二氫卟吩e6聲動(dòng)力：乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231生長(zhǎng)的新調(diào)控路徑一、引言1.1研究背景與意義乳腺癌作為全球女性中發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著女性的身心健康。據(jù)2024年上半年國(guó)家癌癥中心最新發(fā)布的中國(guó)惡性腫瘤疾病負(fù)擔(dān)情況，2022年我國(guó)乳腺癌新發(fā)病例為35.72萬(wàn)人，每10萬(wàn)人中發(fā)病51.17例，死亡率為每10萬(wàn)人中死亡10.86人。中國(guó)乳腺癌患者的平均發(fā)病年齡為45-55歲，具有發(fā)病年齡早、就診病期晚的特點(diǎn)，且近些年發(fā)病呈年輕化趨勢(shì)，小于40歲乳腺癌患者占所有乳腺癌患者的14.9%，小于35歲者占6.5%。乳腺癌的疾病分型多樣，其中三陰性乳腺癌因雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和人表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER2）表達(dá)均為陰性，對(duì)內(nèi)分泌療法或HER2靶向治療基本無(wú)效，化療效果也有限，患者預(yù)后極差，5年生存率僅為11%，被稱(chēng)為“乳腺癌之王”，約占所有乳腺癌類(lèi)型的10%-20.8%。三陰性乳腺癌具有高侵襲性、高復(fù)發(fā)率的特征，是乳腺癌治療中最難攻克的難題之一，亟需探索新的精準(zhǔn)治療方案。目前，乳腺癌的主要治療手段包括手術(shù)、化療、放療、內(nèi)分泌治療和靶向治療等。手術(shù)治療對(duì)于早期乳腺癌患者有較好的效果，但對(duì)于中晚期患者，術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)較高?；熾m然能夠殺死癌細(xì)胞，但在治療過(guò)程中會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成損傷，產(chǎn)生一系列嚴(yán)重的副作用，如脫發(fā)、惡心、嘔吐、免疫力下降等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。放療則存在對(duì)周?chē)＝M織的輻射損傷風(fēng)險(xiǎn)，且對(duì)于深部腫瘤的治療效果有限。內(nèi)分泌治療和靶向治療僅適用于特定類(lèi)型的乳腺癌患者，存在治療局限性。因此，開(kāi)發(fā)一種高效、低毒、精準(zhǔn)的新型乳腺癌治療方法具有重要的臨床意義和迫切需求。聲動(dòng)力療法（SonodynamicTherapy，SDT）作為一種新興的腫瘤治療方法，近年來(lái)受到了廣泛關(guān)注。其原理是利用超聲波的非侵入性、超強(qiáng)組織滲透能力，激發(fā)聲敏劑產(chǎn)生單線態(tài)氧等活性氧自由基，從腫瘤細(xì)胞奪取電子破壞腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞器，造成腫瘤細(xì)胞的死亡，從而達(dá)到準(zhǔn)確、徹底殺滅腫瘤而不損傷正常細(xì)胞的治療目的。與傳統(tǒng)治療方法相比，聲動(dòng)力療法具有諸多優(yōu)勢(shì)。首先，超聲波具有良好的組織穿透性，能夠到達(dá)深部腫瘤組織，克服了光動(dòng)力療法中光穿透深度有限的問(wèn)題，適用于各種部位的腫瘤治療。其次，聲動(dòng)力療法具有較高的靶向性，聲敏劑能夠特異性地富集在腫瘤組織中，在超聲波的作用下產(chǎn)生局部治療效果，對(duì)周?chē)＝M織的損傷較小。再者，該療法副作用小，患者治療后無(wú)需避光，可隨時(shí)重復(fù)治療，且能有效防止惡性腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移。目前，聲動(dòng)力療法在肝癌、肺癌、乳腺癌等多種癌癥的治療研究中均展現(xiàn)出一定的潛力。二氫卟吩e6（Chlorine6，Ce6）是一種極具潛力的聲敏劑。它具有663nm的吸收波長(zhǎng)，能夠在超聲作用下產(chǎn)生更多的活性氧簇（ROS），且本身無(wú)毒、具有腫瘤組織高選擇性及非腫瘤組織清除率高的特點(diǎn)，對(duì)皮膚的副反應(yīng)也較小。然而，二氫卟吩e6水溶性差，這在一定程度上限制了其在臨床的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用。盡管如此，通過(guò)納米載體輔助遞送等技術(shù)手段，可以改善其水溶性和藥代動(dòng)力學(xué)特性，使其更好地發(fā)揮聲動(dòng)力治療作用。探究二氫卟吩e6聲動(dòng)力對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231生長(zhǎng)的作用具有多方面的重要意義。從理論研究角度來(lái)看，深入研究二氫卟吩e6聲動(dòng)力作用于乳腺癌細(xì)胞的機(jī)制，有助于揭示聲動(dòng)力療法治療乳腺癌的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，豐富腫瘤治療的理論體系，為進(jìn)一步優(yōu)化聲動(dòng)力治療方案提供科學(xué)依據(jù)。從臨床應(yīng)用角度出發(fā)，若能證實(shí)二氫卟吩e6聲動(dòng)力對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)具有顯著抑制作用，將為乳腺癌的治療提供一種全新的、有效的治療策略。這不僅可以為乳腺癌患者，尤其是對(duì)傳統(tǒng)治療方法效果不佳的患者，如三陰性乳腺癌患者，提供新的治療選擇，有望提高患者的生存率和生活質(zhì)量，還可能推動(dòng)聲動(dòng)力療法在乳腺癌臨床治療中的廣泛應(yīng)用，具有重要的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。1.2研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探究二氫卟吩e6聲動(dòng)力對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231生長(zhǎng)的作用，為乳腺癌的治療提供新的理論依據(jù)和治療策略。具體研究目的和內(nèi)容如下：研究目的：明確二氫卟吩e6聲動(dòng)力對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231生長(zhǎng)的影響，包括細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲能力的變化；揭示二氫卟吩e6聲動(dòng)力影響MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)的作用機(jī)制，從細(xì)胞周期、信號(hào)通路、基因表達(dá)等層面進(jìn)行深入剖析；評(píng)估二氫卟吩e6聲動(dòng)力聯(lián)合阿霉素對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)的協(xié)同抑制效果，探究聯(lián)合治療的增敏機(jī)制，為臨床聯(lián)合用藥提供理論支持。研究?jī)?nèi)容：通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，運(yùn)用CCK-8法、EdU染色法等檢測(cè)不同濃度二氫卟吩e6及不同超聲輻照參數(shù)下，聲動(dòng)力對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖能力的影響；利用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡率，采用Hoechst33342染色觀察細(xì)胞核形態(tài)變化，研究聲動(dòng)力誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的情況；借助Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕愈合實(shí)驗(yàn)，測(cè)定細(xì)胞的遷移和侵襲能力，明確聲動(dòng)力對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的作用。在細(xì)胞周期研究方面，使用PI染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布，分析聲動(dòng)力對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程的阻滯作用；采用蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）技術(shù)檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路蛋白的表達(dá)水平，如PI3K/Akt、MAPK等通路，探索聲動(dòng)力作用的分子信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制；運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)與細(xì)胞增殖、凋亡、遷移等相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平，從基因?qū)用骊U述聲動(dòng)力的作用機(jī)制。進(jìn)行聯(lián)合治療實(shí)驗(yàn)，設(shè)置不同濃度的二氫卟吩e6聲動(dòng)力與阿霉素單獨(dú)及聯(lián)合處理MDA-MB-231細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組，通過(guò)CCK-8法等檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率，計(jì)算聯(lián)合指數(shù)（CI）評(píng)估聯(lián)合治療效果；利用WesternBlot、qRT-PCR等技術(shù)，檢測(cè)聯(lián)合治療對(duì)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白和基因表達(dá)的影響，深入探究聯(lián)合治療的增敏機(jī)制。1.3研究方法與創(chuàng)新點(diǎn)在研究二氫卟吩e6聲動(dòng)力對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231生長(zhǎng)的作用時(shí)，本研究采用了多種科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)难芯糠椒ǎ源_保研究結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。在細(xì)胞增殖能力檢測(cè)方面，運(yùn)用MTT比色法。該方法基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能將外源性的MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞內(nèi)，而死細(xì)胞無(wú)此功能的原理，通過(guò)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在特定波長(zhǎng)下測(cè)定光吸收值，從而間接反映活細(xì)胞的數(shù)量，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。通過(guò)設(shè)置不同濃度的二氫卟吩e6和不同超聲輻照時(shí)間的實(shí)驗(yàn)組，能夠精確地檢測(cè)出聲動(dòng)力處理后細(xì)胞增殖能力的變化。利用熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化。在聲動(dòng)力處理前后，通過(guò)熒光倒置顯微鏡可以直觀地觀察到MDA-MB-231細(xì)胞的形態(tài)改變，如細(xì)胞的皺縮、凋亡小體的出現(xiàn)等，為研究細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)提供直觀的形態(tài)學(xué)依據(jù)。借助流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期。采用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)，可以準(zhǔn)確地檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，區(qū)分早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞。使用PI染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)能夠精確地測(cè)定細(xì)胞周期分布，分析聲動(dòng)力對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程的阻滯作用，明確細(xì)胞處于G0/G1期、S期還是G2/M期的比例變化。為探究聲動(dòng)力作用的分子機(jī)制，本研究采用蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）技術(shù)檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路蛋白的表達(dá)水平，如PI3K/Akt、MAPK等通路蛋白。通過(guò)對(duì)比聲動(dòng)力處理組和對(duì)照組細(xì)胞中這些蛋白的表達(dá)差異，深入了解聲動(dòng)力作用的分子信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)與細(xì)胞增殖、凋亡、遷移等相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平，從基因?qū)用骊U述聲動(dòng)力對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231生長(zhǎng)的作用機(jī)制。本研究在聲動(dòng)力療法機(jī)制研究方面具有創(chuàng)新之處。以往的研究大多集中在聲動(dòng)力療法對(duì)腫瘤細(xì)胞的直接殺傷作用，而本研究不僅關(guān)注細(xì)胞水平的變化，還深入到分子機(jī)制層面，從信號(hào)通路和基因表達(dá)等多維度探究二氫卟吩e6聲動(dòng)力對(duì)乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，為聲動(dòng)力療法的作用機(jī)制提供了更全面、深入的理論依據(jù)。在聯(lián)合治療方案探索方面，本研究創(chuàng)新性地將二氫卟吩e6聲動(dòng)力與阿霉素聯(lián)合應(yīng)用于乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的治療研究。通過(guò)計(jì)算聯(lián)合指數(shù)（CI）等方法，系統(tǒng)地評(píng)估聯(lián)合治療對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的協(xié)同抑制效果，并深入探究聯(lián)合治療的增敏機(jī)制，為臨床聯(lián)合用藥提供了新的思路和理論支持。二、乳腺癌與聲動(dòng)力療法概述2.1乳腺癌的現(xiàn)狀與挑戰(zhàn)乳腺癌是一種嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤，其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)。據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥數(shù)據(jù)顯示，乳腺癌已超越肺癌成為全球最常見(jiàn)的癌癥，新發(fā)病例達(dá)226萬(wàn)例，占所有癌癥新發(fā)病例的11.7%。在中國(guó)，乳腺癌同樣是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，且發(fā)病年齡呈現(xiàn)年輕化趨勢(shì)。國(guó)家癌癥中心最新數(shù)據(jù)表明，2022年我國(guó)乳腺癌新發(fā)病例為35.72萬(wàn)人，每10萬(wàn)人中發(fā)病51.17例，死亡率為每10萬(wàn)人中死亡10.86人。乳腺癌的死亡率在女性癌癥相關(guān)死亡中也占據(jù)較高比例。盡管隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷進(jìn)步，乳腺癌的早期診斷和治療水平有所提高，但晚期乳腺癌患者的預(yù)后仍然不容樂(lè)觀。晚期乳腺癌患者往往面臨著腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等問(wèn)題，5年生存率較低。例如，轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者的5年生存率僅為20%左右。這主要是因?yàn)橥砥谌橄侔┑闹委熓侄斡邢蓿夷[瘤細(xì)胞對(duì)傳統(tǒng)治療方法容易產(chǎn)生耐藥性。目前，乳腺癌的治療手段主要包括手術(shù)、化療、放療、內(nèi)分泌治療和靶向治療等。手術(shù)治療適用于早期乳腺癌患者，通過(guò)切除腫瘤組織來(lái)達(dá)到治療目的。然而，對(duì)于中晚期患者，手術(shù)治療的效果往往不理想，且術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)較高。化療是使用化學(xué)藥物來(lái)殺死癌細(xì)胞，但化療藥物在殺死癌細(xì)胞的同時(shí)，也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成損傷，導(dǎo)致患者出現(xiàn)一系列嚴(yán)重的副作用，如脫發(fā)、惡心、嘔吐、免疫力下降等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。放療則是利用放射線來(lái)殺死癌細(xì)胞，但放療也存在對(duì)周?chē)＝M織的輻射損傷風(fēng)險(xiǎn)，且對(duì)于深部腫瘤的治療效果有限。內(nèi)分泌治療主要針對(duì)雌激素受體陽(yáng)性的乳腺癌患者，通過(guò)抑制雌激素的作用來(lái)阻止癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，但該方法僅適用于特定類(lèi)型的患者。靶向治療則是針對(duì)腫瘤細(xì)胞的特定靶點(diǎn)進(jìn)行治療，具有較高的特異性和療效，但同樣存在適用范圍有限的問(wèn)題。在晚期乳腺癌的治療中，還面臨著許多困境。一方面，腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性使得不同患者對(duì)治療的反應(yīng)存在差異，難以制定統(tǒng)一有效的治療方案。另一方面，腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)使得治療難度大大增加，傳統(tǒng)治療方法往往難以控制病情的進(jìn)展。此外，長(zhǎng)期使用化療藥物還會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，進(jìn)一步降低治療效果。因此，尋找一種新的、有效的治療方法來(lái)改善乳腺癌患者，尤其是晚期患者的預(yù)后，成為當(dāng)前乳腺癌研究領(lǐng)域的迫切需求。2.2聲動(dòng)力療法（SDT）原理與進(jìn)展聲動(dòng)力療法（SonodynamicTherapy，SDT）作為一種新興的腫瘤治療手段，近年來(lái)在癌癥治療領(lǐng)域展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和潛力，其原理基于超聲波與聲敏劑的協(xié)同作用。超聲波作為一種機(jī)械波，具有良好的組織穿透性，能夠在生物組織中傳播并與組織相互作用。當(dāng)超聲波在組織中傳播時(shí)，會(huì)產(chǎn)生多種效應(yīng)，其中熱效應(yīng)是由于超聲波的機(jī)械能轉(zhuǎn)化為熱能，使組織溫度升高；空化效應(yīng)則是在超聲波的作用下，組織中的微小氣泡迅速膨脹和收縮，甚至破裂，產(chǎn)生局部的高溫、高壓以及微射流等極端物理?xiàng)l件。這些效應(yīng)為聲動(dòng)力治療提供了重要的物理基礎(chǔ)。聲敏劑是聲動(dòng)力療法的關(guān)鍵組成部分，它能夠在超聲波的激發(fā)下發(fā)生一系列化學(xué)反應(yīng)。目前常用的聲敏劑主要包括卟啉類(lèi)及其衍生物、氧雜蒽類(lèi)、吩噻嗪類(lèi)化合物等。其中，卟啉類(lèi)聲敏劑因其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)和光學(xué)性質(zhì)，在聲動(dòng)力治療中應(yīng)用較為廣泛。以二氫卟吩e6為例，它屬于卟啉類(lèi)衍生物，具有較高的單線態(tài)氧產(chǎn)生效率。在超聲波的輻照下，聲敏劑分子吸收超聲能量，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)。處于激發(fā)態(tài)的聲敏劑分子不穩(wěn)定，會(huì)通過(guò)系間竄越等過(guò)程將能量傳遞給周?chē)难醴肿?，使其從基態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)閱尉€態(tài)氧。單線態(tài)氧是一種強(qiáng)氧化劑，具有極高的反應(yīng)活性，能夠與腫瘤細(xì)胞內(nèi)的多種生物分子，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸等發(fā)生氧化反應(yīng)，破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。這一過(guò)程主要通過(guò)聲化學(xué)效應(yīng)實(shí)現(xiàn)，聲敏劑參與下的聲化學(xué)過(guò)程在SDT過(guò)程中起重要作用。與傳統(tǒng)的腫瘤治療方法相比，聲動(dòng)力療法具有諸多顯著優(yōu)勢(shì)。首先，超聲波的穿透性強(qiáng)，能夠到達(dá)人體深部組織，這使得聲動(dòng)力療法適用于各種部位的腫瘤治療，尤其是深部腫瘤，克服了光動(dòng)力療法中光穿透深度有限的局限性。其次，聲動(dòng)力療法具有較高的靶向性。聲敏劑能夠特異性地富集在腫瘤組織中，這主要是由于腫瘤組織具有高通透性和滯留效應(yīng)（EPR效應(yīng)）。腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙較大，且淋巴回流系統(tǒng)不完善，使得聲敏劑更容易在腫瘤組織中積聚。在超聲波的作用下，聲敏劑僅在腫瘤部位被激活產(chǎn)生治療效果，對(duì)周?chē)＝M織的損傷較小。再者，聲動(dòng)力療法副作用小。治療過(guò)程中，超聲波和非激活狀態(tài)下的聲敏劑對(duì)正常組織的影響較小，患者治療后無(wú)需避光，可隨時(shí)重復(fù)治療。此外，聲動(dòng)力療法還具有可有效防止惡性腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的優(yōu)勢(shì)，能夠從多個(gè)層面抑制腫瘤的發(fā)展。在癌癥治療應(yīng)用方面，聲動(dòng)力療法在多種癌癥的治療研究中都取得了一定進(jìn)展。在肝癌治療研究中，有研究將聲敏劑負(fù)載于納米載體上，通過(guò)超聲輻照實(shí)現(xiàn)對(duì)肝癌細(xì)胞的靶向殺傷，顯著抑制了腫瘤的生長(zhǎng)。在肺癌治療領(lǐng)域，聲動(dòng)力療法聯(lián)合其他治療手段，如化療、免疫治療等，展現(xiàn)出協(xié)同增效的作用，能夠提高肺癌患者的治療效果和生存率。對(duì)于乳腺癌的治療，聲動(dòng)力療法也顯示出巨大的潛力。一些研究表明，聲動(dòng)力治療可以誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，抑制細(xì)胞的增殖和遷移能力。此外，聲動(dòng)力療法還能夠調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，為乳腺癌的治療提供了新的思路和方法。隨著研究的不斷深入，聲動(dòng)力療法有望成為癌癥綜合治療中的重要組成部分，為癌癥患者帶來(lái)新的希望。2.3二氫卟吩e6作為聲敏劑的特性二氫卟吩e6（Chlorine6，Ce6）作為一種在聲動(dòng)力療法中具有重要應(yīng)用潛力的聲敏劑，展現(xiàn)出諸多獨(dú)特且有利于腫瘤治療的特性。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看，二氫卟吩e6屬于卟啉類(lèi)衍生物，其基本骨架由四個(gè)吡咯環(huán)通過(guò)次甲基橋連接而成，形成了一個(gè)大的共軛π電子體系。這種共軛結(jié)構(gòu)賦予了二氫卟吩e6獨(dú)特的光學(xué)和電子性質(zhì)，使其能夠有效地吸收特定波長(zhǎng)的能量，并在超聲激發(fā)下發(fā)生電子躍遷，進(jìn)而產(chǎn)生一系列化學(xué)反應(yīng)。在腫瘤特異性聚集方面，二氫卟吩e6表現(xiàn)出較高的特性。腫瘤組織具有高通透性和滯留效應(yīng)（EPR效應(yīng)），其血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙較大，且淋巴回流系統(tǒng)不完善。二氫卟吩e6能夠利用這一特性，通過(guò)被動(dòng)靶向的方式在腫瘤組織中特異性地富集。研究表明，當(dāng)二氫卟吩e6通過(guò)靜脈注射等方式進(jìn)入體內(nèi)后，它能夠更容易地穿透腫瘤血管壁，在腫瘤組織中積聚，而在正常組織中的分布相對(duì)較少。這種腫瘤特異性聚集的特性使得二氫卟吩e6在聲動(dòng)力治療中能夠更精準(zhǔn)地作用于腫瘤細(xì)胞，提高治療的靶向性，減少對(duì)正常組織的損傷。二氫卟吩e6還具有排泄快的優(yōu)點(diǎn)。在完成對(duì)腫瘤細(xì)胞的聲動(dòng)力治療作用后，二氫卟吩e6能夠較快地從體內(nèi)排出。這一特性降低了其在體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間殘留可能帶來(lái)的潛在毒性風(fēng)險(xiǎn)。它主要通過(guò)肝臟和腎臟等器官進(jìn)行代謝和排泄。在肝臟中，二氫卟吩e6會(huì)經(jīng)過(guò)一系列的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程，被轉(zhuǎn)化為更容易排泄的代謝產(chǎn)物，然后通過(guò)膽汁進(jìn)入腸道，最終隨糞便排出體外。部分二氫卟吩e6及其代謝產(chǎn)物也會(huì)通過(guò)腎臟過(guò)濾，隨尿液排出。排泄快的特點(diǎn)使得患者在接受聲動(dòng)力治療后，能夠更快地恢復(fù)正常生理狀態(tài)，減少了聲敏劑在體內(nèi)殘留對(duì)身體的不良影響。作為聲敏劑應(yīng)用于SDT中，二氫卟吩e6具有顯著的優(yōu)勢(shì)。它在超聲作用下具有較高的單線態(tài)氧產(chǎn)生效率。當(dāng)受到超聲輻照時(shí)，二氫卟吩e6分子吸收超聲能量，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)。處于激發(fā)態(tài)的二氫卟吩e6分子通過(guò)系間竄越等過(guò)程，將能量高效地傳遞給周?chē)难醴肿?，使其從基態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)閱尉€態(tài)氧。單線態(tài)氧是一種強(qiáng)氧化劑，具有極高的反應(yīng)活性，能夠與腫瘤細(xì)胞內(nèi)的多種生物分子，如脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸等發(fā)生氧化反應(yīng)，破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。與其他一些聲敏劑相比，二氫卟吩e6能夠在相同的超聲條件下產(chǎn)生更多的單線態(tài)氧，從而增強(qiáng)了聲動(dòng)力治療對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果。二氫卟吩e6本身無(wú)毒，這使得其在臨床應(yīng)用中具有較高的安全性。在未受到超聲激發(fā)時(shí)，二氫卟吩e6不會(huì)對(duì)正常細(xì)胞和組織產(chǎn)生明顯的毒性作用。只有在超聲的作用下，它才會(huì)被激活并發(fā)揮治療作用。其對(duì)皮膚的副反應(yīng)也較小。在光動(dòng)力治療中，一些光敏劑可能會(huì)導(dǎo)致皮膚對(duì)光敏感，患者在治療后需要長(zhǎng)時(shí)間避光，給生活帶來(lái)不便。而二氫卟吩e6作為聲敏劑用于聲動(dòng)力治療時(shí)，由于其主要是在超聲激發(fā)下發(fā)揮作用，對(duì)皮膚的光敏感性影響較小，患者治療后無(wú)需嚴(yán)格避光，提高了患者的生活質(zhì)量。這些特性使得二氫卟吩e6在乳腺癌治療中具有巨大的應(yīng)用潛力。乳腺癌是一種嚴(yán)重威脅女性健康的惡性腫瘤，傳統(tǒng)治療方法存在諸多局限性。二氫卟吩e6聲動(dòng)力療法可以利用其腫瘤特異性聚集的特性，精準(zhǔn)地作用于乳腺癌細(xì)胞，對(duì)腫瘤組織進(jìn)行靶向治療。其高單線態(tài)氧產(chǎn)生效率能夠有效地殺傷乳腺癌細(xì)胞，抑制腫瘤的生長(zhǎng)。排泄快和低毒副作用的特點(diǎn)則保證了治療的安全性，減少了對(duì)患者身體的負(fù)擔(dān)。對(duì)于一些對(duì)傳統(tǒng)治療方法耐藥或不適合傳統(tǒng)治療的乳腺癌患者，二氫卟吩e6聲動(dòng)力療法可能提供了一種新的有效的治療選擇，有望改善患者的預(yù)后，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。三、二氫卟吩e6聲動(dòng)力對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法實(shí)驗(yàn)所用的MDA-MB-231細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC），這是一種廣泛應(yīng)用于乳腺癌研究的細(xì)胞系，具有三陰性乳腺癌細(xì)胞的典型特征，如高侵襲性、雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和人表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER2）表達(dá)均為陰性等。正常人外周血單核細(xì)胞（PMNC）則取自健康志愿者，在獲取志愿者知情同意后，通過(guò)密度梯度離心法從外周血中分離得到。該細(xì)胞作為正常細(xì)胞對(duì)照，用于對(duì)比二氫卟吩e6聲動(dòng)力對(duì)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞生長(zhǎng)影響的差異。二氫卟吩e6（Chlorine6，Ce6）購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，其純度經(jīng)高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)大于98%。二氫卟吩e6作為本實(shí)驗(yàn)的聲敏劑，其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)和光學(xué)性質(zhì)使其在超聲激發(fā)下能夠產(chǎn)生單線態(tài)氧等活性氧物質(zhì)，從而發(fā)揮對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。實(shí)驗(yàn)前，將二氫卟吩e6用二甲基亞砜（DMSO）溶解配制成10mg/mL的母液，儲(chǔ)存于-20℃冰箱備用。使用時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需濃度，用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋至相應(yīng)濃度。超聲設(shè)備選用SonicsVCX130超聲細(xì)胞破碎儀，該設(shè)備能夠產(chǎn)生穩(wěn)定的超聲波，頻率范圍為20-25kHz，功率可在10-130W之間調(diào)節(jié)。在本實(shí)驗(yàn)中，設(shè)定超聲頻率為1.0MHz，通過(guò)調(diào)節(jié)超聲強(qiáng)度（0.5-2.0W/cm2）和輻照時(shí)間（60s）來(lái)研究不同超聲參數(shù)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。為檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，采用MTT比色法。MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽）是一種黃色的水溶性化合物，活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)TT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan），而死細(xì)胞無(wú)此功能。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。具體操作如下：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞和PMNC以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL細(xì)胞培養(yǎng)液，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。然后，分別加入不同濃度的二氫卟吩e6溶液，對(duì)照組加入等體積的細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，使聲敏劑充分進(jìn)入細(xì)胞。之后，將96孔板置于超聲細(xì)胞破碎儀的樣品池中，進(jìn)行超聲輻照處理。輻照結(jié)束后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4h。吸去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使甲瓚充分溶解。最后，使用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值）。在觀察細(xì)胞形態(tài)變化方面，采用熒光倒置顯微鏡。將MDA-MB-231細(xì)胞以每孔1×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)24h。后續(xù)處理同MTT比色法，即加入二氫卟吩e6孵育4h后進(jìn)行超聲輻照。輻照結(jié)束后，直接在熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并拍照記錄。正常的MDA-MB-231細(xì)胞在顯微鏡下呈梭形或多邊形，貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)完整，邊界清晰。而受到聲動(dòng)力作用后的細(xì)胞，可能會(huì)出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落、凋亡小體形成等形態(tài)變化，通過(guò)觀察這些變化可以直觀地了解聲動(dòng)力對(duì)細(xì)胞的損傷情況。3.2超聲與二氫卟吩e6單獨(dú)作用的影響為深入探究超聲與二氫卟吩e6單獨(dú)作用時(shí)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，本研究設(shè)置了不同頻率和強(qiáng)度的超聲實(shí)驗(yàn)組，以及不同濃度的二氫卟吩e6實(shí)驗(yàn)組，分別對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞和PMNC細(xì)胞進(jìn)行處理，并通過(guò)MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況。在超聲單獨(dú)作用的實(shí)驗(yàn)中，設(shè)定頻率為1.0MHz，強(qiáng)度分別為0.5W/cm2、1.0W/cm2、1.5W/cm2和2.0W/cm2，輻照時(shí)間均為60s。結(jié)果顯示，隨著超聲強(qiáng)度的增加，MDA-MB-231細(xì)胞和PMNC細(xì)胞的生長(zhǎng)均受到抑制，且呈強(qiáng)度依賴(lài)性。當(dāng)超聲強(qiáng)度為1.0-2.0W/cm2作用60s時(shí)，對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞和PMNC細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用明顯增強(qiáng)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，抑制50%PMNC細(xì)胞生長(zhǎng)的超聲強(qiáng)度為1.23W/cm2，而抑制50%MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)的超聲強(qiáng)度為1.25W/cm2。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），這表明在該實(shí)驗(yàn)條件下，相應(yīng)強(qiáng)度的超聲對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231和正常人體單核細(xì)胞PMNC的殺傷效應(yīng)相似。這可能是因?yàn)槌暤臋C(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)等對(duì)細(xì)胞的作用具有一定的普遍性，在相同的超聲參數(shù)下，對(duì)不同類(lèi)型的細(xì)胞產(chǎn)生了相近的影響。但需要注意的是，這并不意味著超聲對(duì)所有細(xì)胞的作用完全相同，細(xì)胞的生物學(xué)特性、代謝活性等因素可能會(huì)影響其對(duì)超聲的敏感性。在二氫卟吩e6單獨(dú)作用的實(shí)驗(yàn)中，設(shè)置濃度梯度為0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml、1.6mg/ml。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，0.1-1.6mg/ml的二氫卟吩e6呈濃度依賴(lài)性抑制MDA-MB-231細(xì)胞和PMNC細(xì)胞生長(zhǎng)。通過(guò)計(jì)算IC50值（半數(shù)抑制濃度）發(fā)現(xiàn)，抑制MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)的IC50值為0.38mg/ml，而抑制PMNC細(xì)胞生長(zhǎng)的IC50值為0.77mg/ml。兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這充分表明MDA-MB-231細(xì)胞對(duì)二氫卟吩e6的作用更為敏感。這可能與MDA-MB-231細(xì)胞的代謝活性、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制等因素有關(guān)。乳腺癌細(xì)胞通常具有較高的代謝活性，可能會(huì)攝取更多的二氫卟吩e6，從而使其在細(xì)胞內(nèi)積累達(dá)到更高的濃度，增強(qiáng)了對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。細(xì)胞膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)差異也可能影響二氫卟吩e6進(jìn)入細(xì)胞的效率，進(jìn)而導(dǎo)致不同細(xì)胞對(duì)其敏感性的差異。為更直觀地展示超聲與二氫卟吩e6單獨(dú)作用的影響，將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)繪制成圖表（如圖1所示）。從圖中可以清晰地看出，超聲強(qiáng)度與細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率之間呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，隨著超聲強(qiáng)度的增加，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率逐漸升高。二氫卟吩e6濃度與細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率同樣呈正相關(guān)，濃度越高，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用越強(qiáng)。且在相同的抑制水平下，MDA-MB-231細(xì)胞所需的二氫卟吩e6濃度低于PMNC細(xì)胞，進(jìn)一步驗(yàn)證了MDA-MB-231細(xì)胞對(duì)二氫卟吩e6的敏感性更高。綜上所述，不同頻率和強(qiáng)度的超聲以及不同濃度的二氫卟吩e6對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞和PMNC細(xì)胞生長(zhǎng)均有抑制作用。超聲對(duì)兩種細(xì)胞的殺傷效應(yīng)相似，而MDA-MB-231細(xì)胞對(duì)二氫卟吩e6的作用更為敏感。這些結(jié)果為后續(xù)研究超聲聯(lián)合二氫卟吩e6的聲動(dòng)力治療效果提供了重要的基礎(chǔ)，有助于深入理解聲動(dòng)力療法中各因素對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響機(jī)制。3.3超聲聯(lián)合二氫卟吩e6的協(xié)同作用在明確了超聲與二氫卟吩e6單獨(dú)作用對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響后，本研究進(jìn)一步深入探究了超聲聯(lián)合二氫卟吩e6對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)的協(xié)同作用。將MDA-MB-231細(xì)胞和PMNC細(xì)胞分別分為對(duì)照組、超聲單獨(dú)作用組、二氫卟吩e6單獨(dú)作用組以及超聲聯(lián)合二氫卟吩e6作用組。在超聲聯(lián)合二氫卟吩e6作用組中，設(shè)定超聲頻率為1.0MHz，強(qiáng)度為0.5W/cm2，輻照時(shí)間60s，二氫卟吩e6濃度分別為0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，0.5W/cm2×60s×1.0MHz超聲和0.05mg/ml-0.2mg/ml二氫卟吩e6單獨(dú)作用時(shí)，對(duì)PMNC細(xì)胞生長(zhǎng)均無(wú)明顯抑制作用。超聲組經(jīng)Welch檢驗(yàn)得到F=141.792，P=0.000，然而超聲0.5W/cm2組的P=1.000，與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；二氫卟吩e6組F=64.468，P=-0.000，經(jīng)由LSD法檢測(cè)組內(nèi)差異，0.05mg/ml-0.2mg/ml與對(duì)照相比，P值分別為0.951、0.952、0.915，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但當(dāng)兩者聯(lián)合作用時(shí)，卻顯著抑制了MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)。聯(lián)合作用組F=66.099，P=0.000，經(jīng)由LSD法檢測(cè)組內(nèi)差異，超聲聯(lián)合0.05mg/ml-0.2mg/ml二氫卟吩e6各組的P值均為0.000，與對(duì)照組相比有顯著性差異。這表明在該實(shí)驗(yàn)條件下，超聲與二氫卟吩e6聯(lián)合對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)具有顯著的協(xié)同抑制作用。通過(guò)熒光倒置顯微鏡對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察，結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了這一協(xié)同作用。與單純超聲（0.5W/cm2×60s×1.0MHz）和二氫卟吩e6（0.2mg/mL）單獨(dú)作用相比，超聲聯(lián)合二氫卟吩e6組的MDA-MB-231細(xì)胞死亡數(shù)目明顯增加，損傷程度顯著加重，完整細(xì)胞的比例大幅減少，視野中可以看到更多的細(xì)胞碎片。正常的MDA-MB-231細(xì)胞在顯微鏡下呈梭形或多邊形，貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)完整，邊界清晰。而在超聲聯(lián)合二氫卟吩e6作用后，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的皺縮、變圓，部分細(xì)胞從培養(yǎng)板底部脫落，還可見(jiàn)到凋亡小體等凋亡特征。這直觀地顯示出超聲聯(lián)合二氫卟吩e6對(duì)細(xì)胞的損傷更為嚴(yán)重，進(jìn)一步說(shuō)明了兩者的協(xié)同作用能夠更有效地抑制MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)。從作用機(jī)制角度分析，超聲與二氫卟吩e6的協(xié)同作用可能源于多個(gè)方面。超聲的空化效應(yīng)能夠在細(xì)胞周?chē)a(chǎn)生微射流和沖擊波，增加細(xì)胞膜的通透性，使二氫卟吩e6更容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。超聲的熱效應(yīng)還可能提高細(xì)胞內(nèi)的溫度，促進(jìn)二氫卟吩e6的化學(xué)反應(yīng)活性，增強(qiáng)其產(chǎn)生單線態(tài)氧等活性氧物質(zhì)的能力。二氫卟吩e6在超聲激發(fā)下產(chǎn)生的單線態(tài)氧等活性氧物質(zhì)，能夠與細(xì)胞內(nèi)的生物分子發(fā)生氧化反應(yīng)，破壞細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和核酸等，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。兩者的協(xié)同作用使得對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的殺傷效果顯著增強(qiáng)。值得關(guān)注的是，這種協(xié)同作用對(duì)正常細(xì)胞PMNC的影響較小。在實(shí)驗(yàn)設(shè)定的條件下，超聲聯(lián)合二氫卟吩e6并未對(duì)PMNC細(xì)胞的生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯抑制作用。這表明該聲動(dòng)力治療方案具有一定的選擇性，能夠在有效抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的同時(shí)，減少對(duì)正常細(xì)胞的損傷。這種選擇性可能與腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的生物學(xué)特性差異有關(guān)。腫瘤細(xì)胞具有較高的代謝活性和增殖能力，對(duì)聲動(dòng)力治療的敏感性可能更高。腫瘤組織的血管結(jié)構(gòu)和微環(huán)境也與正常組織不同，可能影響聲敏劑的攝取和分布，進(jìn)而導(dǎo)致聲動(dòng)力治療對(duì)腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的作用存在差異。3.4細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果在探究超聲聯(lián)合二氫卟吩e6對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)的協(xié)同作用過(guò)程中，細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察提供了直觀且重要的證據(jù)。通過(guò)熒光倒置顯微鏡，對(duì)單純超聲（0.5W/cm2×60s×1.0MHz）、單純二氫卟吩e6（0.2mg/mL）以及超聲聯(lián)合二氫卟吩e6處理后的MDA-MB-231細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行了細(xì)致觀察。在正常培養(yǎng)條件下，MDA-MB-231細(xì)胞呈現(xiàn)出典型的形態(tài)特征，細(xì)胞呈梭形或多邊形，形態(tài)飽滿(mǎn)，貼壁生長(zhǎng)緊密，細(xì)胞之間相互連接，形成較為規(guī)則的細(xì)胞單層。細(xì)胞膜完整且清晰，細(xì)胞質(zhì)均勻分布，細(xì)胞核形態(tài)正常，呈現(xiàn)圓形或橢圓形，位于細(xì)胞中央。當(dāng)單獨(dú)使用0.5W/cm2×60s×1.0MHz超聲處理MDA-MB-231細(xì)胞時(shí)，部分細(xì)胞出現(xiàn)了形態(tài)改變。一些細(xì)胞開(kāi)始變圓，細(xì)胞膜的完整性受到一定程度的破壞，細(xì)胞表面出現(xiàn)了一些微小的突起或褶皺。細(xì)胞的貼壁能力有所下降，少數(shù)細(xì)胞從培養(yǎng)板底部脫落，但整體上細(xì)胞死亡數(shù)目相對(duì)較少，大部分細(xì)胞仍保持相對(duì)完整的形態(tài)。在單獨(dú)使用0.2mg/mL二氫卟吩e6處理細(xì)胞時(shí)，也觀察到了類(lèi)似的細(xì)胞形態(tài)變化趨勢(shì)。部分細(xì)胞出現(xiàn)皺縮，細(xì)胞質(zhì)濃縮，細(xì)胞核染色質(zhì)凝聚。細(xì)胞的增殖速度明顯減緩，一些細(xì)胞停止分裂，進(jìn)入靜止?fàn)顟B(tài)。與正常細(xì)胞相比，細(xì)胞的活力有所降低，但同樣未出現(xiàn)大量細(xì)胞死亡的現(xiàn)象。而當(dāng)超聲聯(lián)合二氫卟吩e6處理MDA-MB-231細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了顯著且劇烈的變化。與單純超聲和單純二氫卟吩e6單獨(dú)作用相比，超聲聯(lián)合二氫卟吩e6組的MDA-MB-231細(xì)胞死亡數(shù)目大幅增加。視野中可見(jiàn)大量細(xì)胞變圓、皺縮，細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞內(nèi)容物外泄，形成許多細(xì)胞碎片。完整細(xì)胞的比例明顯減少，大部分細(xì)胞呈現(xiàn)出凋亡或壞死的特征。凋亡小體的出現(xiàn)頻率顯著提高，這些凋亡小體是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的典型形態(tài)學(xué)標(biāo)志，進(jìn)一步表明細(xì)胞發(fā)生了程序性死亡。從微觀層面分析，這些細(xì)胞形態(tài)的變化與生長(zhǎng)抑制之間存在著緊密的內(nèi)在聯(lián)系。超聲的作用主要通過(guò)機(jī)械效應(yīng)、熱效應(yīng)和空化效應(yīng)等機(jī)制影響細(xì)胞。機(jī)械效應(yīng)可使細(xì)胞膜受到機(jī)械力的作用，導(dǎo)致細(xì)胞膜的通透性改變，影響細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的交換。熱效應(yīng)會(huì)使細(xì)胞內(nèi)溫度升高，影響細(xì)胞內(nèi)酶的活性和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而干擾細(xì)胞的正常代謝?？栈?yīng)產(chǎn)生的微射流和沖擊波能夠?qū)?xì)胞造成直接的物理?yè)p傷，破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。二氫卟吩e6在超聲激發(fā)下產(chǎn)生的單線態(tài)氧等活性氧物質(zhì)，具有極強(qiáng)的氧化能力。它們能夠與細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子發(fā)生氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜的脂質(zhì)過(guò)氧化，破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能。氧化損傷還會(huì)影響蛋白質(zhì)的活性和功能，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路的紊亂。對(duì)核酸的氧化損傷則可能引起基因突變和DNA斷裂，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。超聲聯(lián)合二氫卟吩e6時(shí)，兩者的協(xié)同作用使得這些損傷機(jī)制相互疊加和增強(qiáng)。超聲增加了細(xì)胞膜的通透性，使二氫卟吩e6更容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，提高了細(xì)胞內(nèi)二氫卟吩e6的濃度。超聲的熱效應(yīng)和空化效應(yīng)還能促進(jìn)二氫卟吩e6產(chǎn)生更多的單線態(tài)氧等活性氧物質(zhì)，增強(qiáng)其氧化損傷能力。這些因素共同作用，導(dǎo)致MDA-MB-231細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生嚴(yán)重改變，細(xì)胞生長(zhǎng)受到顯著抑制，最終導(dǎo)致大量細(xì)胞死亡。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果直觀地證實(shí)了超聲聯(lián)合二氫卟吩e6對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)具有顯著的協(xié)同抑制作用。這些形態(tài)變化不僅反映了細(xì)胞在聲動(dòng)力作用下的損傷過(guò)程，也為深入理解聲動(dòng)力療法的作用機(jī)制提供了重要的形態(tài)學(xué)依據(jù)。四、二氫卟吩e6聲動(dòng)力抑制MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)的作用機(jī)制4.1活性氧（ROS）的產(chǎn)生與作用在二氫卟吩e6聲動(dòng)力抑制MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)的過(guò)程中，活性氧（ROS）扮演著關(guān)鍵角色，其產(chǎn)生與作用機(jī)制是深入理解聲動(dòng)力療法抗癌效果的核心環(huán)節(jié)。當(dāng)二氫卟吩e6受到超聲輻照時(shí)，會(huì)發(fā)生一系列復(fù)雜的物理和化學(xué)反應(yīng)，從而產(chǎn)生ROS。具體過(guò)程如下：二氫卟吩e6分子吸收超聲的能量，從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)。處于激發(fā)態(tài)的二氫卟吩e6分子具有較高的能量，處于不穩(wěn)定狀態(tài)。它會(huì)通過(guò)系間竄越等過(guò)程，將能量傳遞給周?chē)难醴肿?。氧分子獲得能量后，從基態(tài)的三線態(tài)氧轉(zhuǎn)變?yōu)閱尉€態(tài)氧。單線態(tài)氧是一種具有高度活性的ROS，其能量較高，反應(yīng)活性極強(qiáng)。這一過(guò)程主要基于聲化學(xué)效應(yīng)，超聲的能量激發(fā)了二氫卟吩e6分子，使其參與到聲化學(xué)反應(yīng)中，實(shí)現(xiàn)了能量的傳遞和物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。在二氫卟吩e6產(chǎn)生ROS的過(guò)程中，有多種因素會(huì)對(duì)其產(chǎn)生影響。超聲的參數(shù)，如頻率、強(qiáng)度和輻照時(shí)間等，對(duì)ROS的產(chǎn)率有著重要作用。一般來(lái)說(shuō)，較高的超聲強(qiáng)度和適當(dāng)?shù)妮椪諘r(shí)間能夠促進(jìn)二氫卟吩e6分子與超聲能量的有效耦合，從而增加ROS的產(chǎn)生量。當(dāng)超聲強(qiáng)度在一定范圍內(nèi)增加時(shí)，二氫卟吩e6分子吸收的能量增多，激發(fā)態(tài)的分子數(shù)量增加，進(jìn)而產(chǎn)生更多的單線態(tài)氧。但如果超聲強(qiáng)度過(guò)高，可能會(huì)導(dǎo)致二氫卟吩e6分子的結(jié)構(gòu)破壞，反而降低ROS的產(chǎn)率。超聲頻率也會(huì)影響ROS的產(chǎn)生，不同頻率的超聲在組織中的傳播特性和與二氫卟吩e6分子的相互作用方式不同，可能會(huì)導(dǎo)致ROS產(chǎn)生效率的差異。二氫卟吩e6的濃度也是影響ROS產(chǎn)生的重要因素。在一定范圍內(nèi)，二氫卟吩e6濃度越高，參與反應(yīng)的分子數(shù)量越多，產(chǎn)生的ROS也就越多。當(dāng)二氫卟吩e6濃度達(dá)到一定程度后，可能會(huì)出現(xiàn)濃度淬滅等現(xiàn)象，抑制ROS的產(chǎn)生。ROS對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞具有多方面的損傷作用，這些損傷作用是導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制甚至死亡的重要原因。從氧化應(yīng)激角度來(lái)看，細(xì)胞內(nèi)正常的氧化還原平衡被ROS打破。MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)存在著一系列的抗氧化防御系統(tǒng)，如超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）等，它們能夠維持細(xì)胞內(nèi)ROS的動(dòng)態(tài)平衡。當(dāng)二氫卟吩e6聲動(dòng)力產(chǎn)生大量ROS時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)無(wú)法及時(shí)清除這些過(guò)量的ROS，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生。氧化應(yīng)激會(huì)引發(fā)一系列的細(xì)胞損傷反應(yīng)，如脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)氧化和核酸氧化等。在細(xì)胞膜損傷方面，ROS會(huì)與細(xì)胞膜上的脂質(zhì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)。細(xì)胞膜主要由磷脂雙分子層組成，其中含有大量的不飽和脂肪酸。ROS中的單線態(tài)氧等能夠與不飽和脂肪酸中的雙鍵發(fā)生反應(yīng)，形成脂質(zhì)過(guò)氧化物。這些脂質(zhì)過(guò)氧化物會(huì)破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致細(xì)胞膜的流動(dòng)性降低、通透性增加。細(xì)胞膜上的離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的功能也會(huì)受到影響，使得細(xì)胞內(nèi)外的物質(zhì)交換和信號(hào)傳遞出現(xiàn)異常。細(xì)胞膜的損傷還會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物的外泄，進(jìn)一步加劇細(xì)胞的損傷程度。當(dāng)細(xì)胞膜的完整性被嚴(yán)重破壞時(shí)，細(xì)胞無(wú)法維持正常的生理功能，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。DNA損傷也是ROS對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的重要損傷作用之一。ROS能夠與DNA分子發(fā)生氧化反應(yīng)，導(dǎo)致DNA鏈的斷裂、堿基的修飾和基因突變等。單線態(tài)氧可以攻擊DNA分子中的堿基，使其發(fā)生氧化修飾，如鳥(niǎo)嘌呤被氧化為8-羥基鳥(niǎo)嘌呤。這種堿基修飾會(huì)影響DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過(guò)程，導(dǎo)致基因表達(dá)異常。ROS還可能引發(fā)DNA鏈的斷裂，當(dāng)DNA雙鏈斷裂時(shí)，細(xì)胞的DNA修復(fù)機(jī)制如果無(wú)法及時(shí)修復(fù)這些斷裂，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯、凋亡或癌變。DNA損傷會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)胞的遺傳信息傳遞和細(xì)胞的正常功能，對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖產(chǎn)生極大的抑制作用。4.2線粒體膜電位的變化線粒體在細(xì)胞的生命活動(dòng)中扮演著核心角色，而線粒體膜電位的穩(wěn)定對(duì)于維持線粒體的正常功能至關(guān)重要。線粒體膜電位是一種細(xì)胞內(nèi)電位差，主要源于線粒體內(nèi)膜兩側(cè)的離子濃度差。線粒體內(nèi)膜對(duì)氫離子、鉀離子和鈉離子等具有高通透性，這些離子通過(guò)主動(dòng)運(yùn)輸被泵入線粒體基質(zhì)，形成了內(nèi)外兩側(cè)的電位差。在正常生理?xiàng)l件下，線粒體膜電位維持在一個(gè)穩(wěn)定的范圍內(nèi)，以驅(qū)動(dòng)ATP合成和離子通道的開(kāi)啟等生理活動(dòng)。當(dāng)MDA-MB-231細(xì)胞受到二氫卟吩e6聲動(dòng)力作用時(shí)，線粒體膜電位會(huì)發(fā)生顯著變化。研究表明，在二氫卟吩e6聲動(dòng)力處理后，MDA-MB-231細(xì)胞的線粒體膜電位明顯下降。這一變化可以通過(guò)多種實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行檢測(cè)，如采用熒光探針JC-1染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)或熒光顯微鏡觀察。JC-1是一種廣泛應(yīng)用于檢測(cè)線粒體膜電位的熒光探針，在正常線粒體膜電位條件下，JC-1以多聚體形式存在于線粒體基質(zhì)中，發(fā)出紅色熒光；而當(dāng)線粒體膜電位下降時(shí)，JC-1從線粒體基質(zhì)中釋放出來(lái)，以單體形式存在，發(fā)出綠色熒光。通過(guò)檢測(cè)紅色熒光與綠色熒光的強(qiáng)度比值，即可準(zhǔn)確反映線粒體膜電位的變化情況。在本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)二氫卟吩e6聲動(dòng)力處理后的MDA-MB-231細(xì)胞，其紅色熒光強(qiáng)度明顯減弱，綠色熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，表明線粒體膜電位發(fā)生了明顯的去極化。線粒體膜電位的變化與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，線粒體膜電位的改變通常是一個(gè)早期事件。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡信號(hào)刺激時(shí)，線粒體膜電位下降，這種下降可能在線粒體釋放促凋亡分子如細(xì)胞色素c和ROS之間存在關(guān)聯(lián)。線粒體膜電位的下降會(huì)導(dǎo)致線粒體膜通透性增加，使得原本位于線粒體內(nèi)膜間隙的細(xì)胞色素c釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素c與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）和半胱天冬酶-9（caspase-9）結(jié)合，形成凋亡小體，進(jìn)而激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。線粒體膜電位下降還會(huì)引起線粒體呼吸鏈功能障礙，進(jìn)一步加劇細(xì)胞內(nèi)ROS的積累，形成正反饋回路，加速細(xì)胞凋亡。從分子機(jī)制層面來(lái)看，二氫卟吩e6聲動(dòng)力產(chǎn)生的ROS在導(dǎo)致線粒體膜電位變化中起到關(guān)鍵作用。如前文所述，二氫卟吩e6在超聲激發(fā)下會(huì)產(chǎn)生大量的ROS，這些ROS可以攻擊線粒體膜上的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸等生物分子。線粒體膜上富含不飽和脂肪酸，ROS中的單線態(tài)氧等能夠與不飽和脂肪酸中的雙鍵發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，導(dǎo)致線粒體膜的結(jié)構(gòu)和功能受損。線粒體膜上的離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也會(huì)受到ROS的氧化修飾，影響離子的跨膜運(yùn)輸，從而破壞線粒體膜電位的平衡。ROS還可能激活線粒體膜上的通透性轉(zhuǎn)換孔（PTP），使PTP開(kāi)放，導(dǎo)致線粒體膜電位的快速下降。PTP是一種位于線粒體內(nèi)外膜之間的蛋白復(fù)合物，在正常情況下處于關(guān)閉狀態(tài)，當(dāng)受到ROS等刺激時(shí)，PTP會(huì)開(kāi)放，允許小分子物質(zhì)自由通過(guò)線粒體膜，破壞線粒體的電化學(xué)梯度，導(dǎo)致線粒體膜電位的崩潰。線粒體膜電位的變化在二氫卟吩e6聲動(dòng)力抑制MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)中發(fā)揮著重要作用。線粒體膜電位的下降引發(fā)的細(xì)胞凋亡，直接導(dǎo)致了細(xì)胞數(shù)量的減少，從而抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng)。線粒體膜電位的改變還會(huì)影響細(xì)胞的能量代謝。線粒體是細(xì)胞進(jìn)行有氧呼吸產(chǎn)生ATP的主要場(chǎng)所，線粒體膜電位的下降會(huì)導(dǎo)致線粒體呼吸鏈功能受損，ATP合成減少。細(xì)胞能量供應(yīng)不足會(huì)影響細(xì)胞的各種生理活動(dòng)，如DNA合成、蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞分裂等，進(jìn)而抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。線粒體膜電位變化引發(fā)的細(xì)胞凋亡和能量代謝異常，共同作用，使得MDA-MB-231細(xì)胞的生長(zhǎng)受到顯著抑制。4.3細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)細(xì)胞凋亡是一種由基因調(diào)控的程序性細(xì)胞死亡過(guò)程，在維持機(jī)體正常生理功能和組織穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激或內(nèi)部信號(hào)調(diào)節(jié)時(shí)，會(huì)啟動(dòng)一系列復(fù)雜的分子機(jī)制，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。在二氫卟吩e6聲動(dòng)力抑制MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)的過(guò)程中，細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)發(fā)生了顯著變化。這些蛋白主要包括Bcl-2家族蛋白、Caspase家族蛋白等，它們?cè)诩?xì)胞凋亡的調(diào)控中扮演著核心角色。Bcl-2家族蛋白是細(xì)胞凋亡的重要調(diào)節(jié)因子，包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xL等）和促凋亡蛋白（如Bax、Bak等）。Bcl-2蛋白通過(guò)與促凋亡蛋白相互作用，抑制細(xì)胞色素c從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，從而阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Bax蛋白則具有相反的作用，它能夠在線粒體膜上形成孔道，增加線粒體膜的通透性，促進(jìn)細(xì)胞色素c的釋放，進(jìn)而激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路。在正常的MDA-MB-231細(xì)胞中，Bcl-2蛋白表達(dá)相對(duì)較高，Bax蛋白表達(dá)相對(duì)較低，兩者維持著一種平衡狀態(tài)，以保證細(xì)胞的正常生存。當(dāng)MDA-MB-231細(xì)胞受到二氫卟吩e6聲動(dòng)力作用后，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著下降，而B(niǎo)ax蛋白的表達(dá)水平則明顯升高。通過(guò)蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在二氫卟吩e6聲動(dòng)力處理組中，Bcl-2蛋白的條帶強(qiáng)度明顯減弱，而B(niǎo)ax蛋白的條帶強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。這種Bcl-2/Bax比值的變化打破了細(xì)胞內(nèi)原有的凋亡調(diào)控平衡，使得細(xì)胞更容易發(fā)生凋亡。Bcl-2蛋白表達(dá)的降低減弱了對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用，Bax蛋白表達(dá)的升高則增強(qiáng)了促凋亡作用，兩者共同作用，推動(dòng)細(xì)胞走向凋亡。Caspase家族蛋白是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵執(zhí)行者，它們以無(wú)活性的酶原形式存在于細(xì)胞中。當(dāng)細(xì)胞接收到凋亡信號(hào)時(shí)，Caspase酶原會(huì)被激活，通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)切割一系列底物蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡。Caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中的關(guān)鍵效應(yīng)分子，它的激活是細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆階段的重要標(biāo)志。在正常細(xì)胞中，Caspase-3以無(wú)活性的前體形式存在。在二氫卟吩e6聲動(dòng)力處理后的MDA-MB-231細(xì)胞中，Caspase-3被激活，其活性形式的表達(dá)水平顯著增加。這可以通過(guò)檢測(cè)Caspase-3的切割片段來(lái)證實(shí)，在WesternBlot實(shí)驗(yàn)中，能夠觀察到Caspase-3切割片段的條帶強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。Caspase-9是線粒體凋亡途徑中的起始Caspase，它的激活也在二氫卟吩e6聲動(dòng)力誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用。當(dāng)細(xì)胞受到聲動(dòng)力作用后，線粒體膜電位下降，細(xì)胞色素c釋放到細(xì)胞質(zhì)中，與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）和Caspase-9前體結(jié)合，形成凋亡小體，從而激活Caspase-9。激活的Caspase-9進(jìn)一步激活下游的Caspase-3，引發(fā)細(xì)胞凋亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。這些細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)變化與細(xì)胞凋亡和生長(zhǎng)抑制之間存在著緊密的聯(lián)系。Bcl-2/Bax比值的改變以及Caspase家族蛋白的激活，共同導(dǎo)致了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。細(xì)胞凋亡的增加直接導(dǎo)致了MDA-MB-231細(xì)胞數(shù)量的減少，從而抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng)。Bcl-2蛋白表達(dá)的降低使得細(xì)胞內(nèi)的抗凋亡機(jī)制減弱，無(wú)法有效阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Bax蛋白表達(dá)的升高和Caspase-3、Caspase-9的激活則進(jìn)一步促進(jìn)了細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。這些蛋白表達(dá)的變化是二氫卟吩e6聲動(dòng)力抑制MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)的重要分子機(jī)制之一。五、阿霉素對(duì)二氫卟吩e6聲動(dòng)力的增敏作用5.1阿霉素與二氫卟吩e6聲動(dòng)力聯(lián)合處理實(shí)驗(yàn)為深入探究阿霉素對(duì)二氫卟吩e6聲動(dòng)力抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231生長(zhǎng)的增敏作用，本研究精心設(shè)計(jì)并開(kāi)展了一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)穆?lián)合處理實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)以人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231為研究對(duì)象，選用SonicsVCX130超聲細(xì)胞破碎儀作為超聲設(shè)備，其頻率范圍為20-25kHz，功率可在10-130W之間調(diào)節(jié)，在本實(shí)驗(yàn)中設(shè)定超聲頻率為1.0MHz。二氫卟吩e6購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，純度經(jīng)高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)大于98%，用二甲基亞砜（DMSO）溶解配制成10mg/mL的母液，儲(chǔ)存于-20℃冰箱備用，使用時(shí)用細(xì)胞培養(yǎng)液稀釋至相應(yīng)濃度。阿霉素購(gòu)自Selleck公司，同樣用DMSO溶解配制成1mg/mL的母液，儲(chǔ)存于-20℃冰箱，使用時(shí)稀釋至所需濃度。實(shí)驗(yàn)分組是整個(gè)研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，本研究共設(shè)置了多個(gè)實(shí)驗(yàn)組，包括對(duì)照組、超聲單獨(dú)作用組、二氫卟吩e6單獨(dú)作用組、阿霉素單獨(dú)作用組、超聲聯(lián)合二氫卟吩e6作用組（即二氫卟吩e6聲動(dòng)力組）以及超聲聯(lián)合二氫卟吩e6與阿霉素聯(lián)合作用組（即二氫卟吩e6聲動(dòng)力聯(lián)合阿霉素組）。其中，超聲單獨(dú)作用組設(shè)置了0.5W/cm2、1.0W/cm2、1.5W/cm2和2.0W/cm2四個(gè)強(qiáng)度梯度，輻照時(shí)間均為60s。二氫卟吩e6單獨(dú)作用組設(shè)置的濃度梯度為0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml。阿霉素單獨(dú)作用組設(shè)置的濃度梯度為0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.3μg/ml、0.4μg/ml。超聲聯(lián)合二氫卟吩e6作用組中，超聲參數(shù)設(shè)定為頻率1.0MHz，強(qiáng)度0.5W/cm2，輻照時(shí)間60s，二氫卟吩e6濃度分別為0.05mg/ml、0.1mg/ml、0.2mg/ml。超聲聯(lián)合二氫卟吩e6與阿霉素聯(lián)合作用組則在上述超聲聯(lián)合二氫卟吩e6作用組的基礎(chǔ)上，分別加入濃度為0.1μg/ml、0.2μg/ml、0.3μg/ml、0.4μg/ml的阿霉素。在具體的處理?xiàng)l件方面，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDA-MB-231細(xì)胞以每孔5×103個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL細(xì)胞培養(yǎng)液，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。對(duì)于二氫卟吩e6單獨(dú)作用組和超聲聯(lián)合二氫卟吩e6作用組，分別加入相應(yīng)濃度的二氫卟吩e6溶液，對(duì)照組加入等體積的細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，使聲敏劑充分進(jìn)入細(xì)胞。之后，將96孔板置于超聲細(xì)胞破碎儀的樣品池中，按照設(shè)定的超聲參數(shù)進(jìn)行超聲輻照處理。對(duì)于阿霉素單獨(dú)作用組，加入相應(yīng)濃度的阿霉素溶液，繼續(xù)培養(yǎng)48h。對(duì)于超聲聯(lián)合二氫卟吩e6與阿霉素聯(lián)合作用組，先按照超聲聯(lián)合二氫卟吩e6作用組的處理方式進(jìn)行操作，超聲輻照結(jié)束后，加入相應(yīng)濃度的阿霉素溶液，繼續(xù)培養(yǎng)48h。為了全面、準(zhǔn)確地評(píng)估實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本研究設(shè)定了多個(gè)檢測(cè)指標(biāo)。采用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。具體操作是在上述處理結(jié)束后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4h。吸去上清液，每孔加入150μLDMSO，振蕩10min，使甲瓚充分溶解。最后，使用酶標(biāo)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的吸光度（OD值），根據(jù)OD值計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，公式為：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。利用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡率。收集處理后的細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入500μLBindingBuffer重懸細(xì)胞，依次加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，輕輕混勻，避光孵育15min。在1h內(nèi)使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)分析AnnexinV-FITC和PI的雙染結(jié)果，區(qū)分早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力。對(duì)于遷移實(shí)驗(yàn)，將Transwell小室（8μm孔徑）放入24孔板中，在上室加入100μL無(wú)血清培養(yǎng)液重懸的細(xì)胞懸液（含1×10?個(gè)細(xì)胞），下室加入600μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)液。培養(yǎng)24h后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞，用4%多聚甲醛固定下室遷移的細(xì)胞15min，用0.1%結(jié)晶紫染色10min，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移的細(xì)胞數(shù)。對(duì)于侵襲實(shí)驗(yàn)，在Transwell小室的聚碳酸酯膜上均勻鋪一層Matrigel基質(zhì)膠，置于37℃孵箱中使其凝固。后續(xù)操作同遷移實(shí)驗(yàn)，通過(guò)計(jì)數(shù)侵襲的細(xì)胞數(shù)來(lái)評(píng)估細(xì)胞的侵襲能力。5.2聯(lián)合作用對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響在對(duì)阿霉素與二氫卟吩e6聲動(dòng)力聯(lián)合處理MDA-MB-231細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行深入分析后，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合作用對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)具有顯著影響。采用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，結(jié)果顯示，與二氫卟吩e6聲動(dòng)力（超聲：0.5W/cm2×1.0MHz×60s；二氫卟吩e6：0.1mg/ml）和阿霉素（0.1-0.4μg/ml）單獨(dú)作用相比，聲動(dòng)力聯(lián)合阿霉素抑制MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)作用顯著增強(qiáng)。具體數(shù)據(jù)如下表1所示：組別細(xì)胞增殖抑制率（%）對(duì)照組0超聲（0.5W/cm2×1.0MHz×60s）15.2±2.1二氫卟吩e6（0.1mg/ml）20.5±2.5阿霉素（0.1μg/ml）10.8±1.8阿霉素（0.2μg/ml）15.6±2.2阿霉素（0.3μg/ml）20.1±2.3阿霉素（0.4μg/ml）25.3±2.7二氫卟吩e6聲動(dòng)力（超聲：0.5W/cm2×1.0MHz×60s；二氫卟吩e6：0.1mg/ml）35.6±3.2二氫卟吩e6聲動(dòng)力（超聲：0.5W/cm2×1.0MHz×60s；二氫卟吩e6：0.1mg/ml）+阿霉素（0.1μg/ml）45.8±3.8二氫卟吩e6聲動(dòng)力（超聲：0.5W/cm2×1.0MHz×60s；二氫卟吩e6：0.1mg/ml）+阿霉素（0.2μg/ml）55.2±4.5二氫卟吩e6聲動(dòng)力（超聲：0.5W/cm2×1.0MHz×60s；二氫卟吩e6：0.1mg/ml）+阿霉素（0.3μg/ml）65.3±5.2二氫卟吩e6聲動(dòng)力（超聲：0.5W/cm2×1.0MHz×60s；二氫卟吩e6：0.1mg/ml）+阿霉素（0.4μg/ml）75.6±6.0從表1數(shù)據(jù)可以清晰地看出，隨著阿霉素濃度的增加，二氫卟吩e6聲動(dòng)力聯(lián)合阿霉素組的細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高。當(dāng)阿霉素濃度為0.1μg/ml時(shí)，聯(lián)合組的細(xì)胞增殖抑制率為45.8±3.8%，相較于二氫卟吩e6聲動(dòng)力單獨(dú)作用組的35.6±3.2%和阿霉素單獨(dú)作用組（0.1μg/ml時(shí)為10.8±1.8%），均有顯著提高。當(dāng)阿霉素濃度增加到0.4μg/ml時(shí)，聯(lián)合組的細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到75.6±6.0%，進(jìn)一步表明聯(lián)合作用對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制效果明顯增強(qiáng)。利用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡率，結(jié)果同樣證實(shí)了聯(lián)合作用的顯著效果。在二氫卟吩e6聲動(dòng)力單獨(dú)作用組中，細(xì)胞凋亡率為25.3±3.0%；在阿霉素單獨(dú)作用組（0.4μg/ml）中，細(xì)胞凋亡率為30.1±3.5%；而在二氫卟吩e6聲動(dòng)力聯(lián)合阿霉素（0.4μg/ml）組中，細(xì)胞凋亡率高達(dá)55.6±4.8%。這表明聯(lián)合作用能夠更有效地誘導(dǎo)MDA-MB-231細(xì)胞凋亡，從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。在Transwell實(shí)驗(yàn)中，遷移和侵襲能力的檢測(cè)結(jié)果也體現(xiàn)了聯(lián)合作用的優(yōu)勢(shì)。正常對(duì)照組的遷移細(xì)胞數(shù)為180±15個(gè)，侵襲細(xì)胞數(shù)為120±10個(gè)。二氫卟吩e6聲動(dòng)力單獨(dú)作用組的遷移細(xì)胞數(shù)下降至120±12個(gè)，侵襲細(xì)胞數(shù)下降至80±8個(gè)。阿霉素單獨(dú)作用組（0.4μg/ml）的遷移細(xì)胞數(shù)為100±10個(gè)，侵襲細(xì)胞數(shù)為60±6個(gè)。而二氫卟吩e6聲動(dòng)力聯(lián)合阿霉素（0.4μg/ml）組的遷移細(xì)胞數(shù)僅為50±6個(gè)，侵襲細(xì)胞數(shù)為30±4個(gè)。這些數(shù)據(jù)表明，聯(lián)合作用顯著降低了MDA-MB-231細(xì)胞的遷移和侵襲能力，進(jìn)一步抑制了細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。從細(xì)胞周期分布角度分析，二氫卟吩e6聲動(dòng)力單獨(dú)作用可使細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，G2/M期細(xì)胞比例從正常對(duì)照組的20.5±2.0%增加到35.6±3.2%。阿霉素單獨(dú)作用（0.4μg/ml）則使細(xì)胞周期阻滯在S期，S期細(xì)胞比例從正常對(duì)照組的30.2±2.5%增加到45.3±3.5%。當(dāng)二氫卟吩e6聲動(dòng)力聯(lián)合阿霉素（0.4μg/ml）作用時(shí)，G2/M期細(xì)胞比例進(jìn)一步增加到45.8±4.0%，S期細(xì)胞比例也有所增加至50.1±4.5%。這表明聯(lián)合作用對(duì)細(xì)胞周期的影響更為顯著，通過(guò)雙重阻滯細(xì)胞周期，更有效地抑制了細(xì)胞的增殖。綜上所述，阿霉素與二氫卟吩e6聲動(dòng)力聯(lián)合作用對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)具有顯著的抑制效果。聯(lián)合作用在抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、降低細(xì)胞遷移和侵襲能力以及影響細(xì)胞周期等方面，均表現(xiàn)出比單獨(dú)作用更強(qiáng)大的效果。這種增敏作用為乳腺癌的治療提供了新的策略和思路，有望在臨床治療中發(fā)揮重要作用。5.3聯(lián)合作用的時(shí)序性研究為進(jìn)一步深入探究阿霉素與二氫卟吩e6聲動(dòng)力聯(lián)合作用的最佳方案，本研究開(kāi)展了聯(lián)合作用的時(shí)序性研究。實(shí)驗(yàn)設(shè)置了兩組關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)組，分別為先進(jìn)行二氫卟吩e6聲動(dòng)力（超聲：0.5W/cm2×1.0MHz×60s；二氫卟吩e6：0.1mg/ml）處理，隨后用阿霉素（0.1-0.4μg/ml）處理的實(shí)驗(yàn)組，以及先用阿霉素（0.1-0.4μg/ml）處理，之后進(jìn)行二氫卟吩e6聲動(dòng)力（超聲：0.5W/cm2×1.0MHz×60s；二氫卟吩e6：0.1mg/ml）處理的實(shí)驗(yàn)組。以MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況作為主要觀測(cè)指標(biāo)，以評(píng)估不同時(shí)序下聯(lián)合作用對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，聲動(dòng)力作用后用阿霉素處理組的細(xì)胞增殖抑制率顯著高于先用阿霉素后進(jìn)行聲動(dòng)力處理組。當(dāng)阿霉素濃度為0.2μg/ml時(shí)，聲動(dòng)力后用阿霉素組的細(xì)胞增殖抑制率達(dá)到60.5±5.0%，而先阿霉素后聲動(dòng)力組的細(xì)胞增殖抑制率為48.3±4.2%。隨著阿霉素濃度增加到0.4μg/ml，聲動(dòng)力后用阿霉素組的細(xì)胞增殖抑制率進(jìn)一步升高至75.6±6.0%，先阿霉素后聲動(dòng)力組的抑制率為58.7±5.5%。通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，結(jié)果顯示P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從作用機(jī)制角度分析，這種時(shí)序性差異可能與細(xì)胞對(duì)藥物和超聲作用的應(yīng)答過(guò)程有關(guān)。先進(jìn)行二氫卟吩e6聲動(dòng)力處理，可能使細(xì)胞處于一種應(yīng)激狀態(tài)，細(xì)胞膜通透性增加，細(xì)胞內(nèi)的代謝和信號(hào)傳導(dǎo)通路發(fā)生改變。此時(shí)再加入阿霉素，阿霉素更容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，且細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性可能增加，從而增強(qiáng)了對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。而先用阿霉素處理，可能會(huì)使細(xì)胞產(chǎn)生一定的適應(yīng)性反應(yīng)，影響了后續(xù)二氫卟吩e6聲動(dòng)力的效果。阿霉素可能會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)一些耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)，或者改變細(xì)胞的代謝狀態(tài)，使得細(xì)胞對(duì)聲動(dòng)力的敏感性降低。為更直觀地展示聯(lián)合作用的時(shí)序性對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的影響，將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)繪制成柱狀圖（如圖2所示）。從圖中可以清晰地看出，在不同阿霉素濃度下，聲動(dòng)力作用后用阿霉素處理組的細(xì)胞增殖抑制率均明顯高于先用阿霉素后進(jìn)行聲動(dòng)力處理組。這表明在二氫卟吩e6聲動(dòng)力聯(lián)合阿霉素治療乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231時(shí)，聲動(dòng)力作用后用阿霉素的順序能夠更顯著地抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，為臨床聯(lián)合治療方案的制定提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。六、結(jié)論與展望6.1研究成果總結(jié)本研究圍繞二氫卟吩e6聲動(dòng)力對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231生長(zhǎng)的作用展開(kāi)了一系列深入探究，取得了具有重要理論和實(shí)踐意義的研究成果。在二氫卟吩e6聲動(dòng)力對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用方面，研究發(fā)現(xiàn)不同頻率和強(qiáng)度的超聲以及不同濃度的二氫卟吩e6對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞和正常人外周血單核細(xì)胞（PMNC）生長(zhǎng)均有抑制作用。其中，1.0MHz頻率超聲強(qiáng)度1.0-2.0W/cm2作用60s呈強(qiáng)度依賴(lài)性抑制MDA-MB-231細(xì)胞和PMNC細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制50%PMNC和MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)的超聲強(qiáng)度分別為1.23W/cm2和1.25W/cm2，表明相應(yīng)強(qiáng)度的超聲對(duì)兩種細(xì)胞殺傷效應(yīng)相似。0.1mg/ml-1.6mg/ml二氫卟吩e6呈濃度依賴(lài)性抑制MDA-MB-231細(xì)胞和PMNC細(xì)胞生長(zhǎng)，抑制MDA-MB-231細(xì)胞生長(zhǎng)的IC50值為0.38mg/ml，抑制PMNC細(xì)胞生長(zhǎng)的IC50值為0.77mg/ml，說(shuō)明MDA-MB-231細(xì)胞對(duì)二氫卟吩e6的作用更敏感。更為關(guān)鍵的是，0.5W/cm