ICS

CCS

JSF

團體標準

T/JSFXXXX—2XXX

美洲黑楊性別早期鑒定的微衛(wèi)星分子標記

技術(shù)規(guī)程

TechnicalregulationsformolecularmarkersforearlysexidentificationinPopulus

deltoides

（征求意見稿）

在提交反饋意見時，請將您知道的相關(guān)專利連同支持性文件一并附上。

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實施

江蘇省林學會??發(fā)布

T/JSFXXXX—2XXX

美洲黑楊性別早期鑒定的微衛(wèi)星分子標記技術(shù)規(guī)范

1范圍

本標準規(guī)定了以美洲黑楊(Populusdeltoides)幼嫩組織（葉片、芽等）為材料，利用分子標記法對美

洲黑楊性別進行分子鑒定的術(shù)語、原理、主要儀器和設備、試劑與溶液、操作程序和鑒定。

2規(guī)范性引用文件

本文件沒有規(guī)范性引用文件。

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件

3.1分子標記MolecularMarkers

指以直接檢測DNA核苷酸序列的差異為基礎(chǔ)的遺傳標記。

3.2微衛(wèi)星microsatellite

簡單重復序列simplesequencerepeats；SSR

也稱基因組中由2個～6個核苷酸組成的DNA串聯(lián)重復序列。

3.3性別鑒定sexdiscrimination

指對雌雄異株植物通過分子標記技術(shù)鑒定性染色體確定植株性別。

4原理

美洲黑楊屬于雌雄異株植物，為XY性別決定型，其性別二態(tài)性主要體現(xiàn)在花器官差異。雌性花器

官由多個雌蕊構(gòu)成的柔荑花序，不含雄蕊；雄性花器官由多個雄蕊構(gòu)成的柔荑花序，不含雌蕊。在達到

性成熟后，雌性花器官授粉產(chǎn)生大量包裹種子的飛絮，造成了嚴重的環(huán)境污染；雄株則不產(chǎn)生飛絮。所

以，通過選育不飛絮雄性良種進行現(xiàn)有品種的更新替代，可以從根本上杜絕楊絮的產(chǎn)生，推動楊樹產(chǎn)業(yè)

的發(fā)展。但是，美洲黑楊的童期一般是5-7年，無法在性成熟前通過外觀直接鑒定性別。所以在品種的

選育過程中，由于不能在苗期進行性別鑒定，往往需要等到植株開花后才能選育不產(chǎn)生楊絮的雄株，淘

汰產(chǎn)生楊絮的雌株，該做法既浪費了一半的財力人力，也提高了一倍的工作量。另外，對市場上1~3

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年生的商品樹苗不能鑒定其性別，容易存在雌株混入雄性品種中，造成飛絮對環(huán)境的污染。因此，建立

美洲黑楊性別早期鑒定的標準體系，不僅可以提高不飛絮雄性良種的選育效率，還有助于對美洲黑楊商

品苗性別的檢測，減少雌性商品苗的流通。

項目申請團隊以美洲黑楊為材料，通過群體遺傳學和全基因組關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)美洲黑楊的性別決定

區(qū)間（SDR）位于19號染色體（Chr.19）的末端。同時對性別決定區(qū)間的X和Y單倍型拆分，結(jié)合區(qū)

間預測基因的時空表達模式和遺傳轉(zhuǎn)化功能驗證，確定美洲黑楊性別由SDR-Y單倍型中一段42Kb的

特異序列上的兩個基因（FERR和MSL）決定，在X單倍型上不存在等位基因序列。因此，我們在美

洲黑楊性別決定基因所在的Y單倍型42Kb區(qū)間內(nèi)開發(fā)通用SSR引物（NJFU582、NJFU600和NJFU602），

在自然群體中進行實驗檢測，結(jié)果顯示所開發(fā)的3對通用SSR引物均在雄株中可以獲得單一擴增產(chǎn)物，

均在雌株中不能獲得任何擴增產(chǎn)物。綜上，當依據(jù)本標準進行美洲黑楊性別鑒定時，可采集待測植株根

莖葉等任一幼嫩組織提取DNA為模板，以本標準公布的微衛(wèi)星引物進行PCR擴增，通過聚丙烯胺凝

膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，若待測樣品檢測到單一擴增產(chǎn)物，即為雄株；若未檢測到擴增產(chǎn)物，則為雌株。

5主要儀器和設備

5.1樣品快速研磨儀（樣品量48×2ml，速度10-70HZ/秒）

5.2雙板夾芯式垂直電泳槽（凝膠板120mm×180mm，40齒，1.00mm厚）。

5.3離心機12000r/min。

5.4微量可調(diào)移液器(2μL、10μL、100μL、1000μL)。

5.5PCR擴增儀。

5.6EPS-300數(shù)顯式穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(電壓10V~300V，電流10mA~400mA)。

5.7全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)(透射紫外波長：302nm，透射紫外面積：20cm×20cm)。

5.8微量核酸蛋白檢測儀(波長范圍：190nm~840nm，波長精度1nm，檢測范圍2ng/μL~15000ng/μL)。

6試劑與溶液

6.1除非另有說明，在分析中所使用的所有試劑均為分析純。實驗中所使用的水均為無菌超純水。

6.21mol/LTris-HCl(pH8.0)：稱取121.1g三羥基甲烷（Tris）溶解于800mL超純水，約加入42ml

的濃鹽酸將pH值調(diào)到8.0，定容到1L，200mL分裝后高壓滅菌，室溫保存。

6.30.5mol/LNa-EDTA(pH8.0)：稱取186.1g乙二胺四乙酸二鈉（Na.EDTA）溶解到700mL超純水，

約加入20g氫氧化鈉（NaOH）調(diào)pH值至8.0，定容到1L，分裝后高壓滅菌，室溫保存。

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6.45mol/LNaCl：稱取58.44g氯化鈉用150mL超純水溶解，定容到200mL后高溫滅菌，室溫保存。

6.510%CTAB：10g溴代十六烷基三甲胺（CTAB）用雙蒸水溶解后定容到100mL后高壓滅菌。

6.63mol/L乙酸鈉（NaAc）：稱取40.8g三水乙酸鈉溶解到40mL超純水，加冰乙酸調(diào)PH至5.2，

加去離子水定容到100mL后高壓滅菌，室溫保存。

6.7三氯甲烷：異戊醇：240mL三氯甲烷和10mL異戊醇，混勻后在棕色瓶中室溫保存。

6.810%PVP：稱取10g聚乙烯吡咯烷酮（PVP）粉末，雙蒸水溶解后定容到100mL，高溫滅菌。

6.9CTAB提取液：CTAB提取液的主要成分為0.1mol/LTris-HCl(pH8.0）、20mmol/LNa-EDTA（pH

8.0）、1.4mol/LNaCl、2%CATB、2%PVP、1%β-巰基乙醇。在50mL的超純水中加入10mL1mol/L

的Tris-HCl，4mL0.5mol/L的Na-EDTA，28mL5mol/L的NaCl，20mL10%的CTAB，20ml10%的

PVP-40溶液，1mLβ-巰基乙醇（用前加入），定容到100mL。

6.10TE緩沖液：1mL0.5mol/LNa-EDTA，5mL1mol/LTris-HCl，用雙蒸水定容到500ml，高壓滅

菌。

6.11TBE緩沖液（5×）：稱取Tris堿270g，硼酸137.5g，溶解到800ml的超純水中，再加0.5mol/L

Na-EDTA100ml，在磁力攪拌器上溶解，后用超純水定量至5L，室溫保存。

6.1230%聚丙烯酰胺：稱取580g丙烯酰胺和20g雙丙烯酰胺，在磁力攪拌機的作用下，溶解到900ml

的超純水中，后用超純水定容至2L，室溫保存。

6.1310%過硫酸銨溶液：稱取15g過硫酸銨（AP），溶解在145ml的超純水中，室溫保存。

6.140.25%溴酚藍：稱取0.25g二甲苯腈、0.25g溴酚藍和40g蔗糖，溶解在80ml超純水中，定容至

100ml，室溫保存。

7操作程序

7.1取樣

采集美洲黑楊待測植株的幼嫩葉片或其它幼嫩器官和組織1.0g-5.0g，放入10ml離心管或樣品保存

袋中，先在液氮速凍后，于-80℃超低溫冰箱保存。

7.2DNA的提取、純化及定量

7.2.1CTAB法提取DNA：

a)取美洲黑楊新鮮幼嫩葉片2-3片或其它幼嫩組織0.5-1.0g，放在2ml離心管中，并加入直徑3mm

的氧化鋯球3顆，在液氮中迅速冷凍后，放置在樣品快速研磨儀中，調(diào)整頻率是50次/秒，持

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續(xù)研磨1min。

b)向研磨后的離心管中加入650μLCTAB提取液(100mmol/LTris-HCl，pH8.0；20mmol/L

Na-EDTA,pH8.0；1.4mol/LNaCl；2%CATB；2%PVP；1%β-巰基乙醇)。

c)加入10mg/mLRnase10μL，充分混勻。

d)放置在65℃水浴鍋中，水浴45min以上，其間溫和混勻2-3次。

e)向離心管中加入500μL三氯甲烷∶異戊醇（24：1）混合液，上下顛倒混勻，9800rpm離心

10min，轉(zhuǎn)移離心上清液至新的2.0ml離心管中。

f)向上清液中加入600μL預冷異丙醇和80μL的3mol/L的NaAc溶液，輕輕混勻，靜止10min

以上。

g)用9800rpm離心15min，棄上清液，沉淀即為提取得到的DNA。加入70%的酒精清洗DNA

兩次。

h)待DNA風干后，加入200μLTE緩沖液溶解DNA（4℃，1~2天），-20℃保存。

7.2.2DNA定量及質(zhì)量檢測：

a)取2μLDNA用微量核酸蛋白檢測儀檢測，可以直接讀出DNA濃度和A260/280的比值。若

A260/280=1.8時，證明提取DNA質(zhì)量高；若A260/280=2.0時，證明提取DNA中含有大量

RNA；若比值低于1.8或2.0，表示存在蛋白質(zhì)或酚類物質(zhì)的影響。

b)另取3μLDNA加3μL溴酚藍，在1%的瓊脂糖凝膠上電泳，穩(wěn)壓100V，電泳緩沖液為1×TBE，

電泳結(jié)束后用凝膠成像系統(tǒng)記錄拍照。

c)植物總DNA樣品只呈現(xiàn)一條相對分子質(zhì)量較大而遷移速率很小的整齊清晰條帶。

d)對照微量核酸蛋白檢測儀的定量結(jié)果，將樣品稀釋成濃度為20ng/μL，在-80℃下保存。

7.3SSR分子標記分型鑒定性別

7.3.1SSR引物是在美洲黑楊性別決定區(qū)間的Y特異區(qū)域開發(fā)的通用性引物，并經(jīng)過美洲黑楊種質(zhì)資源

群體庫材料驗證，對美洲黑楊的性別鑒定實現(xiàn)100%的準確性，具體的引物編號、引物序列和擴增產(chǎn)物

片段大小見附表A

7.3.2PCR反應體系為10μL，具體見表1。

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表1PCR反應體系

成份濃度用量（μL）

PCRbuffer10×1.0

MgCl225mmol/L1.0

dNTP2mmol/L0.2

PrimerF5μmol/L1.0

PrimerR5μmol/L1.0

rTaq酶5U/μL0.1

DNA溶液20ng/μL1.0

H2O4.7

7.3.3PCR反應程序：

反應液加入到PCR板后，在2000rpm下離心5s，將PCR板用乳膠蓋蓋好后放入PCR儀中，PCR

的程序為：

a)95℃預變性4min。

b)94℃變性40s，57℃退火45s，72℃延伸60s，共35個循環(huán)。

c)72℃延伸10min，4℃保存。

7.3.4PCR擴增產(chǎn)物檢測：

PCR產(chǎn)物檢測采用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳，凝膠濃度為30%，使用雙板夾芯式垂直電泳槽，

凝膠大小120mm×180mm×1.0mm，電泳緩沖液為0.5×TBE，電壓180V，電泳時長1.5小時，具體過程

為：

a)使用膠條和螺桿組裝電泳槽，對玻璃板與膠條接觸處進行瓊脂糖凝膠封邊。

b)配置聚丙烯酰胺凝膠液50ml（5×TBE10ml，30%聚丙烯酰胺15ml，超純水25ml，10%AP

溶液500μL，TEMED40μL），灌入玻璃夾板層，插入梳子。

c)待聚丙烯胺凝膠凝固后，把0.5×TBE緩沖液倒入垂直電泳槽中間及兩側(cè)，緩慢拔出梳子。

d)向PCR擴增完成體系中，加2.0μL溴酚藍指示劑，混勻。

e)吸取混勻后的PCR擴增產(chǎn)物2.0μL加入到聚丙烯胺凝膠點樣孔中，同時吸取1.0μL的DNA

Marker（分子量范圍50bp-1000bp）上樣在凝膠起始點樣孔。

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f)點樣完成后，聚丙烯胺凝膠兩極鏈接電泳儀，使用180V恒壓電泳90min。

g)電泳結(jié)束后，凝膠在AgNO3溶液（1.0gAgNO3溶于1000ml水中）中銀染12min。

h)用顯色液（15gNaOH，加水至1000ml）和10ml甲醛(現(xiàn)用現(xiàn)加）顯色，共5-8min。

i)用自來水洗凝膠2-3次，放置在LED觀片燈箱上進行擴增產(chǎn)物條帶分型或拍照。

8待檢樣品檢測的一般程序

待檢樣品檢測的一般程序為：

a)在附表A中隨機選取一對引物，對待檢樣品進行PCR擴增。

b)通過聚丙烯胺凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，若擴增產(chǎn)物特異，且擴增片段大小與附表A中列出一

致，則該待測樣品性別為雄性；若未檢測到擴增產(chǎn)物，則該待測樣品性別為雌性。

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附錄A

（規(guī)范性附錄）

美洲黑楊性別鑒定的SSR引物表

表A美洲黑楊性別鑒定的