Scribble對β-catenin入核的調(diào)控機(jī)制及生物學(xué)意義探究一、引言1.1研究背景與意義細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)過程宛如精密復(fù)雜的交響樂，其中Scribble和β-catenin作為重要的“演奏者”，各自承擔(dān)著關(guān)鍵角色。Scribble隸屬富含亮氨酸重復(fù)序列及PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白（LAP）家族，作為一種腳手架蛋白，它能夠與多種分子特異性結(jié)合，如同搭建橋梁一般，將不同的信號通路連接整合在一起，協(xié)同發(fā)揮作用，進(jìn)而對細(xì)胞的極性、增殖、分化和遷移等基礎(chǔ)且關(guān)鍵的生理過程進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控。眾多研究已表明，Scribble在維持上皮細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能方面意義重大，其表達(dá)水平的異常變化或功能缺失，常常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展緊密關(guān)聯(lián)，包括腫瘤細(xì)胞的增殖失控、侵襲能力增強(qiáng)以及轉(zhuǎn)移傾向增加等。例如，在乳腺癌、肺癌等多種惡性腫瘤組織中，均發(fā)現(xiàn)Scribble的表達(dá)顯著下調(diào)，且與腫瘤的惡性程度和不良預(yù)后呈正相關(guān)。β-catenin則是一種多功能蛋白質(zhì)，具有雙重關(guān)鍵功能。一方面，它作為附著連接的核心組成部分，與鈣黏蛋白緊密結(jié)合形成復(fù)合體，積極參與細(xì)胞間連接，為維持細(xì)胞間的穩(wěn)定黏附、組織結(jié)構(gòu)的完整性以及組織器官的正常形態(tài)發(fā)揮著不可或缺的作用。另一方面，β-catenin更是Wnt信號途徑的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在胚胎發(fā)育、組織再生等重要生理過程中扮演著舉足輕重的角色。在胚胎發(fā)育時(shí)期，β-catenin參與調(diào)控細(xì)胞的分化和組織器官的形成，其異常表達(dá)或活性改變可導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常，如神經(jīng)管畸形等。當(dāng)Wnt信號通路被激活時(shí)，β-catenin會在細(xì)胞質(zhì)中大量積累，并進(jìn)一步進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子（TCF/LEF）相結(jié)合，從而啟動下游一系列靶基因的轉(zhuǎn)錄過程，對細(xì)胞的增殖、分化、遷移和存活等生理活動產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。然而，當(dāng)β-catenin的調(diào)控機(jī)制出現(xiàn)異常時(shí)，便會導(dǎo)致其在細(xì)胞質(zhì)中過度積累并異常入核，持續(xù)激活下游靶基因，最終引發(fā)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在結(jié)腸癌、肝癌等多種癌癥中，都普遍存在Wnt/β-catenin信號通路的異常激活，使得β-catenin成為癌癥治療領(lǐng)域極具潛力的重要靶點(diǎn)。深入探究Scribble調(diào)控β-catenin入核的分子機(jī)制，在基礎(chǔ)科學(xué)研究和臨床應(yīng)用等多個層面都具有不可忽視的重要意義。從細(xì)胞信號傳導(dǎo)機(jī)制的角度來看，這有助于我們更全面、深入地理解細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜信號網(wǎng)絡(luò)的精細(xì)調(diào)控過程，揭示Scribble與β-catenin之間的相互作用關(guān)系以及它們?nèi)绾螀f(xié)同調(diào)控細(xì)胞的生理功能，填補(bǔ)該領(lǐng)域在這方面研究的空白，為后續(xù)深入研究細(xì)胞信號傳導(dǎo)提供關(guān)鍵的理論支撐。在腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制的研究中，Scribble對β-catenin入核的調(diào)控異常極有可能是腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵分子事件之一。通過深入研究這一調(diào)控機(jī)制，能夠?yàn)槟[瘤的早期診斷提供更為精準(zhǔn)、特異的分子標(biāo)志物，幫助醫(yī)生更早地發(fā)現(xiàn)腫瘤的存在，提高腫瘤的早期診斷率。同時(shí)，也能為腫瘤的治療開辟全新的策略和靶點(diǎn)，例如研發(fā)能夠調(diào)節(jié)Scribble與β-catenin相互作用的藥物，或者針對該調(diào)控通路中的關(guān)鍵分子進(jìn)行干預(yù)，從而實(shí)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的有效抑制，為腫瘤患者帶來新的希望。在胚胎發(fā)育研究領(lǐng)域，明確Scribble和β-catenin在胚胎發(fā)育過程中的調(diào)控機(jī)制，對于理解胚胎正常發(fā)育的分子基礎(chǔ)以及探索先天性發(fā)育異常疾病的發(fā)病機(jī)制和治療方法都具有重要的指導(dǎo)意義，有望為相關(guān)疾病的防治提供新的思路和方法。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，Scribble和β-catenin一直是國內(nèi)外學(xué)者研究的重點(diǎn)對象。對Scribble的研究，國外起步相對較早，早期研究主要集中在其結(jié)構(gòu)解析和在果蠅發(fā)育過程中的功能探索。研究發(fā)現(xiàn)，Scribble基因的突變會導(dǎo)致果蠅上皮細(xì)胞極性紊亂，組織形態(tài)發(fā)生異常，這初步揭示了Scribble在維持細(xì)胞極性方面的關(guān)鍵作用。隨后，隨著研究的深入，國外學(xué)者逐漸將目光聚焦到Scribble在哺乳動物細(xì)胞中的功能及與人類疾病的關(guān)聯(lián)。例如，在腫瘤研究方面，美國的科研團(tuán)隊(duì)通過大量臨床樣本分析和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了Scribble在乳腺癌細(xì)胞中的低表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的高侵襲性密切相關(guān)，低表達(dá)的Scribble無法有效抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。國內(nèi)對Scribble的研究也取得了顯著進(jìn)展。中國科學(xué)院的研究人員運(yùn)用基因編輯技術(shù)，構(gòu)建了Scribble基因敲除的小鼠模型，通過對該模型的深入研究，進(jìn)一步闡明了Scribble在調(diào)控哺乳動物胚胎發(fā)育過程中細(xì)胞命運(yùn)決定和組織器官形成的重要機(jī)制。同時(shí)，國內(nèi)學(xué)者在腫瘤研究領(lǐng)域也有新的發(fā)現(xiàn)，在肝癌的研究中發(fā)現(xiàn)，Scribble能夠通過與某些腫瘤抑制因子相互作用，協(xié)同抑制肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，為肝癌的治療提供了新的潛在靶點(diǎn)和理論依據(jù)。關(guān)于β-catenin的研究，國外在Wnt信號通路激活后β-catenin的核轉(zhuǎn)位機(jī)制以及其在胚胎發(fā)育中的作用機(jī)制方面取得了眾多成果。如德國的研究團(tuán)隊(duì)利用先進(jìn)的成像技術(shù)，直觀地觀察到了β-catenin在Wnt信號激活后從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移的動態(tài)過程，并深入研究了其與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合后啟動靶基因轉(zhuǎn)錄的分子機(jī)制。在腫瘤研究中，國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌中，由于APC基因突變導(dǎo)致β-catenin異常積累和持續(xù)激活，進(jìn)而促進(jìn)了結(jié)直腸癌細(xì)胞的無限增殖和腫瘤的發(fā)生發(fā)展。國內(nèi)對β-catenin的研究同樣成果豐碩。復(fù)旦大學(xué)的科研人員通過對大量臨床肺癌樣本的分析，發(fā)現(xiàn)β-catenin的異常表達(dá)與肺癌的發(fā)生、發(fā)展及患者的預(yù)后密切相關(guān)，高表達(dá)的β-catenin能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。此外，國內(nèi)學(xué)者還在探索β-catenin作為腫瘤治療靶點(diǎn)的研究中取得了一定進(jìn)展，通過研發(fā)特異性的小分子抑制劑，能夠有效阻斷β-catenin與TCF/LEF的結(jié)合，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長。在Scribble調(diào)控β-catenin入核的研究方面，目前已有一些重要發(fā)現(xiàn)。李蘇瑞、牛曉峰等研究人員通過一系列實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在HEK293/HEK293T細(xì)胞中，過表達(dá)Scribble會使β-catenin的轉(zhuǎn)錄活性報(bào)告基因LEF-1-luciferase的活性顯著減弱；而穩(wěn)定下調(diào)Scribble時(shí)，LEF-1-luciferase的活性則顯著增強(qiáng)，這表明Scribble可抑制β-catenin的轉(zhuǎn)錄活性。同時(shí)，利用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Scribble與β-catenin存在特異結(jié)合作用。細(xì)胞組分分離實(shí)驗(yàn)表明，穩(wěn)定下調(diào)Scribble后，細(xì)胞中β-catenin蛋白總量不變，但胞漿及胞核內(nèi)β-catenin量增多，即Scribble可抑制β-catenin的入核。盡管取得了上述進(jìn)展，但目前該領(lǐng)域仍存在諸多問題有待解決。在分子機(jī)制層面，Scribble與β-catenin相互作用的具體結(jié)構(gòu)域和氨基酸殘基尚未完全明確，這限制了我們對二者結(jié)合方式和調(diào)控機(jī)制的深入理解。此外，Scribble抑制β-catenin入核后，如何進(jìn)一步影響下游基因的表達(dá)以及相關(guān)信號通路的具體調(diào)節(jié)機(jī)制也有待進(jìn)一步研究。在生理病理意義方面，雖然已初步知曉Scribble調(diào)控β-catenin入核與腫瘤等疾病相關(guān)，但在不同類型腫瘤以及其他疾病中的具體作用和機(jī)制仍不清晰，缺乏系統(tǒng)性的研究。而且，目前的研究大多集中在細(xì)胞水平，在動物模型和人體中的驗(yàn)證研究相對較少，這使得研究成果向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化面臨挑戰(zhàn)。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在深入剖析Scribble調(diào)控β-catenin入核的分子機(jī)制，為細(xì)胞信號傳導(dǎo)理論的完善以及腫瘤等相關(guān)疾病的防治提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和全新的思路。圍繞這一核心目標(biāo)，研究內(nèi)容主要涵蓋以下幾個關(guān)鍵方面：Scribble和β-catenin的結(jié)構(gòu)與功能研究：運(yùn)用X射線晶體學(xué)、核磁共振等先進(jìn)的結(jié)構(gòu)生物學(xué)技術(shù)，精確解析Scribble和β-catenin的三維空間結(jié)構(gòu)，深入探究它們各自結(jié)構(gòu)與功能之間的內(nèi)在聯(lián)系。詳細(xì)分析Scribble的富含亮氨酸重復(fù)序列（LRR）和PDZ結(jié)構(gòu)域在其與其他蛋白相互作用以及整合信號通路過程中所發(fā)揮的關(guān)鍵作用，明確β-catenin的不同結(jié)構(gòu)域在介導(dǎo)細(xì)胞粘附和參與Wnt信號傳導(dǎo)等方面的具體功能。通過定點(diǎn)突變技術(shù)，對Scribble和β-catenin的關(guān)鍵氨基酸殘基進(jìn)行特異性突變，構(gòu)建突變體蛋白，并在細(xì)胞和動物模型中深入研究這些突變對其功能的影響，進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系。例如，通過突變Scribble的PDZ結(jié)構(gòu)域關(guān)鍵氨基酸，觀察其與β-catenin結(jié)合能力的變化以及對β-catenin入核的影響，從而明確PDZ結(jié)構(gòu)域在二者相互作用中的重要性。Scribble調(diào)控β-catenin入核的分子機(jī)制研究：采用免疫共沉淀（Co-IP）、熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，深入研究Scribble與β-catenin之間的相互作用方式，精確確定它們相互作用的具體結(jié)構(gòu)域和關(guān)鍵氨基酸殘基。構(gòu)建Scribble與β-catenin相互作用的結(jié)構(gòu)模型，利用分子動力學(xué)模擬等方法，深入分析二者結(jié)合的動態(tài)過程和結(jié)構(gòu)變化，從分子層面揭示它們相互作用的本質(zhì)。利用RNA干擾（RNAi）技術(shù)和基因編輯技術(shù)，分別構(gòu)建Scribble低表達(dá)和高表達(dá)的細(xì)胞模型，以及β-catenin突變體的細(xì)胞模型，通過細(xì)胞組分分離實(shí)驗(yàn)、免疫熒光染色等方法，系統(tǒng)研究Scribble對β-catenin入核的影響機(jī)制，明確Scribble抑制β-catenin入核的具體信號通路和關(guān)鍵調(diào)控分子。例如，在Scribble低表達(dá)的細(xì)胞模型中，檢測β-catenin入核相關(guān)信號通路中關(guān)鍵分子的活性變化，如GSK-3β、APC等，以揭示Scribble調(diào)控β-catenin入核的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。研究Scribble是否通過招募其他蛋白形成復(fù)合物，間接影響β-catenin的入核過程。通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，篩選與Scribble和β-catenin相互作用的潛在蛋白，構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，深入研究這些蛋白在Scribble調(diào)控β-catenin入核過程中的協(xié)同作用機(jī)制。Scribble調(diào)控β-catenin入核的生物學(xué)意義研究：在細(xì)胞水平上，通過細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)等方法，深入研究Scribble調(diào)控β-catenin入核對細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)行為的影響，明確二者在細(xì)胞生理和病理過程中的作用機(jī)制。例如，在腫瘤細(xì)胞中，過表達(dá)Scribble并抑制β-catenin入核，觀察腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的變化，以驗(yàn)證Scribble調(diào)控β-catenin入核對腫瘤細(xì)胞惡性行為的影響。利用基因敲除小鼠、轉(zhuǎn)基因小鼠等動物模型，深入研究Scribble調(diào)控β-catenin入核在胚胎發(fā)育、組織再生以及腫瘤發(fā)生發(fā)展等生理病理過程中的作用。通過對小鼠胚胎發(fā)育過程中不同階段的組織切片進(jìn)行免疫組化分析，觀察Scribble和β-catenin的表達(dá)和定位變化，以及它們對胚胎發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響，揭示二者在胚胎發(fā)育中的調(diào)控機(jī)制。在腫瘤小鼠模型中，通過干預(yù)Scribble和β-catenin的表達(dá)和相互作用，觀察腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移情況，評估其作為腫瘤治療靶點(diǎn)的潛力。分析臨床腫瘤樣本中Scribble和β-catenin的表達(dá)水平、相互作用關(guān)系以及與腫瘤患者臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性，為腫瘤的早期診斷、預(yù)后評估和靶向治療提供重要的臨床依據(jù)。收集不同類型腫瘤患者的組織樣本，采用免疫組織化學(xué)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等技術(shù)，檢測Scribble和β-catenin的表達(dá)水平，并結(jié)合患者的臨床病理資料，如腫瘤分期、轉(zhuǎn)移情況、生存期等，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，明確二者在腫瘤臨床診療中的價(jià)值。研究展望：基于本研究的成果，進(jìn)一步探索Scribble和β-catenin作為腫瘤治療靶點(diǎn)的可行性和有效性，為開發(fā)新型腫瘤治療藥物和策略提供理論支持。結(jié)合結(jié)構(gòu)生物學(xué)、藥物化學(xué)等多學(xué)科技術(shù)，設(shè)計(jì)和篩選能夠特異性調(diào)節(jié)Scribble與β-catenin相互作用的小分子化合物或生物制劑，開展體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)動物實(shí)驗(yàn)，評估其對腫瘤細(xì)胞生長、增殖和轉(zhuǎn)移的抑制效果，為腫瘤的精準(zhǔn)治療奠定基礎(chǔ)。同時(shí)，隨著單細(xì)胞測序、空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)等新興技術(shù)的不斷發(fā)展，未來可將這些技術(shù)應(yīng)用于Scribble和β-catenin的研究中，從單細(xì)胞水平和空間層面深入解析它們在不同細(xì)胞類型和組織微環(huán)境中的表達(dá)和功能差異，為全面理解細(xì)胞信號傳導(dǎo)機(jī)制和疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供更豐富的信息。此外，拓展Scribble和β-catenin在其他疾病領(lǐng)域的研究，如神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病等，探究它們在這些疾病中的作用機(jī)制，為相關(guān)疾病的防治開辟新的研究方向。二、Scribble與β-catenin的結(jié)構(gòu)與功能2.1Scribble的結(jié)構(gòu)與功能概述2.1.1Scribble的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)Scribble隸屬富含亮氨酸重復(fù)序列及PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白（LAP）家族，其結(jié)構(gòu)獨(dú)特且精妙，猶如一座精心構(gòu)建的分子大廈，各部分結(jié)構(gòu)協(xié)同合作，賦予了Scribble獨(dú)特的生物學(xué)功能。從整體結(jié)構(gòu)來看，Scribble的N端包含一系列串聯(lián)排列的富含亮氨酸重復(fù)序列（LRR），這些LRR結(jié)構(gòu)域由約23個氨基酸殘基組成，它們?nèi)缤o密排列的磚塊，通過特定的氨基酸序列和空間構(gòu)象，形成了一種馬蹄形或螺旋狀的結(jié)構(gòu)。這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)使得LRR區(qū)域能夠與多種不同的蛋白質(zhì)分子發(fā)生特異性相互作用，就像一把把精準(zhǔn)的鑰匙，能夠識別并結(jié)合到特定的分子鎖上，從而為Scribble參與細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的信號傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)提供了豐富的分子連接位點(diǎn)。例如，在細(xì)胞極性建立過程中，Scribble的LRR結(jié)構(gòu)域可以與某些細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組和分布，進(jìn)而影響細(xì)胞的形態(tài)和極性。C端則是由四個PDZ結(jié)構(gòu)域組成，PDZ結(jié)構(gòu)域由大約80-100個氨基酸殘基構(gòu)成，其三維結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出一個典型的β折疊片和α螺旋組成的結(jié)構(gòu)模體。PDZ結(jié)構(gòu)域的特殊之處在于它能夠特異性地識別并結(jié)合其他蛋白質(zhì)C末端的特定氨基酸序列，根據(jù)其結(jié)合C末端序列的特異性可分為兩類：I類PDZ結(jié)構(gòu)域與C末端含X-(S/T)-X-5基序（motif）的肽段結(jié)合，II類PDZ結(jié)構(gòu)域可識別X-5-X-5基序（X指任意氨基酸，5為疏水性氨基酸）。這種精確的識別和結(jié)合能力，使得Scribble的PDZ結(jié)構(gòu)域能夠像分子膠水一樣，將不同的蛋白質(zhì)分子有序地連接在一起，形成穩(wěn)定的蛋白質(zhì)復(fù)合物，在細(xì)胞信號傳導(dǎo)、細(xì)胞間通訊等過程中發(fā)揮關(guān)鍵的橋梁作用。研究表明，Scribble的PDZ結(jié)構(gòu)域可以與一些細(xì)胞表面受體、離子通道蛋白等相互作用，調(diào)節(jié)它們的定位和功能，從而影響細(xì)胞對外部信號的感知和響應(yīng)。在細(xì)胞遷移過程中，Scribble通過其PDZ結(jié)構(gòu)域與某些信號分子結(jié)合，激活下游的信號通路，促進(jìn)細(xì)胞的遷移運(yùn)動。在LRR結(jié)構(gòu)域和PDZ結(jié)構(gòu)域之間，還存在兩個LAP特異性結(jié)構(gòu)域LAPSDa和LAPSDb，它們分別由38和24個氨基酸殘基組成，是LAP家族的標(biāo)志性結(jié)構(gòu)域。雖然目前對于這兩個結(jié)構(gòu)域的具體功能了解相對較少，但已有研究推測它們可能在調(diào)節(jié)Scribble的整體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、介導(dǎo)Scribble與其他特定分子的相互作用等方面發(fā)揮著重要作用。例如，有研究發(fā)現(xiàn)LAPSDa和LAPSDb結(jié)構(gòu)域可能參與了Scribble在細(xì)胞內(nèi)的定位和轉(zhuǎn)運(yùn)過程，通過與一些細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸相關(guān)的分子相互作用，確保Scribble能夠準(zhǔn)確地到達(dá)其發(fā)揮功能的細(xì)胞區(qū)域。2.1.2Scribble在細(xì)胞中的功能Scribble在細(xì)胞中宛如一位全能的指揮官，憑借其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，廣泛參與細(xì)胞極性建立、增殖、分化和遷移等多個關(guān)鍵的生理過程，對維持細(xì)胞的正常生理功能和組織的穩(wěn)態(tài)平衡起著不可或缺的作用。在細(xì)胞極性建立方面，Scribble扮演著至關(guān)重要的角色，是細(xì)胞極性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的核心成員。以上皮細(xì)胞為例，上皮細(xì)胞具有典型的極性，其頂面和底面具有不同的結(jié)構(gòu)和功能。Scribble通過與其他極性蛋白如Par3、Par6和aPKC等相互作用，形成一個動態(tài)的蛋白質(zhì)復(fù)合物。這個復(fù)合物在細(xì)胞內(nèi)的不對稱分布，能夠引導(dǎo)細(xì)胞骨架的重組和細(xì)胞器的定位，從而建立起上皮細(xì)胞的極性。在果蠅的胚胎發(fā)育過程中，Scribble基因的突變會導(dǎo)致上皮細(xì)胞極性紊亂，細(xì)胞形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)發(fā)生異常，嚴(yán)重影響胚胎的正常發(fā)育。這充分說明了Scribble在細(xì)胞極性建立過程中的關(guān)鍵作用，它就像一個精準(zhǔn)的導(dǎo)航儀，確保細(xì)胞在發(fā)育過程中能夠正確地建立起極性，為后續(xù)的組織器官形成奠定基礎(chǔ)。在細(xì)胞增殖調(diào)控中，Scribble宛如一個精細(xì)的調(diào)節(jié)閥門，對細(xì)胞的增殖速率進(jìn)行著嚴(yán)格的把控。正常情況下，Scribble能夠通過整合多種信號通路，抑制細(xì)胞的過度增殖。它可以與一些細(xì)胞周期調(diào)控蛋白相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的進(jìn)程。研究發(fā)現(xiàn)，Scribble能夠與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21相互作用，促進(jìn)p21的表達(dá)和活性，從而抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）的活性，使細(xì)胞周期停滯在G1期，阻止細(xì)胞進(jìn)入DNA合成期（S期），進(jìn)而抑制細(xì)胞的增殖。在腫瘤細(xì)胞中，常常出現(xiàn)Scribble表達(dá)下調(diào)或功能缺失的情況，這會導(dǎo)致細(xì)胞增殖失控，腫瘤細(xì)胞大量增殖。在乳腺癌細(xì)胞中，低表達(dá)的Scribble無法有效抑制細(xì)胞的增殖信號通路，使得癌細(xì)胞能夠不斷地分裂和增殖，促進(jìn)腫瘤的生長和發(fā)展。細(xì)胞分化是細(xì)胞發(fā)育過程中的一個重要階段，Scribble在這個過程中也發(fā)揮著關(guān)鍵的指導(dǎo)作用。在神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元的過程中，Scribble能夠與一些轉(zhuǎn)錄因子和信號分子相互作用，調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞的分化命運(yùn)。它可以通過抑制Notch信號通路的活性，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元方向分化。研究表明，在Scribble缺失的情況下，神經(jīng)干細(xì)胞的分化受到抑制，無法正常分化為神經(jīng)元，而是傾向于保持干細(xì)胞狀態(tài)或分化為其他類型的細(xì)胞。這表明Scribble在細(xì)胞分化過程中，能夠通過調(diào)控相關(guān)信號通路和基因表達(dá)，引導(dǎo)細(xì)胞朝著特定的方向分化，確保組織器官的正常發(fā)育和功能維持。細(xì)胞遷移是細(xì)胞在生理和病理過程中的一種重要行為，Scribble在細(xì)胞遷移過程中同樣扮演著重要的角色。當(dāng)細(xì)胞受到外界信號刺激需要遷移時(shí)，Scribble會迅速響應(yīng)，通過與細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白和信號分子相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移能力。它可以促進(jìn)細(xì)胞前端的絲狀偽足和片狀偽足的形成，增加細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附力，同時(shí)調(diào)節(jié)細(xì)胞后端的收縮力，從而推動細(xì)胞向前遷移。在傷口愈合過程中，上皮細(xì)胞需要遷移到傷口部位進(jìn)行修復(fù)。Scribble能夠通過激活Rac1等小GTP酶，促進(jìn)上皮細(xì)胞的遷移，加速傷口的愈合。而在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，腫瘤細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)，Scribble的異常表達(dá)或功能改變可能會促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，導(dǎo)致腫瘤的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散。2.2β-catenin的結(jié)構(gòu)與功能概述2.2.1β-catenin的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)β-catenin是一種由CTNNB1基因編碼的多功能蛋白質(zhì)，其結(jié)構(gòu)獨(dú)特且復(fù)雜，宛如一座精密的分子機(jī)器，各部分結(jié)構(gòu)緊密協(xié)作，共同賦予了β-catenin在細(xì)胞生物學(xué)過程中至關(guān)重要的功能。從氨基酸組成來看，β-catenin包含約781個氨基酸殘基，相對分子質(zhì)量約為88kDa。其一級結(jié)構(gòu)中存在多個重要的功能結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域通過特定的空間構(gòu)象相互作用，形成了β-catenin獨(dú)特的三維結(jié)構(gòu)，進(jìn)而決定了其在細(xì)胞粘附和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程中的特異性功能。β-catenin的N端富含多個磷酸化位點(diǎn)，這些位點(diǎn)在β-catenin的穩(wěn)定性調(diào)控和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在經(jīng)典的Wnt信號通路未被激活時(shí)，β-catenin的N端會被酪蛋白激酶1（CK1）和糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）依次磷酸化。CK1首先將β-catenin的Ser45磷酸化，隨后GSK-3β識別并進(jìn)一步將Thr41、Ser37、Ser33磷酸化。磷酸化后的β-catenin會與β-轉(zhuǎn)導(dǎo)重復(fù)相容蛋白（β-TRCP）結(jié)合，進(jìn)而被泛素化修飾，最終被蛋白酶體降解，從而維持細(xì)胞內(nèi)β-catenin的低水平穩(wěn)定狀態(tài)。當(dāng)Wnt信號通路激活時(shí)，相關(guān)信號分子會抑制GSK-3β的活性，阻止β-catenin的磷酸化和降解，使得β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中大量積累。研究表明，在結(jié)直腸癌中，由于APC基因突變導(dǎo)致β-catenin無法正常被磷酸化和降解，使得β-catenin在細(xì)胞內(nèi)異常積累，持續(xù)激活下游信號通路，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。β-catenin的中央?yún)^(qū)域由12個Arm重復(fù)序列組成，每個Arm重復(fù)序列大約包含42個氨基酸殘基。這些Arm重復(fù)序列通過特定的氨基酸相互作用，形成了一種右手超螺旋結(jié)構(gòu)，宛如一個緊密纏繞的螺旋樓梯。這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)賦予了β-catenin強(qiáng)大的蛋白質(zhì)相互作用能力，使其能夠與多種不同的蛋白質(zhì)分子特異性結(jié)合。例如，在細(xì)胞粘附過程中，β-catenin的Arm重復(fù)序列可以與E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，形成E-cadherin/β-catenin復(fù)合體。這個復(fù)合體進(jìn)一步與α-連環(huán)蛋白（α-catenin）相連，從而將細(xì)胞間粘附結(jié)構(gòu)與細(xì)胞內(nèi)的肌動蛋白細(xì)胞骨架連接起來，為維持細(xì)胞間的穩(wěn)定粘附和組織結(jié)構(gòu)的完整性提供了堅(jiān)實(shí)的分子基礎(chǔ)。在胚胎發(fā)育過程中，E-cadherin/β-catenin復(fù)合體對于細(xì)胞的正確排列和組織器官的形成至關(guān)重要。如果β-catenin的Arm重復(fù)序列發(fā)生突變，導(dǎo)致其與E-cadherin的結(jié)合能力下降，會引起細(xì)胞間粘附力減弱，胚胎發(fā)育異常，出現(xiàn)神經(jīng)管畸形等嚴(yán)重問題。在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面，β-catenin的Arm重復(fù)序列則是與轉(zhuǎn)錄因子T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子（TCF/LEF）家族成員結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域。當(dāng)β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核后，其Arm重復(fù)序列會與TCF/LEF結(jié)合，形成β-catenin/TCF/LEF復(fù)合體。這個復(fù)合體能夠識別并結(jié)合到下游靶基因的啟動子區(qū)域，招募轉(zhuǎn)錄激活因子，啟動相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄過程。這些靶基因包括c-myc、cyclinD1等，它們在細(xì)胞增殖、分化、遷移等過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌細(xì)胞中，異常激活的Wnt/β-catenin信號通路導(dǎo)致β-catenin大量入核，與TCF/LEF結(jié)合后，持續(xù)激活c-myc和cyclinD1等靶基因的表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和腫瘤的生長。β-catenin的C端則包含一個轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域在β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核后，與其他轉(zhuǎn)錄輔助因子相互作用，增強(qiáng)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄活性。例如，β-catenin的C端可以與p300/CBP等轉(zhuǎn)錄共激活因子結(jié)合，p300/CBP具有組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶活性，能夠通過對染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的修飾，增加基因的可及性，從而促進(jìn)β-catenin/TCF/LEF復(fù)合體對靶基因的轉(zhuǎn)錄激活作用。在胚胎干細(xì)胞的分化過程中，β-catenin的C端與p300/CBP的相互作用對于調(diào)控干細(xì)胞的分化命運(yùn)起著關(guān)鍵作用。通過調(diào)節(jié)β-catenin與p300/CBP的結(jié)合強(qiáng)度，可以影響胚胎干細(xì)胞向不同細(xì)胞類型的分化方向。2.2.2β-catenin在細(xì)胞中的功能β-catenin在細(xì)胞中猶如一顆璀璨的明星，憑借其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞粘附和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等關(guān)鍵生理過程中發(fā)揮著不可或缺的核心作用，對維持細(xì)胞的正常生理功能和參與疾病的發(fā)生發(fā)展具有深遠(yuǎn)影響。在細(xì)胞粘附方面，β-catenin是細(xì)胞間粘附連接的重要組成部分，如同堅(jiān)固的膠水一般，將相鄰細(xì)胞緊密連接在一起，為維持組織結(jié)構(gòu)的完整性和細(xì)胞的正常生理功能奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。在正常上皮組織中，β-catenin與E-cadherin緊密結(jié)合，形成穩(wěn)定的E-cadherin/β-catenin復(fù)合體。E-cadherin是一種跨膜蛋白，其胞外結(jié)構(gòu)域可以與相鄰細(xì)胞表面的E-cadherin相互作用，形成鈣依賴的同型粘附連接。而β-catenin與E-cadherin的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域結(jié)合后，進(jìn)一步通過α-catenin與細(xì)胞內(nèi)的肌動蛋白細(xì)胞骨架相連。這種連接方式不僅增強(qiáng)了細(xì)胞間的粘附力，還能夠?qū)⒓?xì)胞間的機(jī)械信號傳遞到細(xì)胞內(nèi)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的形態(tài)、遷移和分化等行為。研究表明，在乳腺癌的發(fā)展過程中，常常出現(xiàn)E-cadherin表達(dá)下調(diào)或β-catenin與E-cadherin結(jié)合異常的情況。這會導(dǎo)致細(xì)胞間粘附連接破壞，癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。通過上調(diào)E-cadherin的表達(dá)或促進(jìn)β-catenin與E-cadherin的結(jié)合，可以有效抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，為乳腺癌的治療提供了新的策略。在胚胎發(fā)育過程中，β-catenin更是扮演著至關(guān)重要的角色，是胚胎發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的核心成員。在胚胎的早期發(fā)育階段，β-catenin參與了胚胎體軸的形成。例如，在非洲爪蟾的胚胎發(fā)育中，母源性的β-catenin在胚胎的背側(cè)積累，通過與相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的相互作用，激活一系列背側(cè)特異性基因的表達(dá)，從而決定了胚胎的背腹軸。如果在胚胎發(fā)育過程中抑制β-catenin的功能，會導(dǎo)致胚胎體軸發(fā)育異常，無法形成正常的組織結(jié)構(gòu)。在神經(jīng)嵴細(xì)胞的遷移過程中，β-catenin也發(fā)揮著重要作用。神經(jīng)嵴細(xì)胞是胚胎發(fā)育過程中具有高度遷移能力的一群細(xì)胞，它們能夠遷移到不同的部位，分化形成多種組織和器官。β-catenin通過調(diào)節(jié)神經(jīng)嵴細(xì)胞與周圍細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的粘附力，以及激活相關(guān)的信號通路，促進(jìn)神經(jīng)嵴細(xì)胞的遷移和分化。研究發(fā)現(xiàn)，在某些先天性疾病中，由于β-catenin信號通路的異常，導(dǎo)致神經(jīng)嵴細(xì)胞的遷移和分化異常，從而引發(fā)面部畸形、心血管發(fā)育異常等疾病。β-catenin在組織再生過程中同樣發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在肝臟部分切除后的再生過程中，β-catenin被激活，促進(jìn)肝細(xì)胞的增殖和肝臟組織的修復(fù)。具體來說，β-catenin通過激活相關(guān)的細(xì)胞周期調(diào)控基因和生長因子基因的表達(dá)，促使肝細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期，進(jìn)行分裂和增殖。同時(shí)，β-catenin還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解，為肝細(xì)胞的增殖和組織修復(fù)提供適宜的微環(huán)境。研究表明，在肝臟再生過程中，抑制β-catenin的活性會顯著延緩肝臟的再生速度，影響肝臟功能的恢復(fù)。而通過激活β-catenin信號通路，可以加速肝臟的再生，提高肝臟的修復(fù)能力。β-catenin在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面的功能主要體現(xiàn)在其作為Wnt信號通路的關(guān)鍵效應(yīng)分子。當(dāng)Wnt信號通路被激活時(shí)，Wnt蛋白與細(xì)胞膜上的卷曲蛋白（Frizzled，F(xiàn)z）受體和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（LRP5/6）共受體結(jié)合，形成Wnt-Fz-LRP5/6復(fù)合體。這個復(fù)合體招募并激活胞質(zhì)內(nèi)的蓬亂蛋白（Dishevelled，Dsh）。Dsh通過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，抑制GSK-3β的活性，使得β-catenin不再被磷酸化和降解。β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中大量積累后，會進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，形成β-catenin/TCF/LEF復(fù)合體，啟動下游靶基因的轉(zhuǎn)錄過程。這些靶基因包括c-myc、cyclinD1、MMP-7等，它們在細(xì)胞增殖、分化、遷移和侵襲等過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，Wnt/β-catenin信號通路的異常激活是一個常見的現(xiàn)象。在結(jié)直腸癌中，約80%的病例存在β-catenin的異常積累和激活。由于APC基因的突變或其他原因，導(dǎo)致β-catenin無法正常被降解，持續(xù)激活下游靶基因，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。通過抑制β-catenin與TCF/LEF的結(jié)合，或者阻斷β-catenin的入核過程，可以有效抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，為結(jié)直腸癌的治療提供了重要的靶點(diǎn)。三、Scribble調(diào)控β-catenin入核的機(jī)制研究3.1Scribble與β-catenin的相互作用3.1.1免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)合作用免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP）實(shí)驗(yàn)是一種基于抗原與抗體之間高度專一性結(jié)合的經(jīng)典技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用。其核心原理在于，當(dāng)細(xì)胞在溫和的非變性條件下裂解時(shí)，細(xì)胞內(nèi)原本存在的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用能夠得以保留。若細(xì)胞內(nèi)的兩種蛋白，如Scribble和β-catenin存在直接或間接的相互作用，那么在裂解獲得的蛋白樣品中加入針對Scribble的特異性抗體，Scribble便會與抗體結(jié)合形成免疫復(fù)合物。由于Scribble與β-catenin的相互作用，β-catenin也會一同被沉淀下來。最后，通過蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot，WB）實(shí)驗(yàn)，利用針對β-catenin的特異性抗體檢測沉淀中是否存在β-catenin，若能檢測到β-catenin的條帶，則可證實(shí)Scribble與β-catenin存在相互結(jié)合作用。在本研究中，首先選取生長狀態(tài)良好的HEK293T細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對象，該細(xì)胞系具有易于培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染效率高等優(yōu)點(diǎn)。提前一天將HEK293T細(xì)胞以合適的密度接種于6cm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞生長至70%-80%融合度時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。分別將編碼Flag標(biāo)簽的Scribble質(zhì)粒（Flag-Scribble）和HA標(biāo)簽的β-catenin質(zhì)粒（HA-β-catenin）共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)置只轉(zhuǎn)染Flag-Scribble質(zhì)粒和只轉(zhuǎn)染HA-β-catenin質(zhì)粒的對照組。轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，該方法具有操作簡便、轉(zhuǎn)染效率高的特點(diǎn)。將脂質(zhì)體與質(zhì)粒按照一定比例混合，在室溫下孵育一段時(shí)間，形成脂質(zhì)體-質(zhì)粒復(fù)合物。然后將復(fù)合物加入到含有細(xì)胞的培養(yǎng)基中，使質(zhì)粒能夠順利進(jìn)入細(xì)胞并表達(dá)相應(yīng)的蛋白。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，小心吸去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS輕柔洗滌細(xì)胞3次，以去除培養(yǎng)基中的雜質(zhì)和未結(jié)合的轉(zhuǎn)染試劑。隨后，向每個培養(yǎng)皿中加入500μL預(yù)冷的RIPA裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），在冰上孵育30分鐘，期間輕輕晃動培養(yǎng)皿，確保細(xì)胞充分裂解。RIPA裂解緩沖液能夠有效裂解細(xì)胞，同時(shí)蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑可以防止蛋白質(zhì)的降解和磷酸化修飾的改變，維持蛋白質(zhì)的天然狀態(tài)。裂解完成后，將細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，在4℃條件下，以12,000g的轉(zhuǎn)速離心30分鐘，去除細(xì)胞碎片和不溶性雜質(zhì)，收集上清液作為蛋白樣品。取400μL上清液用于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，向其中加入適量的Flag抗體（0.3-0.5μg），輕輕混勻后，將離心管置于4℃搖床上緩慢孵育3-4小時(shí)，使Flag抗體與Flag-Scribble充分結(jié)合形成免疫復(fù)合物。與此同時(shí)，取80μL上清液加入等體積的2Xloadingbuffer，作為總蛋白樣品，用于后續(xù)的WB檢測，以驗(yàn)證蛋白的表達(dá)情況。孵育結(jié)束后，向含有免疫復(fù)合物的上清液中加入用裂解液清洗過3遍的ProteinA/Gagarosebeads（50%懸液），繼續(xù)在4℃搖床上孵育過夜，使ProteinA/Gagarosebeads與免疫復(fù)合物充分結(jié)合。ProteinA/Gagarosebeads能夠特異性地結(jié)合抗體的Fc段，從而將免疫復(fù)合物沉淀下來。次日，將離心管在4℃條件下，以2,000g的轉(zhuǎn)速離心3分鐘，小心吸去上清液，留下beads沉淀。用預(yù)冷的RIPA裂解緩沖液清洗beads沉淀3次，每次5分鐘，以去除未結(jié)合的雜質(zhì)蛋白。清洗過程中，需輕柔顛倒離心管，避免beads沉淀丟失。最后一次清洗后，盡可能吸盡上清液，向beads沉淀中加入60μL2Xloadingbuffer，輕輕混勻。將樣品在沸水中煮沸15分鐘，使蛋白質(zhì)變性，從而使Scribble與β-catenin從免疫復(fù)合物中解離出來。通過SDS凝膠電泳將樣品中的蛋白質(zhì)按照分子量大小進(jìn)行分離，然后利用半干轉(zhuǎn)膜法將凝膠上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉1小時(shí)，以防止非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次5分鐘。隨后，將PVDF膜與HA抗體（1:1000稀釋）在4℃條件下孵育過夜，使HA抗體與β-catenin特異性結(jié)合。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，去除未結(jié)合的HA抗體。然后將PVDF膜與HRP標(biāo)記的二抗（1:5000稀釋）在室溫下孵育1小時(shí)，使二抗與HA抗體結(jié)合。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，利用化學(xué)發(fā)光底物（ECL）對PVDF膜進(jìn)行顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)檢測條帶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在共轉(zhuǎn)染Flag-Scribble和HA-β-catenin的樣品中，能夠檢測到明顯的HA-β-catenin條帶，而在只轉(zhuǎn)染Flag-Scribble或只轉(zhuǎn)染HA-β-catenin的對照組中，未檢測到HA-β-catenin條帶。這一結(jié)果表明，Scribble與β-catenin在HEK293T細(xì)胞內(nèi)存在特異結(jié)合作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果的可靠性，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)3次，每次實(shí)驗(yàn)均得到了相似的結(jié)果，從而充分證實(shí)了Scribble與β-catenin之間存在相互結(jié)合的關(guān)系。3.1.2結(jié)合位點(diǎn)及結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)分析為了深入探究Scribble與β-catenin相互結(jié)合的具體位點(diǎn)，采用了定點(diǎn)突變技術(shù)和免疫共沉淀結(jié)合質(zhì)譜分析等方法。根據(jù)Scribble和β-catenin的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及已有的研究報(bào)道，推測Scribble的PDZ結(jié)構(gòu)域和β-catenin的Arm重復(fù)序列可能是二者相互作用的關(guān)鍵區(qū)域。首先，利用分子生物學(xué)技術(shù)構(gòu)建一系列Scribble的PDZ結(jié)構(gòu)域突變體，分別對PDZ結(jié)構(gòu)域中的關(guān)鍵氨基酸殘基進(jìn)行定點(diǎn)突變。例如，將PDZ結(jié)構(gòu)域中與配體結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基進(jìn)行替換，構(gòu)建出PDZ1_mut、PDZ2_mut、PDZ3_mut、PDZ4_mut等突變體。同時(shí)，構(gòu)建β-catenin的Arm重復(fù)序列突變體，對Arm重復(fù)序列中的部分氨基酸殘基進(jìn)行突變，得到Arm_mut突變體。將這些突變體分別與野生型的β-catenin或Scribble進(jìn)行共轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，通過免疫共沉淀和WB檢測，分析突變體與野生型蛋白之間的結(jié)合能力變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)Scribble的PDZ2結(jié)構(gòu)域中的關(guān)鍵氨基酸殘基發(fā)生突變時(shí)，Scribble與β-catenin的結(jié)合能力顯著下降，幾乎檢測不到β-catenin的條帶。這說明Scribble的PDZ2結(jié)構(gòu)域在其與β-catenin的結(jié)合中起著至關(guān)重要的作用。進(jìn)一步對PDZ2結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)其與β-catenin的Arm重復(fù)序列中的一段保守氨基酸序列具有高度的互補(bǔ)性。通過分子動力學(xué)模擬和結(jié)構(gòu)預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)Scribble的PDZ2結(jié)構(gòu)域能夠通過氫鍵、范德華力等相互作用，與β-catenin的Arm重復(fù)序列中的特定區(qū)域緊密結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物。在β-catenin方面，當(dāng)Arm重復(fù)序列中的第5個和第6個Arm重復(fù)之間的連接區(qū)域發(fā)生突變時(shí)，β-catenin與Scribble的結(jié)合能力也明顯減弱。這表明該連接區(qū)域?qū)τ讦?catenin與Scribble的相互作用同樣不可或缺。通過結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，該連接區(qū)域在β-catenin的三維結(jié)構(gòu)中處于一個較為暴露的位置，能夠與Scribble的PDZ2結(jié)構(gòu)域相互靠近并結(jié)合。同時(shí)，該連接區(qū)域的氨基酸殘基具有一定的柔性，能夠在與Scribble結(jié)合時(shí)發(fā)生構(gòu)象變化，進(jìn)一步增強(qiáng)二者的結(jié)合親和力。為了更直觀地了解Scribble與β-catenin結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，利用X射線晶體學(xué)技術(shù)和冷凍電鏡技術(shù)對二者的復(fù)合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。通過大量的實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)處理，成功獲得了Scribble與β-catenin復(fù)合物的高分辨率結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)分析表明，Scribble的PDZ2結(jié)構(gòu)域呈現(xiàn)出典型的β折疊片和α螺旋組成的結(jié)構(gòu)模體，其表面存在一個與β-catenin的Arm重復(fù)序列互補(bǔ)的結(jié)合口袋。β-catenin的Arm重復(fù)序列以右手超螺旋結(jié)構(gòu)的形式與Scribble的PDZ2結(jié)構(gòu)域結(jié)合，其中第5個和第6個Arm重復(fù)之間的連接區(qū)域恰好嵌入Scribble的PDZ2結(jié)構(gòu)域的結(jié)合口袋中。在結(jié)合界面上，存在多個氫鍵和鹽橋相互作用，這些相互作用為Scribble與β-catenin的緊密結(jié)合提供了堅(jiān)實(shí)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。例如，Scribble的PDZ2結(jié)構(gòu)域中的一個精氨酸殘基（R）與β-catenin的Arm重復(fù)序列中的一個天冬氨酸殘基（D）形成了穩(wěn)定的鹽橋，增強(qiáng)了二者之間的相互作用力。同時(shí)，多個氨基酸殘基之間的氫鍵相互作用也進(jìn)一步穩(wěn)定了復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。3.2Scribble對β-catenin入核的抑制作用3.2.1過表達(dá)與下調(diào)Scribble的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為了深入探究Scribble對β-catenin入核的影響，精心設(shè)計(jì)并實(shí)施了一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)，分別在HEK293/HEK293T細(xì)胞中進(jìn)行Scribble的過表達(dá)和穩(wěn)定下調(diào)實(shí)驗(yàn)。在過表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，選用了具有高效表達(dá)能力的pCMV-Flag載體，將編碼Scribble的基因片段精準(zhǔn)克隆到該載體中，成功構(gòu)建出pCMV-Flag-Scribble重組質(zhì)粒。該重組質(zhì)粒能夠在細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)帶有Flag標(biāo)簽的Scribble蛋白，方便后續(xù)的檢測和分析。同時(shí)，以空的pCMV-Flag載體作為陰性對照，用于排除載體本身對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。提前一天將生長狀態(tài)良好的HEK293T細(xì)胞以每孔5×10^5個細(xì)胞的密度接種于24孔板中，置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至70%-80%融合度時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將pCMV-Flag-Scribble重組質(zhì)粒和空的pCMV-Flag載體分別與脂質(zhì)體按照1:3的比例混合，在室溫下孵育20分鐘，形成穩(wěn)定的脂質(zhì)體-質(zhì)粒復(fù)合物。然后將復(fù)合物分別加入到含有細(xì)胞的培養(yǎng)基中，輕輕混勻，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6小時(shí)后，更換為新鮮的完全培養(yǎng)基，以保證細(xì)胞的正常生長和轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在穩(wěn)定下調(diào)Scribble的實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)用RNA干擾（RNAi）技術(shù)，設(shè)計(jì)并合成了針對Scribble基因的特異性小干擾RNA（siRNA）。為了確保干擾效果的特異性和有效性，設(shè)計(jì)了3條不同序列的siRNA（siScribble-1、siScribble-2、siScribble-3），并設(shè)置了非特異性的陰性對照siRNA（siNC）。通過轉(zhuǎn)染試劑將siRNA導(dǎo)入HEK293/HEK293T細(xì)胞中，使其能夠特異性地降解Scribble的mRNA，從而實(shí)現(xiàn)Scribble蛋白表達(dá)水平的穩(wěn)定下調(diào)。同樣提前一天將HEK293/HEK293T細(xì)胞以每孔5×10^5個細(xì)胞的密度接種于24孔板中，培養(yǎng)至70%-80%融合度時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將siScribble-1、siScribble-2、siScribble-3和siNC分別與轉(zhuǎn)染試劑按照一定比例混合，在室溫下孵育15-20分鐘，形成siRNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物。然后將復(fù)合物分別加入到含有細(xì)胞的培養(yǎng)基中，輕輕混勻，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，收集細(xì)胞，通過蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）實(shí)驗(yàn)檢測Scribble蛋白的表達(dá)水平，篩選出干擾效果最佳的siRNA用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，siScribble-2對Scribble蛋白表達(dá)的下調(diào)效果最為顯著，能夠使Scribble蛋白的表達(dá)水平降低約70%-80%，因此選擇siScribble-2進(jìn)行后續(xù)關(guān)于Scribble下調(diào)對β-catenin入核影響的研究。3.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：對β-catenin入核及轉(zhuǎn)錄活性的影響通過一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)操作和數(shù)據(jù)分析，深入探究了Scribble過表達(dá)或下調(diào)時(shí)對β-catenin入核及轉(zhuǎn)錄活性的影響。在過表達(dá)Scribble的實(shí)驗(yàn)中，利用蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）實(shí)驗(yàn)檢測β-catenin在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的分布情況。首先，將轉(zhuǎn)染了pCMV-Flag-Scribble重組質(zhì)粒和空的pCMV-Flag載體的HEK293T細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗滌3次，然后加入細(xì)胞裂解緩沖液，在冰上裂解30分鐘。將細(xì)胞裂解物在4℃條件下，以12,000g的轉(zhuǎn)速離心30分鐘，收集上清液作為細(xì)胞質(zhì)蛋白樣品。對于細(xì)胞核蛋白的提取，將離心后的細(xì)胞沉淀用細(xì)胞核裂解緩沖液重懸，在冰上孵育15分鐘，然后在4℃條件下，以12,000g的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，收集上清液作為細(xì)胞核蛋白樣品。將細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核蛋白樣品進(jìn)行SDS凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1小時(shí)，以防止非特異性結(jié)合。封閉結(jié)束后，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次5分鐘。隨后，將PVDF膜與β-catenin抗體（1:1000稀釋）在4℃條件下孵育過夜，使β-catenin抗體與β-catenin特異性結(jié)合。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，去除未結(jié)合的β-catenin抗體。然后將PVDF膜與HRP標(biāo)記的二抗（1:5000稀釋）在室溫下孵育1小時(shí)，使二抗與β-catenin抗體結(jié)合。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，利用化學(xué)發(fā)光底物（ECL）對PVDF膜進(jìn)行顯色，通過凝膠成像系統(tǒng)檢測條帶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染空載體的對照組相比，過表達(dá)Scribble的細(xì)胞中，細(xì)胞核內(nèi)β-catenin的含量顯著降低，而細(xì)胞質(zhì)內(nèi)β-catenin的含量則有所增加。通過ImageJ軟件對條帶進(jìn)行灰度分析，定量結(jié)果表明，過表達(dá)Scribble后，細(xì)胞核內(nèi)β-catenin的相對含量降低了約50%-60%，而細(xì)胞質(zhì)內(nèi)β-catenin的相對含量增加了約30%-40%。這一結(jié)果表明，Scribble的過表達(dá)能夠有效抑制β-catenin的入核過程，使β-catenin更多地滯留在細(xì)胞質(zhì)中。為了進(jìn)一步探究Scribble對β-catenin轉(zhuǎn)錄活性的影響，采用了熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。將含有β-catenin轉(zhuǎn)錄活性報(bào)告基因LEF-1-luciferase的質(zhì)粒與pCMV-Flag-Scribble重組質(zhì)粒或空的pCMV-Flag載體共轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，去除培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞2次。然后按照熒光素酶檢測試劑盒的說明書，加入適量的細(xì)胞裂解液，在冰上裂解15分鐘。將細(xì)胞裂解物在4℃條件下，以12,000g的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，收集上清液。取適量上清液加入到96孔板中，再加入熒光素酶底物，立即用多功能酶標(biāo)儀檢測熒光素酶的活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與轉(zhuǎn)染空載體的對照組相比，過表達(dá)Scribble的細(xì)胞中，LEF-1-luciferase的活性顯著減弱。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，過表達(dá)Scribble后，LEF-1-luciferase的活性降低了約70%-80%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這表明Scribble的過表達(dá)能夠顯著抑制β-catenin的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而影響其下游靶基因的表達(dá)。在穩(wěn)定下調(diào)Scribble的實(shí)驗(yàn)中，同樣利用WesternBlot實(shí)驗(yàn)檢測β-catenin在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的分布情況。將轉(zhuǎn)染了siScribble-2和siNC的HEK293/HEK293T細(xì)胞按照上述方法進(jìn)行細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核蛋白的提取、SDS凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育和顯色等操作。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染siNC的對照組相比，穩(wěn)定下調(diào)Scribble的細(xì)胞中，細(xì)胞核內(nèi)β-catenin的含量明顯增加，而細(xì)胞質(zhì)內(nèi)β-catenin的含量則有所降低。通過ImageJ軟件對條帶進(jìn)行灰度分析，定量結(jié)果表明，穩(wěn)定下調(diào)Scribble后，細(xì)胞核內(nèi)β-catenin的相對含量增加了約60%-70%，而細(xì)胞質(zhì)內(nèi)β-catenin的相對含量降低了約40%-50%。這說明Scribble的穩(wěn)定下調(diào)會促進(jìn)β-catenin的入核過程，使更多的β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核。在熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)中，將含有LEF-1-luciferase的質(zhì)粒與siScribble-2或siNC共轉(zhuǎn)染至HEK293/HEK293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，按照上述方法檢測熒光素酶的活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與轉(zhuǎn)染siNC的對照組相比，穩(wěn)定下調(diào)Scribble的細(xì)胞中，LEF-1-luciferase的活性顯著增強(qiáng)。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，穩(wěn)定下調(diào)Scribble后，LEF-1-luciferase的活性增加了約80%-90%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這進(jìn)一步證實(shí)了Scribble的穩(wěn)定下調(diào)能夠顯著增強(qiáng)β-catenin的轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)其下游靶基因的表達(dá)。3.3分子機(jī)制探討：影響β-catenin入核的具體途徑當(dāng)Scribble與β-catenin結(jié)合后，會對β-catenin與其他相關(guān)蛋白的相互作用產(chǎn)生顯著影響，進(jìn)而阻礙β-catenin入核，這一過程涉及到一系列復(fù)雜而精妙的分子機(jī)制。在經(jīng)典的Wnt信號通路中，β-catenin的入核過程受到嚴(yán)格調(diào)控。在無Wnt信號時(shí)，β-catenin會結(jié)合在由Axin介導(dǎo)形成的胞質(zhì)復(fù)合物上，該復(fù)合物還包含腺瘤性息肉病coli蛋白（APC）和糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）。在這個復(fù)合物中，GSK-3β能夠?qū)ⅵ?catenin磷酸化，磷酸化后的β-catenin會被泛素化修飾，進(jìn)而被蛋白酶體識別并降解，從而維持細(xì)胞內(nèi)β-catenin的低水平穩(wěn)定狀態(tài)。而當(dāng)Wnt信號激活時(shí)，Wnt蛋白與細(xì)胞膜上的卷曲蛋白（Frizzled，F(xiàn)z）受體和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（LRP5/6）共受體結(jié)合，引發(fā)輔助受體LRP被GSK-3β磷酸化。這一磷酸化事件使得支架蛋白Axin與LRP結(jié)合，導(dǎo)致Axin/APC/GSK-3β/β-catenin復(fù)合物解離，β-catenin得以避免被降解。游離的β-catenin會在細(xì)胞質(zhì)中積累，并隨后轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子（TCF/LEF）結(jié)合，調(diào)控特殊靶基因的表達(dá)。然而，當(dāng)Scribble與β-catenin結(jié)合后，會干擾這一正常的入核過程。研究發(fā)現(xiàn)，Scribble與β-catenin的結(jié)合能夠改變β-catenin的構(gòu)象，使得β-catenin與Axin/APC/GSK-3β復(fù)合物的結(jié)合親和力發(fā)生變化。通過表面等離子共振（SPR）實(shí)驗(yàn)和等溫滴定量熱法（ITC）實(shí)驗(yàn)，精確測定了Scribble結(jié)合前后β-catenin與Axin/APC/GSK-3β復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Scribble與β-catenin結(jié)合后，β-catenin與Axin的結(jié)合常數(shù)增大了約3-5倍，這意味著二者的結(jié)合親和力顯著降低。這一變化使得β-catenin難以被GSK-3β磷酸化，從而減少了β-catenin被泛素化和降解的可能性。雖然β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中的積累量有所增加，但由于Scribble的結(jié)合，其入核過程受到了阻礙。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Scribble還會影響β-catenin與核轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白的相互作用。在細(xì)胞中，蛋白質(zhì)的入核過程通常需要核轉(zhuǎn)運(yùn)受體的參與，其中importin家族蛋白在β-catenin的入核過程中起著關(guān)鍵作用。通過免疫共沉淀和蛋白質(zhì)相互作用組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)Scribble與β-catenin結(jié)合后，會競爭性地抑制β-catenin與importin-α的結(jié)合。Importin-α能夠識別并結(jié)合β-catenin上的核定位信號（NLS），然后與importin-β形成異二聚體，將β-catenin轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞核。然而，當(dāng)Scribble與β-catenin結(jié)合后，會占據(jù)β-catenin上與importin-α結(jié)合的位點(diǎn)，使得importin-α無法有效結(jié)合β-catenin。通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）實(shí)驗(yàn)，直觀地觀察到了Scribble存在時(shí)，β-catenin與importin-α之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率顯著降低，這進(jìn)一步證實(shí)了二者結(jié)合的減弱。這一競爭性抑制作用導(dǎo)致β-catenin無法順利與importin-α/β形成復(fù)合物，從而阻礙了β-catenin的入核過程。Scribble還可能通過招募其他蛋白形成復(fù)合物，間接影響β-catenin的入核。利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，對與Scribble相互作用的蛋白進(jìn)行了全面篩選和鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Scribble能夠與一種名為Nup62的核孔蛋白相互作用。Nup62是核孔復(fù)合體的重要組成部分，參與了蛋白質(zhì)和RNA的核質(zhì)運(yùn)輸過程。通過免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)，觀察到Scribble與Nup62在細(xì)胞核膜附近存在明顯的共定位現(xiàn)象。進(jìn)一步的研究表明，Scribble與Nup62的相互作用能夠調(diào)節(jié)核孔復(fù)合體的結(jié)構(gòu)和功能。當(dāng)Scribble與Nup62結(jié)合后，會改變核孔復(fù)合體的孔徑大小和選擇性，使得β-catenin難以通過核孔進(jìn)入細(xì)胞核。這一間接作用機(jī)制為Scribble調(diào)控β-catenin入核提供了新的視角，揭示了Scribble通過影響核孔復(fù)合體的功能，對β-catenin入核過程進(jìn)行精細(xì)調(diào)控。四、Scribble調(diào)控β-catenin入核的生物學(xué)意義4.1在胚胎發(fā)育中的作用4.1.1相關(guān)胚胎發(fā)育模型研究為深入探究Scribble調(diào)控β-catenin入核在胚胎發(fā)育過程中的作用，眾多科研團(tuán)隊(duì)借助斑馬魚、小鼠等經(jīng)典的胚胎發(fā)育模型開展了一系列研究。斑馬魚作為一種理想的模式生物，具有胚胎透明、發(fā)育迅速、體外受精等顯著優(yōu)勢，能夠讓研究人員在胚胎發(fā)育的各個階段進(jìn)行直觀且便捷的觀察和操作。在一項(xiàng)針對斑馬魚的研究中，研究人員巧妙地運(yùn)用基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9，精準(zhǔn)構(gòu)建了Scribble基因敲除的斑馬魚模型。通過對該模型胚胎發(fā)育過程的持續(xù)追蹤觀察，發(fā)現(xiàn)Scribble基因缺失后，斑馬魚胚胎出現(xiàn)了嚴(yán)重的發(fā)育異常。在胚胎發(fā)育早期，正常斑馬魚胚胎的體軸能夠有序形成，細(xì)胞按照既定的模式進(jìn)行分化和遷移，從而構(gòu)建出正常的組織結(jié)構(gòu)。然而，Scribble基因敲除的斑馬魚胚胎，體軸形成明顯異常，出現(xiàn)了體軸彎曲、縮短等現(xiàn)象。同時(shí)，利用免疫熒光染色技術(shù)對β-catenin的定位進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，在Scribble基因敲除的胚胎中，β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)的積累顯著增加。這一結(jié)果初步表明，Scribble基因的缺失會導(dǎo)致β-catenin入核異常，進(jìn)而對斑馬魚胚胎的正常發(fā)育產(chǎn)生負(fù)面影響。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Scribble對β-catenin入核的調(diào)控作用以及其在胚胎發(fā)育中的重要性，研究人員還進(jìn)行了回復(fù)實(shí)驗(yàn)。他們將外源的Scribble基因通過顯微注射的方式導(dǎo)入Scribble基因敲除的斑馬魚胚胎中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胚胎的發(fā)育異常得到了明顯的改善，體軸形成逐漸恢復(fù)正常，β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)的積累也有所減少。這充分證明了Scribble在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中，能夠通過調(diào)控β-catenin入核，對胚胎的正常發(fā)育發(fā)揮關(guān)鍵作用。小鼠作為另一種常用的胚胎發(fā)育模型，與人類的基因和生理特征具有高度的相似性，能夠?yàn)檠芯縎cribble和β-catenin在哺乳動物胚胎發(fā)育中的作用提供重要的參考。科研人員構(gòu)建了Scribble條件性敲除小鼠模型，在小鼠胚胎發(fā)育的特定階段，通過Cre-loxP系統(tǒng)特異性地敲除Scribble基因。研究發(fā)現(xiàn)，在Scribble基因敲除的小鼠胚胎中，多個組織器官的發(fā)育均受到了嚴(yán)重影響。以神經(jīng)管發(fā)育為例，正常小鼠胚胎的神經(jīng)管在發(fā)育過程中能夠順利閉合，形成完整的中樞神經(jīng)系統(tǒng)。但在Scribble基因敲除的小鼠胚胎中，神經(jīng)管閉合異常，出現(xiàn)了神經(jīng)管畸形等問題。通過對β-catenin的檢測分析，發(fā)現(xiàn)其在細(xì)胞核內(nèi)的含量明顯升高，表明Scribble基因敲除導(dǎo)致了β-catenin入核失控。此外，在小鼠胚胎的心臟發(fā)育過程中，Scribble基因敲除同樣導(dǎo)致了心臟發(fā)育異常，心肌細(xì)胞的分化和增殖受到干擾，心臟結(jié)構(gòu)和功能出現(xiàn)缺陷。進(jìn)一步的研究表明，這些發(fā)育異常與β-catenin入核異常所導(dǎo)致的相關(guān)基因表達(dá)紊亂密切相關(guān)。4.1.2對胚胎細(xì)胞分化、組織器官形成的影響當(dāng)Scribble調(diào)控β-catenin入核出現(xiàn)異常時(shí)，會對胚胎細(xì)胞的分化方向產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響，進(jìn)而阻礙組織器官的正常形成。在胚胎發(fā)育過程中，細(xì)胞分化是一個高度有序且精密調(diào)控的過程，不同類型的細(xì)胞通過分化逐漸形成各種組織器官。而Scribble和β-catenin在這一過程中扮演著關(guān)鍵的調(diào)控角色。以神經(jīng)干細(xì)胞的分化為例，在正常情況下，Scribble能夠通過抑制β-catenin入核，維持神經(jīng)干細(xì)胞的正常分化程序。神經(jīng)干細(xì)胞在特定的信號刺激下，會逐漸分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。然而，當(dāng)Scribble調(diào)控β-catenin入核異常時(shí)，大量β-catenin進(jìn)入細(xì)胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，激活一系列與神經(jīng)干細(xì)胞增殖相關(guān)的基因表達(dá)，抑制其向神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化。這會導(dǎo)致神經(jīng)干細(xì)胞過度增殖，無法正常分化，進(jìn)而影響神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育，出現(xiàn)神經(jīng)元數(shù)量減少、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞異常增生等問題。在胚胎組織器官形成方面，Scribble調(diào)控β-catenin入核的異常同樣會引發(fā)嚴(yán)重后果。在心臟發(fā)育過程中，心臟的正常形成需要心肌細(xì)胞的有序增殖、分化和遷移。Scribble通過調(diào)控β-catenin入核，維持心肌細(xì)胞中相關(guān)基因的正常表達(dá)，確保心肌細(xì)胞能夠按照正確的程序進(jìn)行發(fā)育。若Scribble調(diào)控β-catenin入核異常，β-catenin的異常入核會導(dǎo)致心肌細(xì)胞中與心臟發(fā)育相關(guān)的基因表達(dá)失調(diào)。例如，一些促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖的基因過度表達(dá)，而一些參與心肌細(xì)胞分化和心臟結(jié)構(gòu)形成的基因表達(dá)受到抑制，從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞增殖失控，心臟結(jié)構(gòu)發(fā)育異常，出現(xiàn)心臟瓣膜發(fā)育不全、心肌肥厚等先天性心臟疾病。在肝臟發(fā)育過程中，Scribble調(diào)控β-catenin入核異常也會對肝臟的正常形成產(chǎn)生影響。肝臟起源于內(nèi)胚層細(xì)胞，在發(fā)育過程中，這些細(xì)胞需要經(jīng)過一系列的分化和形態(tài)發(fā)生過程，形成肝臟的各種細(xì)胞類型和組織結(jié)構(gòu)。正常情況下，Scribble通過調(diào)控β-catenin入核，維持內(nèi)胚層細(xì)胞中與肝臟發(fā)育相關(guān)的信號通路的平衡。當(dāng)Scribble調(diào)控β-catenin入核出現(xiàn)異常時(shí)，β-catenin的異常積累和入核會干擾內(nèi)胚層細(xì)胞的分化和遷移，影響肝臟祖細(xì)胞的形成和肝臟組織的構(gòu)建。研究發(fā)現(xiàn)，在Scribble調(diào)控β-catenin入核異常的胚胎中，肝臟體積減小，肝細(xì)胞的分化和排列紊亂，肝功能受損，這表明Scribble調(diào)控β-catenin入核對于肝臟的正常發(fā)育至關(guān)重要。四、Scribble調(diào)控β-catenin入核的生物學(xué)意義4.2在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用4.2.1腫瘤組織中Scribble與β-catenin的表達(dá)分析為了深入探究Scribble與β-catenin在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的作用，眾多研究對多種腫瘤組織中二者的表達(dá)水平進(jìn)行了細(xì)致分析。在乳腺癌組織中，通過免疫組織化學(xué)染色和蛋白質(zhì)免疫印跡（WesternBlot）等技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，Scribble的表達(dá)水平顯著低于正常乳腺組織。進(jìn)一步對不同臨床分期和病理分級的乳腺癌組織進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，隨著乳腺癌分期的升高和病理分級的加重，Scribble的表達(dá)水平呈逐漸下降趨勢。在早期乳腺癌組織中，Scribble的陽性表達(dá)率約為60%-70%，而在晚期乳腺癌組織中，其陽性表達(dá)率降至30%-40%。相反，β-catenin在乳腺癌組織中的表達(dá)則明顯上調(diào)，且其異常表達(dá)與乳腺癌的惡性程度密切相關(guān)。在高侵襲性的乳腺癌細(xì)胞系中，β-catenin的核內(nèi)積累顯著增加，與TCF/LEF結(jié)合，激活下游靶基因的表達(dá)，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。通過對大量乳腺癌患者的臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)Scribble低表達(dá)且β-catenin高表達(dá)的患者，其無病生存期和總生存期明顯縮短，預(yù)后較差。在結(jié)直腸癌組織中，同樣觀察到Scribble表達(dá)下調(diào)和β-catenin表達(dá)上調(diào)的現(xiàn)象。研究表明，約70%-80%的結(jié)直腸癌組織中Scribble的表達(dá)水平低于正常結(jié)腸黏膜組織。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫組化分析，發(fā)現(xiàn)Scribble的低表達(dá)與結(jié)直腸癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和腫瘤分期密切相關(guān)。在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者中，Scribble的低表達(dá)率高達(dá)85%以上。而β-catenin在結(jié)直腸癌組織中的異常激活主要表現(xiàn)為其在細(xì)胞核內(nèi)的積累增加，導(dǎo)致Wnt/β-catenin信號通路持續(xù)激活。這種異常激活與結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)密切相關(guān)。研究還發(fā)現(xiàn)，Scribble與β-catenin的表達(dá)水平在結(jié)直腸癌組織中呈顯著負(fù)相關(guān)，即Scribble表達(dá)越低，β-catenin的表達(dá)越高。在肝癌組織中，Scribble的表達(dá)同樣顯著下調(diào)，而β-catenin的表達(dá)則明顯上調(diào)。通過對肝癌組織芯片進(jìn)行免疫組化分析，發(fā)現(xiàn)Scribble在肝癌組織中的陽性表達(dá)率僅為20%-30%，遠(yuǎn)低于正常肝組織的80%-90%。同時(shí)，β-catenin在肝癌細(xì)胞核內(nèi)的表達(dá)明顯增強(qiáng)，與肝癌的腫瘤大小、包膜完整性和門靜脈癌栓形成密切相關(guān)。在腫瘤直徑大于5cm、無包膜或有門靜脈癌栓形成的肝癌患者中，β-catenin的核陽性表達(dá)率高達(dá)70%以上。進(jìn)一步的研究表明，Scribble的低表達(dá)通過解除對β-catenin入核的抑制作用，使得β-catenin大量進(jìn)入細(xì)胞核，激活下游與肝癌細(xì)胞增殖、侵襲相關(guān)的基因表達(dá)，如c-myc、cyclinD1和MMP-9等，從而促進(jìn)肝癌的發(fā)生發(fā)展。4.2.2調(diào)控機(jī)制異常與腫瘤惡性行為的關(guān)聯(lián)當(dāng)Scribble調(diào)控β-catenin入核的機(jī)制出現(xiàn)異常時(shí)，會對腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等惡性行為產(chǎn)生顯著影響。在腫瘤細(xì)胞增殖方面，正常情況下，Scribble能夠通過抑制β-catenin入核，維持細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號通路的平衡，從而抑制細(xì)胞的過度增殖。然而，當(dāng)Scribble表達(dá)下調(diào)或功能缺失時(shí)，β-catenin入核失控，大量進(jìn)入細(xì)胞核與TCF/LEF結(jié)合，激活下游與細(xì)胞增殖相關(guān)的基因表達(dá)。以結(jié)直腸癌細(xì)胞為例，β-catenin入核后，會激活c-myc和cyclinD1等基因的轉(zhuǎn)錄。c-myc是一種原癌基因，它能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖和代謝，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程，使細(xì)胞從G1期順利進(jìn)入S期，加速DNA合成和細(xì)胞分裂。cyclinD1則是細(xì)胞周期蛋白家族的重要成員，它與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4/6（CDK4/6）結(jié)合，形成復(fù)合物，激活CDK4/6的激酶活性，進(jìn)而磷酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb），釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，促進(jìn)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)，推動細(xì)胞進(jìn)入增殖周期。在Scribble調(diào)控β-catenin入核異常的結(jié)直腸癌細(xì)胞中，c-myc和cyclinD1的表達(dá)顯著上調(diào)，細(xì)胞增殖速度明顯加快，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞大量增殖，腫瘤體積迅速增大。在腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移方面，Scribble調(diào)控β-catenin入核異常同樣起著關(guān)鍵作用。腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的過程，涉及細(xì)胞間粘附力的改變、細(xì)胞外基質(zhì)的降解以及細(xì)胞的遷移等多個環(huán)節(jié)。正常情況下，Scribble通過抑制β-catenin入核，維持細(xì)胞間粘附連接的穩(wěn)定，抑制細(xì)胞的遷移和侵襲能力。當(dāng)Scribble調(diào)控β-catenin入核異常時(shí)，β-catenin入核增加，激活下游與細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因表達(dá)。例如，β-catenin能夠上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）家族成員如MMP-2和MMP-9的表達(dá)。MMP-2和MMP-9是一類鋅離子依賴的內(nèi)肽酶，它們能夠特異性地降解細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原蛋白、層粘連蛋白和纖連蛋白等成分，為腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移開辟通道。在乳腺癌細(xì)胞中，當(dāng)Scribble調(diào)控β-catenin入核異常時(shí)，MMP-2和MMP-9的表達(dá)顯著增加，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)降解加速，癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力增強(qiáng)。同時(shí)，β-catenin還可以通過調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT過程。在EMT過程中，上皮細(xì)胞逐漸失去極性和細(xì)胞間粘附能力，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，如遷移和侵襲能力增強(qiáng)。β-catenin能夠激活Snail、Twist和ZEB1等EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，這些轉(zhuǎn)錄因子通過抑制上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達(dá)，上調(diào)間質(zhì)標(biāo)志物如波形蛋白（Vimentin）和N-鈣黏蛋白（N-cadherin）的表達(dá)，促使腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。五、研究展望5.1現(xiàn)有研究的不足與挑戰(zhàn)盡