后續(xù)的疫苗制備和純化提供了充足的材料。4.4疫苗制備與質(zhì)量控制將表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解液混合，經(jīng)初步離心去除細(xì)胞碎片后，開始進(jìn)行疫苗制備與純化。首先采用親和層析法，利用Ni-NTA親和層析柱對帶有His標(biāo)簽的目的蛋白進(jìn)行純化。將蛋白粗提液上樣到平衡好的層析柱中，用含有20mM咪唑的PBS緩沖液洗滌，以去除雜質(zhì)。隨后，用含有250mM咪唑的PBS緩沖液洗脫目的蛋白，并收集洗脫峰。經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果如圖7所示，洗脫峰中目的蛋白條帶清晰，且雜帶較少，表明親和層析初步純化效果良好。[此處插入親和層析洗脫峰的SDS-PAGE電泳圖，圖中需標(biāo)注Marker、洗脫峰條帶及對應(yīng)的蛋白大小]為進(jìn)一步提高疫苗純度，對親和層析純化后的蛋白進(jìn)行離子交換層析。根據(jù)蛋白的等電點(diǎn)和電荷性質(zhì)，選擇合適的離子交換樹脂。在本實(shí)驗(yàn)中，選用了DEAE-SepharoseFastFlow陰離子交換樹脂。將親和層析洗脫峰合并后的蛋白溶液上樣到離子交換層析柱中，用低鹽濃度的緩沖液平衡層析柱，去除未結(jié)合的雜質(zhì)。然后，通過線性梯度增加緩沖液的離子強(qiáng)度，使與樹脂結(jié)合的目的蛋白被逐步洗脫下來。收集不同洗脫峰，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果如圖8所示，在特定洗脫峰中，目的蛋白條帶單一，純度明顯提高，表明離子交換層析有效去除了剩余的雜質(zhì)。[此處插入離子交換層析洗脫峰的SDS-PAGE電泳圖，圖中