ICS65.020.30

CCSB44

44

廣東省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB44/T2336—2021

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病毒PCR定性分析

LaboratoryanimalQualitativeanalysisofviruswithpolymerasechainreaction

method

2021-10-18發(fā)布2022-01-18實(shí)施

廣東省市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布

DB44/T2336—2021

目次

前言.................................................................................II

1范圍...............................................................................1

2規(guī)范性引用文件.....................................................................1

3術(shù)語(yǔ)和定義.........................................................................1

4縮略語(yǔ).............................................................................2

5原理...............................................................................2

6主要設(shè)備和材料.....................................................................2

7試劑...............................................................................3

8方法...............................................................................3

9結(jié)果..............................................................................10

10防止交叉污染的措施...............................................................11

附錄A（規(guī)范性）溶液的配制..........................................................12

附錄B（規(guī)范性）引物及探針序列......................................................14

參考文獻(xiàn).............................................................................18

I

DB44/T2336—2021

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定

起草。

請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專(zhuān)利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專(zhuān)利的責(zé)任。

本文件由廣東省科學(xué)技術(shù)廳提出并組織實(shí)施。

本文件由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)（GD/TC93）歸口。

本文件起草單位：廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所。

本文件主要起草人：王靜、袁文、閔凡貴、潘金春、黃樹(shù)武、羅銀珠、何麗芳、張鈺、黃韌。

II

DB44/T2336—2021

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病毒PCR定性分析

1范圍

本文件規(guī)定了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病毒的PCR定性分析方法。

本文件適用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物相關(guān)病毒核酸的定性分析。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求

GB/T19495.2轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)要求

3術(shù)語(yǔ)和定義

下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)polymerasechainreaction，PCR

體外酶催化合成特異DNA片段的方法，模板DNA先經(jīng)高溫變性成為單鏈，在DNA聚合酶作用和適宜的

反應(yīng)條件下，根據(jù)模板序列設(shè)計(jì)的兩條引物分別與模板DNA兩條鏈上相應(yīng)的一段互補(bǔ)序列發(fā)生退火而相

互結(jié)合，接著在DNA聚合酶的作用下以四種dNTP為底物，使引物得以延伸，然后不斷重復(fù)變性、退火和

延伸這一循環(huán)，使欲擴(kuò)增的基因片段以幾何倍數(shù)擴(kuò)增。

逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)reversetranscription-polymerasechainreaction，RT-PCR

以RNA為模板，采用Oligo（dT）、隨機(jī)引物或特異性引物，RNA在逆轉(zhuǎn)錄酶和適宜反應(yīng)條件下，被

逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后再以cDNA作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

巢式PCRnestedpolymerasechainreaction

巢式PCR通過(guò)兩輪PCR反應(yīng)，使用兩套引物擴(kuò)增特異性DNA片段。第一對(duì)PCR引物擴(kuò)增片段和普通PCR

相似。第二對(duì)引物以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，特異性地?cái)U(kuò)增位于首輪PCR產(chǎn)物內(nèi)的一段DNA片段，從而大

大提高了反應(yīng)的敏感性和特異性。

實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)real-timePCR，實(shí)時(shí)熒光PCR

實(shí)時(shí)熒光PCR方法是在普通PCR的基礎(chǔ)上，在反應(yīng)體系中加入特異性熒光探針，利用熒光信號(hào)積累實(shí)

時(shí)報(bào)告整個(gè)PCR進(jìn)程，通過(guò)讀取每次循環(huán)反應(yīng)中的熒光發(fā)射信號(hào)，間接反映了PCR擴(kuò)增的目標(biāo)基因的量，

最后通過(guò)擴(kuò)增曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定性或定量分析。

1

DB44/T2336—2021

實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)real-timeRT-PCR，實(shí)時(shí)熒光RT-PCR

實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法是在RT-PCR的基礎(chǔ)上，在反應(yīng)體系中加入特異性熒光探針，利用熒光信號(hào)積累

實(shí)時(shí)報(bào)告整個(gè)PCR進(jìn)程，通過(guò)讀取每次循環(huán)反應(yīng)中的熒光發(fā)射信號(hào)，間接反映了PCR擴(kuò)增的目標(biāo)基因的量，

最后通過(guò)擴(kuò)增曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定性或定量分析。

Ct值cyclethreshold

實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)中每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

4縮略語(yǔ)

下列縮略語(yǔ)適用于本文件。

cDNA互補(bǔ)DNA（complementaryDNA）

CPE細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathiceffect）

DEPC焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate）

DNA脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）

EDTA乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraaceticacid）

PBS磷酸鹽緩沖液（phosphatebufferedsaline）

RNA核糖核酸（ribonucleicacid）

TAE三羥甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸緩沖液（tris-acetateEDTA）

5原理

用合適的方法提取樣本中的總RNA或/和DNA，分別針對(duì)病毒保守基因設(shè)計(jì)特異的引物探針序列，通

過(guò)普通PCR或?qū)崟r(shí)熒光PCR反應(yīng)對(duì)模板進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)PCR反應(yīng)結(jié)果分析該樣品中是否含有某種病毒。

6主要設(shè)備和材料

PCR儀。

實(shí)時(shí)熒光PCR儀。

電泳儀。

凝膠成像分析系統(tǒng)。

高速冷凍離心機(jī)。

普通離心機(jī)。

恒溫孵育器。

漩渦振蕩器。

組織勻漿器。

微量核酸定量?jī)x。

生物安全柜。

PCR超凈工作臺(tái)。

冰箱（-20℃、-80℃）。

2

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微量移液器：0.1μL～2μL，1μL～10μL，10μL～100μL，100μL～1000μL。

滅菌離心管（1.5mL、2mL、5mL、15mL），滅菌吸頭（10μL，200μL，1mL），滅菌PCR擴(kuò)

增反應(yīng)管（0.2mL，八連管或96孔板）。

采樣工具：剪刀、鑷子和滅菌棉拭子等。

7試劑

以下所用的試劑除特別注明者外均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為雙蒸水或去離子水，應(yīng)符合GB/T6682

所規(guī)定一級(jí)水的要求。所有涉及分子生物學(xué)操作的水均為無(wú)DNA酶、無(wú)RNA酶水。

滅菌PBS。配制方法見(jiàn)附錄A。

PCR用水：經(jīng)DEPC處理的水或商品無(wú)DNA酶、無(wú)RNA酶水，配制方法見(jiàn)附錄A。

RNA抽提試劑：TRIzol或其他類(lèi)似產(chǎn)品。

DNA抽提試劑：基因組DNA提取試劑盒DNeasyBlood&TissueKit或其他類(lèi)似產(chǎn)品。

注：DNA提取試劑盒是由Qiagen公司提供的DNeasyBlood&TissueKit。給出這一信息是為了方便本文件使用者，

并不表示對(duì)這一產(chǎn)品的認(rèn)可。亦可使用其他類(lèi)似的DNA提取試劑盒進(jìn)行。

無(wú)水乙醇。

75%乙醇：使用DNA酶、無(wú)RNA酶水配制為75%乙醇。

三氯甲烷（氯仿）。

異丙醇。

PCR試劑：PremixTaqTM（Version2.0plusdye）、PremixExTaq?（ProbeqPCR）、OneStep

PrimerscriptTMRT-PCRKit（PerfectRealtime）或其他類(lèi)似產(chǎn)品。

注：以上PCR試劑是是由Takara公司提供的商品試劑盒，是本文件適合的市售產(chǎn)品的使用實(shí)例，給出這一信息是為

了方便本文件使用者，并不表示對(duì)這一產(chǎn)品的認(rèn)可。亦可使用其他類(lèi)似的PCR試劑。

DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：100bp～2000bp。

50×TAE電泳緩沖液，配制方法見(jiàn)附錄A。

溴化乙錠：10mg/mL，配制方法見(jiàn)附錄A或其他類(lèi)似產(chǎn)品。

1.5%瓊脂糖凝膠，配制方法見(jiàn)附錄A。

引物和探針：引物和探針序列見(jiàn)附錄B。根據(jù)附錄B中表B.1和表B.2序列合成引物和探針，引

物和探針加入無(wú)DNA酶、無(wú)RNA酶水配制成10μmol/L儲(chǔ)備液，-20℃保存。

8方法

生物安全措施

對(duì)于可能潛在人獸共患病的樣本，應(yīng)在生物安全二級(jí)及以上實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行操作，采樣應(yīng)在生物安全柜

中進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)操作及處理按照GB19489的規(guī)定，由具備相關(guān)資質(zhì)的工作人員進(jìn)行相應(yīng)操作。

采樣及樣本的處理

采樣過(guò)程中樣本不得交叉污染，采樣及樣本前處理過(guò)程中須戴一次性手套。采樣及樣本處理過(guò)程操

作人員應(yīng)做好個(gè)人防護(hù)。

8.2.1臟器組織

3

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剖檢，無(wú)菌采集動(dòng)物臟器，剪取待檢樣本0.5g～2g，加入5倍體積滅菌PBS，使用勻漿器充分勻漿

1min～2min，然后將組織懸液在4℃，8000g離心10min，取上清液轉(zhuǎn)入另一無(wú)菌5mL離心管中，

編號(hào)備用。

8.2.2盲腸內(nèi)容物或糞便

無(wú)菌采集動(dòng)物盲腸內(nèi)容物或糞便，取待檢樣本1g～2.0g于無(wú)菌5mL離心管，加入5倍體積滅菌PBS，

使用勻漿器充分勻漿1min～2min，8000g離心5min，上清液轉(zhuǎn)入另一無(wú)菌5mL離心管中，編號(hào)備

用。

8.2.3血液樣本

無(wú)菌采集動(dòng)物血液0.2mL～0.5mL，加入檸檬酸鈉或EDTA抗凝管中，輕輕顛倒混勻3次～5次，編號(hào)

備用。

8.2.4拭子取樣

對(duì)活體動(dòng)物取樣可采集肛拭子、口腔拭子、鼻拭子，皮膚拭子、泄殖腔拭子等，浸泡于3mL無(wú)菌PBS

中5min～10min，充分混勻后，4℃，8000g離心5min，取離心上清液轉(zhuǎn)入另一無(wú)菌5mL離心管中，

編號(hào)備用。

8.2.5細(xì)胞培養(yǎng)物

應(yīng)通過(guò)以下任一方法取樣：

——直接刮取樣本接種后出現(xiàn)CPE或可疑的細(xì)胞培養(yǎng)物置于無(wú)菌15mL離心管中，1500g離心

5min，棄上清，加1mL滅菌PBS重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到無(wú)菌1.5mL離心管，編號(hào)

備用；

——將樣本接種后出現(xiàn)CPE或可疑的細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融三次，細(xì)胞混懸液轉(zhuǎn)移于無(wú)菌離心管

中，8000g離心5min，棄細(xì)胞碎片，上清液轉(zhuǎn)移到無(wú)菌15mL離心管中，編號(hào)備用。

8.2.6飼料、墊料和飲水

飼料、墊料：取約5g～10g飼料和墊料置于50mL無(wú)菌離心管中，加入3倍體積滅菌PBS（飼料和墊

料需全部浸泡于液體中）。密封后浸泡5min～10min，充分混勻，將混懸液轉(zhuǎn)移至15mL無(wú)菌離心管，

4℃，8000g離心5min，取上清液轉(zhuǎn)入另一無(wú)菌5mL離心管中，編號(hào)備用。

飲水：取200μL～1000μL實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飲水直接轉(zhuǎn)移到無(wú)菌1.5mL離心管中，編號(hào)備用。

8.2.7設(shè)施設(shè)備

用滅菌棉拭子拭取實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施設(shè)備出風(fēng)口初效濾膜表面約5cm2沉積物，將拭子置入滅菌15mL離

心管，加入適量滅菌PBS，浸泡5min～10min，充分混勻，取出棉拭子，將離心管于4℃，8000g離

心5min，取上清液轉(zhuǎn)入另一無(wú)菌5mL離心管中，編號(hào)備用。

8.2.8樣本的存放

采集或處理的樣本在2℃～8℃條件下保存應(yīng)不超過(guò)24h，若需長(zhǎng)期保存，須放置于-80℃冰箱，

但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

8.2.9采樣廢棄物處理

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采樣結(jié)束，動(dòng)物尸體應(yīng)使用生物安全垃圾袋包裝完整，高壓滅菌后交由醫(yī)療垃圾處理單位進(jìn)行處理，

采樣器材應(yīng)使用消毒液浸泡或高壓滅菌消毒，并做好實(shí)驗(yàn)臺(tái)面及采樣室的消毒。

核酸提取

8.3.1樣本RNA提取

8.3.1.1取200μL處理后的樣本加1mLTRIzol后，充分混勻，室溫靜置10min使其充分裂解。

8.3.1.2加入200μL氯仿，蓋緊樣本管蓋，用手用力振蕩搖晃離心管15s，禁用漩渦振蕩器，以免

基因組RNA斷裂。室溫靜置5min，4℃，10000g離心15min。

8.3.1.3離心后混合物分成三層：下層紅色的苯酚-氯仿層，中間層，上層無(wú)色的水樣層。RNA存在于

水樣層當(dāng)中，水樣層的容量大約為所加TRIzol容量的60%。吸取上層水相，至另一離心管中，注意不

要吸取中間界面。

8.3.1.4加入等量異丙醇混勻，室溫放置10min，4℃，10000g離心10min，棄上清，RNA沉淀一

般形成一膠狀片狀沉淀附著于試管壁和管底。

8.3.1.5加入1mL75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。4℃，5000g離心5min，棄上清，將離

心管倒立吸水紙上，盡量使液體流干。

8.3.1.6室溫自然風(fēng)干5min～10min，注意RNA樣本不要過(guò)于干燥，否則很難溶解。用50μL～100

μL無(wú)DNA酶、無(wú)RNA酶水溶解RNA樣本。

8.3.1.7取2μL提取的RNA樣本使用微量核酸定量?jī)x測(cè)定提取RNA濃度。

8.3.1.8制備好的RNA應(yīng)盡快進(jìn)行下一步RT-PCR反應(yīng)，若暫時(shí)不能進(jìn)行PCR反應(yīng)，應(yīng)于-80℃冰箱

保存?zhèn)溆谩?/p>

8.3.2樣本DNA提取

8.3.2.1取50μL～100μL樣本至1.5mL或2mL離心管，加20μL蛋白酶K，用PBS補(bǔ)加至220

μL。

8.3.2.2加入200μL緩沖液AL，渦旋震蕩充分混勻，56℃孵育10min。

8.3.2.3加入200μL的無(wú)水乙醇，渦旋震蕩充分混勻。

8.3.2.4將第8.3.2.3條制備的混合液加入離心柱中，離心柱放在2mL收集管上?！?000g離心1

min后棄收集管/液。

8.3.2.5離心柱放至新的2mL收集管，加500μL緩沖液AW1，≥6000g離心1min后棄收集管/液。

8.3.2.6離心柱放至新的2mL收集管，加500μL緩沖液AW2，20000g離心3min。棄收集管/液。

8.3.2.7將離心柱放在一個(gè)新的1.5mL離心管上，吸200μL的緩沖液AE在吸附膜上，室溫孵育1

min，≥6000g離心1min。收獲DNA提取液。

8.3.2.8取2μL提取的DNA樣本使用微量核酸定量?jī)x測(cè)定提取DNA濃度。

8.3.2.9制備好的DNA應(yīng)盡快進(jìn)行下一步PCR反應(yīng)，若暫時(shí)不能進(jìn)行PCR反應(yīng)，應(yīng)于-20℃冰箱保存

備用。

注：該DNA提取方法是針對(duì)DNA提取試劑盒DNeasyBlood&TissueKit給出的應(yīng)用實(shí)例，可使用其他類(lèi)似的DNA提取

試劑盒進(jìn)行，提取方法可做相應(yīng)調(diào)整。

PCR方法

8.4.1普通PCR

5

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8.4.1.1PCR反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表1。反應(yīng)液的配制在冰上操作，每次反應(yīng)同時(shí)設(shè)計(jì)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照，

其中陽(yáng)性對(duì)照以含有陽(yáng)性病毒的組織或培養(yǎng)物提取的核酸作為陽(yáng)性對(duì)照模板，其中陰性對(duì)照以不含有

陽(yáng)性病毒的樣本核酸（可以是正常動(dòng)物組織或正常培養(yǎng)物）作為陰性對(duì)照模板，空白對(duì)照即為不加模板

對(duì)照（NoTemplateControl，NTC），即在反應(yīng)中用水來(lái)代替模板。

表1PCR反應(yīng)體系配制表

反應(yīng)組份用量/μL終濃度

2×PremixTaqMix（plusdye）101×

Forwardprimer（10μmol/L）0.80.4μmol/L～1μmol/L

Reverseprimer（10μmol/L）0.80.4μmol/L～1μmol/L

DNA模板2<250ng

PCR用水6.4

總體積20

注1：可使用其他類(lèi)似的PCR試劑進(jìn)行，反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)可做相應(yīng)調(diào)整。

注2：反應(yīng)體系可按各反應(yīng)組份終濃度配比按比例增加或減少。

8.4.1.2PCR反應(yīng)參數(shù)

PCR反應(yīng)參數(shù)見(jiàn)表2。

表2PCR反應(yīng)參數(shù)

步驟溫度時(shí)間循環(huán)數(shù)

預(yù)變性95℃3min1

變性98℃10s

退火50℃～60℃30s30

延伸72℃1min/kb

注：各引物退火溫度及擴(kuò)增條件參照附錄B可作相應(yīng)調(diào)整。

8.4.2RT-PCR

8.4.2.1RT-PCR反應(yīng)體系

RT-PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表3。反應(yīng)液的配制在冰浴上操作，每次反應(yīng)同時(shí)設(shè)計(jì)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空

白對(duì)照，其中陽(yáng)性對(duì)照以含有陽(yáng)性病毒的組織或培養(yǎng)物提取的核酸作為陽(yáng)性對(duì)照模板，其中陰性對(duì)照以

不含有陽(yáng)性病毒的樣本核酸（可以是正常動(dòng)物組織或正常培養(yǎng)物）作為陰性對(duì)照模板，空白對(duì)照即為不

加模板對(duì)照（NoTemplateControl，NTC），即在反應(yīng)中用水來(lái)代替模板。

6

DB44/T2336—2021

表3RT-PCR反應(yīng)體系配制表

反應(yīng)組份用量/μL終濃度

2×1StepBuffer101×

PrimeScript1StepEnzymeMix0.8

Forwardprimer（10μmol/L）0.80.4μmol/L～1μmol/L

Reverseprimer（10μmol/L）0.80.4μmol/L～1μmol/L

RNA模板2<1μg

PCR用水5.6

總體積20

注1：可使用其他類(lèi)似的一步法或兩步法RT-PCR試劑盒進(jìn)行，反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)可做

相應(yīng)調(diào)整。

注2：反應(yīng)體系可按各反應(yīng)組份終濃度配比按比例增加或減少。

8.4.2.2RT-PCR反應(yīng)參數(shù)

RT-PCR反應(yīng)參數(shù)見(jiàn)表4。

表4RT-PCR反應(yīng)參數(shù)

步驟溫度時(shí)間循環(huán)數(shù)

逆轉(zhuǎn)錄50℃30min1

預(yù)變性94℃2min1

變性94℃30s

退火55℃～65℃30s30

延伸72℃1min/kb

延伸72℃10min1

注：各引物退火溫度及擴(kuò)增條件參照附錄B可作相應(yīng)調(diào)整。

8.4.3巢式PCR

8.4.3.1巢式PCR反應(yīng)體系

當(dāng)待檢樣本中所含病原核酸豐度較低時(shí)，可選用巢式PCR反應(yīng)。巢式PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表5。反應(yīng)液的

配制在冰上操作，其中陽(yáng)性對(duì)照以含有陽(yáng)性病毒的組織或培養(yǎng)物提取的核酸作為陽(yáng)性對(duì)照模板，其中陰

性對(duì)照以不含有陽(yáng)性病毒的樣本核酸（可以是正常動(dòng)物組織或正常培養(yǎng)物）作為陰性對(duì)照模板，空白對(duì)

照即為不加模板對(duì)照（NoTemplateControl，NTC），即在反應(yīng)中用水來(lái)代替模板。

7

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表5巢式PCR反應(yīng)體系配制表

步驟反應(yīng)組分用量/μL終濃度

2×PremixTaqMix10

PCR用水6.41×

第

一Forwardprimer1（10μmol/L）0.8

輪

PCRReverseprimer1（10μmol/L）0.80.4μmol/L

cDNA模板/DNA模板20.4μmol/L

總體積20

2×PremixTaqMix（Loadingdyemix）10

PCR用水7.51×

第

二Forwardprimer2（10μmol/L）0.8

輪

PCRReverseprimer2（10μmol/L）0.80.4μmol/L

第一輪PCR產(chǎn)物10.4μmol/L

總體積20

注1：可使用其他類(lèi)似的一步法或兩步法RT-PCR試劑盒進(jìn)行，反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)可

做相應(yīng)調(diào)整。

注2：反應(yīng)體系可按各反應(yīng)組份終濃度配比按比例增加或減少。

8.4.3.2巢式PCR反應(yīng)參數(shù)

巢式PCR反應(yīng)參數(shù)見(jiàn)表6。

表6巢式PCR反應(yīng)參數(shù)

步驟溫度時(shí)間循環(huán)數(shù)

94℃3min1

第

一98℃10s

輪

PCR50℃～60℃30s20

72℃1min/kb

94℃3min1

第

二95℃30s

輪

PCR50℃～60℃30s30

72℃1min/kb

注：各引物退火溫度及擴(kuò)增條件參照附錄B可作相應(yīng)調(diào)整。

8.4.4PCR產(chǎn)物電泳分析

將適量50×TAE稀釋成1×TAE溶液，配制含核酸染料溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠。PCR反應(yīng)結(jié)束后，

取10μLPCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，以DNA分子量作參照。電壓大小根據(jù)電泳槽長(zhǎng)度來(lái)確定，

一般控制在3V/cm～5V/cm，當(dāng)上樣染料移動(dòng)到凝膠邊緣時(shí)關(guān)閉電源。電泳完成后在凝膠成像系統(tǒng)拍照

記錄電泳結(jié)果。

8

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實(shí)時(shí)熒光PCR方法

8.5.1實(shí)時(shí)熒光PCR

8.5.1.1實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系

實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表7。反應(yīng)液的配制在冰上操作，每次反應(yīng)同時(shí)設(shè)計(jì)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和

空白對(duì)照，其中陽(yáng)性對(duì)照以含有陽(yáng)性病毒的組織或細(xì)胞培養(yǎng)物提取的核酸作為陽(yáng)性對(duì)照模板，其中陰性

對(duì)照以不含有陽(yáng)性病毒的核酸樣本（可以是正常動(dòng)物組織或正常細(xì)胞培養(yǎng)物）作為陰性對(duì)照模板，空白

對(duì)照即為不加模板對(duì)照（NoTemplateControl，NTC），即在反應(yīng)中用水來(lái)代替模板。

表7實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系配制表

反應(yīng)組份用量/μL終濃度

2×PremixExTaqMix101×

ForwardPrimer（10μmol/L）0.40.2μmol/L～1μmol/L

ReversePrimer（10μmol/L）0.40.2μmol/L～1μmol/L

Probe（10μmol/L）0.80.4μmol/L～1μmol/L

Rox（50×）0.2/

DNA模板2≤100ng

PCR用水6.2/

總體積20/

注1：試劑Rox只在具有Rox熒光校正通道的實(shí)時(shí)熒光PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)添加，否則用水補(bǔ)齊。

注2：可使用其他類(lèi)似的實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒進(jìn)行，反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)可做相應(yīng)調(diào)整。

注3：反應(yīng)體系可按各反應(yīng)組份終濃度配比按比例增加或減少。

8.5.1.2實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)參數(shù)

實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表8，反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)收集的熒光曲線和Ct值判定結(jié)果。

表8實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)參數(shù)

步驟溫度時(shí)間采集熒光信號(hào)循環(huán)數(shù)

預(yù)變性95℃30s1

否

變性95℃5s

40

退火，延伸60℃34s是

8.5.2實(shí)時(shí)熒光RT-PCR

8.5.2.1實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)體系

實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表9。反應(yīng)液的配制在冰上操作，每次反應(yīng)同時(shí)設(shè)計(jì)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)

照和空白對(duì)照，其中陽(yáng)性對(duì)照以含有陽(yáng)性病毒的組織或細(xì)胞培養(yǎng)物提取的核酸作為陽(yáng)性對(duì)照模板，其中

陰性對(duì)照以不含有陽(yáng)性病毒的核酸樣本（可以是正常動(dòng)物組織或正常細(xì)胞培養(yǎng)物）作為陰性對(duì)照模板，

空白對(duì)照即為不加模板對(duì)照（NoTemplateControl，NTC），即在反應(yīng)中用水來(lái)代替模板。

9

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表9實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)體系配制表

反應(yīng)組份用量（μL）終濃度

2×OneStepRT-PCRBufferIII101×

PrimeScriptRTEnzymeMixII0.4/

ExTaqHS（5U/μL）0.4/

ForwardPrimer（10μmol/L）0.40.2μmol/L～1μmol/L

ReversePrimer（10μmol/L）0.40.2μmol/L～1μmol/L

Probe（10μmol/L）0.80.4μmol/L～1μmol/L

Rox（50×）0.4/

RNA模板210pg～100ng

PCR用水5.2/

總體積20/

注1：可使用其他類(lèi)似的一步法或兩步法實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試劑盒進(jìn)行，反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)可做

相應(yīng)調(diào)整。

注2：試劑Rox只在具有Rox熒光校正通道的實(shí)時(shí)熒光PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)添加，否則用水補(bǔ)齊。

注3：反應(yīng)體系可按各反應(yīng)組份終濃度配比按比例增加或減少。

8.5.2.2實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)參數(shù)

實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)參數(shù)見(jiàn)表10，反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)收集的熒光曲線和Ct值判定結(jié)果。

表10實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)參數(shù)

步驟溫度時(shí)間采集熒光信號(hào)循環(huán)數(shù)

逆轉(zhuǎn)錄42℃5min1

預(yù)變性95℃10s否1

變性95℃5s

40

退火，延伸60℃34s是

9結(jié)果

普通PCR/普通RT-PCR/巢式PCR

9.1.1質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

在陰性、陽(yáng)性對(duì)照及空白對(duì)照成立的條件下，即陽(yáng)性對(duì)照的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳分析可見(jiàn)到目的擴(kuò)增條

帶（條帶大小參見(jiàn)附錄B），陰性對(duì)照及空白對(duì)照的擴(kuò)增產(chǎn)物無(wú)任何條帶，可進(jìn)行結(jié)果判定。

10

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9.1.2結(jié)果判定

9.1.2.1樣本經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀上觀察到特定大小的目的擴(kuò)增條帶，判定為該病毒核

酸陽(yáng)性。

9.1.2.2樣本經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀上未觀察到特定大小的目的擴(kuò)增條帶，判定為該病毒

核酸陰性。

實(shí)時(shí)熒光PCR/實(shí)時(shí)熒光RT-PCR

9.2.1結(jié)果分析和條件設(shè)定

直接讀取儀器結(jié)果，基線和閾值設(shè)定原則根據(jù)儀器的噪聲情況進(jìn)行調(diào)整，以閾值線剛好超過(guò)正常陰

性樣本擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)。

9.2.2質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

9.2.2.1空白對(duì)照無(wú)Ct值，并且無(wú)熒光擴(kuò)增曲線，擴(kuò)增曲線為水平線或Ct值小于40。

9.2.2.2陰性對(duì)照無(wú)Ct值，并且無(wú)熒光擴(kuò)增曲線，擴(kuò)增曲線為水平線或Ct值小于40。

9.2.2.3各病毒陽(yáng)性對(duì)照Ct值≤35，并且有明顯的熒光擴(kuò)增曲線，則表明反應(yīng)體系運(yùn)行正常，否則此

次試驗(yàn)無(wú)效，需重新進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。

9.2.3結(jié)果判定

9.2.3.1若待檢樣本無(wú)熒光擴(kuò)增曲線，則判定該病毒核酸陰性。

9.2.3.2若待檢樣本有熒光擴(kuò)增曲線，且Ct值≤35時(shí)，則判斷該病毒核酸陽(yáng)性，其中漢坦病毒根據(jù)

探針和病毒的對(duì)應(yīng)關(guān)系鑒別診斷漢坦病毒的基因型。

9.2.3.3若待檢樣本Ct值介于35和40之間時(shí)，應(yīng)重新進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR。重新試驗(yàn)后，若Ct值≥

40時(shí)，則判定該病毒核酸陰性。重新試驗(yàn)后的Ct值仍介于35和40之間，則判定該病毒核酸可疑陽(yáng)

性，需進(jìn)一步進(jìn)行序列測(cè)定。

序列測(cè)定

必要時(shí)，可取待檢樣本擴(kuò)增出的陽(yáng)性PCR產(chǎn)物進(jìn)行核酸序列測(cè)定，序列結(jié)果與已公開(kāi)發(fā)表的特異性

片段序列進(jìn)行比對(duì)，序列同源性在99%以上，可確診待檢樣本某種病毒核酸陽(yáng)性，否則判定某種病毒核

酸陰性。

10防止交叉污染的措施

按照GB/T19495.2中的要求執(zhí)行。

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A

A

附錄A

（規(guī)范性）

溶液的配制

A.10.02mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液（PBS）的配制

A.1.1A液

0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液：稱(chēng)取磷酸二氫鈉（NaH2PO4?H20）27.6g，先加適量去離子水溶解，最

后定容至1000mL，混勻。

A.1.2B液

0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液：稱(chēng)取磷酸氫二鈉NaH2PO4·7H2O53.6g（或Na2HPO4·12H2O71.6g或

Na2HPO4·2H2O35.6g），先加適量去離子水溶解，最后定容至1000mL，混勻。

A.1.30.02mol/LpH7.2磷酸鹽緩沖液（PBS）的配制

取A液14mL，B液36mL，加氯化鈉（NaCl）8.5g，加800mL無(wú)離子水溶解稀釋?zhuān)肏Cl調(diào)pH至7.2，

最后定容至1000mL，經(jīng)121℃高壓滅菌15min，冷卻備用。

A.2無(wú)RNase去離子水的配制

實(shí)驗(yàn)用去離子水按體積比0.1%加入DEPC搖勻，室溫靜置過(guò)夜，121℃高壓滅菌15min，冷卻備用。

A.350×TAE電泳緩沖液

A.3.10.5mol/L乙二銨四乙酸二鈉（EDTA）溶液（pH8.0）

乙二銨四乙酸二鈉（EDTA-Na2-H2O）18.61g

滅菌去離子水80mL

5mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)pH至8.0

滅菌去離子加至100mL，121℃，15min滅菌備用。

A.3.250×TAE電泳緩沖液配制

三羥甲基氨基甲烷（Tris）242g

冰乙酸57.1mL

0.5mol/LEDTA溶液，pH8.0l00mL

滅菌去離子加至1000mL，121℃，15min滅菌備用。

用時(shí)用滅菌去離子水稀釋至lX使用。

A.4溴化乙錠（EB）溶液（10μg/μL）

溴化乙錠20mg

滅菌去離子水20mL

A.5含0.5μg/mL溴化乙錠的1.5%瓊脂糖凝膠的配制

瓊脂糖1.5g

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1×TAE電泳緩沖液加至l00mL

混合后加熱至完仝融化,待冷至50℃～55℃時(shí)，加溴化乙錠（EB）溶液5μL，輕輕晃動(dòng)搖勻，避

免產(chǎn)生氣泡，將梳子置人電泳槽中，然后將瓊脂糖溶液倒人電泳板上，凝膠適宜厚度為3mm～5

mm，需確認(rèn)在梳齒下或梳齒間沒(méi)有氣泡，待凝固后取下梳子備用。

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B

B

附錄B

（規(guī)范性）

引物及探針序列

針對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常見(jiàn)病毒性病原微生物核酸保守序列設(shè)計(jì)特異引物，進(jìn)行PCR或反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增；普通

PCR引物序列見(jiàn)表B.1，實(shí)時(shí)熒光PCR引物和探針序列見(jiàn)表B.2。

表B.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病毒普通PCR/普通RT-PCR引物

動(dòng)物產(chǎn)物大小退火溫度

病毒引物名稱(chēng)引物序列（5′→3′）

種類(lèi)（bp）（℃）

淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦ForwardprimerCGCACCGGGGATCCTAGGCT

膜炎病毒71255

ReverseprimerCCTGTCCAGCCCCAGCCAC

（LCMV）

漢坦病毒ForwardprimerAAAGTAGGTGITAYATCYTIACAATGTGG

46455

（HV）ReverseprimerGTACAICCTGTRCCIACCCC

漢坦病毒漢灘型ForwardprimerGAATCGATACTGTGGGCTGCAAGTGC

38355

（HTN）ReverseprimerGGATTAGAACCCCAGCTCGTCTC

漢坦病毒漢城型ForwardprimerGTGGACTCTTCTTCTCATTATT

41855

（SEO）ReverseprimerTGGGCAATCTGGGGGGTTGCATG

鼠痘病毒ForwardprimerTGACTGAATACGACGAC

33855

（ECT）ReverseprimerTGGATCTAATTGCGCATG

小鼠肝炎病毒/大ForwardprimerAATGGAACTTCTCGTTGGG

鼠冠狀病毒37555

ReverseprimerTAGTGGCTGTTAGTGTATGG

（MHV/RCV）

嚙齒類(lèi)

仙臺(tái)病毒ForwardprimerATGAAGGACAAAGCATTATCGCCTA

動(dòng)物18055

（SV）ReverseprimerCAACCAGTCTCCTGATTCCACGTA

小鼠肺炎病毒ForwardprimerAGATCACAGAGCCCGTCAAAAT

12260

（PVM）ReverseprimerGCATATAACATCCAATACGAGTTTGAA

呼腸孤病毒III型ForwardprimerTGCAAAGATGGGGAACGC

41155

（REO3）ReverseprimerTGGTGACACTGACAGCAC

小鼠細(xì)小病毒MVMForwardprimerGAGCGCCATCTAGTGAGC

48355

株（MVM）ReverseprimerATTTGCCTGTGCTGGCTG

小鼠細(xì)小病毒MPVForwardprimerGCAGCAATGATGTAACTGAAGCT