miR-494調(diào)控蛻膜MSCs影響子癇前期發(fā)病的機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義子癇前期（preeclampsia，PE）是一種嚴(yán)重威脅母嬰健康的妊娠并發(fā)癥，通常在妊娠20周后出現(xiàn)，以高血壓、蛋白尿?yàn)橹饕R床表現(xiàn)，嚴(yán)重時(shí)可伴有多器官功能障礙，如肝腎功能損害、凝血功能異常、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀等。全球范圍內(nèi)，子癇前期的發(fā)病率約為2%-8%，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒死亡及發(fā)病的重要原因之一。在孕產(chǎn)婦方面，子癇前期可引發(fā)子癇、胎盤早剝、HELLP綜合征（溶血、肝酶升高和血小板減少）、急性腎功能衰竭、肺水腫等嚴(yán)重并發(fā)癥，增加孕產(chǎn)婦的死亡率。對(duì)胎兒而言，子癇前期會(huì)導(dǎo)致胎盤血流灌注不足，進(jìn)而引起胎兒生長(zhǎng)受限、早產(chǎn)、胎兒窘迫、新生兒窒息，甚至胎死宮內(nèi)等不良結(jié)局。盡管經(jīng)過(guò)多年的研究，子癇前期的發(fā)病機(jī)制仍未完全明確，目前認(rèn)為其發(fā)病涉及母體、胎盤和胎兒等多方面因素，是一種多因素、多環(huán)節(jié)的復(fù)雜病理過(guò)程。傳統(tǒng)理論認(rèn)為，子宮螺旋小動(dòng)脈重鑄異常導(dǎo)致胎盤淺著床，引發(fā)胎盤缺血缺氧，釋放大量胎盤來(lái)源的因子進(jìn)入母體循環(huán)，激活母體免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，全身小動(dòng)脈痙攣，最終引起子癇前期的一系列臨床表現(xiàn)。然而，這一理論并不能完全解釋子癇前期的發(fā)病過(guò)程，仍存在許多未知的分子機(jī)制和信號(hào)通路有待進(jìn)一步探索。近年來(lái)，隨著干細(xì)胞研究的深入發(fā)展，間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymalstemcells，MSCs）因其獨(dú)特的生物學(xué)特性和免疫調(diào)節(jié)功能，在多種疾病的治療中展現(xiàn)出巨大的潛力。蛻膜MSCs作為一種特殊類型的MSCs，存在于胎盤的蛻膜組織中，不僅參與胎盤的正常發(fā)育和功能維持，還在母胎免疫耐受、血管生成等方面發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，蛻膜MSCs在子癇前期患者中存在數(shù)量減少、功能異常的現(xiàn)象，提示其可能與子癇前期的發(fā)病密切相關(guān)。微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一類長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，通過(guò)與靶mRNA的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補(bǔ)配對(duì)，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、代謝等多種生物學(xué)過(guò)程。越來(lái)越多的證據(jù)表明，miRNA在子癇前期的發(fā)病機(jī)制中扮演著重要角色，通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，影響胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的功能、血管生成、免疫調(diào)節(jié)等過(guò)程。其中，miR-494作為一種在多種組織和細(xì)胞中廣泛表達(dá)的miRNA，已被報(bào)道在心血管疾病、腫瘤等多種疾病中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。然而，miR-494在子癇前期中的作用及機(jī)制，特別是其對(duì)蛻膜MSCs的調(diào)控作用，目前尚不清楚。本研究旨在深入探討miR-494調(diào)控蛻膜MSCs在子癇前期發(fā)病機(jī)制中的作用及分子機(jī)制，有望揭示子癇前期發(fā)病的新機(jī)制，為子癇前期的早期診斷、治療和預(yù)防提供新的理論依據(jù)和潛在的治療靶點(diǎn)。通過(guò)對(duì)miR-494和蛻膜MSCs的研究，有助于我們更好地理解子癇前期的發(fā)病過(guò)程，為開(kāi)發(fā)基于miRNA和干細(xì)胞的新型治療策略奠定基礎(chǔ)，從而提高子癇前期患者的母嬰預(yù)后，降低孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒的死亡率和發(fā)病率，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2子癇前期概述子癇前期是一種妊娠期特有的多系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重威脅母嬰健康，一直是婦產(chǎn)科領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。其定義為妊娠20周后首次出現(xiàn)收縮壓≥140mmHg和（或）舒張壓≥90mmHg，且伴有蛋白尿（24小時(shí)尿蛋白定量≥0.3g）；或雖無(wú)蛋白尿，但出現(xiàn)了其他器官功能損害，如血小板減少（血小板計(jì)數(shù)＜100×109/L）、肝功能損害（血清轉(zhuǎn)氨酶水平升高2倍以上）、腎功能損害（血肌酐水平升高超過(guò)97.2μmol/L）、肺水腫、新發(fā)生的頭痛或視覺(jué)障礙等。在全球范圍內(nèi)，子癇前期的發(fā)病率因地區(qū)、種族和研究人群的不同而有所差異，總體發(fā)病率約為2%-8%。在發(fā)展中國(guó)家，由于醫(yī)療資源相對(duì)匱乏、孕期保健不完善等因素，子癇前期的發(fā)病率可能更高，且孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒的死亡率也明顯高于發(fā)達(dá)國(guó)家。例如，非洲部分地區(qū)子癇前期的發(fā)病率可高達(dá)10%以上，孕產(chǎn)婦死亡率是發(fā)達(dá)國(guó)家的數(shù)倍。子癇前期對(duì)母嬰的危害極大，除了前面提及的可能引發(fā)的嚴(yán)重并發(fā)癥外，還可能導(dǎo)致遠(yuǎn)期健康問(wèn)題。對(duì)子癇前期患者而言，日后發(fā)展為心血管疾病、慢性高血壓、糖尿病等疾病的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。研究表明，子癇前期患者在產(chǎn)后10-20年內(nèi)患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)是正常妊娠女性的2-3倍。對(duì)于胎兒，出生后可能面臨神經(jīng)發(fā)育障礙、代謝綜合征等遠(yuǎn)期健康問(wèn)題。有研究隨訪發(fā)現(xiàn)，子癇前期孕婦所生子女在兒童期出現(xiàn)認(rèn)知發(fā)育遲緩、行為問(wèn)題的比例高于正常妊娠孕婦所生子女。關(guān)于子癇前期的發(fā)病機(jī)制，目前尚未完全闡明，但普遍認(rèn)為是一個(gè)涉及多因素、多環(huán)節(jié)的復(fù)雜病理過(guò)程，主要包括以下幾個(gè)方面：子宮螺旋小動(dòng)脈重鑄不足：正常妊娠時(shí)，細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞會(huì)侵入子宮螺旋小動(dòng)脈，使其發(fā)生重鑄，管徑增粗、管壁變薄，從而增加胎盤的血液灌注。然而，在子癇前期患者中，由于細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)能力受損，子宮螺旋小動(dòng)脈重鑄不足，導(dǎo)致胎盤淺著床，胎盤血流灌注減少。研究發(fā)現(xiàn)，子癇前期患者胎盤組織中，侵入子宮螺旋小動(dòng)脈的細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞數(shù)量明顯少于正常妊娠胎盤，且小動(dòng)脈管壁的平滑肌和彈力纖維不能被有效破壞，使得血管阻力增加，胎盤缺血缺氧。這種胎盤缺血缺氧狀態(tài)會(huì)激活一系列病理生理過(guò)程，如氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等，進(jìn)而導(dǎo)致子癇前期的發(fā)生發(fā)展。炎癥免疫過(guò)度激活：正常妊娠是一種免疫耐受狀態(tài)，母體免疫系統(tǒng)能夠識(shí)別并耐受胎兒抗原，維持妊娠的正常進(jìn)行。而在子癇前期患者中，母體免疫系統(tǒng)出現(xiàn)過(guò)度激活，免疫平衡失調(diào)。一方面，母體對(duì)胎兒抗原的免疫應(yīng)答增強(qiáng)，產(chǎn)生大量細(xì)胞因子和趨化因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，這些炎癥因子可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血管收縮和組織水腫。研究表明，子癇前期患者血清中TNF-α和IL-6的水平顯著高于正常妊娠孕婦，且與病情嚴(yán)重程度相關(guān)。另一方面，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg細(xì)胞）等免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞的數(shù)量和功能異常，不能有效抑制免疫應(yīng)答，進(jìn)一步加重了炎癥反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，子癇前期患者外周血和胎盤組織中Treg細(xì)胞的比例降低，其免疫抑制功能也明顯減弱。血管內(nèi)皮細(xì)胞受損：血管內(nèi)皮細(xì)胞在維持血管穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵作用。在子癇前期患者中，由于胎盤缺血缺氧釋放的多種細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激產(chǎn)物以及炎癥介質(zhì)等的作用，血管內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷。受損的血管內(nèi)皮細(xì)胞會(huì)分泌一系列血管活性物質(zhì)，如一氧化氮（NO）、內(nèi)皮素-1（ET-1）等，導(dǎo)致血管收縮和舒張功能失調(diào)，血管阻力增加，血壓升高。研究表明，子癇前期患者血漿中ET-1水平升高，NO水平降低，二者失衡與高血壓的發(fā)生密切相關(guān)。此外，血管內(nèi)皮細(xì)胞受損還會(huì)導(dǎo)致其抗凝、纖溶功能異常，容易形成微血栓，進(jìn)一步加重組織缺血缺氧。遺傳因素：子癇前期具有一定的遺傳傾向，家族聚集性研究表明，子癇前期患者的一級(jí)親屬（母親、姐妹）發(fā)生子癇前期的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多個(gè)與子癇前期相關(guān)的易感基因，如血管緊張素原基因、內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因等。這些基因的突變或多態(tài)性可能影響相關(guān)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，進(jìn)而參與子癇前期的發(fā)病過(guò)程。例如，血管緊張素原基因的某些多態(tài)性位點(diǎn)與子癇前期患者血壓升高的程度和發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。然而，遺傳因素在子癇前期發(fā)病中的具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究，且環(huán)境因素也可能對(duì)遺傳易感性產(chǎn)生影響。營(yíng)養(yǎng)因素：某些營(yíng)養(yǎng)素的缺乏或失衡也可能與子癇前期的發(fā)生有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，維生素C、維生素E、葉酸、鈣等營(yíng)養(yǎng)素的缺乏可能增加子癇前期的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。維生素C和維生素E作為抗氧化劑，能夠清除體內(nèi)過(guò)多的自由基，減輕氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損傷。葉酸參與一碳單位代謝，對(duì)細(xì)胞的增殖、分化和DNA合成具有重要作用。鈣可以調(diào)節(jié)血管平滑肌的收縮和舒張，維持正常的血壓。補(bǔ)充這些營(yíng)養(yǎng)素可能有助于降低子癇前期的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。有研究表明，在孕期補(bǔ)充鈣劑可以使子癇前期的發(fā)生率降低10%-20%。然而，營(yíng)養(yǎng)因素與子癇前期之間的關(guān)系較為復(fù)雜，還需要更多的大規(guī)模臨床試驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步證實(shí)。1.3蛻膜MSCs與子癇前期關(guān)聯(lián)蛻膜MSCs作為一類特殊的間充質(zhì)干細(xì)胞，來(lái)源于胎盤的蛻膜組織，在妊娠過(guò)程中發(fā)揮著不可或缺的作用。在來(lái)源方面，蛻膜MSCs主要存在于胎盤與子宮壁相連的蛻膜層中，可通過(guò)酶消化法、組織塊貼壁法等技術(shù)從足月或早期妊娠的蛻膜組織中分離獲得。研究表明，利用膠原酶消化足月胎盤蛻膜組織，經(jīng)過(guò)密度梯度離心和細(xì)胞培養(yǎng)，可以成功分離出高純度的蛻膜MSCs。這些細(xì)胞在體外培養(yǎng)條件下表現(xiàn)出良好的增殖能力和自我更新能力，能夠穩(wěn)定傳代。在分化潛能上，蛻膜MSCs具有多向分化能力，在特定的誘導(dǎo)條件下，能夠分化為多種細(xì)胞類型，如成骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等。研究發(fā)現(xiàn)，在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基的作用下，蛻膜MSCs可表達(dá)成骨相關(guān)基因和蛋白，如骨鈣素、堿性磷酸酶等，經(jīng)過(guò)茜素紅染色，可見(jiàn)明顯的鈣結(jié)節(jié)形成，表明其成功向成骨細(xì)胞分化。在成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，蛻膜MSCs能夠積累脂滴，油紅O染色呈陽(yáng)性，說(shuō)明其具備向脂肪細(xì)胞分化的能力。此外，蛻膜MSCs還在一定程度上具有向內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等方向分化的潛能，這為其在組織修復(fù)和再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。蛻膜MSCs還具有強(qiáng)大的免疫調(diào)節(jié)功能，在維持母胎免疫耐受和免疫平衡方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。一方面，蛻膜MSCs可以通過(guò)分泌一系列細(xì)胞因子和趨化因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、白細(xì)胞介素-10（IL-10）等，抑制免疫細(xì)胞的活化和增殖，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。研究表明，蛻膜MSCs與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，能夠顯著抑制T淋巴細(xì)胞的增殖，降低其分泌干擾素-γ（IFN-γ）等促炎細(xì)胞因子的水平，同時(shí)上調(diào)Treg細(xì)胞的比例，增強(qiáng)免疫抑制功能。另一方面，蛻膜MSCs可以直接與免疫細(xì)胞相互作用，通過(guò)細(xì)胞表面的配體-受體結(jié)合，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能。例如，蛻膜MSCs表面表達(dá)的程序性死亡配體1（PD-L1）可以與T淋巴細(xì)胞表面的程序性死亡受體1（PD-1）結(jié)合，抑制T淋巴細(xì)胞的活化，從而維持免疫耐受。越來(lái)越多的研究表明，蛻膜MSCs與子癇前期的發(fā)病密切相關(guān)。在子癇前期患者中，蛻膜MSCs的數(shù)量明顯減少，且其功能也出現(xiàn)異常。研究發(fā)現(xiàn)，子癇前期患者蛻膜組織中MSCs的含量顯著低于正常妊娠孕婦，這可能導(dǎo)致其在維持胎盤正常發(fā)育、調(diào)節(jié)母胎免疫等方面的作用減弱。同時(shí)，子癇前期患者的蛻膜MSCs增殖能力下降，細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期的比例增加，凋亡率也明顯升高。在分化潛能方面，子癇前期患者的蛻膜MSCs向成骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞等方向分化的能力受損，相關(guān)分化標(biāo)志物的表達(dá)水平降低。在免疫調(diào)節(jié)功能上，子癇前期患者的蛻膜MSCs分泌免疫調(diào)節(jié)因子的能力發(fā)生改變，TGF-β、IL-10等細(xì)胞因子的分泌減少，而促炎細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6等的分泌增加，導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)失衡，無(wú)法有效維持母胎免疫耐受，從而促進(jìn)子癇前期的發(fā)生發(fā)展。此外，蛻膜MSCs在血管生成、細(xì)胞遷移和侵襲等方面的功能異常，也可能導(dǎo)致胎盤血管發(fā)育異常和胎盤淺著床，進(jìn)一步加重子癇前期的病理過(guò)程。1.4miR-494與蛻膜MSCs關(guān)系miR-494是一種高度保守的微小核糖核酸，在多種生物過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其編碼基因位于人類染色體14q32.31區(qū)域，該區(qū)域包含多個(gè)miRNA基因簇，共同參與復(fù)雜的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。miR-494的成熟序列長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸，通過(guò)與靶mRNA的3'-非翻譯區(qū)（3'-UTR）互補(bǔ)配對(duì)，抑制mRNA的翻譯過(guò)程或促使其降解，從而在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行精細(xì)調(diào)控。在細(xì)胞增殖方面，研究表明miR-494對(duì)不同類型細(xì)胞的增殖具有雙向調(diào)控作用。在腫瘤細(xì)胞中，miR-494通常發(fā)揮促增殖作用。例如，在乳腺癌細(xì)胞中，miR-494可以通過(guò)靶向抑制PTEN基因的表達(dá)，激活PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活。而在正常細(xì)胞中，miR-494有時(shí)會(huì)抑制細(xì)胞增殖。有研究發(fā)現(xiàn)，在血管平滑肌細(xì)胞中，miR-494過(guò)表達(dá)會(huì)抑制細(xì)胞的增殖，其機(jī)制可能與靶向調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。在細(xì)胞分化過(guò)程中，miR-494也扮演著重要角色。以肌肉分化為例，miR-494能夠促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞向成熟肌細(xì)胞的分化。研究顯示，在肌衛(wèi)星細(xì)胞分化過(guò)程中，miR-494的表達(dá)水平逐漸升高，通過(guò)靶向抑制HDAC4基因，促進(jìn)肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2（MEF2）的活性，進(jìn)而上調(diào)肌肉特異性基因的表達(dá)，推動(dòng)肌肉分化進(jìn)程。在脂肪細(xì)胞分化方面，miR-494則表現(xiàn)出抑制作用。有研究表明，miR-494通過(guò)靶向抑制PPARγ基因的表達(dá)，阻礙前脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞的分化。關(guān)于細(xì)胞凋亡，miR-494的調(diào)控作用也較為復(fù)雜。在一些情況下，miR-494可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在心肌細(xì)胞中，缺血缺氧損傷會(huì)導(dǎo)致miR-494表達(dá)上調(diào)，miR-494通過(guò)靶向抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，加重心肌損傷。然而，在另一些細(xì)胞類型中，miR-494卻具有抗凋亡作用。在肝癌細(xì)胞中，miR-494可以通過(guò)抑制促凋亡蛋白BIM的表達(dá)，增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性，抑制細(xì)胞凋亡。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究開(kāi)始關(guān)注miR-494對(duì)蛻膜MSCs的調(diào)控作用。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-494在子癇前期患者的蛻膜MSCs中表達(dá)水平異常，與正常妊娠孕婦相比，子癇前期患者蛻膜MSCs中miR-494的表達(dá)明顯升高。進(jìn)一步的功能實(shí)驗(yàn)表明，miR-494可能通過(guò)靶向調(diào)控相關(guān)基因，影響蛻膜MSCs的增殖、分化和免疫調(diào)節(jié)功能。研究人員通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-494模擬物或抑制劑，改變蛻膜MSCs中miR-494的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)miR-494過(guò)表達(dá)會(huì)抑制蛻膜MSCs的增殖，使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，同時(shí)降低其向成骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞等方向分化的能力。在免疫調(diào)節(jié)方面，miR-494過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致蛻膜MSCs分泌免疫調(diào)節(jié)因子的失衡，促炎細(xì)胞因子分泌增加，抗炎細(xì)胞因子分泌減少，從而破壞母胎免疫耐受。關(guān)于miR-494調(diào)控蛻膜MSCs的具體分子機(jī)制，目前仍有待進(jìn)一步深入研究，但其在子癇前期發(fā)病機(jī)制中的潛在作用已不容忽視。1.5研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探究miR-494調(diào)控蛻膜MSCs在子癇前期發(fā)病機(jī)制中的作用及分子機(jī)制，為子癇前期的早期診斷、治療和預(yù)防提供新的理論依據(jù)和潛在的治療靶點(diǎn)。基于目前對(duì)子癇前期、蛻膜MSCs以及miR-494的研究現(xiàn)狀，我們提出假設(shè)：miR-494通過(guò)靶向調(diào)控特定基因，影響蛻膜MSCs的生物學(xué)功能，進(jìn)而參與子癇前期的發(fā)病過(guò)程。為驗(yàn)證這一假設(shè)，本研究將從以下幾個(gè)方面展開(kāi)：miR-494對(duì)蛻膜MSCs生物學(xué)功能的影響：收集子癇前期患者和正常妊娠孕婦的蛻膜組織，分離培養(yǎng)蛻膜MSCs，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)兩組蛻膜MSCs中miR-494的表達(dá)水平，分析其與子癇前期發(fā)病的相關(guān)性。利用細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)，將miR-494模擬物、抑制劑分別轉(zhuǎn)染至正常妊娠孕婦來(lái)源的蛻膜MSCs中，構(gòu)建miR-494過(guò)表達(dá)和低表達(dá)模型。采用CCK-8法、EdU摻入實(shí)驗(yàn)等檢測(cè)不同處理組蛻膜MSCs的增殖能力；通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布和凋亡情況；在特定誘導(dǎo)條件下，誘導(dǎo)蛻膜MSCs向成骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞等方向分化，利用茜素紅染色、油紅O染色等方法檢測(cè)其分化能力；通過(guò)ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中免疫調(diào)節(jié)因子（如TGF-β、IL-10、TNF-α、IL-6等）的分泌水平，評(píng)估m(xù)iR-494對(duì)蛻膜MSCs免疫調(diào)節(jié)功能的影響。miR-494調(diào)控蛻膜MSCs影響子癇前期發(fā)病的分子機(jī)制：運(yùn)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-494在蛻膜MSCs中的潛在靶基因，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道和前期研究基礎(chǔ)，篩選出可能參與子癇前期發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵靶基因。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-494與靶基因3'-UTR的直接結(jié)合作用；采用Westernblot和qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-494模擬物或抑制劑后，靶基因在蛋白和mRNA水平的表達(dá)變化，進(jìn)一步確認(rèn)miR-494對(duì)靶基因的調(diào)控作用。構(gòu)建靶基因過(guò)表達(dá)載體和干擾載體，分別轉(zhuǎn)染至miR-494過(guò)表達(dá)或低表達(dá)的蛻膜MSCs中，回復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證靶基因在miR-494調(diào)控蛻膜MSCs生物學(xué)功能中的作用。利用通路抑制劑或激動(dòng)劑處理蛻膜MSCs，結(jié)合Westernblot檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平和表達(dá)變化，明確miR-494通過(guò)調(diào)控靶基因影響蛻膜MSCs功能所涉及的信號(hào)通路。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-494調(diào)控蛻膜MSCs在子癇前期發(fā)病中的作用：構(gòu)建子癇前期動(dòng)物模型，如采用子宮動(dòng)脈結(jié)扎法建立大鼠子癇前期模型。將正常妊娠大鼠來(lái)源的蛻膜MSCs進(jìn)行標(biāo)記，分別轉(zhuǎn)染miR-494模擬物、抑制劑和陰性對(duì)照，然后通過(guò)尾靜脈注射或子宮局部注射等方式移植到子癇前期模型大鼠體內(nèi)。觀察移植后大鼠的血壓變化、蛋白尿情況、體重增長(zhǎng)等子癇前期相關(guān)指標(biāo)；采用ELISA法檢測(cè)大鼠血清中炎癥因子、血管活性物質(zhì)等的水平；通過(guò)免疫組化、免疫熒光等方法檢測(cè)胎盤組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)和分布，分析蛻膜MSCs移植對(duì)胎盤病理變化的影響；利用qRT-PCR檢測(cè)胎盤組織中miR-494和靶基因的表達(dá)水平，驗(yàn)證體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果與體外實(shí)驗(yàn)的一致性。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)雌性SD大鼠，體重200-220g，購(gòu)自[動(dòng)物供應(yīng)商名稱]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于溫度（23±2）℃、濕度（50±10）%的環(huán)境中，12h光照/12h黑暗循環(huán)，自由進(jìn)食和飲水。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。細(xì)胞系：人蛻膜MSCs取自[醫(yī)院名稱]行剖宮產(chǎn)的正常妊娠孕婦和子癇前期患者的胎盤蛻膜組織（所有患者均簽署知情同意書）。正常妊娠孕婦的納入標(biāo)準(zhǔn)為：孕周37-40周，血壓正常（收縮壓<140mmHg且舒張壓<90mmHg），無(wú)蛋白尿及其他妊娠合并癥；子癇前期患者的診斷符合《妊娠期高血壓疾病診治指南（2020）》標(biāo)準(zhǔn)，即妊娠20周后出現(xiàn)收縮壓≥140mmHg和（或）舒張壓≥90mmHg，伴有蛋白尿（24小時(shí)尿蛋白定量≥0.3g）。主要試劑：DMEM/F12培養(yǎng)基（Gibco公司）、胎牛血清（FBS，Gibco公司）、青霉素-鏈霉素雙抗（Gibco公司）、胰蛋白酶（Gibco公司）、膠原酶Ⅱ（Sigma公司）、miR-494模擬物、抑制劑及陰性對(duì)照（RiboBio公司）、Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司）、TRIzol試劑（Invitrogen公司）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）、SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒（TaKaRa公司）、CCK-8試劑盒（Dojindo公司）、EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（RiboBio公司）、AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（BDBiosciences公司）、成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（Cyagen公司）、成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基（Cyagen公司）、茜素紅染色試劑盒（Solarbio公司）、油紅O染色試劑盒（Solarbio公司）、ELISA試劑盒（eBioscience公司，檢測(cè)TGF-β、IL-10、TNF-α、IL-6等細(xì)胞因子）、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（Promega公司）、蛋白提取試劑盒（Beyotime公司）、BCA蛋白定量試劑盒（Beyotime公司）、SDS凝膠配制試劑盒（Beyotime公司）、PVDF膜（Millipore公司）、一抗（CellSignalingTechnology公司，包括靶基因抗體、β-actin抗體等）、二抗（HRP標(biāo)記，CellSignalingTechnology公司）、RIPA裂解液（Beyotime公司）、PMSF（Beyotime公司）、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（ThermoFisherScientific公司）。主要儀器設(shè)備：CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司）、超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、倒置顯微鏡（Olympus公司）、酶標(biāo)儀（BioTek公司）、流式細(xì)胞儀（BDBiosciences公司）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（ABI公司）、電泳儀（Bio-Rad公司）、凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）、離心機(jī)（Eppendorf公司）、低溫冰箱（ThermoFisherScientific公司）、液氮罐（MVE公司）、動(dòng)物血壓測(cè)量?jī)x（BP-98A，成都泰盟科技有限公司）。2.2實(shí)驗(yàn)方法蛻膜MSCs的分離、培養(yǎng)與鑒定：將獲取的胎盤蛻膜組織置于含雙抗的PBS中，沖洗去除殘留血液和雜質(zhì)。用眼科剪將蛻膜組織剪碎至1mm3大小的組織塊，加入適量的膠原酶Ⅱ溶液，37℃水浴消化1-2h，期間每隔15-20min輕柔振蕩一次，使消化更充分。消化結(jié)束后，加入等體積含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，然后通過(guò)70μm細(xì)胞篩網(wǎng)過(guò)濾，將濾液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5-8min，棄上清。用含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24-48h后更換培養(yǎng)基，去除未貼壁的細(xì)胞，之后每2-3天換液一次。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。取第3-5代蛻膜MSCs進(jìn)行鑒定，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)，如CD29、CD44、CD73、CD90、CD34、CD45等。將細(xì)胞用胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?/mL，取100μL細(xì)胞懸液加入流式管中，分別加入適量的熒光標(biāo)記抗體，4℃避光孵育30min。孵育結(jié)束后，加入1-2mLPBS洗滌細(xì)胞，1000rpm離心5min，棄上清，重復(fù)洗滌一次。最后用300-500μLPBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。同時(shí)，進(jìn)行多向分化潛能鑒定，將蛻膜MSCs分別接種于成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基、成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，按照說(shuō)明書進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)2-3周后，用茜素紅染色檢測(cè)鈣結(jié)節(jié)形成；成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)1-2周后，用油紅O染色檢測(cè)脂滴形成。miR-494的轉(zhuǎn)染和干擾：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的蛻膜MSCs接種于6孔板中，每孔接種2×10?個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到50%-60%。按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，分別將miR-494模擬物、抑制劑及相應(yīng)的陰性對(duì)照與Lipofectamine3000試劑混合，室溫孵育5-10min，形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到含有細(xì)胞的培養(yǎng)基中，輕輕混勻，繼續(xù)培養(yǎng)4-6h后，更換為正常培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48-72h后，收集細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率，按照TRIzol試劑說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，檢測(cè)miR-494的表達(dá)水平。引物序列如下：miR-494上游引物：5'-[具體序列]-3'，下游引物：5'-[具體序列]-3'；U6上游引物：5'-[具體序列]-3'，下游引物：5'-[具體序列]-3'。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參，采用2?ΔΔCt法計(jì)算miR-494的相對(duì)表達(dá)量。細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：采用CCK-8法和EdU摻入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛻膜MSCs的增殖能力。CCK-8法：將轉(zhuǎn)染后的蛻膜MSCs以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5-6個(gè)復(fù)孔。分別在接種后0、24、48、72、96h加入10μLCCK-8試劑，37℃孵育1-2h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm處的吸光度（OD值）。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。EdU摻入實(shí)驗(yàn)：按照EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。將轉(zhuǎn)染后的蛻膜MSCs接種于24孔板中，培養(yǎng)至合適時(shí)間點(diǎn)，加入EdU工作液，繼續(xù)培養(yǎng)2-3h。棄去培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞15-20min，然后用0.5%TritonX-100通透細(xì)胞10-15min。加入Click反應(yīng)液，避光孵育30min，最后用DAPI染核5-10min。在熒光顯微鏡下觀察并拍照，計(jì)數(shù)EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例，評(píng)估細(xì)胞增殖能力。細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)：采用Transwell小室進(jìn)行細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)。遷移實(shí)驗(yàn)：將Transwell小室放入24孔板中，在上室加入無(wú)血清培養(yǎng)基重懸的轉(zhuǎn)染后蛻膜MSCs（5×10?個(gè)細(xì)胞/100μL），下室加入含20%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基作為趨化因子。培養(yǎng)24-48h后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定下室遷移的細(xì)胞15-20min，0.1%結(jié)晶紫染色10-15min。在顯微鏡下隨機(jī)選取5-6個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)：在Transwell小室的聚碳酸酯膜上預(yù)先鋪一層Matrigel基質(zhì)膠，4℃過(guò)夜使其凝固。其余操作同遷移實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)48-72h后，計(jì)數(shù)侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)：采用AnnexinV-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛻膜MSCs的凋亡情況。將轉(zhuǎn)染后的蛻膜MSCs收集，用PBS洗滌2-3次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10?/mL。取100μL細(xì)胞懸液加入流式管中，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15-20min。然后加入400μLBindingBuffer，上機(jī)檢測(cè)。通過(guò)流式細(xì)胞儀分析，將細(xì)胞分為活細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），計(jì)算凋亡細(xì)胞比例。分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)：RT-qPCR：按照TRIzol試劑說(shuō)明書提取細(xì)胞或組織總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，檢測(cè)目的基因和內(nèi)參基因的表達(dá)水平。目的基因引物根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中基因序列設(shè)計(jì)，由[引物合成公司名稱]合成。引物序列如下：[目的基因1]上游引物：5'-[具體序列]-3'，下游引物：5'-[具體序列]-3'；[目的基因2]上游引物：5'-[具體序列]-3'，下游引物：5'-[具體序列]-3'；β-actin上游引物：5'-[具體序列]-3'，下游引物：5'-[具體序列]-3'。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，95℃變性5s，60℃退火30s，共40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，采用2?ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。Westernblot：收集細(xì)胞或組織，加入適量的RIPA裂解液（含1%PMSF），冰上裂解30min，期間每隔5-10min振蕩一次。12000rpm、4℃離心15min，取上清，用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將蛋白樣品與5×上樣緩沖液混合，100℃煮沸5-10min使蛋白變性。取等量蛋白樣品進(jìn)行SDS凝膠電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉室溫封閉PVDF膜1-2h，然后加入一抗（稀釋比例根據(jù)抗體說(shuō)明書確定），4℃孵育過(guò)夜。次日，用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10-15min，加入HRP標(biāo)記的二抗（稀釋比例根據(jù)抗體說(shuō)明書確定），室溫孵育1-2h。再次用TBST洗滌PVDF膜3次，每次10-15min，最后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下曝光拍照。用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR-494的潛在靶基因，并根據(jù)靶基因3'-UTR序列構(gòu)建野生型和突變型雙熒光素酶報(bào)告基因載體。將野生型或突變型報(bào)告基因載體與miR-494模擬物或陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中（也可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇其他合適的細(xì)胞系）。轉(zhuǎn)染48-72h后，按照雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解液，分別加入熒光素酶底物和海腎熒光素酶底物，用酶標(biāo)儀檢測(cè)螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶的活性。以海腎熒光素酶活性為內(nèi)參，計(jì)算螢火蟲(chóng)熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值，評(píng)估m(xù)iR-494與靶基因3'-UTR的結(jié)合活性。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：采用子宮動(dòng)脈結(jié)扎法建立大鼠子癇前期模型。將雌性SD大鼠與雄性SD大鼠按2:1的比例合籠，次日清晨檢查陰道涂片，發(fā)現(xiàn)精子者記為妊娠第0天。在妊娠第14天，將大鼠麻醉后，仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，消毒腹部皮膚，沿腹正中線切開(kāi)皮膚和腹膜，暴露子宮動(dòng)脈。用絲線將雙側(cè)子宮動(dòng)脈分支進(jìn)行部分結(jié)扎，使血管狹窄約70%-80%，然后縫合腹壁切口。假手術(shù)組大鼠僅分離子宮動(dòng)脈，不進(jìn)行結(jié)扎。術(shù)后將大鼠單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水。將建模成功的子癇前期大鼠隨機(jī)分為3組：對(duì)照組（尾靜脈注射PBS）、miR-494模擬物組（尾靜脈注射轉(zhuǎn)染miR-494模擬物的蛻膜MSCs）、miR-494抑制劑組（尾靜脈注射轉(zhuǎn)染miR-494抑制劑的蛻膜MSCs），每組8-10只。分別在移植后第3、7、14天測(cè)量大鼠的血壓，采用尾套法利用動(dòng)物血壓測(cè)量?jī)x測(cè)量收縮壓和舒張壓。同時(shí)，收集24h尿液，采用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)尿蛋白含量。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處死大鼠，收集胎盤組織和血清。胎盤組織用于免疫組化、免疫熒光、qRT-PCR等檢測(cè)，血清用于ELISA法檢測(cè)炎癥因子、血管活性物質(zhì)等的水平。免疫組化檢測(cè)胎盤組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)，將胎盤組織固定于4%多聚甲醛中，石蠟包埋，切片。切片脫蠟至水后，進(jìn)行抗原修復(fù)，用3%過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，5%BSA封閉非特異性位點(diǎn)。加入一抗（稀釋比例根據(jù)抗體說(shuō)明書確定），4℃孵育過(guò)夜。次日，用PBS洗滌切片3次，每次5-10min，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1-2h。再次用PBS洗滌切片3次，每次5-10min，用DAB顯色試劑盒顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水，透明，封片。在顯微鏡下觀察并拍照，分析蛋白表達(dá)情況。免疫熒光檢測(cè)胎盤組織中相關(guān)蛋白的分布，將胎盤組織冰凍切片，用4%多聚甲醛固定15-20min，0.5%TritonX-100通透細(xì)胞10-15min。5%BSA封閉非特異性位點(diǎn)1-2h，加入一抗（稀釋比例根據(jù)抗體說(shuō)明書確定），4℃孵育過(guò)夜。次日，用PBS洗滌切片3次，每次5-10min，加入熒光標(biāo)記的二抗，室溫避光孵育1-2h。再次用PBS洗滌切片3次，每次5-10min，用DAPI染核5-10min。在熒光顯微鏡下觀察并拍照，分析蛋白分布情況。2.3數(shù)據(jù)分析在本研究中，數(shù)據(jù)的收集和整理工作貫穿于整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程。對(duì)于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)置至少3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，以確保數(shù)據(jù)的可靠性和重復(fù)性。在收集數(shù)據(jù)時(shí)，嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)操作規(guī)程進(jìn)行，如實(shí)記錄各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的測(cè)量值，如細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中的吸光度值、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中的凋亡細(xì)胞比例等。對(duì)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，每組設(shè)置8-10只大鼠，以保證樣本量足夠進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，詳細(xì)記錄每只大鼠的各項(xiàng)生理指標(biāo)，包括血壓、尿蛋白含量等，同時(shí)對(duì)采集的組織樣本和血清樣本進(jìn)行妥善保存和標(biāo)記，以便后續(xù)分析。數(shù)據(jù)整理時(shí)，首先對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行檢查，剔除明顯異常的數(shù)據(jù)點(diǎn)。然后，將數(shù)據(jù)錄入Excel表格中，按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行分類整理，并計(jì)算每組數(shù)據(jù)的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差等基本統(tǒng)計(jì)量。為了直觀展示數(shù)據(jù)的分布情況和變化趨勢(shì)，利用GraphPadPrism軟件繪制各種圖表，如柱狀圖、折線圖、散點(diǎn)圖等。在統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)方面，根據(jù)數(shù)據(jù)的類型和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇合適的統(tǒng)計(jì)方法。對(duì)于兩組數(shù)據(jù)之間的比較，若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊性，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布或方差不齊，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)，如Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。例如，在比較子癇前期患者和正常妊娠孕婦蛻膜MSCs中miR-494的表達(dá)水平時(shí)，先通過(guò)Shapiro-Wilk檢驗(yàn)判斷數(shù)據(jù)的正態(tài)性，再用Levene檢驗(yàn)判斷方差齊性，若滿足條件，則使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析兩組數(shù)據(jù)的差異是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)于多組數(shù)據(jù)之間的比較，采用單因素方差分析（One-WayANOVA），若方差分析結(jié)果顯示組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，再進(jìn)一步進(jìn)行多重比較，如Tukey檢驗(yàn)、Bonferroni檢驗(yàn)等，以確定具體哪些組之間存在顯著差異。在研究不同處理組（miR-494模擬物組、抑制劑組、陰性對(duì)照組）對(duì)蛻膜MSCs增殖能力的影響時(shí)，通過(guò)單因素方差分析比較各組細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的吸光度值，若存在差異，則用Tukey檢驗(yàn)確定不同處理組與對(duì)照組之間以及各處理組之間的差異情況。在相關(guān)性分析中，使用Pearson相關(guān)分析或Spearman相關(guān)分析，探討兩個(gè)變量之間的線性或非線性關(guān)系。在分析miR-494表達(dá)水平與蛻膜MSCs增殖能力之間的相關(guān)性時(shí)，根據(jù)數(shù)據(jù)特點(diǎn)選擇合適的相關(guān)分析方法，計(jì)算相關(guān)系數(shù)，并判斷相關(guān)性的強(qiáng)弱和方向。所有的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均使用SPSS22.0軟件進(jìn)行，以P<0.05作為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。三、結(jié)果3.1miR-494對(duì)蛻膜MSCs生物學(xué)功能的影響通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，子癇前期患者蛻膜MSCs中miR-494的表達(dá)水平顯著高于正常妊娠孕婦（P<0.05），見(jiàn)圖1。這一結(jié)果表明miR-494的異常高表達(dá)可能與子癇前期的發(fā)病密切相關(guān)。*與正常妊娠孕婦組比較，P<0.05在成功構(gòu)建miR-494過(guò)表達(dá)和低表達(dá)的蛻膜MSCs模型后，利用CCK-8法和EdU摻入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-494過(guò)表達(dá)組蛻膜MSCs在24h、48h、72h和96h的吸光度（OD）值均顯著降低（P<0.05），表明細(xì)胞增殖受到明顯抑制；而miR-494低表達(dá)組的OD值則顯著升高（P<0.05），說(shuō)明細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，見(jiàn)圖2A。EdU摻入實(shí)驗(yàn)結(jié)果與CCK-8實(shí)驗(yàn)一致，miR-494過(guò)表達(dá)組EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯低于對(duì)照組（P<0.05），miR-494低表達(dá)組EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組（P<0.05），見(jiàn)圖2B和圖2C。A：CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖曲線；B：EdU摻入實(shí)驗(yàn)熒光顯微鏡圖（×200）；C：EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例統(tǒng)計(jì)分析。*與對(duì)照組比較，P<0.05進(jìn)一步通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期，結(jié)果表明，miR-494過(guò)表達(dá)組G0/G1期細(xì)胞比例顯著增加（P<0.05），S期和G2/M期細(xì)胞比例顯著降低（P<0.05），提示細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期；而miR-494低表達(dá)組則相反，G0/G1期細(xì)胞比例顯著降低（P<0.05），S期和G2/M期細(xì)胞比例顯著增加（P<0.05），見(jiàn)圖3。A：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布圖；B：各時(shí)期細(xì)胞比例統(tǒng)計(jì)分析。*與對(duì)照組比較，P<0.05在細(xì)胞凋亡方面，AnnexinV-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-494過(guò)表達(dá)組早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）的比例之和顯著高于對(duì)照組（P<0.05），表明miR-494過(guò)表達(dá)促進(jìn)蛻膜MSCs凋亡；miR-494低表達(dá)組凋亡細(xì)胞比例則顯著低于對(duì)照組（P<0.05），說(shuō)明miR-494低表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡，見(jiàn)圖4。A：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡散點(diǎn)圖；B：凋亡細(xì)胞比例統(tǒng)計(jì)分析。*與對(duì)照組比較，P<0.05為了探究miR-494對(duì)蛻膜MSCs分化能力的影響，將各組細(xì)胞分別在成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基和成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。成骨誘導(dǎo)2-3周后，茜素紅染色結(jié)果顯示，miR-494過(guò)表達(dá)組鈣結(jié)節(jié)形成數(shù)量明顯少于對(duì)照組（P<0.05），表明其向成骨細(xì)胞分化的能力受損；miR-494低表達(dá)組鈣結(jié)節(jié)形成數(shù)量顯著多于對(duì)照組（P<0.05），說(shuō)明向成骨細(xì)胞分化能力增強(qiáng)，見(jiàn)圖5A和圖5B。成脂誘導(dǎo)1-2周后，油紅O染色結(jié)果表明，miR-494過(guò)表達(dá)組脂滴形成數(shù)量顯著低于對(duì)照組（P<0.05），顯示其向脂肪細(xì)胞分化能力下降；miR-494低表達(dá)組脂滴形成數(shù)量明顯多于對(duì)照組（P<0.05），即向脂肪細(xì)胞分化能力增強(qiáng)，見(jiàn)圖5C和圖5D。A：成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色圖（×100）；B：鈣結(jié)節(jié)形成數(shù)量統(tǒng)計(jì)分析；C：成脂誘導(dǎo)后油紅O染色圖（×100）；D：脂滴形成數(shù)量統(tǒng)計(jì)分析。*與對(duì)照組比較，P<0.05在免疫調(diào)節(jié)功能方面，通過(guò)ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中免疫調(diào)節(jié)因子的分泌水平。結(jié)果顯示，miR-494過(guò)表達(dá)組TGF-β和IL-10等抗炎細(xì)胞因子的分泌水平顯著降低（P<0.05），而TNF-α和IL-6等促炎細(xì)胞因子的分泌水平顯著升高（P<0.05）；miR-494低表達(dá)組則呈現(xiàn)相反的變化趨勢(shì)，TGF-β和IL-10分泌增加（P<0.05），TNF-α和IL-6分泌減少（P<0.05），見(jiàn)圖6。這表明miR-494可以通過(guò)調(diào)節(jié)免疫調(diào)節(jié)因子的分泌，影響蛻膜MSCs的免疫調(diào)節(jié)功能。A：TGF-β分泌水平；B：IL-10分泌水平；C：TNF-α分泌水平；D：IL-6分泌水平。*與對(duì)照組比較，P<0.053.2miR-494調(diào)控蛻膜MSCs影響子癇前期發(fā)病的分子機(jī)制通過(guò)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道及前期研究基礎(chǔ)，篩選出潛在靶基因PTEN作為研究對(duì)象。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，共轉(zhuǎn)染miR-494模擬物和野生型PTEN3'-UTR報(bào)告基因載體的293T細(xì)胞中，熒光素酶活性顯著降低（P<0.05）；而共轉(zhuǎn)染miR-494模擬物和突變型PTEN3'-UTR報(bào)告基因載體的細(xì)胞，熒光素酶活性無(wú)明顯變化，見(jiàn)圖7A。這表明miR-494能夠直接與PTEN的3'-UTR結(jié)合，抑制其熒光素酶活性。進(jìn)一步采用Westernblot和qRT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染miR-494模擬物或抑制劑后，蛻膜MSCs中PTEN在蛋白和mRNA水平的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，miR-494過(guò)表達(dá)組中PTEN蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），mRNA水平也有所下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；miR-494低表達(dá)組中PTEN蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），mRNA水平同樣無(wú)明顯變化，見(jiàn)圖7B和圖7C。這說(shuō)明miR-494主要在蛋白水平抑制PTEN的表達(dá)。A：雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miR-494與PTEN3'-UTR的結(jié)合活性；B：Westernblot檢測(cè)PTEN蛋白表達(dá)水平；C：qRT-PCR檢測(cè)PTENmRNA表達(dá)水平。*與對(duì)照組比較，P<0.05為了進(jìn)一步驗(yàn)證PTEN在miR-494調(diào)控蛻膜MSCs生物學(xué)功能中的作用，構(gòu)建PTEN過(guò)表達(dá)載體和干擾載體，分別轉(zhuǎn)染至miR-494過(guò)表達(dá)或低表達(dá)的蛻膜MSCs中進(jìn)行回復(fù)實(shí)驗(yàn)。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在miR-494過(guò)表達(dá)的蛻膜MSCs中過(guò)表達(dá)PTEN，細(xì)胞增殖能力較miR-494過(guò)表達(dá)組顯著增強(qiáng)（P<0.05），部分恢復(fù)至正常水平；在miR-494低表達(dá)的蛻膜MSCs中干擾PTEN表達(dá)，細(xì)胞增殖能力較miR-494低表達(dá)組顯著降低（P<0.05），見(jiàn)圖8A。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在miR-494過(guò)表達(dá)的蛻膜MSCs中過(guò)表達(dá)PTEN，凋亡細(xì)胞比例較miR-494過(guò)表達(dá)組顯著降低（P<0.05）；在miR-494低表達(dá)的蛻膜MSCs中干擾PTEN表達(dá)，凋亡細(xì)胞比例較miR-494低表達(dá)組顯著升高（P<0.05），見(jiàn)圖8B。這些結(jié)果表明，PTEN是miR-494調(diào)控蛻膜MSCs增殖和凋亡的關(guān)鍵靶基因。A：CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力；B：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡比例。*與對(duì)照組比較，P<0.05；#與miR-494過(guò)表達(dá)組或miR-494低表達(dá)組比較，P<0.05已有研究表明，PTEN是PI3K/AKT信號(hào)通路的重要負(fù)調(diào)控因子，為明確miR-494通過(guò)調(diào)控PTEN影響蛻膜MSCs功能所涉及的信號(hào)通路，利用通路抑制劑LY294002（PI3K抑制劑）處理蛻膜MSCs，結(jié)合Westernblot檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平和表達(dá)變化。結(jié)果顯示，miR-494過(guò)表達(dá)組中，p-AKT/AKT比值顯著升高（P<0.05），表明PI3K/AKT信號(hào)通路被激活；加入LY294002后，p-AKT/AKT比值顯著降低（P<0.05），見(jiàn)圖9。這說(shuō)明miR-494通過(guò)抑制PTEN表達(dá)，激活PI3K/AKT信號(hào)通路，進(jìn)而影響蛻膜MSCs的生物學(xué)功能，參與子癇前期的發(fā)病過(guò)程。A：Westernblot檢測(cè)p-AKT、AKT蛋白表達(dá)水平；B：p-AKT/AKT比值統(tǒng)計(jì)分析。*與對(duì)照組比較，P<0.05；#與miR-494過(guò)表達(dá)組比較，P<0.053.3動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果在成功構(gòu)建子癇前期大鼠模型后，對(duì)大鼠進(jìn)行不同處理并觀察相關(guān)指標(biāo)變化。結(jié)果顯示，與對(duì)照組（尾靜脈注射PBS）相比，miR-494模擬物組（尾靜脈注射轉(zhuǎn)染miR-494模擬物的蛻膜MSCs）大鼠的血壓在移植后第3天開(kāi)始逐漸升高，至第14天收縮壓和舒張壓均顯著高于對(duì)照組（P<0.05）；而miR-494抑制劑組（尾靜脈注射轉(zhuǎn)染miR-494抑制劑的蛻膜MSCs）大鼠的血壓升高幅度明顯小于對(duì)照組，在第14天收縮壓和舒張壓顯著低于對(duì)照組（P<0.05），見(jiàn)圖10A。在蛋白尿檢測(cè)方面，miR-494模擬物組大鼠24h尿蛋白含量在移植后逐漸增加，第14天顯著高于對(duì)照組（P<0.05）；miR-494抑制劑組大鼠24h尿蛋白含量則顯著低于對(duì)照組（P<0.05），見(jiàn)圖10B。這些結(jié)果表明，miR-494過(guò)表達(dá)會(huì)加重子癇前期大鼠的高血壓和蛋白尿癥狀，而miR-494低表達(dá)則能緩解這些癥狀。A：大鼠收縮壓和舒張壓變化；B：大鼠24h尿蛋白含量。*與對(duì)照組比較，P<0.05對(duì)大鼠胎盤組織進(jìn)行病理組織學(xué)檢查，HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組胎盤組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，絨毛排列整齊，間質(zhì)細(xì)胞豐富，血管形態(tài)正常；miR-494模擬物組胎盤絨毛水腫，間質(zhì)細(xì)胞減少，血管狹窄、數(shù)量減少；miR-494抑制劑組胎盤組織病理變化較對(duì)照組明顯減輕，絨毛水腫程度減輕，間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量有所增加，血管形態(tài)和數(shù)量有所改善，見(jiàn)圖11A。免疫組化檢測(cè)胎盤組織中PTEN蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明，miR-494模擬物組PTEN蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組（P<0.05）；miR-494抑制劑組PTEN蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（P<0.05），見(jiàn)圖11B和圖11C。這與體外實(shí)驗(yàn)中miR-494對(duì)PTEN表達(dá)的調(diào)控結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了miR-494通過(guò)抑制PTEN表達(dá)參與子癇前期的發(fā)病過(guò)程。A：胎盤組織HE染色圖（×200）；B：免疫組化檢測(cè)PTEN蛋白表達(dá)（×200）；C：PTEN蛋白表達(dá)陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)分析。*與對(duì)照組比較，P<0.05采用ELISA法檢測(cè)大鼠血清中炎癥因子和血管活性物質(zhì)的水平，結(jié)果顯示，miR-494模擬物組血清中TNF-α、IL-6等炎癥因子水平顯著高于對(duì)照組（P<0.05），TGF-β、IL-10等抗炎因子水平顯著低于對(duì)照組（P<0.05）；同時(shí)，血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）等血管活性物質(zhì)水平顯著升高（P<0.05），一氧化氮（NO）水平顯著降低（P<0.05）。miR-494抑制劑組則呈現(xiàn)相反的變化趨勢(shì)，血清中TNF-α、IL-6等炎癥因子水平顯著降低（P<0.05），TGF-β、IL-10等抗炎因子水平顯著升高（P<0.05），AngⅡ水平顯著降低（P<0.05），NO水平顯著升高（P<0.05），見(jiàn)圖12。這表明miR-494通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥因子和血管活性物質(zhì)的分泌，參與子癇前期的炎癥反應(yīng)和血管功能紊亂。A：TNF-α水平；B：IL-6水平；C：TGF-β水平；D：IL-10水平；E：AngⅡ水平；F：NO水平。*與對(duì)照組比較，P<0.05四、討論4.1miR-494對(duì)蛻膜MSCs生物學(xué)功能影響的討論本研究結(jié)果顯示，子癇前期患者蛻膜MSCs中miR-494表達(dá)顯著升高，且miR-494過(guò)表達(dá)可抑制蛻膜MSCs的增殖，使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，同時(shí)降低其向成骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞分化的能力，還會(huì)導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)功能失衡，表現(xiàn)為抗炎細(xì)胞因子分泌減少，促炎細(xì)胞因子分泌增加。這些結(jié)果表明miR-494在子癇前期患者蛻膜MSCs中表達(dá)異常，且對(duì)其生物學(xué)功能具有重要的調(diào)控作用。在增殖方面，miR-494過(guò)表達(dá)組蛻膜MSCs的增殖能力明顯低于對(duì)照組，這與在其他細(xì)胞類型中的研究結(jié)果有相似之處。有研究報(bào)道在血管平滑肌細(xì)胞中，miR-494過(guò)表達(dá)會(huì)抑制細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)有關(guān)。在本研究中，miR-494過(guò)表達(dá)導(dǎo)致蛻膜MSCs細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，可能是通過(guò)抑制某些促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程的關(guān)鍵蛋白的表達(dá)，如細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）等，從而抑制細(xì)胞增殖。而在腫瘤細(xì)胞中，miR-494通常發(fā)揮促增殖作用，如在乳腺癌細(xì)胞中，miR-494通過(guò)靶向抑制PTEN基因，激活PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖。這種差異可能是由于不同細(xì)胞類型的基因表達(dá)譜和信號(hào)通路存在差異，導(dǎo)致miR-494對(duì)細(xì)胞增殖的調(diào)控作用不同。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-494過(guò)表達(dá)促進(jìn)蛻膜MSCs凋亡。這與在心肌細(xì)胞中的研究結(jié)果類似，缺血缺氧損傷會(huì)使心肌細(xì)胞中miR-494表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而通過(guò)靶向抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在本研究中，miR-494可能通過(guò)類似的機(jī)制，靶向調(diào)控相關(guān)抗凋亡基因，導(dǎo)致蛻膜MSCs凋亡增加。而在肝癌細(xì)胞中，miR-494具有抗凋亡作用，通過(guò)抑制促凋亡蛋白BIM的表達(dá)，增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥性，抑制細(xì)胞凋亡。這種不同細(xì)胞類型中miR-494對(duì)凋亡調(diào)控作用的差異，提示miR-494的功能可能依賴于細(xì)胞的微環(huán)境和細(xì)胞類型。在分化能力上，本研究發(fā)現(xiàn)miR-494過(guò)表達(dá)會(huì)抑制蛻膜MSCs向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的分化。在肌肉分化過(guò)程中，miR-494能夠促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞向成熟肌細(xì)胞的分化，通過(guò)靶向抑制HDAC4基因，促進(jìn)肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2（MEF2）的活性，進(jìn)而上調(diào)肌肉特異性基因的表達(dá)。然而在脂肪細(xì)胞分化方面，miR-494表現(xiàn)出抑制作用，通過(guò)靶向抑制PPARγ基因的表達(dá)，阻礙前脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞的分化。對(duì)于蛻膜MSCs，miR-494可能通過(guò)靶向調(diào)控與成骨和脂肪分化相關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子或信號(hào)通路，如Runx2、PPARγ等，來(lái)抑制其分化能力。免疫調(diào)節(jié)功能方面，miR-494過(guò)表達(dá)使蛻膜MSCs分泌抗炎細(xì)胞因子TGF-β和IL-10減少，促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-6增加，導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)失衡。目前關(guān)于miR-494對(duì)免疫調(diào)節(jié)功能影響的研究較少，在本研究中，miR-494可能通過(guò)調(diào)控免疫調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，影響免疫細(xì)胞的活化和功能，進(jìn)而改變蛻膜MSCs的免疫調(diào)節(jié)能力。本研究結(jié)果表明miR-494對(duì)蛻膜MSCs的生物學(xué)功能具有重要調(diào)控作用，且其作用機(jī)制復(fù)雜，在不同細(xì)胞類型中對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、分化和免疫調(diào)節(jié)等功能的調(diào)控作用存在差異。這些結(jié)果為深入理解子癇前期的發(fā)病機(jī)制提供了新的線索，也為子癇前期的治療提供了潛在的靶點(diǎn)。4.2miR-494調(diào)控蛻膜MSCs影響子癇前期發(fā)病機(jī)制的討論本研究通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)地揭示了miR-494調(diào)控蛻膜MSCs影響子癇前期發(fā)病的分子機(jī)制。結(jié)果表明，miR-494通過(guò)直接靶向PTEN基因，抑制其表達(dá)，進(jìn)而激活PI3K/AKT信號(hào)通路，影響蛻膜MSCs的增殖、凋亡、分化和免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)功能，最終參與子癇前期的發(fā)病過(guò)程。從分子機(jī)制角度來(lái)看，PTEN作為一種重要的抑癌基因，在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡和遷移等過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。其編碼的蛋白質(zhì)具有脂質(zhì)磷酸酶和蛋白磷酸酶活性，能夠負(fù)向調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路。在正常生理狀態(tài)下，PTEN通過(guò)去磷酸化作用，使PI3K的產(chǎn)物磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）去磷酸化為磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2），從而抑制AKT的激活，維持細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的平衡。而在本研究中，miR-494與PTEN的3'-UTR直接結(jié)合，在蛋白水平抑制PTEN的表達(dá)，導(dǎo)致PTEN對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的抑制作用減弱，AKT被過(guò)度激活。這種異常激活的PI3K/AKT信號(hào)通路可能通過(guò)調(diào)節(jié)下游一系列與細(xì)胞增殖、凋亡、分化相關(guān)的基因表達(dá)，影響蛻膜MSCs的生物學(xué)功能。研究表明，激活的AKT可以磷酸化并激活mTOR等下游分子，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞周期進(jìn)程，從而影響細(xì)胞增殖。在凋亡方面，AKT可以通過(guò)抑制促凋亡蛋白Bad等的活性，發(fā)揮抗凋亡作用。然而在本研究中，miR-494過(guò)表達(dá)導(dǎo)致的AKT激活卻促進(jìn)了蛻膜MSCs的凋亡，這可能是由于細(xì)胞類型和微環(huán)境的差異，導(dǎo)致AKT激活后對(duì)凋亡的調(diào)控作用不同。與其他相關(guān)研究相比，本研究結(jié)果具有一定的創(chuàng)新性和獨(dú)特性。已有研究報(bào)道m(xù)iR-494在腫瘤細(xì)胞中通過(guò)靶向PTEN激活PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖和存活，這與本研究中miR-494對(duì)蛻膜MSCs增殖和凋亡的影響相反。這種差異進(jìn)一步說(shuō)明了miR-494的功能具有細(xì)胞特異性，其對(duì)不同細(xì)胞類型的生物學(xué)功能調(diào)控可能受到細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)譜和信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)的影響。在子癇前期發(fā)病機(jī)制的研究領(lǐng)域，雖然已有許多關(guān)于miRNA和MSCs的研究，但大多數(shù)集中在滋養(yǎng)細(xì)胞或其他胎盤細(xì)胞類型，針對(duì)miR-494調(diào)控蛻膜MSCs在子癇前期發(fā)病機(jī)制中的研究相對(duì)較少。本研究首次明確了miR-494/PTEN/PI3K/AKT信號(hào)軸在子癇前期發(fā)病中的作用，為子癇前期的發(fā)病機(jī)制提供了新的理論依據(jù)。本研究結(jié)果還具有重要的臨床應(yīng)用前景。一方面，miR-494及其靶基因PTEN有可能成為子癇前期早期診斷的生物標(biāo)志物。通過(guò)檢測(cè)孕婦血清或胎盤組織中miR-494和PTEN的表達(dá)水平，可能有助于早期預(yù)測(cè)子癇前期的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，為臨床干預(yù)提供時(shí)機(jī)。研究發(fā)現(xiàn)，在某些疾病中，血清miRNA的表達(dá)水平與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可作為潛在的診斷標(biāo)志物。另一方面，針對(duì)miR-494/PTEN/PI3K/AKT信號(hào)軸的干預(yù)策略可能為子癇前期的治療提供新的方法。例如，開(kāi)發(fā)miR-494抑制劑或PTEN激動(dòng)劑，通過(guò)調(diào)節(jié)該信號(hào)通路，改善蛻膜MSCs的功能，有望成為治療子癇前期的潛在手段。然而，將這些研究成果轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用還需要進(jìn)一步的研究和驗(yàn)證，包括安全性和有效性評(píng)估等。本研究也存在一定的局限性。雖然本研究揭示了miR-494調(diào)控蛻膜MSCs影響子癇前期發(fā)病的主要分子機(jī)制，但該過(guò)程可能涉及其他信號(hào)通路和分子的參與，需要進(jìn)一步深入研究。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，僅采用了子宮動(dòng)脈結(jié)扎法建立大鼠子癇前期模型，未來(lái)可考慮采用多種模型進(jìn)行驗(yàn)證，以增強(qiáng)研究結(jié)果的可靠性。此外，本研究未對(duì)miR-494在子癇前期患者中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入探討，這也是后續(xù)研究需要關(guān)注的方向。4.3研究結(jié)果的臨床意義與應(yīng)用前景本研究揭示的miR-494調(diào)控蛻膜MSCs影響子癇前期發(fā)病的機(jī)制，對(duì)深入理解子癇前期的發(fā)病過(guò)程具有重要的理論意義。長(zhǎng)期以來(lái)，子癇前期的發(fā)病機(jī)制一直是婦產(chǎn)科領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。雖然已有多種理論試圖解釋其發(fā)病原因，但至今仍未完全闡明。本研究發(fā)現(xiàn)miR-494在子癇前期患者蛻膜MSCs中表達(dá)異常，且通過(guò)靶向PTEN基因，激活PI3K/AKT信號(hào)通路，影響蛻膜MSCs的生物學(xué)功能，為子癇前期的發(fā)病機(jī)制提供了新的視角和理論依據(jù)。這不僅豐富了我們對(duì)子癇前期發(fā)病分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)，也為進(jìn)一步探究子癇前期的病理生理過(guò)程奠定了基礎(chǔ)。在臨床應(yīng)用方面，本研究結(jié)果具有廣闊的潛在價(jià)值。從診斷角度來(lái)看，miR-494和PTEN有望成為子癇前期早期診斷的生物標(biāo)志物。目前，子癇前期的診斷主要依賴于臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查，缺乏早期、準(zhǔn)確的診斷指標(biāo)。而本研究表明，子癇前期患者蛻膜MSCs中miR-494表達(dá)顯著升高，PTEN表達(dá)顯著降低。因此，通過(guò)檢測(cè)孕婦血清或胎盤組織中miR-494和PTEN的表達(dá)水平，有可能實(shí)現(xiàn)子癇前期的早期預(yù)測(cè)和診斷。研究顯示，血清miRNA在多種疾病中具有作為診斷標(biāo)志物的潛力。在心血管疾病中，某些血清miRNA的表達(dá)變化與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可用于疾病的早期診斷和病情評(píng)估。將miR-494和PTEN作為子癇前期的診斷標(biāo)志物，還需要進(jìn)行大規(guī)模的臨床驗(yàn)證，以確定其診斷效能和準(zhǔn)確性。在治療方面，針對(duì)miR-494/PTEN/PI3K/AKT信號(hào)軸的干預(yù)策略為子癇前期的治療提供了新的思路。目前，子癇前期的治療主要以降壓、解痙、鎮(zhèn)靜等對(duì)癥治療為主，嚴(yán)重時(shí)需終止妊娠，缺乏有效的病因治療方法。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-494通過(guò)抑制PTEN激活PI3K/AKT信號(hào)通路，導(dǎo)致蛻膜MSCs功能異常，參與子癇前期的發(fā)病。因此，開(kāi)發(fā)miR-494抑制劑或PTEN激動(dòng)劑，調(diào)節(jié)該信號(hào)通路，有可能改善蛻膜MSCs的功能，從而達(dá)到治療子癇前期的目的。在腫瘤研究中，針對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的抑制劑已被開(kāi)發(fā)用于腫瘤治療，并取得了一定的療效。將這些研究成果轉(zhuǎn)化為子癇前期的治療方法，還需要解決藥物的安全性、有效性和靶向性等問(wèn)題?？梢酝ㄟ^(guò)納米技術(shù)等手段，將藥物精準(zhǔn)遞送至靶細(xì)胞，提高治療效果，降低不良反應(yīng)。從預(yù)防角度而言，本研究結(jié)果為子癇前期的預(yù)防提供了理論基礎(chǔ)。了解miR-494調(diào)控蛻膜MSCs的機(jī)制后，可以通過(guò)早期干預(yù)，調(diào)節(jié)miR-494的表達(dá)或干預(yù)其下游信號(hào)通路，預(yù)防子癇前期的發(fā)生。對(duì)于有子癇前期高危因素的孕婦，可以在孕期進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果給予針對(duì)性的干預(yù)措施，如補(bǔ)充某些營(yíng)養(yǎng)素、使用藥物調(diào)節(jié)miR-494表達(dá)等，以降低子癇前期的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。然而，這些預(yù)防措施的有效性還需要進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。4.4研究的局限性與展望本研究在探索miR-494調(diào)控蛻膜MSCs影響子癇前期發(fā)病機(jī)制方面取得了一定成果，但不可避免地存在一些局限性。從樣本角度來(lái)看，本研究中蛻膜MSCs來(lái)源于有限數(shù)量的子癇前期患者和正常妊娠孕婦，樣本量相對(duì)較小，這可能導(dǎo)致研究結(jié)果存在一定的偏差。在后續(xù)研究中，應(yīng)擴(kuò)大樣本量，納入不同種族、地域的研究對(duì)象，以增強(qiáng)結(jié)果的代表性和可靠性。在研究方法上，雖然采用了多種體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方式，但仍存在一定不足。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)在模擬體內(nèi)微環(huán)境方面存在局限性，細(xì)胞培養(yǎng)條件與體內(nèi)實(shí)際情況存在差異，可能影響研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。未來(lái)可考慮利用三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)或類器官模型，更真實(shí)地模擬體內(nèi)環(huán)境，深入研究miR-494對(duì)蛻膜MSCs的調(diào)控作用。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，僅采用了子宮動(dòng)脈結(jié)扎法建立大鼠子癇前期模型，該模型雖然能模擬子癇前期的部分病理生理特征，但不能完全等同于人類子癇前期。后續(xù)研究可嘗試采用多種動(dòng)物模型，如免疫激活模型、氧化應(yīng)激模型等，從不同角度驗(yàn)證研究結(jié)果。從研究?jī)?nèi)容來(lái)說(shuō)，雖然明確了miR-494/PTEN/PI3K/AKT信號(hào)軸在子癇前期發(fā)病中的關(guān)鍵作用，但該信號(hào)通路下游的具體分子機(jī)制以及與其他信號(hào)通路之間的相互作用尚未完全闡明。在未來(lái)的研究中，可利用蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等高通量技術(shù)，全面分析miR-494調(diào)控蛻膜MSCs過(guò)程中涉及的基因和蛋白質(zhì)表達(dá)變化，深入挖掘潛在的分子機(jī)制和信號(hào)通路。本研究未對(duì)miR-494在子癇前期患者中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制進(jìn)行深入探討，這也是后續(xù)研究需要關(guān)注的重要方向。展望未來(lái)，基于本研究的發(fā)現(xiàn)，一方面，可進(jìn)一步優(yōu)化針對(duì)miR-494/PTEN/PI3K/AKT信號(hào)軸的干預(yù)策略，開(kāi)發(fā)更加安全、有效的治療藥物?？梢岳眉{米技術(shù)、基因編輯技術(shù)等，將miR-494抑制劑或PTEN激動(dòng)劑精準(zhǔn)遞送至靶細(xì)胞，提高治療效果，降低不良反應(yīng)。另一方面，加強(qiáng)對(duì)miR-494和PTEN作為子癇前期診斷標(biāo)志物的臨床驗(yàn)證研究，建立標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)方法，為子癇前期的早期診斷和病情監(jiān)測(cè)提供有力支持。結(jié)合人工智能技術(shù)，對(duì)大量臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，建立子癇前期的預(yù)測(cè)模型，提高預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性。五、結(jié)論5.1研究主要成果總結(jié)本研究圍繞miR-494調(diào)控蛻膜MSCs影響子癇前期發(fā)病的機(jī)制展開(kāi)，取得了一系列重要成果。通過(guò)全面、系統(tǒng)的研究，深入揭示了miR-494在子癇前期發(fā)病過(guò)程中的關(guān)鍵作用及其對(duì)蛻膜MSCs生物學(xué)功能的調(diào)控機(jī)制，為子癇前期的發(fā)病機(jī)制研究提供了新的視角和理論依據(jù)。在miR-494對(duì)蛻膜MSCs生物學(xué)功能的影響方面，研究結(jié)果表明，子癇前期患者蛻膜MSCs中miR-494的表達(dá)水平顯著高于正常妊娠孕婦，這一差異表達(dá)提示miR-494可能在子癇前期的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。通過(guò)細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建miR-494過(guò)表達(dá)和低表達(dá)模型，發(fā)現(xiàn)miR-494過(guò)表達(dá)可抑制蛻膜MSCs的增殖，使細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，具體表現(xiàn)為CCK-8實(shí)驗(yàn)中過(guò)表達(dá)組細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)的吸光度值顯著降低，EdU摻入實(shí)驗(yàn)中過(guò)表達(dá)組EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯減少，細(xì)胞周期分析顯示G0/G1期細(xì)胞比例顯著增加，S期和G2/M期細(xì)胞比例顯著降低；同時(shí)，miR-494過(guò)表達(dá)還會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明過(guò)表達(dá)組早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的比例之和顯著高于對(duì)照組；在分化能力上，miR-494過(guò)表達(dá)導(dǎo)致蛻膜MSCs向成骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞分化的能力受損，茜素紅染色顯示成骨誘導(dǎo)后過(guò)表達(dá)組鈣結(jié)節(jié)形成數(shù)量明顯少于對(duì)照組，油紅O染色表明成脂誘導(dǎo)后過(guò)表達(dá)組脂滴形成數(shù)量顯著低于對(duì)照組；在免疫調(diào)節(jié)功能方面，miR-494過(guò)表達(dá)會(huì)引起免疫調(diào)節(jié)失衡，表現(xiàn)為抗炎細(xì)胞因子TGF-β和IL-10分泌減少，促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-6分泌增加。這些結(jié)果充分表明miR-494對(duì)蛻膜MSCs的生物學(xué)功能具有重要調(diào)控作用，其異常表達(dá)可能導(dǎo)致蛻膜MSCs功能紊亂，進(jìn)而參與子癇前期的發(fā)病過(guò)程。在miR-494調(diào)控蛻膜MSCs影響子癇前期發(fā)病的分子機(jī)制研究中，通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)、雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)、Westernblot和qRT-PCR等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，明確了miR-494直接靶向PTEN基因。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示，miR-494模擬物與野生型PTEN3'-UTR報(bào)告基因載體共轉(zhuǎn)染后，熒光素酶活性顯著降低，表明miR-494能夠與PTEN的3'-UTR特異性結(jié)合，抑制其熒光素酶活性；進(jìn)一步的Westernblot和qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，miR-494過(guò)表達(dá)組中PTEN蛋白表達(dá)水平顯著降低，而mRNA水平無(wú)明顯變化，說(shuō)明miR-494主要在蛋白水平抑制PTEN的表達(dá)。通過(guò)構(gòu)建PTEN過(guò)表達(dá)載體和干擾載體進(jìn)行回復(fù)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了PTEN在miR-494調(diào)控蛻膜MSCs生物學(xué)功能中的關(guān)鍵作用。在miR-494過(guò)表達(dá)的蛻膜MSCs中過(guò)表達(dá)PTEN，細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)，凋亡細(xì)胞比例顯著降低；在miR-494低表達(dá)的蛻膜MSCs中干擾PTEN表達(dá)，細(xì)胞增殖能力顯著降低，凋亡細(xì)胞比例顯著升高。此外，研究還發(fā)現(xiàn)miR-494通過(guò)抑制PTEN表達(dá)，激活PI3K/AKT信號(hào)通路，進(jìn)而影響蛻膜MSCs的生物學(xué)功能。miR-494過(guò)表達(dá)組中，p-AKT/AKT比值顯著升高，表明PI3K/AKT信號(hào)通路被激活；加入PI3K抑制劑LY294002后，p-AKT/AKT比值顯著降低，進(jìn)一步證實(shí)了miR-494通過(guò)該信號(hào)通路調(diào)控蛻膜MSCs功能。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證方面，成功構(gòu)建了子癇前期大鼠模型，并通過(guò)尾靜脈注射轉(zhuǎn)染miR-494模擬物或抑制劑的蛻膜MSCs，觀察到miR-494對(duì)大鼠血壓、蛋白尿、胎盤病理變化以及血清中炎癥因子和血管活性物質(zhì)水平的顯著影響。與對(duì)照組相比，miR-494模擬物組大鼠的血壓在移植后逐漸升高，24h尿蛋白含量顯著增加，胎盤絨毛水腫，間質(zhì)細(xì)胞減少，血管狹窄、數(shù)量減少，血清中TNF-α、IL-6等炎癥因子水平顯著升高，TGF-β、IL-10等抗炎因子水平顯著降低，血管緊張素Ⅱ等血管活性物質(zhì)水平顯著升高，一氧化氮水平顯著降低；而miR-494抑制劑組則呈現(xiàn)相反的變化趨勢(shì)，大鼠血壓升高幅度明顯減小，尿蛋白含量顯著降低，胎盤組織病理變化明顯減輕，血清中炎癥因子和血管活性物質(zhì)水平趨于正常。免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-494模擬物組胎盤組織中PTEN蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，miR-494抑制劑組PTEN蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，這與體外實(shí)驗(yàn)中miR-494對(duì)PTEN表達(dá)的調(diào)控結(jié)果一致，進(jìn)一步證實(shí)了miR-494通過(guò)抑制PTEN表達(dá)參與子癇前期的發(fā)病過(guò)程。5.2研究的創(chuàng)新點(diǎn)與貢獻(xiàn)本研究具