1GB/T32732—XXXX香莢蘭試驗(yàn)方法本文件規(guī)定了香莢蘭[Vanillafragrans(Salisbury)Ames]的兩種試驗(yàn)方法：a)香草醛、香草酸、4-羥基苯甲醛、4-羥基苯甲酸的高效液相色譜測(cè)定法；b)香草醛的紫外光譜測(cè)定法。本文件適用于香莢蘭(香莢蘭豆、切碎香莢蘭和香莢蘭粉)的質(zhì)量評(píng)定及其貿(mào)易。本文件不適用于香莢蘭提取物。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T12806實(shí)驗(yàn)室玻璃儀器單標(biāo)線容量瓶(GB/T12806-2011，ISO1042：1998，NEQ)GB/T22268香莢蘭詞匯（ISO3493:2014)3術(shù)語和定義GB/T22268界定的術(shù)語和定義適用于本文件。4香草醛、香草酸、4-羥基苯甲醛、4-羥基苯甲酸的高效液相色譜測(cè)定法4.1原理將試樣萃取后稀釋（若需要），用高效液相色譜法（HPLC）分離，內(nèi)標(biāo)法、紫外光譜檢測(cè)器測(cè)定。4.2試劑、工作溶液、內(nèi)標(biāo)溶液4.2.1試劑除非特別標(biāo)注，所需試劑純度均為分析純。使用蒸餾水、去離子水或純度相當(dāng)?shù)乃?。所需試劑如下：a)乙醇：98%（V/V）；b)甲醇：色譜純；c)稀磷酸：c（H3PO4）=0.01mol/L；d)流動(dòng)相（作為參導(dǎo)）：將75份稀磷酸與25份甲醇混合，膜過濾后，脫氣；e)參比物質(zhì)（純度≥99%）：.香草醛（4-羥基-3-甲氧基苯甲醛）；.香草酸（4-羥基-3-甲氧基苯甲酸）；.4-羥基苯甲醛；.4-羥基苯甲酸。GB/T32732—XXXX2f)內(nèi)標(biāo)物：水楊酸，純度≥99%；g)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：溶于流動(dòng)相。.香草醛儲(chǔ)備液：濃度1g/L,稱量精確至0.001g；.香草酸儲(chǔ)備液：濃度0.1g/L,稱量精確至0.001g；.4-羥基苯甲醛儲(chǔ)備液：濃度0.1g/L,稱量精確至0.001g。..4-羥基苯甲酸儲(chǔ)備液：濃度0.1g/L,稱量精確至0.001g。4.2.2工作溶液將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋得到工作溶液，工作溶液可在溫度4℃、避光下儲(chǔ)存數(shù)天，具體濃度如下：a)香草醛工作液：濃度0.1g/L。b)香草酸工作液：濃度0.008g/L。c)4-羥基苯甲醛工作液：濃度0.008g/L。d)4-羥基苯甲酸工作液：濃度0.002g/L。4.2.3內(nèi)標(biāo)溶液將水楊酸溶于流動(dòng)相中，使其濃度達(dá)到0.6g/L，稱量精確至0.001g。注：濃度應(yīng)接近樣品中的濃度。4.3儀器常用實(shí)驗(yàn)室儀器，其它儀器如下：a)氣密研磨；b)單刻線容量瓶：100mL、200mL、250mL（符合GB/T12806的要求）；c)多孔濾膜：0.45μm；d)連續(xù)提取裝置：索氏提取器（由如下部分組成）。.索氏提取器：125mL；.冷凝器；.燒瓶：250mL（帶磨口）；.濾紙筒；.熱源：電加熱套或油?。◣Э勺冸娮杌蚱渌鼰嵴{(diào)節(jié)裝置及線路延時(shí)開關(guān)）。e)高效液相色譜儀（配置如下）：.光譜檢測(cè)器：可測(cè)波長254nm；.進(jìn)樣裝置：10μL至100μL；.色譜柱：C18鍵合硅膠，粒度5μm～10μm。a)注射器：適合高效液相色譜使用。b)分析天平：精度0.001g。4.4試樣準(zhǔn)備4.4.1香莢蘭豆、切碎香莢蘭和混合香莢蘭將樣品磨碎、混合均勻。GB/T32732—XXXX34.4.2香莢蘭粉將樣品充分混勻。4.5稱樣稱取20g制備好的樣品放入濾紙筒密封好，精確至0.001g。4.6提取用200mL乙醇，在提取裝置中連續(xù)提取試樣16h，即溶劑回流25次至30次。香草豆莢或香草粉的試樣量應(yīng)使每升提取溶劑，在100g香莢蘭豆莢中能得到最大的提取物濃度。將提取物移入250mL容量瓶中，用少量乙醇將燒瓶洗滌數(shù)次，并將洗滌液合并到容量瓶中。用乙醇稀至刻度，這樣得到已知稀釋度的溶液。用流動(dòng)相將該溶液稀釋10倍。4.7方法4.7.1色譜操作條件室溫下按4.3中高效液相色譜儀配置進(jìn)行，用流速約1mL/min的流動(dòng)相進(jìn)行分析。4.7.2校正4.7.2.1將參比物質(zhì)和內(nèi)標(biāo)物分別進(jìn)樣，混合后進(jìn)樣；用合適的操作條件使所有化合物的餾出因子大4.7.2.2將4.6制備好的樣品經(jīng)膜過濾后進(jìn)樣，內(nèi)標(biāo)物不得干擾樣品中的其它組分。4.7.2.3將10mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液與10mL內(nèi)標(biāo)溶液混合，膜過濾后進(jìn)樣。響應(yīng)系數(shù)（Ki）由式（1）得到：式中：Ki——被測(cè)組分i的響應(yīng)系數(shù)；mi——進(jìn)樣溶液中組分i的質(zhì)量；ms——進(jìn)樣溶液中內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量；hi——被測(cè)組分i的色譜峰面積；hs——內(nèi)標(biāo)的色譜峰面積。4.7.3測(cè)定將10mL按4.6制備的溶液與10mL內(nèi)標(biāo)溶液混合，經(jīng)膜過濾后進(jìn)樣。用式（2）計(jì)算被測(cè)物濃度：式中：Ki——被測(cè)組分i的響應(yīng)系數(shù)；mi——進(jìn)樣溶液中組分i的質(zhì)量；ms——進(jìn)樣溶液中內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量；GB/T32732—XXXX4hi——被測(cè)組分i的色譜峰面積；hs——內(nèi)標(biāo)的色譜峰面積。5香草醛含量的紫外光譜測(cè)定法5.1原理用乙醇萃取試樣得到香草醛，然后用紫外光譜法測(cè)定。5.2試劑僅使用分析純?cè)噭?、蒸餾水去離子水或純度相當(dāng)?shù)乃?。所需試劑如下：a)乙醇：96%（V/V），適用于紫外光譜測(cè)定。b)氫氧化鈉溶液：c（NaOH）≈1mol/L。c)香草醛（4-羥基-3-甲氧基苯甲醛）。5.3儀器除常用實(shí)驗(yàn)室儀器，其它儀器如下：a)氣密研磨機(jī)；b)單刻線容量瓶：100mL、200mL、250mL，符合GB/T12806要求；c)移液管：10mL、20mL和25mL；d)干燥器：內(nèi)有干燥劑；e)提取裝置：同4.3索氏提取器；f)光譜儀；g)石英比色池：1cm光程（可選）；h)稱量瓶：25mL，帶氣密蓋子；i)注射器：適用于高效液相色譜測(cè)定；j)分析天平：精度0.001g。5.4方法5.4.1香草醛特征吸收的測(cè)定5.4.1.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備用稱量瓶稱取約30mg預(yù)先在干燥器中干燥的香草醛（精確至0.001g然后用約200mL乙醇將其溶解，定量移入250mL容量瓶中，用乙醇洗稱量瓶數(shù)次，將洗滌液并入容量瓶中，最后用乙醇稀至刻度，混合均勻（溶液A1）。吸取25mL溶液A1至100mL容量瓶中，用乙醇稀至刻度，混合均勻（溶液B1）。吸取10mL溶液B1至100mL容量瓶中，加約60mL乙醇和2mL氫氧化鈉溶液，用乙醇稀至刻度，混合均勻5.4.1.2參比溶液的制備吸取2mL氫氧化鈉溶液，放入100mL容量瓶中，用乙醇稀至刻度，混合均勻。GB/T32732—XXXX55.4.1.3測(cè)定用光譜儀和比色池，在波長為250納米至420納米范圍內(nèi)，記錄溶液C1相對(duì)于參比溶液的紫外吸收光譜。5.4.1.4計(jì)算最大吸收位于350μm±3μm處，其吸收值在0.2~0.8之間。觀察最大吸收（Amax）以及在最大吸收波長處的基線吸收（Abase）。用式(3)計(jì)算特征波長吸收（E1%）式中：m——用于制備標(biāo)準(zhǔn)溶液的香草醛質(zhì)量，單位為毫克（mg）。5.4.2試樣的制備5.4.2.1香莢蘭豆莢、切碎香莢蘭和混合香莢蘭將樣品研磨后混合均勻。5.4.2.2香莢蘭粉將樣品混合均勻。5.4.3稱樣稱取20g制備好的樣品放入濾紙筒密封好，精確至0.001g。5.4.4提取用提取設(shè)備、約200mL乙醇提取試樣16h，即溶劑回流25至30次。將提取物轉(zhuǎn)移至250mL容量瓶中，用少量乙醇洗燒瓶數(shù)次，將洗滌液并入容量瓶中。用乙醇稀至刻度，并混合均勻（溶液A2）。5.4.5參比溶液的制備吸取2mL氫氧化鈉溶液放入100mL容量瓶中，用乙醇稀至刻度，混合均勻。5.4.6標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定吸取25mL溶液A2至100mL容量瓶中，用乙醇稀至刻度并混合均勻（溶液B2）。吸取20mL溶液B2至100mL容量瓶中，用乙醇稀至刻度并混合均勻（溶液C2）。吸取10mL溶液C2至100mL容量瓶中，加60mL乙醇和2mL氫氧化鈉溶液，用乙醇稀至刻度并混合均勻（溶用分光光度計(jì)和比色池，在250nm~420nm范圍，記錄溶液D2相對(duì)于參比溶液的吸收光譜。4.3.4.7結(jié)果表示GB/T32732—XXXX6香草醛含量（Wv），以樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示如式(4)：式中：Amax——最大吸收；Abase——最大吸收波長處的基線吸收；E1%——香草醛的特征吸收；m—