Toll樣受體4：動脈粥樣硬化發(fā)病機制與防治新靶點的深度探索一、引言1.1研究背景動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是一種嚴(yán)重威脅人類健康的心血管疾病，其發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)居高不下。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計，心血管疾病每年導(dǎo)致約1790萬人死亡，占全球死亡總數(shù)的31%，而動脈粥樣硬化是心血管疾病的主要病理基礎(chǔ)。動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展是一個復(fù)雜的過程，涉及脂質(zhì)代謝紊亂、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移等多個環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)觀點認(rèn)為，動脈粥樣硬化是由于脂質(zhì)在血管壁內(nèi)沉積，逐漸形成粥樣斑塊，導(dǎo)致血管狹窄和阻塞。然而，近年來的研究表明，炎癥反應(yīng)在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。越來越多的證據(jù)顯示，動脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，炎癥細(xì)胞和炎癥介質(zhì)參與了動脈粥樣硬化的各個階段，從早期的脂質(zhì)條紋形成到晚期的斑塊破裂和血栓形成。Toll樣受體4（Toll-likereceptor4，TLR4）作為Toll樣受體家族中的重要成員，在天然免疫和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著核心作用。TLR4能夠識別病原體相關(guān)分子模式（Pathogen-associatedmolecularpatterns，PAMPs），如細(xì)菌脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）等，以及內(nèi)源性危險信號分子，如熱休克蛋白、高遷移率族蛋白B1等。當(dāng)TLR4被激活后，會啟動一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致核因子κB（Nuclearfactor-κB，NF-κB）等轉(zhuǎn)錄因子的活化，進而誘導(dǎo)多種炎性細(xì)胞因子、趨化因子和黏附分子的表達，引發(fā)炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，TLR4不僅在免疫細(xì)胞中高表達，在血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等動脈粥樣硬化相關(guān)細(xì)胞中也有表達。在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中，TLR4通過識別內(nèi)、外源性配體，激活炎癥信號通路，促進炎癥細(xì)胞的浸潤和活化，加速脂質(zhì)沉積和斑塊形成，同時還可能影響斑塊的穩(wěn)定性，增加斑塊破裂和血栓形成的風(fēng)險。因此，深入研究TLR4與動脈粥樣硬化之間的關(guān)系，對于揭示動脈粥樣硬化的發(fā)病機制、尋找新的治療靶點具有重要意義。目前，雖然已經(jīng)有大量關(guān)于TLR4與動脈粥樣硬化的研究，但仍存在許多未解之謎，如TLR4在動脈粥樣硬化不同階段的具體作用機制、TLR4信號通路的精細(xì)調(diào)控等。進一步探索TLR4與動脈粥樣硬化的關(guān)系，有望為動脈粥樣硬化的防治提供新的策略和方法。1.2研究目的與意義本研究旨在深入揭示Toll樣受體4與動脈粥樣硬化之間的內(nèi)在聯(lián)系，全面剖析TLR4在動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸過程中的具體作用機制。通過細(xì)胞實驗和動物模型，觀察TLR4激活或抑制后，動脈粥樣硬化相關(guān)細(xì)胞的生物學(xué)行為變化，如巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、泡沫細(xì)胞的形成，血管平滑肌細(xì)胞的增殖與遷移等。同時，探究TLR4信號通路中關(guān)鍵分子的調(diào)控機制，明確其上下游信號分子的相互作用關(guān)系。動脈粥樣硬化嚴(yán)重威脅人類健康，當(dāng)前治療手段存在一定局限性，深入研究其發(fā)病機制以尋找新的治療靶點至關(guān)重要。本研究具有重要意義，在理論層面，有望補充和完善動脈粥樣硬化的發(fā)病機制理論。傳統(tǒng)的動脈粥樣硬化發(fā)病機制主要集中在脂質(zhì)代謝異常等方面，對炎癥免疫機制的研究相對較少。本研究深入探討TLR4與動脈粥樣硬化的關(guān)系，有助于從炎癥免疫角度更全面地理解動脈粥樣硬化的發(fā)病過程，為后續(xù)研究提供新的理論依據(jù)。在臨床應(yīng)用方面，若能明確TLR4在動脈粥樣硬化中的關(guān)鍵作用及機制，將為動脈粥樣硬化的防治提供新的靶點和策略。可以研發(fā)針對TLR4或其信號通路關(guān)鍵分子的藥物，阻斷炎癥信號傳導(dǎo)，從而抑制動脈粥樣硬化的發(fā)展。同時，還能為動脈粥樣硬化的早期診斷和病情評估提供新的生物標(biāo)志物，通過檢測TLR4及其相關(guān)分子的表達水平，更準(zhǔn)確地預(yù)測疾病的發(fā)生風(fēng)險和進展情況，實現(xiàn)早期干預(yù)和精準(zhǔn)治療。1.3國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國外，對于Toll樣受體4與動脈粥樣硬化關(guān)系的研究起步較早且成果豐碩。早在2002年，Edfeldt等學(xué)者通過研究發(fā)現(xiàn)，TLR4在人類動脈粥樣硬化病變中呈現(xiàn)表達狀態(tài)，這一發(fā)現(xiàn)為后續(xù)探究TLR4在動脈粥樣硬化中的作用奠定了基礎(chǔ)。此后，諸多研究從不同角度深入剖析兩者關(guān)聯(lián)。Tobias和Curtiss指出，TLR4在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中，對病原體保護的同時也付出了代價，其在炎癥反應(yīng)與動脈粥樣硬化進程中扮演著關(guān)鍵角色。Pasterkamp等人的研究表明，TLR4參與了動脈粥樣硬化疾病的起始與發(fā)展進程。在細(xì)胞和動物實驗方面，有研究利用基因敲除技術(shù)構(gòu)建TLR4基因敲除小鼠，以此探究TLR4缺失對動脈粥樣硬化發(fā)展的影響。結(jié)果顯示，TLR4基因敲除小鼠在高脂飲食誘導(dǎo)下，動脈粥樣硬化斑塊形成明顯減少，炎癥細(xì)胞浸潤程度降低，炎性細(xì)胞因子表達水平顯著下降。這一系列研究充分表明，TLR4在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中起著促進作用，其激活會導(dǎo)致炎癥反應(yīng)加劇，加速斑塊形成。國內(nèi)學(xué)者也在積極開展相關(guān)研究，并取得了一系列重要成果。宮玉玲等人通過免疫組織化學(xué)方法，對行冠狀動脈旁路移植術(shù)患者的主動脈壁全層組織以及腎移植供體者的動脈壁全層組織進行檢測。研究發(fā)現(xiàn)，TLR4在冠狀動脈粥樣硬化患者的動脈壁全層組織中有明顯表達，而在對照組中無表達。進一步分析發(fā)現(xiàn)，TLR4表達與高血壓、高血糖、低密度脂蛋白膽固醇升高、高密度脂蛋白膽固醇降低等動脈粥樣硬化危險因素密切相關(guān)。這表明TLR4可能是動脈粥樣硬化的始動因素之一，這些危險因素通過TLR4信號途徑促進動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。楊波等人探討了TLR4/NF-κB信號通路在溶血磷脂酸致動脈粥樣硬化中的作用。研究結(jié)果顯示，溶血磷脂酸可顯著上調(diào)人單核細(xì)胞株THP-1細(xì)胞中TLR4表達，并促進NF-κB的活化，提示溶血磷脂酸致動脈粥樣硬化作用可能部分是由TLR4/NF-κB信號途徑介導(dǎo)的。盡管國內(nèi)外在TLR4與動脈粥樣硬化關(guān)系的研究上已取得諸多成果，但仍存在一些不足之處。在研究內(nèi)容方面，雖然已知TLR4參與動脈粥樣硬化過程，但對于TLR4在動脈粥樣硬化不同階段的具體作用機制尚未完全明確。例如，在動脈粥樣硬化早期，TLR4如何精準(zhǔn)識別內(nèi)源性危險信號分子，啟動炎癥反應(yīng)，進而促使脂質(zhì)條紋形成；在斑塊進展期，TLR4對血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移以及細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解的調(diào)控機制還需深入研究。在研究方法上，目前多采用細(xì)胞實驗和動物模型，與人體實際情況存在一定差異。如何將基礎(chǔ)研究成果更好地轉(zhuǎn)化到臨床應(yīng)用，實現(xiàn)從實驗室到臨床的跨越，是亟待解決的問題。在信號通路研究方面，TLR4信號通路復(fù)雜，涉及多個上下游信號分子和多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，它們之間的相互作用和精細(xì)調(diào)控機制尚未完全闡明。此外，針對TLR4開發(fā)的治療藥物在臨床試驗中效果仍有待進一步提升，如何優(yōu)化藥物設(shè)計，提高藥物療效和安全性，也是未來研究的重要方向。二、Toll樣受體4與動脈粥樣硬化的相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1Toll樣受體4概述Toll樣受體4（TLR4）作為Toll樣受體家族的重要成員，在免疫系統(tǒng)中扮演著關(guān)鍵角色，其發(fā)現(xiàn)歷程充滿了探索與突破。1980年，Nusslein-Volhard等在研究果蠅胚胎發(fā)育時，發(fā)現(xiàn)了Toll基因，該基因決定著果蠅的背腹側(cè)分化。1988年，Hashimoto等人闡明了Toll基因編碼的是一種跨膜蛋白質(zhì)，揭示了Toll蛋白的結(jié)構(gòu)。1991年，Gay等人發(fā)現(xiàn)Toll蛋白在結(jié)構(gòu)上與哺乳動物中白細(xì)胞介素1受體（IL-1R）的細(xì)胞質(zhì)部分具有同源性，首次暗示了Toll與免疫的關(guān)聯(lián)。1996年，JulesA.Hoffmann和他的同事們發(fā)現(xiàn)Toll在果蠅對真菌感染的免疫中起著重要作用，確立了Toll的免疫學(xué)意義。1997年，CharlesJaneway和RuslanMedzhitov鑒定和克隆了人的一種果蠅Toll同源體，將其命名為Toll樣受體4（TLR4），自此開啟了對TLR4深入研究的新篇章。從結(jié)構(gòu)特征來看，TLR4屬于I型跨膜蛋白，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)三部分組成。胞外區(qū)富含亮氨酸重復(fù)序列（LRR），這些LRR序列呈馬蹄狀結(jié)構(gòu)域，其中包含2段保守模塊以及1個配體結(jié)合區(qū)域（LBR）。這種獨特的結(jié)構(gòu)使得胞外區(qū)能夠直接識別病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）和損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）。由于配體結(jié)合區(qū)域在進化過程中具有較大的變異性，這賦予了TLR4識別不同配體分子的能力，使其可以感知多種外來病原體和內(nèi)源性危險信號。跨膜區(qū)由21個主要為半胱氨酸的氨基酸螺旋連接而成，它如同一個橋梁，將胞外區(qū)與胞內(nèi)區(qū)連接起來，并且有助于TLR4在細(xì)胞膜上的精準(zhǔn)定位，確保其能夠在合適的位置接收和傳遞信號。胞內(nèi)區(qū)則是由大約200個氨基酸殘基組成的高度保守的Toll/白細(xì)胞介素-1受體（TIR）結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域是TLR4信號通路活化和傳導(dǎo)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。當(dāng)TLR4識別配體后，TIR結(jié)構(gòu)域會特異性募集接頭分子髓樣分化因子88（MyD88）和β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白（TRIF）。TIR結(jié)構(gòu)域與接頭分子的TIR結(jié)構(gòu)域發(fā)生二聚化，這一過程是活化后TLR4向下游進行信號傳遞的起始步驟，如同信號傳導(dǎo)的“開關(guān)”，一旦開啟，便會引發(fā)一系列的信號級聯(lián)反應(yīng)。在免疫系統(tǒng)中，TLR4發(fā)揮著核心作用，是連接固有免疫和獲得性免疫的重要橋梁。固有免疫是機體抵御病原體入侵的第一道防線，具有快速響應(yīng)的特點，但識別病原體的特異性相對有限。而獲得性免疫則具有高度特異性和記憶性，能夠針對特定病原體產(chǎn)生精準(zhǔn)的免疫應(yīng)答。TLR4在這兩種免疫之間起到了關(guān)鍵的銜接作用。當(dāng)病原體入侵機體時，TLR4能夠識別病原體表面的PAMPs，如細(xì)菌脂多糖（LPS）、病毒雙鏈RNA等，以及機體自身細(xì)胞在應(yīng)激或損傷時釋放的DAMPs，如熱休克蛋白、高遷移率族蛋白B1等。一旦TLR4識別到這些配體，便會啟動一系列復(fù)雜的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。其中主要包括MyD88依賴性和非依賴性兩條信號通路。在MyD88依賴性通路中，TLR4與配體結(jié)合后，其胞內(nèi)的TIR結(jié)構(gòu)域與MyD88結(jié)合，MyD88再招募白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶（IRAK）家族成員，使IRAK發(fā)生磷酸化。磷酸化的IRAK激活腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6），進而激活核因子κB（NF-κB）抑制物的激酶（IKKs）復(fù)合物。IKKs復(fù)合物使IkB磷酸化，磷酸化的IkB發(fā)生泛素化而降解，最終導(dǎo)致NF-κB的活化。活化的NF-κB進入細(xì)胞核，誘導(dǎo)一系列炎性細(xì)胞因子、趨化因子和黏附分子的基因轉(zhuǎn)錄和表達，如白細(xì)胞介素1（IL-1）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等。這些炎性介質(zhì)能夠招募和激活免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞等，引發(fā)炎癥反應(yīng)，從而清除病原體。在TRIF依賴性通路中，TLR4與配體結(jié)合后，通過TRIF激活TANK結(jié)合激酶1（TBK1）和干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3），誘導(dǎo)干擾素（IFN）的產(chǎn)生。IFN具有抗病毒、調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能等作用，進一步增強機體的免疫防御能力。此外，TRIF還能通過激活NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等通路，促進炎癥因子的產(chǎn)生。通過這兩條信號通路，TLR4不僅能夠迅速啟動固有免疫應(yīng)答，對病原體進行初步的防御，還能為獲得性免疫應(yīng)答的啟動提供必要的信號和條件。它能夠激活樹突狀細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞，使其成熟并更好地呈遞抗原給T細(xì)胞，從而啟動獲得性免疫應(yīng)答。在這個過程中，TLR4就像是免疫系統(tǒng)的“預(yù)警雷達”，及時發(fā)現(xiàn)病原體和危險信號，并通過復(fù)雜的信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)，調(diào)動機體的免疫細(xì)胞和免疫分子，共同抵御病原體的入侵，維護機體的免疫平衡和健康。2.2動脈粥樣硬化概述動脈粥樣硬化是一種嚴(yán)重危害人類健康的慢性進行性心血管疾病，其定義為動脈管壁增厚變硬、失去彈性和管腔縮小，主要特征是動脈內(nèi)膜下脂質(zhì)沉積，形成粥樣斑塊。這些斑塊由膽固醇、甘油三酯、磷脂、載脂蛋白以及炎性細(xì)胞等組成，外觀呈黃色粥樣，故而得名。動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展是一個復(fù)雜的病理過程，涉及多個階段和多種細(xì)胞的參與。從病理特征來看，動脈粥樣硬化的早期病變表現(xiàn)為脂紋，主要由內(nèi)皮下大量脂質(zhì)和泡沫細(xì)胞聚集而成。泡沫細(xì)胞是由巨噬細(xì)胞吞噬氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）后形成的，它們的出現(xiàn)標(biāo)志著動脈粥樣硬化的起始。隨著病變的進展，脂紋逐漸發(fā)展為纖維斑塊，纖維斑塊由脂質(zhì)核心、纖維帽和周邊的平滑肌細(xì)胞、炎性細(xì)胞等組成。纖維帽主要由平滑肌細(xì)胞分泌的膠原蛋白、彈性蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成，起到穩(wěn)定斑塊的作用。然而，在某些因素的作用下，纖維帽可能會變薄、破裂，導(dǎo)致脂質(zhì)核心暴露，引發(fā)血小板聚集和血栓形成，形成粥樣潰瘍和血栓，這是動脈粥樣硬化的晚期病變，也是導(dǎo)致急性心血管事件如心肌梗死、腦卒中等發(fā)生的主要原因。動脈粥樣硬化的發(fā)病機制十分復(fù)雜，目前尚未完全明確，但普遍認(rèn)為是多種因素共同作用的結(jié)果。炎癥反應(yīng)在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起著核心作用。當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞受到各種危險因素的刺激，如高血脂、高血壓、高血糖、吸煙、感染等，會發(fā)生功能障礙，表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞的通透性增加、黏附分子表達上調(diào)、炎性細(xì)胞因子釋放等。這些變化使得血液中的單核細(xì)胞、低密度脂蛋白（LDL）等成分更容易進入血管內(nèi)膜下。單核細(xì)胞進入內(nèi)膜下后分化為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞通過表面的清道夫受體大量攝取ox-LDL，逐漸轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞。泡沫細(xì)胞的堆積形成脂紋，啟動了動脈粥樣硬化的進程。同時，巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞釋放的炎性細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1（IL-1）、白細(xì)胞介素6（IL-6）等，會進一步招募和激活更多的炎性細(xì)胞，如T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等，形成慢性炎癥微環(huán)境。在這個微環(huán)境中，炎性細(xì)胞分泌的多種蛋白酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等，會降解細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致纖維帽變薄，斑塊穩(wěn)定性下降。脂質(zhì)代謝紊亂也是動脈粥樣硬化發(fā)生的重要因素。血液中LDL水平升高，尤其是ox-LDL的增加，是動脈粥樣硬化的主要危險因素之一。ox-LDL具有很強的細(xì)胞毒性，能夠損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進炎癥反應(yīng)，同時也是泡沫細(xì)胞形成的關(guān)鍵物質(zhì)。高密度脂蛋白（HDL）則具有抗動脈粥樣硬化的作用，它可以通過逆向轉(zhuǎn)運膽固醇，將動脈壁中的膽固醇轉(zhuǎn)運回肝臟進行代謝，從而減少脂質(zhì)在血管壁的沉積。此外，HDL還具有抗氧化、抗炎、抗血栓等多種功能，能夠抑制動脈粥樣硬化的發(fā)展。氧化應(yīng)激在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中也扮演著重要角色。當(dāng)機體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時，體內(nèi)產(chǎn)生過多的活性氧（ROS），如超氧陰離子、過氧化氫、羥自由基等。這些ROS會氧化修飾LDL，形成ox-LDL，同時還會損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞、促進炎性細(xì)胞因子的釋放、激活細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而加速動脈粥樣硬化的進程。血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移在動脈粥樣硬化的發(fā)展過程中也起著重要作用。在炎癥因子和生長因子的刺激下，血管平滑肌細(xì)胞從收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚停哂懈鼜姷脑鲋澈瓦w移能力。它們遷移到內(nèi)膜下，分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)，參與纖維斑塊的形成。同時，平滑肌細(xì)胞的增殖還會導(dǎo)致血管壁增厚，管腔狹窄，進一步加重血流動力學(xué)異常。動脈粥樣硬化的主要危險因素包括高血脂、高血壓、糖尿病、吸煙、肥胖、遺傳因素等。高血脂，尤其是高膽固醇血癥和高甘油三酯血癥，以及低HDL血癥，與動脈粥樣硬化的發(fā)生密切相關(guān)。高血壓會增加血管壁的壓力，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進脂質(zhì)沉積和炎癥反應(yīng)。糖尿病患者常伴有糖代謝紊亂和脂代謝異常，高血糖會導(dǎo)致蛋白質(zhì)糖基化，產(chǎn)生糖基化終末產(chǎn)物（AGEs），AGEs具有很強的氧化應(yīng)激作用，能夠損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進動脈粥樣硬化的發(fā)生。吸煙中的尼古丁、焦油等有害物質(zhì)會損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，降低HDL水平，增加血液黏稠度，促進血栓形成。肥胖患者往往伴有胰島素抵抗、高血脂、高血壓等代謝紊亂，這些因素都會增加動脈粥樣硬化的發(fā)病風(fēng)險。遺傳因素在動脈粥樣硬化的發(fā)生中也起著重要作用，某些基因突變會導(dǎo)致脂質(zhì)代謝異常、炎癥反應(yīng)增強等，使個體更容易患動脈粥樣硬化。2.3Toll樣受體4與動脈粥樣硬化的關(guān)聯(lián)Toll樣受體4與動脈粥樣硬化之間存在著緊密且復(fù)雜的關(guān)聯(lián)，這種關(guān)聯(lián)主要體現(xiàn)在炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)以及對血管細(xì)胞功能的影響等多個關(guān)鍵方面。炎癥反應(yīng)是TLR4與動脈粥樣硬化關(guān)聯(lián)的核心紐帶。在動脈粥樣硬化的起始階段，血管內(nèi)皮細(xì)胞由于受到諸如高血脂、高血壓、高血糖、吸煙、感染等多種危險因素的刺激，其正常功能會遭到破壞，表現(xiàn)為細(xì)胞間連接松散、通透性增加，同時分泌一系列炎性細(xì)胞因子和趨化因子，如白細(xì)胞介素6（IL-6）、單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）等。這些變化使得血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的TLR4表達上調(diào)，并且增強了其對配體的敏感性。當(dāng)TLR4識別到病原體相關(guān)分子模式（PAMPs），如細(xì)菌脂多糖（LPS），或者損傷相關(guān)分子模式（DAMPs），如氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）、熱休克蛋白（HSPs）、高遷移率族蛋白B1（HMGB1）等內(nèi)源性危險信號分子時，便會迅速啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。在MyD88依賴性信號通路中，TLR4與配體結(jié)合后，其胞內(nèi)的TIR結(jié)構(gòu)域會與髓樣分化因子88（MyD88）結(jié)合。MyD88再招募白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶（IRAK）家族成員，包括IRAK1、IRAK2和IRAK4，使它們發(fā)生磷酸化。磷酸化的IRAK激活腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6），TRAF6進一步激活核因子κB（NF-κB）抑制物的激酶（IKKs）復(fù)合物。IKKs復(fù)合物使抑制蛋白IkB磷酸化，磷酸化的IkB隨即發(fā)生泛素化并被降解，從而解除了對NF-κB的抑制，使其得以活化并進入細(xì)胞核。在細(xì)胞核內(nèi)，NF-κB與特定的DNA序列結(jié)合，啟動一系列炎性細(xì)胞因子、趨化因子和黏附分子的基因轉(zhuǎn)錄和表達，如白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、細(xì)胞間黏附分子1（ICAM-1）、血管細(xì)胞黏附分子1（VCAM-1）等。這些炎性介質(zhì)會吸引血液中的單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞向血管內(nèi)膜下遷移和聚集。單核細(xì)胞進入內(nèi)膜下后，會分化為巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞通過表面的清道夫受體大量攝取ox-LDL，逐漸轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞，泡沫細(xì)胞的大量堆積形成脂紋，標(biāo)志著動脈粥樣硬化的起始。同時，TNF-α、IL-1β等炎性細(xì)胞因子還會進一步激活內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞，促使它們分泌更多的炎性介質(zhì)，形成炎癥的級聯(lián)放大反應(yīng)。在TRIF依賴性信號通路中，TLR4與配體結(jié)合后，通過β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白（TRIF）激活TANK結(jié)合激酶1（TBK1）和干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3），誘導(dǎo)干擾素（IFN）的產(chǎn)生。IFN具有抗病毒、調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能等作用，但同時也會促進炎癥反應(yīng)的發(fā)生。此外，TRIF還能通過激活NF-κB和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）等通路，進一步促進炎癥因子的產(chǎn)生，加劇炎癥反應(yīng)。免疫調(diào)節(jié)方面，TLR4在動脈粥樣硬化進程中對固有免疫和適應(yīng)性免疫均有著重要的調(diào)節(jié)作用。在固有免疫中，TLR4激活后，巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等抗原呈遞細(xì)胞被活化，它們不僅會分泌大量炎性細(xì)胞因子，還會表達更多的共刺激分子，如CD80、CD86等。這些共刺激分子與T細(xì)胞表面的相應(yīng)受體結(jié)合，為T細(xì)胞的活化提供第二信號，從而促進T細(xì)胞的增殖和分化?；罨腡細(xì)胞進一步釋放細(xì)胞因子，如干擾素γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素2（IL-2）等，這些細(xì)胞因子會增強巨噬細(xì)胞的吞噬能力和殺傷活性，同時也會促進其他免疫細(xì)胞的活化和募集，進一步加劇炎癥反應(yīng)。在適應(yīng)性免疫中，TLR4通過調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞的功能，影響T細(xì)胞和B細(xì)胞的活化和分化。樹突狀細(xì)胞攝取抗原后，在TLR4信號的作用下，會成熟并遷移到淋巴結(jié)，將抗原呈遞給T細(xì)胞。不同類型的T細(xì)胞在TLR4信號的影響下，會分化為不同的亞群，如Th1、Th2、Th17和Treg等。Th1細(xì)胞主要分泌IFN-γ等細(xì)胞因子，參與細(xì)胞免疫應(yīng)答，促進炎癥反應(yīng)；Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5等細(xì)胞因子，參與體液免疫應(yīng)答，在一定程度上抑制炎癥反應(yīng)；Th17細(xì)胞主要分泌IL-17等細(xì)胞因子，具有很強的促炎作用；Treg細(xì)胞則通過分泌抑制性細(xì)胞因子，如IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）等，抑制免疫細(xì)胞的活化和炎癥反應(yīng)。在動脈粥樣硬化中，TLR4的激活會打破這些T細(xì)胞亞群之間的平衡，導(dǎo)致Th1和Th17細(xì)胞的比例增加，Treg細(xì)胞的比例減少，從而促進炎癥反應(yīng)和動脈粥樣硬化的發(fā)展。對血管細(xì)胞功能的影響也是TLR4與動脈粥樣硬化關(guān)聯(lián)的重要體現(xiàn)。在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，TLR4激活后會導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，表現(xiàn)為一氧化氮（NO）釋放減少，內(nèi)皮素1（ET-1）釋放增加。NO是一種重要的血管舒張因子，其釋放減少會導(dǎo)致血管收縮，血流阻力增加；ET-1是一種強效的血管收縮因子，其釋放增加會進一步加劇血管收縮。此外，TLR4激活還會使內(nèi)皮細(xì)胞表面的黏附分子表達增加，促進炎性細(xì)胞的黏附和遷移，同時也會增加內(nèi)皮細(xì)胞對ox-LDL的攝取，加速脂質(zhì)沉積。在血管平滑肌細(xì)胞中，TLR4激活會促使平滑肌細(xì)胞從收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚?。合成型平滑肌?xì)胞具有更強的增殖和遷移能力，它們會遷移到內(nèi)膜下，分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)，如膠原蛋白、彈性蛋白等，參與纖維斑塊的形成。同時，平滑肌細(xì)胞的增殖還會導(dǎo)致血管壁增厚，管腔狹窄，進一步加重血流動力學(xué)異常。此外，TLR4激活還會影響平滑肌細(xì)胞的收縮功能，使其對血管收縮物質(zhì)的反應(yīng)性增強，導(dǎo)致血管痙攣。在巨噬細(xì)胞中，TLR4激活會促進巨噬細(xì)胞對ox-LDL的攝取和泡沫細(xì)胞的形成。同時，巨噬細(xì)胞會分泌更多的炎性細(xì)胞因子和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）。MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，導(dǎo)致纖維帽變薄，斑塊穩(wěn)定性下降，增加斑塊破裂和血栓形成的風(fēng)險。三、Toll樣受體4與動脈粥樣硬化關(guān)系的研究方法3.1實驗動物模型的建立3.1.1動脈粥樣硬化動物模型小鼠是常用的實驗動物，其繁殖周期短、飼養(yǎng)成本低，且基因編輯技術(shù)成熟，便于構(gòu)建各種基因修飾模型。在構(gòu)建小鼠動脈粥樣硬化模型時，載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠和低密度脂蛋白受體基因敲除（Ldlr-/-）小鼠是常用的品系。ApoE在脂蛋白代謝中起著關(guān)鍵作用，ApoE-/-小鼠缺乏ApoE，導(dǎo)致血漿中膽固醇和甘油三酯水平顯著升高。在正常飲食條件下，ApoE-/-小鼠就會逐漸出現(xiàn)動脈粥樣硬化病變，隨著年齡的增長，病變會不斷進展。通常在8周齡左右，ApoE-/-小鼠主動脈根部開始出現(xiàn)脂質(zhì)條紋，16周齡時，動脈粥樣硬化病變較為明顯，表現(xiàn)為內(nèi)膜下脂質(zhì)沉積、泡沫細(xì)胞形成。Ldlr負(fù)責(zé)介導(dǎo)低密度脂蛋白（LDL）的攝取和代謝，Ldlr-/-小鼠由于Ldlr基因缺失，無法有效清除血液中的LDL，使得血漿LDL水平升高。給予Ldlr-/-小鼠高脂飲食，能加速動脈粥樣硬化的發(fā)展。一般在高脂飲食4-8周后，Ldlr-/-小鼠主動脈弓和冠狀動脈等部位會出現(xiàn)明顯的粥樣斑塊。兔子也是構(gòu)建動脈粥樣硬化模型的常用動物，其優(yōu)點是體型較大，便于進行各種操作和檢測。以新西蘭大白兔為例，高脂飲食法是常用的建模方法之一。給予兔子高脂飼料，飼料中通常含有高膽固醇（1%-2%）、高脂肪（5%-10%）等成分。在高脂飲食喂養(yǎng)12-16周后，兔子主動脈和冠狀動脈等部位會出現(xiàn)明顯的動脈粥樣硬化病變。內(nèi)膜損傷結(jié)合高脂飲食法能更快速地誘導(dǎo)動脈粥樣硬化模型的形成。在高脂飲食的基礎(chǔ)上，通過手術(shù)對兔子的腹主動脈或頸動脈內(nèi)膜進行損傷，如使用球囊導(dǎo)管損傷內(nèi)膜。這種方法可使兔子在8-12周內(nèi)就形成較為穩(wěn)定的動脈粥樣硬化斑塊，斑塊內(nèi)含有大量的脂質(zhì)、泡沫細(xì)胞和炎性細(xì)胞，纖維帽較薄，更接近人類動脈粥樣硬化斑塊的特征。3.1.2Toll樣受體4相關(guān)基因編輯動物模型對于Toll樣受體4基因敲除小鼠，利用基因編輯技術(shù)，如CRISPR/Cas9系統(tǒng)，在小鼠胚胎干細(xì)胞中對Tlr4基因進行敲除。將經(jīng)過基因編輯的胚胎干細(xì)胞注射到小鼠囊胚中，再將囊胚移植到假孕母鼠的子宮內(nèi)，使其發(fā)育成嵌合體小鼠。通過后續(xù)的繁育和篩選，獲得純合的Tlr4基因敲除小鼠。Tlr4基因敲除小鼠缺失功能性的TLR4蛋白，在研究TLR4在動脈粥樣硬化中的作用機制時，可將其與ApoE-/-或Ldlr-/-小鼠進行雜交。雜交后代小鼠同時具備動脈粥樣硬化易感性和TLR4缺失的特點，通過觀察這些小鼠在高脂飲食或其他刺激條件下動脈粥樣硬化的發(fā)展情況，與正常對照小鼠進行對比。若雜交后代小鼠的動脈粥樣硬化病變明顯減輕，如斑塊面積減小、炎癥細(xì)胞浸潤減少、炎性細(xì)胞因子表達降低等，可表明TLR4在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中起促進作用。Toll樣受體4過表達小鼠模型的構(gòu)建可采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)。將編碼TLR4的基因與特定的啟動子連接，構(gòu)建表達載體。例如，使用巨細(xì)胞病毒（CMV）啟動子或肝臟特異性啟動子，將表達載體通過顯微注射的方法導(dǎo)入小鼠受精卵的雄原核中。將注射后的受精卵移植到假孕母鼠的子宮內(nèi)，使其發(fā)育成轉(zhuǎn)基因小鼠。對轉(zhuǎn)基因小鼠進行鑒定，篩選出TLR4過表達的小鼠品系。在研究中，將TLR4過表達小鼠與正常小鼠同時給予高脂飲食或其他動脈粥樣硬化誘導(dǎo)因素。若TLR4過表達小鼠的動脈粥樣硬化病變加重，如斑塊面積增大、纖維帽變薄、炎癥反應(yīng)增強等，可進一步證實TLR4在動脈粥樣硬化中的促炎作用。3.2細(xì)胞實驗方法3.2.1細(xì)胞培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的培養(yǎng)：從新鮮的臍帶中分離出臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，將其接種于含10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素-鏈霉素雙抗的M199培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至80%-90%融合時，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液進行消化傳代。傳代時，輕輕吸去舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液沖洗細(xì)胞2-3次，加入適量消化液，在顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞變圓、脫離瓶壁時，立即加入含血清的培養(yǎng)基終止消化。然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000r/min離心5min，棄上清，加入新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照1:2或1:3的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的培養(yǎng)：將RAW264.7細(xì)胞復(fù)蘇后，接種于含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基中。同樣置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞長滿后進行傳代。傳代方法與HUVECs類似，先吸去舊培養(yǎng)基，PBS沖洗，加入消化液消化，待細(xì)胞脫離瓶壁后，加入含血清培養(yǎng)基終止消化，離心收集細(xì)胞，重懸后接種到新培養(yǎng)瓶。在培養(yǎng)過程中，定期觀察細(xì)胞形態(tài)和生長狀態(tài)，確保細(xì)胞處于良好的生長環(huán)境。3.2.2細(xì)胞刺激對于HUVECs，當(dāng)細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時，進行刺激實驗。實驗組加入終濃度為100ng/mL的脂多糖（LPS），以模擬病原體感染，刺激時間設(shè)定為6h、12h和24h。同時設(shè)置對照組，加入等體積的無菌PBS緩沖液。在刺激過程中，每隔一定時間觀察細(xì)胞形態(tài)變化，如細(xì)胞是否出現(xiàn)腫脹、變形，細(xì)胞間連接是否改變等。對于RAW264.7細(xì)胞，將細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，實驗組加入終濃度為50μg/mL的氧化低密度脂蛋白（ox-LDL），刺激時間為12h、24h和48h。對照組加入等體積的無血清DMEM培養(yǎng)基。在刺激不同時間點，收集細(xì)胞及培養(yǎng)上清液，用于后續(xù)檢測。3.2.3檢測指標(biāo)及方法采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中炎性細(xì)胞因子的水平。如檢測白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）和白細(xì)胞介素1β（IL-1β）等。按照ELISA試劑盒說明書進行操作，首先將捕獲抗體包被在酶標(biāo)板上，4℃過夜。次日，棄去包被液，用洗滌緩沖液洗滌3-5次。然后加入封閉液，37℃孵育1-2h，以減少非特異性結(jié)合。棄去封閉液，加入不同稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品，37℃孵育1-2h。再次洗滌后，加入生物素化的檢測抗體，37℃孵育1h。洗滌后，加入鏈霉親和素-辣根過氧化物酶（HRP）結(jié)合物，37℃孵育30min。最后加入底物溶液，室溫避光反應(yīng)15-30min，加入終止液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中炎性細(xì)胞因子的濃度。利用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）檢測細(xì)胞中相關(guān)基因的表達水平。提取細(xì)胞總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，進行qPCR反應(yīng)。反應(yīng)體系包括SYBRGreenMasterMix、上下游引物和cDNA模板。引物設(shè)計根據(jù)目的基因序列，如TLR4、MyD88、NF-κB等基因。反應(yīng)條件一般為95℃預(yù)變性30s，然后95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達。收集細(xì)胞，加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白。用BCA法測定蛋白濃度，然后將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5min。將變性后的蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1-2h，以阻斷非特異性結(jié)合。封閉后，加入一抗，如抗TLR4抗體、抗MyD88抗體、抗NF-κBp65抗體等，4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3-5次，每次10min。然后加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1-2h。再次洗滌后，加入化學(xué)發(fā)光底物，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)下曝光顯影，分析蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參，計算目的蛋白的相對表達量。3.3臨床研究方法臨床研究選取某三甲醫(yī)院心內(nèi)科收治的患者作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)為：經(jīng)冠狀動脈造影或血管超聲確診為動脈粥樣硬化患者，年齡在40-75歲之間；簽署知情同意書，自愿參與本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)為：近期（3個月內(nèi)）有急性感染、創(chuàng)傷、手術(shù)史；患有惡性腫瘤、自身免疫性疾病、嚴(yán)重肝腎功能不全等影響研究結(jié)果的疾??；正在使用免疫抑制劑、抗炎藥物或其他可能影響TLR4表達及動脈粥樣硬化進程的藥物。最終納入動脈粥樣硬化患者100例，同時選取50例年齡、性別匹配的健康體檢者作為對照組。在樣本采集方面，所有研究對象均于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下采集外周靜脈血5ml。將采集的血液注入含有乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝劑的采血管中，輕輕顛倒混勻，防止血液凝固。采集的血樣在2小時內(nèi)進行處理，以3000r/min的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，分離出血漿，將血漿轉(zhuǎn)移至無菌凍存管中，標(biāo)記后置于-80℃冰箱中保存，待后續(xù)檢測。對于動脈粥樣硬化患者，若有機會進行血管介入治療或手術(shù)切除病變血管組織，在取得患者同意后，采集少量動脈粥樣硬化斑塊組織。將采集的斑塊組織迅速放入預(yù)冷的生理鹽水中沖洗，去除表面的血液和雜質(zhì)，然后將其切成小塊，一部分放入10%中性甲醛溶液中固定，用于病理切片和免疫組織化學(xué)檢測；另一部分置于液氮中速凍，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，用于蛋白質(zhì)和核酸提取。采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測血漿中TLR4、炎性細(xì)胞因子（如白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β））以及脂質(zhì)相關(guān)指標(biāo)（如總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C））的水平。操作過程嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進行，在酶標(biāo)儀上測定各樣本的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出相應(yīng)指標(biāo)的濃度。運用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）檢測動脈粥樣硬化斑塊組織中TLR4及相關(guān)炎癥基因（如MyD88、NF-κB等）的mRNA表達水平。提取組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行qPCR反應(yīng)，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參基因，采用2?ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。利用免疫組織化學(xué)法檢測動脈粥樣硬化斑塊組織中TLR4蛋白的表達和定位。將固定好的斑塊組織制成石蠟切片，依次進行脫蠟、水化、抗原修復(fù)、封閉等步驟，然后加入抗TLR4抗體孵育，再加入相應(yīng)的二抗和顯色劑進行顯色，最后在顯微鏡下觀察并拍照，分析TLR4蛋白的表達強度和分布情況。對于數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，使用SPSS22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，進一步進行兩兩比較（LSD法）。計數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Pearson相關(guān)分析或Spearman相關(guān)分析探討TLR4表達與動脈粥樣硬化相關(guān)指標(biāo)之間的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。四、Toll樣受體4在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用機制4.1Toll樣受體4的信號傳導(dǎo)通路Toll樣受體4（TLR4）的信號傳導(dǎo)通路主要包括MyD88依賴性和非依賴性兩條通路，它們在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，通過一系列復(fù)雜的分子相互作用，調(diào)控炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖與遷移等生物學(xué)過程。MyD88依賴性信號通路是TLR4信號傳導(dǎo)的經(jīng)典途徑。當(dāng)TLR4識別病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）如細(xì)菌脂多糖（LPS），或損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）如氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）、熱休克蛋白（HSPs）等配體后，其胞內(nèi)的Toll/白細(xì)胞介素-1受體（TIR）結(jié)構(gòu)域會與髓樣分化因子88（MyD88）結(jié)合。MyD88分子含有死亡結(jié)構(gòu)域（DD）和TIR結(jié)構(gòu)域，其TIR結(jié)構(gòu)域與TLR4的TIR結(jié)構(gòu)域相互作用，而死亡結(jié)構(gòu)域則負(fù)責(zé)招募白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶（IRAK）家族成員。IRAK家族包括IRAK1、IRAK2、IRAK4和IRAK-M，其中IRAK4在信號傳導(dǎo)的起始階段起著關(guān)鍵作用。MyD88與IRAK4結(jié)合后，促使IRAK4發(fā)生自身磷酸化，激活的IRAK4進一步磷酸化IRAK1和IRAK2。磷酸化的IRAK1和IRAK2從MyD88復(fù)合物中解離出來，與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）相互作用。TRAF6是一種E3泛素連接酶，它能催化自身發(fā)生K63連接的多聚泛素化修飾。泛素化的TRAF6招募并激活轉(zhuǎn)化生長因子β激活激酶1（TAK1）及其結(jié)合蛋白TAB1和TAB2。TAK1是絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶（MAP3K）家族的成員，被激活后，它可以通過兩條主要途徑進一步傳遞信號。一方面，TAK1激活核因子κB（NF-κB）抑制物的激酶（IKKs）復(fù)合物，該復(fù)合物由IKKα、IKKβ和調(diào)節(jié)亞基IKKγ（也稱為NEMO）組成。IKKβ磷酸化抑制蛋白IkB，使其發(fā)生泛素化修飾，進而被蛋白酶體降解。IkB的降解使得NF-κB得以釋放，NF-κB由p50和p65亞基組成，活化后轉(zhuǎn)位進入細(xì)胞核，與特定的DNA序列結(jié)合，啟動一系列炎性細(xì)胞因子、趨化因子和黏附分子的基因轉(zhuǎn)錄和表達，如白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）、細(xì)胞間黏附分子1（ICAM-1）、血管細(xì)胞黏附分子1（VCAM-1）等。這些炎性介質(zhì)的釋放吸引血液中的單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞向血管內(nèi)膜下遷移和聚集，引發(fā)炎癥反應(yīng)，促進動脈粥樣硬化的發(fā)展。另一方面，TAK1激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK。激活的MAPK進一步磷酸化下游的轉(zhuǎn)錄因子，如激活蛋白1（AP-1）等，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和炎癥反應(yīng)等過程，在動脈粥樣硬化中，MAPK的激活可促進血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，參與纖維斑塊的形成。MyD88非依賴性信號通路（也稱為TRIF依賴性信號通路）在TLR4信號傳導(dǎo)中也起著重要作用。在這條通路中，TLR4與配體結(jié)合后，通過TIR結(jié)構(gòu)域招募含有TIR結(jié)構(gòu)域的接頭分子β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白（TRIF）。TRIF分子含有TIR結(jié)構(gòu)域和一個RIP同源相互作用基序（RHIM）。TRIF通過其RHIM結(jié)構(gòu)域與受體相互作用蛋白1（RIP1）和RIP3相互作用，形成一個信號復(fù)合物。RIP1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它在TRIF依賴性信號通路中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。RIP1的激酶活性對于激活下游信號分子至關(guān)重要。TRIF還可以通過TANK結(jié)合激酶1（TBK1）和干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3）途徑發(fā)揮作用。TBK1被TRIF招募并激活，激活的TBK1磷酸化IRF3。IRF3是一種轉(zhuǎn)錄因子，磷酸化后發(fā)生二聚化并轉(zhuǎn)位進入細(xì)胞核，與特定的DNA序列結(jié)合，誘導(dǎo)干擾素（IFN）相關(guān)基因的表達，如IFN-β等。IFN具有抗病毒、調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能等作用，但在動脈粥樣硬化中，IFN的產(chǎn)生也會促進炎癥反應(yīng)。此外，TRIF還能通過激活NF-κB和MAPK等通路，促進炎癥因子的產(chǎn)生。在NF-κB激活過程中，TRIF可能通過與TRAF6等分子相互作用，間接激活I(lǐng)KKs復(fù)合物，從而導(dǎo)致NF-κB的活化。在MAPK激活方面，TRIF可能通過激活其他MAP3K家族成員，如ASK1等，進而激活JNK和p38MAPK，促進炎癥因子的表達。MyD88非依賴性信號通路在動脈粥樣硬化中的作用主要體現(xiàn)在調(diào)節(jié)抗病毒免疫反應(yīng)、促進炎癥反應(yīng)以及影響細(xì)胞的存活和凋亡等方面。在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中，病毒感染或內(nèi)源性危險信號可能通過激活TRIF依賴性信號通路，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的加劇和斑塊的不穩(wěn)定。4.2Toll樣受體4對炎癥反應(yīng)的調(diào)控在動脈粥樣硬化的起始階段，血管內(nèi)皮細(xì)胞由于受到諸如高血脂、高血壓、高血糖、吸煙、感染等多種危險因素的刺激，其正常功能會遭到破壞，表現(xiàn)為細(xì)胞間連接松散、通透性增加，同時分泌一系列炎性細(xì)胞因子和趨化因子，如白細(xì)胞介素6（IL-6）、單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）等。這些變化使得血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的TLR4表達上調(diào)，并且增強了其對配體的敏感性。當(dāng)TLR4識別到病原體相關(guān)分子模式（PAMPs），如細(xì)菌脂多糖（LPS），或者損傷相關(guān)分子模式（DAMPs），如氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）、熱休克蛋白（HSPs）、高遷移率族蛋白B1（HMGB1）等內(nèi)源性危險信號分子時，便會迅速啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。在MyD88依賴性信號通路中，TLR4與配體結(jié)合后，其胞內(nèi)的TIR結(jié)構(gòu)域會與髓樣分化因子88（MyD88）結(jié)合。MyD88分子含有死亡結(jié)構(gòu)域（DD）和TIR結(jié)構(gòu)域，其TIR結(jié)構(gòu)域與TLR4的TIR結(jié)構(gòu)域相互作用，而死亡結(jié)構(gòu)域則負(fù)責(zé)招募白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶（IRAK）家族成員。IRAK家族包括IRAK1、IRAK2、IRAK4和IRAK-M，其中IRAK4在信號傳導(dǎo)的起始階段起著關(guān)鍵作用。MyD88與IRAK4結(jié)合后，促使IRAK4發(fā)生自身磷酸化，激活的IRAK4進一步磷酸化IRAK1和IRAK2。磷酸化的IRAK1和IRAK2從MyD88復(fù)合物中解離出來，與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）相互作用。TRAF6是一種E3泛素連接酶，它能催化自身發(fā)生K63連接的多聚泛素化修飾。泛素化的TRAF6招募并激活轉(zhuǎn)化生長因子β激活激酶1（TAK1）及其結(jié)合蛋白TAB1和TAB2。TAK1是絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶（MAP3K）家族的成員，被激活后，它可以通過兩條主要途徑進一步傳遞信號。一方面，TAK1激活核因子κB（NF-κB）抑制物的激酶（IKKs）復(fù)合物，該復(fù)合物由IKKα、IKKβ和調(diào)節(jié)亞基IKKγ（也稱為NEMO）組成。IKKβ磷酸化抑制蛋白IkB，使其發(fā)生泛素化修飾，進而被蛋白酶體降解。IkB的降解使得NF-κB得以釋放，NF-κB由p50和p65亞基組成，活化后轉(zhuǎn)位進入細(xì)胞核，與特定的DNA序列結(jié)合，啟動一系列炎性細(xì)胞因子、趨化因子和黏附分子的基因轉(zhuǎn)錄和表達，如白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）、細(xì)胞間黏附分子1（ICAM-1）、血管細(xì)胞黏附分子1（VCAM-1）等。這些炎性介質(zhì)的釋放吸引血液中的單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞向血管內(nèi)膜下遷移和聚集，引發(fā)炎癥反應(yīng)，促進動脈粥樣硬化的發(fā)展。另一方面，TAK1激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK。激活的MAPK進一步磷酸化下游的轉(zhuǎn)錄因子，如激活蛋白1（AP-1）等，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和炎癥反應(yīng)等過程，在動脈粥樣硬化中，MAPK的激活可促進血管平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，參與纖維斑塊的形成。在TRIF依賴性信號通路中，TLR4與配體結(jié)合后，通過TIR結(jié)構(gòu)域招募含有TIR結(jié)構(gòu)域的接頭分子β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白（TRIF）。TRIF分子含有TIR結(jié)構(gòu)域和一個RIP同源相互作用基序（RHIM）。TRIF通過其RHIM結(jié)構(gòu)域與受體相互作用蛋白1（RIP1）和RIP3相互作用，形成一個信號復(fù)合物。RIP1是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它在TRIF依賴性信號通路中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。RIP1的激酶活性對于激活下游信號分子至關(guān)重要。TRIF還可以通過TANK結(jié)合激酶1（TBK1）和干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3）途徑發(fā)揮作用。TBK1被TRIF招募并激活，激活的TBK1磷酸化IRF3。IRF3是一種轉(zhuǎn)錄因子，磷酸化后發(fā)生二聚化并轉(zhuǎn)位進入細(xì)胞核，與特定的DNA序列結(jié)合，誘導(dǎo)干擾素（IFN）相關(guān)基因的表達，如IFN-β等。IFN具有抗病毒、調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞功能等作用，但在動脈粥樣硬化中，IFN的產(chǎn)生也會促進炎癥反應(yīng)。此外，TRIF還能通過激活NF-κB和MAPK等通路，促進炎癥因子的產(chǎn)生。在NF-κB激活過程中，TRIF可能通過與TRAF6等分子相互作用，間接激活I(lǐng)KKs復(fù)合物，從而導(dǎo)致NF-κB的活化。在MAPK激活方面，TRIF可能通過激活其他MAP3K家族成員，如ASK1等，進而激活JNK和p38MAPK，促進炎癥因子的表達。MyD88非依賴性信號通路在動脈粥樣硬化中的作用主要體現(xiàn)在調(diào)節(jié)抗病毒免疫反應(yīng)、促進炎癥反應(yīng)以及影響細(xì)胞的存活和凋亡等方面。在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中，病毒感染或內(nèi)源性危險信號可能通過激活TRIF依賴性信號通路，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的加劇和斑塊的不穩(wěn)定。4.3Toll樣受體4對脂質(zhì)代謝的影響Toll樣受體4（TLR4）對脂質(zhì)代謝的影響在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中扮演著關(guān)鍵角色，主要通過影響脂質(zhì)攝取、代謝和轉(zhuǎn)運等多個環(huán)節(jié)，導(dǎo)致脂質(zhì)在血管壁的異常沉積，從而促進動脈粥樣硬化的進程。在脂質(zhì)攝取方面，TLR4的激活能夠顯著增強巨噬細(xì)胞對氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）的攝取能力，這一過程與清道夫受體的表達密切相關(guān)。研究表明，當(dāng)巨噬細(xì)胞受到TLR4配體如脂多糖（LPS）或ox-LDL刺激時，細(xì)胞內(nèi)的TLR4信號通路被激活。在MyD88依賴性信號通路中，TLR4與配體結(jié)合后，通過MyD88招募白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶（IRAK），激活的IRAK進一步激活腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6）。TRAF6通過激活核因子κB（NF-κB）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路，上調(diào)清道夫受體A（SR-A）和CD36等清道夫受體的表達。SR-A和CD36能夠特異性地識別和結(jié)合ox-LDL，促進巨噬細(xì)胞對ox-LDL的攝取。一項細(xì)胞實驗研究發(fā)現(xiàn)，用LPS刺激小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7后，SR-A和CD36的mRNA和蛋白表達水平顯著升高，同時細(xì)胞對ox-LDL的攝取量也明顯增加。當(dāng)使用siRNA干擾TLR4基因表達后，LPS誘導(dǎo)的SR-A和CD36表達上調(diào)以及ox-LDL攝取增加的現(xiàn)象被明顯抑制。這充分表明，TLR4通過上調(diào)清道夫受體的表達，促進巨噬細(xì)胞對ox-LDL的攝取，加速泡沫細(xì)胞的形成，而泡沫細(xì)胞的大量堆積是動脈粥樣硬化早期病變的重要特征。在脂質(zhì)代謝過程中，TLR4對膽固醇代謝相關(guān)酶和轉(zhuǎn)運蛋白的表達和功能產(chǎn)生重要影響。膽固醇酯化是細(xì)胞內(nèi)膽固醇代謝的重要環(huán)節(jié)，膽固醇?；D(zhuǎn)移酶1（ACAT1）是催化膽固醇酯化的關(guān)鍵酶。研究發(fā)現(xiàn)，TLR4激活后，通過MyD88依賴性信號通路，激活NF-κB和AP-1等轉(zhuǎn)錄因子，上調(diào)ACAT1的表達。ACAT1活性增強，促使細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇與脂肪酸結(jié)合，形成膽固醇酯儲存起來。在動脈粥樣硬化病變部位，巨噬細(xì)胞因TLR4激活導(dǎo)致ACAT1表達增加，使得細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯大量蓄積，進一步促進泡沫細(xì)胞的形成和發(fā)展。膽固醇逆向轉(zhuǎn)運是維持體內(nèi)膽固醇平衡的重要機制，三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1（ABCA1）和三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體G1（ABCG1）是參與膽固醇逆向轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵轉(zhuǎn)運蛋白。TLR4激活后，會抑制ABCA1和ABCG1的表達和功能。在MyD88非依賴性信號通路中，TLR4通過激活TANK結(jié)合激酶1（TBK1）和干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3），抑制肝臟X受體（LXR）的活性。LXR是調(diào)控ABCA1和ABCG1表達的重要轉(zhuǎn)錄因子，其活性受到抑制后，ABCA1和ABCG1的表達減少，導(dǎo)致膽固醇逆向轉(zhuǎn)運受阻。細(xì)胞內(nèi)多余的膽固醇無法有效轉(zhuǎn)運出去，進一步加重脂質(zhì)沉積，促進動脈粥樣硬化的發(fā)展。有研究對TLR4基因敲除小鼠和野生型小鼠進行對比，發(fā)現(xiàn)TLR4基因敲除小鼠巨噬細(xì)胞中ABCA1和ABCG1的表達水平明顯高于野生型小鼠，膽固醇逆向轉(zhuǎn)運能力增強，動脈粥樣硬化病變程度減輕。在脂質(zhì)轉(zhuǎn)運方面，TLR4對載脂蛋白和脂蛋白受體的表達和功能產(chǎn)生影響，進而干擾脂質(zhì)的正常轉(zhuǎn)運。載脂蛋白E（ApoE）在脂蛋白代謝中起著關(guān)鍵作用，它能夠與脂蛋白受體結(jié)合，促進脂蛋白的攝取和代謝。研究表明，TLR4激活后，通過炎癥信號通路，抑制ApoE的表達。在動脈粥樣硬化模型中，TLR4高表達的小鼠血漿中ApoE水平降低，導(dǎo)致脂蛋白代謝異常，脂質(zhì)在血液中堆積。脂蛋白受體如低密度脂蛋白受體（LDLR）的表達和功能也受到TLR4的影響。TLR4激活后，通過激活NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子，下調(diào)LDLR的表達。LDLR表達減少，使得細(xì)胞對LDL的攝取能力下降，血液中LDL水平升高，增加了動脈粥樣硬化的發(fā)病風(fēng)險。4.4Toll樣受體4與血管平滑肌細(xì)胞的相互作用血管平滑肌細(xì)胞（Vascularsmoothmusclecells，VSMCs）在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著關(guān)鍵角色，而Toll樣受體4（TLR4）與VSMCs之間存在著復(fù)雜而緊密的相互作用，這種相互作用對動脈粥樣硬化的進程產(chǎn)生著深遠(yuǎn)影響。在正常生理狀態(tài)下，VSMCs主要呈收縮型，具有維持血管張力和調(diào)節(jié)血壓的重要功能。它們通過表達特異性的收縮蛋白，如α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）、平滑肌肌球蛋白重鏈（SM-MHC）等，實現(xiàn)對血管管徑的精確調(diào)控。同時，收縮型VSMCs分泌細(xì)胞外基質(zhì)的能力較弱，主要維持血管壁的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。然而，在動脈粥樣硬化等病理條件下，VSMCs會發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，從收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚?。合成型VSMCs失去了部分收縮功能，但其增殖和遷移能力顯著增強。它們能夠大量合成和分泌細(xì)胞外基質(zhì)成分，如膠原蛋白、彈性蛋白、纖連蛋白等，同時還分泌多種細(xì)胞因子、趨化因子和蛋白酶，如血小板衍生生長因子（PDGF）、轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）、單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等。這些變化使得VSMCs在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，它們參與了纖維斑塊的形成、血管壁的重構(gòu)以及斑塊的不穩(wěn)定過程。TLR4在VSMCs中廣泛表達，其表達水平會受到多種因素的影響。當(dāng)VSMCs受到病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）如細(xì)菌脂多糖（LPS），或損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）如氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）、熱休克蛋白（HSPs）、高遷移率族蛋白B1（HMGB1）等刺激時，TLR4的表達會顯著上調(diào)。研究表明，用LPS刺激體外培養(yǎng)的VSMCs，TLR4的mRNA和蛋白表達水平在刺激后6小時開始升高，12-24小時達到峰值。ox-LDL也能以時間和劑量依賴的方式上調(diào)VSMCs中TLR4的表達。TLR4激活對VSMCs的增殖和遷移具有顯著的促進作用。在增殖方面，TLR4激活后，通過MyD88依賴性信號通路，激活核因子κB（NF-κB）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路。NF-κB活化后，進入細(xì)胞核，與特定的DNA序列結(jié)合，啟動一系列與細(xì)胞增殖相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達，如細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）等。這些基因的表達增加，促進VSMCs從G1期進入S期，加速細(xì)胞增殖。MAPK信號通路中的細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK被激活后，通過磷酸化下游的轉(zhuǎn)錄因子和其他信號分子，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化。研究發(fā)現(xiàn)，使用LPS刺激VSMCs，細(xì)胞增殖活性明顯增強，而當(dāng)使用TLR4抗體阻斷TLR4信號，或使用siRNA干擾TLR4基因表達后，LPS誘導(dǎo)的VSMCs增殖受到顯著抑制。在遷移方面，TLR4激活促使VSMCs遷移能力增強。TLR4激活后，通過激活RhoA/ROCK信號通路，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組。RhoA是一種小GTP酶，被激活后與ROCK結(jié)合，激活的ROCK使肌球蛋白輕鏈磷酸酶（MLCP）失活，導(dǎo)致肌球蛋白輕鏈（MLC）磷酸化增加。MLC磷酸化增加促進肌動蛋白和肌球蛋白相互作用，引起細(xì)胞骨架收縮和重排，從而增強VSMCs的遷移能力。此外，TLR4激活還會促進VSMCs分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），如MMP-2和MMP-9。MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)成分，為VSMCs的遷移開辟道路。有研究表明，用LPS刺激VSMCs后，細(xì)胞的遷移能力顯著提高，遷移到劃痕區(qū)域的細(xì)胞數(shù)量明顯增加，而當(dāng)使用RhoA抑制劑或MMPs抑制劑處理細(xì)胞后，LPS誘導(dǎo)的VSMCs遷移受到抑制。TLR4激活還會導(dǎo)致VSMCs分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，進一步促進炎癥反應(yīng)和動脈粥樣硬化的發(fā)展。TLR4激活后，通過NF-κB和MAPK信號通路，誘導(dǎo)VSMCs分泌白細(xì)胞介素6（IL-6）、白細(xì)胞介素8（IL-8）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）等炎性細(xì)胞因子和趨化因子。IL-6和TNF-α能夠激活其他免疫細(xì)胞和血管細(xì)胞，促進炎癥反應(yīng)的放大。IL-8和MCP-1則具有強大的趨化作用，能夠吸引血液中的單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞向血管內(nèi)膜下遷移和聚集，加劇炎癥反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，在動脈粥樣硬化斑塊中，VSMCs分泌的這些細(xì)胞因子和趨化因子的水平明顯升高，且與TLR4的表達呈正相關(guān)。當(dāng)使用TLR4抑制劑或基因敲除TLR4后，VSMCs分泌的細(xì)胞因子和趨化因子水平顯著降低，炎癥反應(yīng)得到緩解。五、Toll樣受體4基因多態(tài)性與動脈粥樣硬化的關(guān)系5.1Toll樣受體4基因多態(tài)性概述Toll樣受體4（TLR4）基因多態(tài)性是指在人群中TLR4基因序列存在的差異，這些差異主要表現(xiàn)為單核苷酸多態(tài)性（SingleNucleotidePolymorphisms，SNPs），即基因組DNA序列中單個核苷酸（A、T、C或G）的改變。TLR4基因位于人類染色體9q32-33區(qū)域，全長約60kb，包含3個外顯子和2個內(nèi)含子。目前已發(fā)現(xiàn)多個TLR4基因的單核苷酸多態(tài)性位點，其中較為常見的有Asp299Gly和Thr399Ile。Asp299Gly多態(tài)性是由于TLR4基因外顯子3上第896位核苷酸發(fā)生A-G的替換，導(dǎo)致其編碼的蛋白質(zhì)在第299位氨基酸由天冬氨酸（Asp）替換為甘氨酸（Gly）。這種氨基酸的替換發(fā)生在TLR4的胞外區(qū)富含亮氨酸重復(fù)序列（LRR）結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域?qū)τ赥LR4識別病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）和損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）起著關(guān)鍵作用。研究表明，Asp299Gly多態(tài)性可能會影響TLR4與配體的結(jié)合能力。一些體外實驗發(fā)現(xiàn)，攜帶Gly299等位基因的TLR4對細(xì)菌脂多糖（LPS）的識別和結(jié)合能力較野生型Asp299有所降低。這種結(jié)合能力的改變可能會影響TLR4信號通路的激活，進而影響炎癥反應(yīng)的強度。有研究對攜帶不同TLR4Asp299Gly基因型的人群進行LPS刺激實驗，發(fā)現(xiàn)攜帶Gly299等位基因的個體，其外周血單核細(xì)胞在LPS刺激后產(chǎn)生的炎性細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）等的水平明顯低于攜帶Asp299等位基因的個體。Thr399Ile多態(tài)性是TLR4基因外顯子3上第1196位核苷酸發(fā)生C-T的替換，使得編碼的蛋白質(zhì)在第399位氨基酸由蘇氨酸（Thr）替換為異亮氨酸（Ile）。這一氨基酸替換同樣位于TLR4的胞外區(qū)LRR結(jié)構(gòu)域。Thr399Ile多態(tài)性也會對TLR4的功能產(chǎn)生影響。研究發(fā)現(xiàn)，Thr399Ile多態(tài)性可能影響TLR4的空間構(gòu)象，進而影響其與配體的相互作用以及信號傳導(dǎo)。有研究報道，攜帶Ile399等位基因的TLR4在識別內(nèi)源性危險信號分子如熱休克蛋白60（HSP60）時，其親和力與野生型Thr399存在差異。在細(xì)胞實驗中，將表達攜帶Ile399等位基因TLR4的細(xì)胞與表達野生型TLR4的細(xì)胞分別用HSP60刺激，發(fā)現(xiàn)攜帶Ile399等位基因的細(xì)胞中，TLR4信號通路的激活程度以及下游炎性細(xì)胞因子的表達水平與野生型存在明顯差異。5.2不同基因多態(tài)性與動脈粥樣硬化易感性的關(guān)聯(lián)Toll樣受體4（TLR4）基因的不同多態(tài)性與動脈粥樣硬化易感性之間存在著復(fù)雜的關(guān)聯(lián)，眾多研究圍繞常見的單核苷酸多態(tài)性位點展開，旨在揭示其內(nèi)在機制，但目前研究結(jié)果存在一定差異。對于Asp299Gly多態(tài)性，Ameziane等學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，具有Asp299GlyTLR-4基因多態(tài)性的人，急性冠狀動脈事件發(fā)生率降低，且獨立于其他危險因素。他們推測，該多態(tài)性可能改變了TLR4的結(jié)構(gòu)和功能，使其對病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）和損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）的識別和應(yīng)答能力發(fā)生變化，從而降低了炎癥反應(yīng)的強度，減少了急性冠狀動脈事件的發(fā)生風(fēng)險。然而，Erridge等學(xué)者持有不同觀點，他們認(rèn)為TLR-4基因多態(tài)性Asp299Gly與動脈粥樣硬化進程無關(guān)。最近也有研究發(fā)現(xiàn)，TLR-4基因多態(tài)性Asp299Gly與冠脈狹窄有一定聯(lián)系，但是與急性或陳舊性心肌梗死的發(fā)生無相關(guān)性。這些不一致的研究結(jié)果可能是由于研究對象的種族差異、樣本量大小、研究方法不同以及環(huán)境因素等多種因素共同作用導(dǎo)致的。不同種族人群的遺傳背景存在差異，可能使得TLR4基因多態(tài)性在不同種族中的分布頻率以及與動脈粥樣硬化的關(guān)聯(lián)程度有所不同。樣本量較小可能無法準(zhǔn)確反映總體人群的特征，研究方法的差異，如基因檢測技術(shù)的準(zhǔn)確性、研究設(shè)計的合理性等，也會對結(jié)果產(chǎn)生影響。在Thr399Ile多態(tài)性方面，有研究表明，攜帶Ile399等位基因的個體，其動脈粥樣硬化的發(fā)病風(fēng)險可能增加。這可能是因為Ile399等位基因影響了TLR4與配體的結(jié)合親和力，或者改變了TLR4信號通路中某些關(guān)鍵分子的相互作用，從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失調(diào)，促進動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。然而，也有部分研究未發(fā)現(xiàn)Thr399Ile多態(tài)性與動脈粥樣硬化易感性之間存在顯著關(guān)聯(lián)。這些矛盾的結(jié)果可能與研究人群的遺傳背景、生活方式以及其他遺傳因素與環(huán)境因素的交互作用有關(guān)。某些遺傳背景下，Thr399Ile多態(tài)性可能對動脈粥樣硬化易感性產(chǎn)生影響，而在其他遺傳背景下，這種影響可能被其他因素所掩蓋。生活方式，如飲食習(xí)慣、運動量等，也可能與TLR4基因多態(tài)性相互作用，影響動脈粥樣硬化的發(fā)生風(fēng)險。除了Asp299Gly和Thr399Ile這兩個常見的多態(tài)性位點外，TLR4基因還存在其他一些罕見的多態(tài)性位點，它們與動脈粥樣硬化易感性的關(guān)系也逐漸受到關(guān)注。一些研究發(fā)現(xiàn)，某些罕見多態(tài)性位點可能通過影響TLR4的表達水平、蛋白穩(wěn)定性或信號傳導(dǎo)效率，進而影響動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。但由于這些罕見多態(tài)性位點的頻率較低，研究難度較大，目前相關(guān)研究相對較少，其具體作用機制尚有待進一步深入探索。5.3基因多態(tài)性影響動脈粥樣硬化的潛在機制Toll樣受體4（TLR4）基因多態(tài)性對動脈粥樣硬化產(chǎn)生影響，主要通過受體功能改變、信號傳導(dǎo)異常和炎癥反應(yīng)失調(diào)等潛在機制，在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用。從受體功能改變角度來看，TLR4基因多態(tài)性如Asp299Gly和Thr399Ile，可使編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列改變，影響受體空間構(gòu)象。以Asp299Gly多態(tài)性為例，第299位氨基酸由天冬氨酸替換為甘氨酸，發(fā)生在胞外區(qū)富含亮氨酸重復(fù)序列（LRR）結(jié)構(gòu)域。該結(jié)構(gòu)域?qū)ψR別病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）和損傷相關(guān)分子模式（DAMPs）至關(guān)重要，氨基酸替換可能降低TLR4與LPS、ox-LDL等配體的結(jié)合親和力。研究發(fā)現(xiàn)，攜帶Gly299等位基因的TLR4對LPS的結(jié)合能力弱于野生型，導(dǎo)致受體激活減少，信號傳導(dǎo)減弱。這種受體功能改變影響了對危險信號的識別和免疫應(yīng)答啟動，進而影響動脈粥樣硬化進程。若TLR4不能有效識別ox-LDL，巨噬細(xì)胞對其攝取減少，泡沫細(xì)胞形成受抑制，動脈粥樣硬化發(fā)展可能減緩。在信號傳導(dǎo)異常方面，基因多態(tài)性可干擾TLR4信號通路關(guān)鍵分子的相互作用和活化過程。MyD88依賴性信號通路中，TLR4與MyD88結(jié)合是信號起始的關(guān)鍵步驟?；蚨鄳B(tài)性可能改變TLR4的TIR結(jié)構(gòu)域與MyD88的結(jié)合能力，影響IRAK的招募和活化。Thr399Ile多態(tài)性可能改變TLR4空間構(gòu)象，使TIR結(jié)構(gòu)域與MyD88結(jié)合位點改變，導(dǎo)致MyD88不能正常招募和激活I(lǐng)RAK。IRAK活化受阻，無法激活下游的TRAF6和NF-κB，炎性細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)錄和表達受抑制，炎癥反應(yīng)減弱。TRIF依賴性信號通路也受影響，基因多態(tài)性可能干擾TRIF與TLR4的結(jié)合，或影響TRIF激活TBK1和IRF3的過程。若TRIF與TLR4結(jié)合異常，TBK1和IRF3無法激活，IFN相關(guān)基因表達受阻，影響抗病毒免疫反應(yīng)和炎癥調(diào)節(jié)，對動脈粥樣硬化進程產(chǎn)生作用。炎癥反應(yīng)失調(diào)也是基因多態(tài)性影響動脈粥樣硬化的重要機制。TLR4基因多態(tài)性通過改變受體功能和信號傳導(dǎo)，導(dǎo)致炎癥因子表達和釋放異常。攜帶特定基因多態(tài)性的個體，在受到PAMPs或DAMPs刺激時，炎性細(xì)胞因子如TNF-α、IL-6、IL-1β的產(chǎn)生量與野生型個體不同。研究表明，攜帶Asp299Gly多態(tài)性Gly299等位基因的個體，外周血單核細(xì)胞在LPS刺激后，TNF-α和IL-6水平低于攜帶Asp299等位基因個體。炎癥因子表達失調(diào)影響免疫細(xì)胞活化、遷移和聚集。TNF-α和IL-6可激活巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞，促進其向血管內(nèi)膜下遷移。炎癥因子水平改變會影響免疫細(xì)胞功能和炎癥微環(huán)境，進而影響動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展。炎癥因子還可作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等，影響其功能和代謝，如促進平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，參與纖維斑塊形成。六、基于Toll樣受體4的動脈粥樣硬化防治策略6.1藥物干預(yù)針對Toll樣受體4（TLR4）的藥物研發(fā)在動脈粥樣硬化防治領(lǐng)域具有重要意義，目前主要集中在抑制劑、抗體等方面，這些藥物通過不同機制作用于TLR4及其信號通路，展現(xiàn)出潛在的治療效果。抑制劑是當(dāng)前研究的重點之一。其中，TAK-242（resatorvid）是一種備受關(guān)注的小分子TLR4抑制劑。它能夠特異性地結(jié)合TLR4，阻斷其與配體的相互作用，從而抑制TLR4信號通路的激活。研究表明，在動脈粥樣硬化動物模型中，給予TAK-242處理后，可顯著降低炎癥細(xì)胞因子的表達水平，如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）等。一項針對載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，在高脂飲食誘導(dǎo)動脈粥樣硬化的過程中，給予TAK-242干預(yù)，小鼠主動脈根部的粥樣斑塊面積明顯減小，炎癥細(xì)胞浸潤減少，同時巨噬細(xì)胞中TLR4信號通路相關(guān)蛋白的磷酸化水平降低。這表明TAK-242通過抑制TLR4信號通路，減輕了炎癥反應(yīng)，進而抑制了動脈粥樣硬化的發(fā)展。另一種抑制劑E5564，它是一種合成的脂多糖（LPS）類似物，能夠與TLR4/MD-2復(fù)合物結(jié)合，但不激活信號通路，從而競爭性地抑制LPS與T