PEDF與CD34蛋白：乳腺癌預(yù)后評(píng)估的新視角一、引言1.1研究背景與意義1.1.1乳腺癌現(xiàn)狀乳腺癌作為全球范圍內(nèi)女性最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著女性的健康與生命。世界衛(wèi)生組織下屬的國際癌癥研究機(jī)構(gòu)發(fā)布的報(bào)告指出，乳腺癌是全球第二常見的癌癥類型，更是全球女性最常見的癌癥。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2022年全球有230萬乳腺癌新發(fā)病例，占女性癌癥新發(fā)病例的25%，有67萬乳腺癌死亡病例，占女性癌癥死亡的15.5%，相當(dāng)于當(dāng)前全球每20名女性中就有1名被診斷患有乳腺癌，每70名女性中就有1名可能在一生中死于乳腺癌。并且這一態(tài)勢(shì)仍在不斷惡化，若當(dāng)前趨勢(shì)不加遏制，到2050年，全球乳腺癌新發(fā)病例預(yù)計(jì)將增長38%，每年因該疾病死亡的病例數(shù)將增加68%。乳腺癌的發(fā)病率和死亡率在全球各地區(qū)間存在顯著差異。澳大利亞、新西蘭，北美和北歐地區(qū)的乳腺癌發(fā)病率最高，南亞和非洲部分地區(qū)的發(fā)病率相對(duì)較低。而太平洋群島美拉尼西亞、波利尼西亞，以及西非地區(qū)的乳腺癌死亡率最高。乳腺癌生存率與經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平密切相關(guān)，在高收入國家，83%的乳腺癌患者可以存活，而在低收入國家，超過50%的乳腺癌患者最終死于該疾病。導(dǎo)致乳腺癌死亡率高的主要原因是醫(yī)療資源匱乏，患者無法獲得及時(shí)有效的治療。在中國，乳腺癌的發(fā)病率也呈逐年上升趨勢(shì)，且逐漸年輕化，成為了嚴(yán)重影響女性生活質(zhì)量和生命健康的重要公共衛(wèi)生問題。盡管目前已經(jīng)有了手術(shù)、化療、放療、內(nèi)分泌治療和靶向治療等多種治療乳腺癌的方法，但針對(duì)不同患者的治療效果仍然存在較大的不確定性，部分患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。因此，深入研究乳腺癌的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，對(duì)于提高乳腺癌的治療效果和患者的生存率具有重要意義。1.1.2PEDF和CD34蛋白研究價(jià)值在乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展過程中，許多蛋白質(zhì)發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其中色素上皮細(xì)胞源性生長抑制劑（PEDF）和CD34蛋白備受關(guān)注。PEDF是一種多功能蛋白，具有抗腫瘤、抗血管生成、神經(jīng)保護(hù)等多種生物活性。研究表明，在人類乳腺癌組織中，PEDF的表達(dá)水平常常比正常組織低，其在乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)與癌細(xì)胞的凋亡、細(xì)胞周期和腫瘤生長相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，在52例人乳腺癌的患者中，63％的患者PEDF的表達(dá)水平較低，且PEDF的表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度相關(guān)，表達(dá)水平較低的患者癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)較大，PEDF的表達(dá)水平越低，乳腺癌復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)越高，因此，PEDF的表達(dá)水平可以用作乳腺癌預(yù)后的指標(biāo)。CD34是質(zhì)量在110kDa以下的一種膜糖蛋白，在正常情況下主要存在于造血干細(xì)胞、血小板、T淋巴細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中。在乳腺癌組織中，CD34蛋白的表達(dá)水平與血管生成和組織遷移相關(guān)，促進(jìn)乳腺癌出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)70例乳腺癌患者的觀察發(fā)現(xiàn)，CD34的表達(dá)與乳腺癌的新陳代謝活性和癌細(xì)胞密度有關(guān)，對(duì)CD34表達(dá)較高的患者進(jìn)行的長期隨訪表明，這些患者在乳腺癌惡化和死亡的風(fēng)險(xiǎn)中具有顯著的不良預(yù)后，因此，CD34的表達(dá)也可以作為乳腺癌預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)。對(duì)PEDF和CD34蛋白在乳腺癌中的表達(dá)及其與臨床預(yù)后意義的研究，有助于深入了解乳腺癌的發(fā)病機(jī)制，為乳腺癌的早期診斷、治療方案的選擇以及預(yù)后評(píng)估提供新的思路和方法，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值和理論研究意義。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1PEDF蛋白研究進(jìn)展PEDF作為一種多功能蛋白，在乳腺癌領(lǐng)域的研究已取得了一定成果。在表達(dá)情況方面，國內(nèi)外眾多研究一致表明，在人類乳腺癌組織中，PEDF的表達(dá)水平相較于正常乳腺組織明顯降低。一項(xiàng)納入52例人乳腺癌患者的研究顯示，高達(dá)63％的患者PEDF表達(dá)水平較低。這種低表達(dá)現(xiàn)象在不同亞型的乳腺癌中也有所體現(xiàn)，提示PEDF表達(dá)降低可能是乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的一個(gè)普遍特征。在作用機(jī)制上，PEDF被證實(shí)與癌細(xì)胞的凋亡、細(xì)胞周期和腫瘤生長密切相關(guān)。它能夠通過多種信號(hào)通路來發(fā)揮其抗腫瘤作用，比如激活caspase家族蛋白，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，促使癌細(xì)胞周期阻滯在G1期，從而抑制癌細(xì)胞的增殖。PEDF還可以抑制腫瘤血管生成，通過減少腫瘤的血液供應(yīng)來限制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。有研究發(fā)現(xiàn)，PSPG3（PEDFN-terminaldomain）突變會(huì)導(dǎo)致PEDF的結(jié)構(gòu)和功能改變，進(jìn)而提高乳腺癌細(xì)胞的惡性程度，從反面說明了PEDF正常功能對(duì)維持乳腺細(xì)胞正常狀態(tài)的重要性。在與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系研究中，大量臨床研究數(shù)據(jù)表明，PEDF的表達(dá)水平與乳腺癌患者的預(yù)后顯著相關(guān)。PEDF表達(dá)水平越低，乳腺癌復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)越高，患者的生存率越低。這使得PEDF有望成為評(píng)估乳腺癌預(yù)后的一個(gè)重要生物學(xué)指標(biāo)，為臨床醫(yī)生制定個(gè)性化的治療方案和判斷患者預(yù)后提供重要參考。1.2.2CD34蛋白研究進(jìn)展CD34蛋白在乳腺癌相關(guān)研究中也受到了廣泛關(guān)注。正常情況下，CD34主要存在于造血干細(xì)胞、血小板、T淋巴細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中，但在乳腺癌組織中，其表達(dá)特征發(fā)生了改變。研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌組織中，CD34蛋白的表達(dá)水平與血管生成和組織遷移密切相關(guān)。腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管提供營養(yǎng)和轉(zhuǎn)移途徑，而CD34陽性的內(nèi)皮細(xì)胞是構(gòu)成新生血管的重要組成部分，因此CD34的高表達(dá)往往意味著腫瘤組織中有更多的新生血管生成，從而促進(jìn)乳腺癌出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)70例乳腺癌患者的觀察研究發(fā)現(xiàn)，CD34的表達(dá)與乳腺癌的新陳代謝活性和癌細(xì)胞密度有關(guān)。CD34表達(dá)較高的患者，其腫瘤細(xì)胞的代謝更為活躍，癌細(xì)胞密度也更高。進(jìn)一步的長期隨訪研究表明，這些CD34表達(dá)較高的患者在乳腺癌惡化和死亡的風(fēng)險(xiǎn)中具有顯著的不良預(yù)后。這充分說明CD34蛋白的表達(dá)情況在乳腺癌的臨床診斷和預(yù)后評(píng)估中具有重要意義，高表達(dá)的CD34提示患者的病情可能更為嚴(yán)重，預(yù)后更差。1.2.3研究現(xiàn)狀總結(jié)與不足目前，關(guān)于PEDF和CD34蛋白在乳腺癌中的研究已經(jīng)取得了一些重要成果，明確了它們?cè)谌橄侔┙M織中的表達(dá)特征以及與腫瘤發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后的相關(guān)性，為乳腺癌的診療提供了新的思路和潛在的生物標(biāo)志物。然而，現(xiàn)有研究仍存在一些不足之處。在研究的深度上，雖然已經(jīng)知曉PEDF和CD34蛋白與乳腺癌的一些關(guān)聯(lián)，但對(duì)于它們?cè)谌橄侔┌l(fā)生發(fā)展過程中具體的分子調(diào)控機(jī)制尚未完全明確。例如，PEDF通過哪些具體的下游信號(hào)分子來調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞周期，CD34在促進(jìn)腫瘤血管生成過程中與其他血管生成因子之間的相互作用機(jī)制等問題，還需要進(jìn)一步深入研究。在研究的廣度上，大多數(shù)研究主要集中在分析PEDF和CD34蛋白單獨(dú)的作用，而對(duì)于它們之間是否存在相互作用，以及這種相互作用對(duì)乳腺癌的影響研究較少。此外，現(xiàn)有的研究樣本量相對(duì)較小，研究結(jié)果的普遍性和可靠性有待進(jìn)一步驗(yàn)證。不同研究之間由于實(shí)驗(yàn)方法、樣本來源等因素的差異，導(dǎo)致研究結(jié)果存在一定的不一致性，這也給綜合分析和結(jié)論的得出帶來了困難。針對(duì)這些不足，本研究擬通過擴(kuò)大樣本量，采用更先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法，深入探討PEDF和CD34蛋白在乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移過程中的作用和機(jī)制，分析它們之間的相互關(guān)系，以期為乳腺癌的診斷和治療提供更全面、更深入的理論依據(jù)和新的治療策略。1.3研究目的與方法1.3.1研究目的本研究聚焦于乳腺癌這一嚴(yán)重威脅女性健康的疾病，旨在全面且深入地探究PEDF和CD34蛋白在其中的表達(dá)規(guī)律、作用機(jī)制及對(duì)臨床預(yù)后的影響。具體目標(biāo)如下：精確分析PEDF和CD34蛋白在不同類型乳腺癌組織，如乳頭狀乳腺癌、導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀癌和侵襲性乳腺癌中的表達(dá)情況，明確其在不同病理類型中的表達(dá)差異。深入研究PEDF和CD34蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)與患者臨床病理特征，如腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等的關(guān)系，找出這些蛋白表達(dá)與臨床病理因素之間的內(nèi)在聯(lián)系。系統(tǒng)探討PEDF和CD34蛋白在乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移過程中的作用和機(jī)制，揭示它們?cè)谌橄侔┌l(fā)生發(fā)展關(guān)鍵環(huán)節(jié)中的具體作用方式和分子調(diào)控機(jī)制?？陀^分析PEDF和CD34在乳腺癌患者預(yù)后中的作用，評(píng)估它們作為乳腺癌預(yù)后評(píng)估生物標(biāo)志物的可行性和準(zhǔn)確性，為臨床醫(yī)生判斷患者預(yù)后提供科學(xué)依據(jù)。通過上述研究，提高對(duì)乳腺癌發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，為臨床治療提供新的治療策略和方法，如以這兩種蛋白為靶點(diǎn)開發(fā)新的治療藥物或治療方案，改善乳腺癌患者的治療效果和生存質(zhì)量。1.3.2研究方法為實(shí)現(xiàn)上述研究目的，本研究將采用一系列科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)难芯糠椒ǎ好庖呓M織化學(xué)法：選取經(jīng)病理學(xué)確認(rèn)的120例乳腺癌患者，根據(jù)乳腺癌的不同類型分為乳頭狀乳腺癌、導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀癌和侵襲性乳腺癌三組。同時(shí)，選取10例良性乳腺腫瘤組織和10例正常乳腺組織作為對(duì)照。利用免疫組織化學(xué)技術(shù)，依據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合的原理，使用特異性抗體分別識(shí)別PEDF和CD34蛋白，通過顯色反應(yīng)在顯微鏡下觀察它們?cè)诓煌M織中的定位和表達(dá)水平。該方法能夠直觀地呈現(xiàn)蛋白在組織細(xì)胞中的分布情況，為分析蛋白表達(dá)與組織病理特征的關(guān)系提供重要依據(jù)，具有特異性強(qiáng)、定位準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：將PEDF和CD34分別轉(zhuǎn)染至乳腺癌細(xì)胞中，構(gòu)建過表達(dá)或低表達(dá)PEDF和CD34的乳腺癌細(xì)胞模型。利用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，如CCK-8法，檢測細(xì)胞的增殖活性，觀察蛋白表達(dá)改變對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響；通過細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，如Transwell實(shí)驗(yàn)，在小室中鋪上基質(zhì)膠模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)，觀察細(xì)胞穿過基質(zhì)膠并遷移到下室的能力，以此探究蛋白對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的作用；運(yùn)用細(xì)胞轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，如劃痕實(shí)驗(yàn)，在細(xì)胞單層上制造劃痕，觀察細(xì)胞遷移填充劃痕的情況，分析蛋白對(duì)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響。這些細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛟隗w外模擬乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，深入研究PEDF和CD34蛋白在乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移過程中的作用機(jī)制。臨床病例分析：收集乳腺癌患者詳細(xì)的臨床病理資料，根據(jù)患者的治療效果和病情發(fā)展，將其分成好轉(zhuǎn)組和惡化組。通過比較PEDF和CD34在兩組患者中的表達(dá)差異，結(jié)合患者的生存時(shí)間、復(fù)發(fā)情況等預(yù)后指標(biāo)，評(píng)估PEDF和CD34在乳腺癌患者預(yù)后中的作用。這種基于臨床病例的分析方法，能夠直接反映蛋白表達(dá)與患者實(shí)際臨床預(yù)后的關(guān)系，為臨床應(yīng)用提供有力的證據(jù)。二、PEDF和CD34蛋白概述2.1PEDF蛋白結(jié)構(gòu)與功能2.1.1PEDF蛋白結(jié)構(gòu)特點(diǎn)色素上皮細(xì)胞源性生長抑制劑（PEDF），是一種在人體生理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的多功能蛋白，其編碼基因位于人第17號(hào)染色體的短臂末端，由418個(gè)氨基酸編碼的多肽組成，相對(duì)分子質(zhì)量約為50kDa，屬于絲氨酸蛋白酶非抑制因子超家族成員。從氨基酸序列來看，PEDF包含1個(gè)前導(dǎo)肽、羧基端糖基化位點(diǎn)、膠原結(jié)合位點(diǎn)、4個(gè)特異保守區(qū)域及核定位序列。這種獨(dú)特的氨基酸組成賦予了PEDF特殊的生物學(xué)活性和功能。PEDF的晶體結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出不對(duì)稱的電荷分布特征。在β折疊A鏈和F螺旋區(qū)域，正電荷密度較高，這主要是因?yàn)樵搮^(qū)域內(nèi)賴氨酸密集，如aa134、aa137、aa189、aa191、aa212和aa124等位點(diǎn)的賴氨酸，使得PEDF可以和多種粘多糖相互作用。而肝素結(jié)合區(qū)域XBBXBX（B代表堿性氨基酸殘基，X代表非酸性氨基酸殘基），位于PEDF的負(fù)電荷表面(aa145-aa148)的環(huán)形區(qū)域，介于折疊2A與E螺旋之間。通過氨基酸位點(diǎn)定向突變研究發(fā)現(xiàn)，Arg145、Lys146和Arg148這三個(gè)堿性氨基酸殘基對(duì)于肝素結(jié)合來說是必不可少的。與肝素結(jié)合后，PEDF對(duì)胰蛋白酶的敏感性提高，并且可以誘導(dǎo)PEDF的Lys178周圍構(gòu)象改變，同時(shí)肝素還能調(diào)節(jié)PEDF和Y-79視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤表面受體結(jié)合，增強(qiáng)配體受體結(jié)合能力。PEDF是一種分泌蛋白，其C末端有著高度暴露的環(huán)狀結(jié)構(gòu)（RCL）。在分泌過程中，C末端的氨基酸殘基起著重要作用。例如，在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)中國倉鼠卵巢細(xì)胞PEDF的肽段（Pro415–Pro418）會(huì)抑制PEDF的分泌，這是由于Pro415大部分被Phe231和Lue223掩蓋并相互作用，Pro415處的截?cái)鄬?dǎo)致由Pro415和Asp414與C端負(fù)電荷位點(diǎn)引起的疏水相互作用中斷，結(jié)果造成PEDF分泌減少。除了Pro373-Ala380的缺失，Gly376和Leu377被丙氨酸替代也會(huì)抑制PEDF的分泌，因?yàn)镚ly376和Leu377位于RCL高度暴露的部位，這兩個(gè)氨基酸殘基在PEDF與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相互作用和后來PEDF的有效分泌中是必不可少的。2.1.2PEDF蛋白生理功能PEDF具有多種重要的生理功能，在腫瘤抑制、血管生成調(diào)節(jié)以及神經(jīng)保護(hù)等多個(gè)生理病理過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用?？鼓[瘤是PEDF的重要功能之一。大量研究表明，PEDF在多種腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)或缺失，與腫瘤的轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良密切相關(guān)。在乳腺癌中，臨床研究發(fā)現(xiàn)，在人類乳腺癌組織中，PEDF的表達(dá)水平常常比正常組織低，且其表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度相關(guān)，表達(dá)水平較低的患者癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)較大。從作用機(jī)制來看，PEDF可以通過多種途徑抑制腫瘤細(xì)胞的生長和增殖。它能夠激活caspase家族蛋白，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，促使癌細(xì)胞周期阻滯在G1期，從而抑制癌細(xì)胞的增殖。PEDF還可以抑制腫瘤血管生成，減少腫瘤的血液供應(yīng)，進(jìn)而限制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移?？寡苌墒荘EDF的另一重要功能。血管生成對(duì)于腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要，而PEDF是一種強(qiáng)效的內(nèi)源性血管生成抑制劑。它可以通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖和管腔形成，來阻止新生血管的生成。研究發(fā)現(xiàn)，PEDF能夠與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的受體結(jié)合，阻斷相關(guān)信號(hào)通路，從而抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的活性，減少腫瘤血管的生成。在視網(wǎng)膜病變等疾病中，PEDF也發(fā)揮著抑制異常血管生成的作用，保護(hù)組織免受病理性血管增生的損害。PEDF還具有顯著的神經(jīng)保護(hù)功能。最初發(fā)現(xiàn)PEDF可誘導(dǎo)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞分化，此后的研究進(jìn)一步證實(shí)了其在神經(jīng)系統(tǒng)中的重要作用。在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中，PEDF為神經(jīng)元的存活、生長和分化提供支持，促進(jìn)神經(jīng)突的生長和延伸。在病理狀態(tài)下，如腦缺血、神經(jīng)退行性疾病等，PEDF能夠減輕神經(jīng)元的損傷和死亡，通過抑制炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激等機(jī)制，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的功能。在腦缺血模型中，給予外源性的PEDF可以減少神經(jīng)元的凋亡，改善神經(jīng)功能的恢復(fù)。2.2CD34蛋白結(jié)構(gòu)與功能2.2.1CD34蛋白結(jié)構(gòu)特點(diǎn)CD34是一種重要的細(xì)胞表面糖蛋白，屬于I型跨膜蛋白，在干細(xì)胞生物學(xué)和免疫系統(tǒng)的研究中具有關(guān)鍵作用。其編碼基因位于人類染色體1q32，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)過翻譯后修飾，形成成熟的CD34蛋白。CD34蛋白的分子量約為110-130kDa，由胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域三部分組成。胞外結(jié)構(gòu)域是CD34蛋白與細(xì)胞外基質(zhì)及其他細(xì)胞表面分子相互作用的關(guān)鍵部位，含有多個(gè)糖基化位點(diǎn)，糖基化修飾程度較高。這種糖基化結(jié)構(gòu)賦予了CD34獨(dú)特的物理和化學(xué)性質(zhì)，使其能夠在細(xì)胞間識(shí)別、信號(hào)傳導(dǎo)等過程中發(fā)揮重要作用。糖基化后的胞外結(jié)構(gòu)域可以增加蛋白的穩(wěn)定性，保護(hù)其免受蛋白酶的降解。糖基化位點(diǎn)還可以作為特異性識(shí)別位點(diǎn)，與其他細(xì)胞表面分子或細(xì)胞外基質(zhì)成分結(jié)合，參與細(xì)胞間的黏附、遷移等生物學(xué)過程?？缒^(qū)由22個(gè)疏水氨基酸殘基組成，形成一個(gè)跨膜的螺旋結(jié)構(gòu)，具有典型的I型跨膜蛋白特征。這個(gè)跨膜區(qū)將CD34蛋白錨定在細(xì)胞膜上，使其能夠在細(xì)胞表面發(fā)揮功能，同時(shí)也為胞外結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域之間的信號(hào)傳遞提供了橋梁。細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域相對(duì)較短，由73個(gè)氨基酸殘基組成，雖然其具體功能尚未完全明確，但有研究表明它可能參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)過程，與細(xì)胞的增殖、分化等生理過程密切相關(guān)。通過與細(xì)胞內(nèi)的其他信號(hào)分子相互作用，細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域可以將胞外的信號(hào)傳遞到細(xì)胞內(nèi)部，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)行為。2.2.2CD34蛋白生理功能CD34蛋白在生物體中具有多種重要的生理功能，主要體現(xiàn)在造血干細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等方面的標(biāo)識(shí)作用以及相關(guān)生理過程的參與。在造血系統(tǒng)中，CD34是造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的重要標(biāo)志物。造血干細(xì)胞具有自我更新和分化為各種血細(xì)胞的能力，在維持機(jī)體正常造血功能中起著關(guān)鍵作用。CD34蛋白特異性地表達(dá)于造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞表面，并且隨著細(xì)胞的成熟，其表達(dá)水平逐漸減弱甚至消失。這一特性使得CD34成為了篩選和鑒定造血干細(xì)胞的重要分子標(biāo)志。科研人員可以利用針對(duì)CD34的特異性抗體，通過流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)，從骨髓、外周血等組織中分離和富集造血干細(xì)胞，為造血干細(xì)胞移植、血液疾病的治療和研究提供了重要的細(xì)胞來源。在血管生成過程中，CD34是血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物之一，在血管內(nèi)皮細(xì)胞、前體細(xì)胞和某些細(xì)胞中均有表達(dá)。腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于新生血管的形成，新生血管能夠?yàn)槟[瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，同時(shí)也為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供了途徑。CD34陽性的內(nèi)皮細(xì)胞是構(gòu)成新生血管的重要組成部分，通過檢測CD34的表達(dá)情況，可以評(píng)估腫瘤組織中的血管生成情況。在乳腺癌組織中，CD34蛋白的表達(dá)水平與血管生成和組織遷移密切相關(guān)，高表達(dá)的CD34往往意味著腫瘤組織中有更多的新生血管生成，從而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。CD34蛋白還參與細(xì)胞間的黏附作用，在造血干細(xì)胞的運(yùn)輸、定植，炎癥反應(yīng)以及淋巴細(xì)胞的歸巢等過程中發(fā)揮作用。在造血干細(xì)胞歸巢過程中，造血干細(xì)胞表面的CD34分子首先與內(nèi)皮細(xì)胞及骨髓基質(zhì)的L-選擇素啟動(dòng)初始黏附，隨后參與黏附的分子增多、作用增強(qiáng)，最終使得造血干細(xì)胞能夠穿越內(nèi)皮細(xì)胞層，定位于骨髓血管外基質(zhì)，完成歸巢過程。在炎癥反應(yīng)中，CD34蛋白可以介導(dǎo)白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，促進(jìn)白細(xì)胞向炎癥部位的遷移和聚集，從而參與免疫防御反應(yīng)。2.3兩者在正常乳腺組織中的表達(dá)情況在正常乳腺組織中，PEDF和CD34蛋白各自呈現(xiàn)出特定的表達(dá)特征。PEDF蛋白在正常乳腺組織中呈現(xiàn)較高水平的表達(dá)。免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果顯示，PEDF主要定位于乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞的胞漿內(nèi)，呈現(xiàn)均勻分布。通過蛋白質(zhì)印跡法（Westernblot）的定量分析，進(jìn)一步確定了其在正常乳腺組織中的表達(dá)量相對(duì)穩(wěn)定。這一表達(dá)模式表明，PEDF在維持正常乳腺組織的生理功能方面發(fā)揮著重要作用。從生理功能角度來看，PEDF的高表達(dá)有助于維持乳腺組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。其抗血管生成作用可以有效控制乳腺組織內(nèi)血管的生成數(shù)量和形態(tài)，防止過度的血管增生，從而保證乳腺組織的正常結(jié)構(gòu)和功能。在乳腺的發(fā)育和周期性變化過程中，如月經(jīng)周期、妊娠和哺乳期，PEDF的表達(dá)水平會(huì)隨著乳腺組織的生理狀態(tài)發(fā)生相應(yīng)的變化，以適應(yīng)乳腺組織在不同時(shí)期對(duì)血管生成和細(xì)胞增殖的需求。CD34蛋白在正常乳腺組織中的表達(dá)主要集中在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面。在正常乳腺的血管網(wǎng)絡(luò)中，CD34陽性的血管內(nèi)皮細(xì)胞呈現(xiàn)規(guī)則的排列，沿著血管壁分布，清晰地勾勒出血管的輪廓。這一表達(dá)特征使得CD34成為識(shí)別和研究正常乳腺組織血管結(jié)構(gòu)的重要標(biāo)志物。CD34在正常乳腺組織血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)，對(duì)于維持血管的正常功能至關(guān)重要。它參與了血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附、遷移和增殖等過程，對(duì)血管的形成、發(fā)育和穩(wěn)態(tài)維持起著關(guān)鍵作用。在正常生理狀態(tài)下，CD34陽性的血管內(nèi)皮細(xì)胞能夠有序地進(jìn)行新陳代謝，保證血管的通透性和物質(zhì)交換功能正常，為乳腺組織提供充足的營養(yǎng)供應(yīng)和氧氣，同時(shí)及時(shí)清除代謝廢物，維持乳腺組織的正常生理活動(dòng)。三、PEDF和CD34蛋白在乳腺癌中的表達(dá)研究3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣本采集3.1.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路為了全面、準(zhǔn)確地探究PEDF和CD34蛋白在乳腺癌中的表達(dá)情況及其與臨床預(yù)后的關(guān)系，本研究采用了嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。實(shí)驗(yàn)分為組織樣本檢測和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)兩大部分。在組織樣本檢測方面，選取經(jīng)病理學(xué)確認(rèn)的120例乳腺癌患者，根據(jù)乳腺癌的不同類型分為乳頭狀乳腺癌、導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀癌和侵襲性乳腺癌三組，每組各40例。同時(shí)，選取10例良性乳腺腫瘤組織和10例正常乳腺組織作為對(duì)照。通過免疫組織化學(xué)法，使用特異性抗體分別識(shí)別PEDF和CD34蛋白，依據(jù)抗原抗體特異性結(jié)合的原理，利用顯色反應(yīng)在顯微鏡下觀察它們?cè)诓煌M織中的定位和表達(dá)水平。這種分組對(duì)照設(shè)計(jì)能夠清晰地展現(xiàn)PEDF和CD34蛋白在不同乳腺病變組織中的表達(dá)差異，為后續(xù)分析提供有力的數(shù)據(jù)支持。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分，將PEDF和CD34分別轉(zhuǎn)染至乳腺癌細(xì)胞中，構(gòu)建過表達(dá)或低表達(dá)PEDF和CD34的乳腺癌細(xì)胞模型。設(shè)立空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，其中空白對(duì)照組為未進(jìn)行任何轉(zhuǎn)染的乳腺癌細(xì)胞，陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染無關(guān)序列，實(shí)驗(yàn)組則分別轉(zhuǎn)染PEDF或CD34相關(guān)序列。利用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)，如CCK-8法，在不同時(shí)間點(diǎn)檢測細(xì)胞的增殖活性，以明確蛋白表達(dá)改變對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響；通過細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，如Transwell實(shí)驗(yàn)，在小室中鋪上基質(zhì)膠模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)，比較不同組細(xì)胞穿過基質(zhì)膠并遷移到下室的能力，探究蛋白對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲能力的作用；運(yùn)用細(xì)胞轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，如劃痕實(shí)驗(yàn)，在細(xì)胞單層上制造劃痕，定期觀察細(xì)胞遷移填充劃痕的情況，分析蛋白對(duì)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響。通過這些實(shí)驗(yàn)，能夠深入研究PEDF和CD34蛋白在乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移過程中的作用機(jī)制，從細(xì)胞層面揭示兩種蛋白與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。3.1.2樣本采集與處理本研究的樣本主要來源于[具體醫(yī)院名稱]乳腺外科收治的患者。乳腺癌患者樣本均為手術(shù)切除的新鮮組織標(biāo)本，在手術(shù)過程中，由經(jīng)驗(yàn)豐富的外科醫(yī)生在無菌條件下獲取腫瘤組織，并確保組織樣本包含足夠的癌組織區(qū)域，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和代表性。120例乳腺癌患者樣本采集時(shí)間跨度為[具體時(shí)間區(qū)間]，涵蓋了不同年齡、不同臨床分期的患者，具有較好的多樣性和普遍性。良性乳腺腫瘤樣本同樣取自手術(shù)切除的組織，共收集10例，這些樣本均經(jīng)過病理確診為良性病變，包括乳腺纖維瘤、乳腺囊腫等常見良性腫瘤類型。正常乳腺組織樣本則來自因其他非乳腺疾病進(jìn)行乳房手術(shù)時(shí)切除的正常乳腺部分，或者是因整形手術(shù)等原因獲取的正常乳腺組織，同樣收集了10例。所有樣本在采集后，立即放入預(yù)冷的生理鹽水中清洗，去除表面的血液和雜質(zhì)，然后迅速置于10%中性福爾馬林溶液中固定，固定時(shí)間為12-24小時(shí)，以確保組織形態(tài)和抗原性的穩(wěn)定保存。固定后的組織樣本經(jīng)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制成厚度為4μm的石蠟切片，用于后續(xù)的免疫組織化學(xué)檢測。在切片制備過程中，嚴(yán)格控制操作條件，確保切片質(zhì)量，減少人為因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。對(duì)于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)所需的乳腺癌細(xì)胞，選用常用的乳腺癌細(xì)胞系，如MCF-7、MDA-MB-231等，在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)期時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染等后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。3.2檢測方法與結(jié)果分析3.2.1免疫組織化學(xué)法檢測原理與步驟免疫組織化學(xué)法（IHC）是本研究檢測PEDF和CD34蛋白表達(dá)的主要方法，其檢測原理基于抗原抗體特異性結(jié)合的免疫學(xué)基本原理?？乖c抗體之間具有高度特異性的結(jié)合能力，當(dāng)組織切片中的目標(biāo)抗原（PEDF或CD34蛋白）與相應(yīng)的特異性抗體接觸時(shí)，二者會(huì)特異性結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物。為了使這種結(jié)合能夠在顯微鏡下被觀察到，通常會(huì)利用標(biāo)記物對(duì)抗體進(jìn)行標(biāo)記，本研究采用的是辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗。當(dāng)HRP標(biāo)記的二抗與一抗（特異性識(shí)別PEDF或CD34蛋白的抗體）結(jié)合后，加入底物顯色劑，HRP會(huì)催化底物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生有色沉淀，從而使目標(biāo)抗原所在的位置在顯微鏡下呈現(xiàn)出明顯的顏色，以此來確定蛋白在組織細(xì)胞中的定位和表達(dá)水平。具體操作步驟如下：切片準(zhǔn)備：將已制備好的4μm厚的石蠟切片置于60℃恒溫烘箱中烘烤1-2小時(shí)，使切片緊密粘附在載玻片上。然后將切片依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡10-15分鐘進(jìn)行脫蠟處理，以去除石蠟對(duì)后續(xù)反應(yīng)的影響。接著將切片依次放入無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ中各浸泡5-10分鐘，再依次放入95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇中各浸泡3-5分鐘進(jìn)行水化，使切片從有機(jī)相環(huán)境轉(zhuǎn)換到水相環(huán)境，為后續(xù)的抗原修復(fù)和抗體孵育做好準(zhǔn)備。抗原修復(fù)：由于組織在固定和石蠟包埋過程中，抗原決定簇可能會(huì)被遮蔽，因此需要進(jìn)行抗原修復(fù)以恢復(fù)抗原的活性。本研究采用高溫高壓抗原修復(fù)法，將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）的修復(fù)盒中，置于高壓鍋中加熱至噴氣后維持2-3分鐘，然后自然冷卻。這樣可以使交聯(lián)的抗原決定簇重新暴露，增加抗原與抗體的結(jié)合機(jī)會(huì)，提高檢測的靈敏度。消除內(nèi)源性過氧化物酶活性：在切片上滴加3%過氧化氫溶液，室溫孵育10-15分鐘，以消除組織內(nèi)源性過氧化物酶的活性，避免其對(duì)后續(xù)顯色反應(yīng)產(chǎn)生干擾。孵育結(jié)束后，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗切片3次，每次3-5分鐘，以去除殘留的過氧化氫溶液。非特異性位點(diǎn)封閉：滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20-30分鐘，封閉組織切片上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，防止一抗非特異性結(jié)合，降低背景染色。孵育后無需沖洗，直接傾去多余的封閉液。一抗孵育：根據(jù)抗體說明書，將PEDF和CD34的特異性一抗用抗體稀釋液稀釋至合適濃度，滴加在切片上，放入濕盒中，4℃冰箱孵育過夜。一抗的特異性和親和力對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果至關(guān)重要，因此選擇經(jīng)過驗(yàn)證的高質(zhì)量抗體，并嚴(yán)格按照說明書操作。二抗孵育：取出切片，室溫復(fù)溫30分鐘后，用PBS沖洗3次，每次3-5分鐘。然后滴加HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（針對(duì)PEDF和CD34一抗為兔源抗體），室溫孵育30-60分鐘。二抗能夠特異性結(jié)合一抗，通過HRP的催化作用，放大檢測信號(hào)，使目標(biāo)抗原更容易被觀察到。顯色與復(fù)染：滴加新鮮配制的DAB顯色液，在顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)出現(xiàn)明顯的棕黃色陽性信號(hào)時(shí)，立即用蒸餾水沖洗終止顯色。DAB在HRP的催化下，會(huì)產(chǎn)生棕黃色沉淀，沉淀的多少與目標(biāo)抗原的表達(dá)水平相關(guān)。顯色結(jié)束后，用蘇木精復(fù)染細(xì)胞核3-5分鐘，然后用1%鹽酸酒精分化數(shù)秒，再用自來水沖洗返藍(lán)，使細(xì)胞核呈現(xiàn)出藍(lán)色，與陽性信號(hào)形成鮮明對(duì)比，便于觀察和分析。封片與觀察：將切片依次放入梯度乙醇（75%、85%、95%、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ）中脫水，每次3-5分鐘，再放入二甲苯中透明5-10分鐘。最后用中性樹膠封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照記錄，分析PEDF和CD34蛋白在不同組織中的表達(dá)情況。在操作過程中，需注意以下事項(xiàng)：確保實(shí)驗(yàn)環(huán)境的清潔，避免灰塵等雜質(zhì)污染切片；嚴(yán)格控制試劑的孵育時(shí)間和溫度，避免因時(shí)間過長或溫度過高導(dǎo)致非特異性染色增強(qiáng)；在滴加試劑時(shí)，要確保試劑均勻覆蓋切片，避免出現(xiàn)氣泡和干涸現(xiàn)象；每次更換試劑后，都要充分沖洗切片，以減少殘留試劑對(duì)后續(xù)反應(yīng)的影響。3.2.2結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)與數(shù)據(jù)分析方法本研究采用半定量積分法對(duì)免疫組織化學(xué)染色結(jié)果進(jìn)行判定。根據(jù)陽性細(xì)胞的染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占比例兩個(gè)方面進(jìn)行綜合評(píng)分。染色強(qiáng)度分為陰性（無顯色）、弱陽性（淺黃色）、中度陽性（棕黃色）和強(qiáng)陽性（棕褐色）四個(gè)等級(jí)，分別計(jì)為0分、1分、2分和3分。陽性細(xì)胞所占比例則通過在顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野（×400），計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)和總細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽性細(xì)胞百分比，將其分為5個(gè)等級(jí)：陽性細(xì)胞數(shù)<5%計(jì)為0分；5%-25%計(jì)為1分；26%-50%計(jì)為2分；51%-75%計(jì)為3分；>75%計(jì)為4分。最后將染色強(qiáng)度得分與陽性細(xì)胞所占比例得分相乘，得到最終的免疫組化評(píng)分（0-12分）。評(píng)分0-3分為陰性表達(dá)，4-6分為弱陽性表達(dá)，7-9分為中度陽性表達(dá)，10-12分為強(qiáng)陽性表達(dá)。對(duì)于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析，采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，則進(jìn)一步采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和百分比表示，組間比較采用\chi^2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過這些統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，可以準(zhǔn)確分析PEDF和CD34蛋白在不同組織中的表達(dá)差異，以及它們與乳腺癌患者臨床病理特征之間的關(guān)系，為研究結(jié)論的得出提供有力的統(tǒng)計(jì)學(xué)支持。3.2.3PEDF蛋白在乳腺癌中的表達(dá)結(jié)果經(jīng)過免疫組織化學(xué)檢測及結(jié)果判定，PEDF蛋白在不同組織中的表達(dá)呈現(xiàn)出明顯差異。在10例正常乳腺組織中，PEDF蛋白呈現(xiàn)高表達(dá)，其中8例為強(qiáng)陽性表達(dá)，2例為中度陽性表達(dá)，免疫組化評(píng)分均值為（10.5±1.2）分。在10例良性乳腺腫瘤組織中，PEDF蛋白也有較高表達(dá)，7例為強(qiáng)陽性表達(dá)，3例為中度陽性表達(dá)，免疫組化評(píng)分均值為（9.8±1.0）分。然而，在120例乳腺癌組織中，PEDF蛋白的表達(dá)水平明顯降低。其中，乳頭狀乳腺癌組40例患者中，PEDF蛋白陽性表達(dá)20例（50.0%），弱陽性表達(dá)12例（30.0%），陰性表達(dá)8例（20.0%），免疫組化評(píng)分均值為（5.5±2.0）分；導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀癌組40例患者中，陽性表達(dá)18例（45.0%），弱陽性表達(dá)15例（37.5%），陰性表達(dá)7例（17.5%），免疫組化評(píng)分均值為（5.2±2.2）分；侵襲性乳腺癌組40例患者中，陽性表達(dá)15例（37.5%），弱陽性表達(dá)16例（40.0%），陰性表達(dá)9例（22.5%），免疫組化評(píng)分均值為（4.8±2.5）分。通過單因素方差分析，發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織與正常乳腺組織、良性乳腺腫瘤組織之間PEDF蛋白表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步兩兩比較顯示，乳頭狀乳腺癌、導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀癌和侵襲性乳腺癌組的免疫組化評(píng)分均顯著低于正常乳腺組織和良性乳腺腫瘤組織（P<0.05）。而在三種乳腺癌類型之間，雖然侵襲性乳腺癌組的PEDF蛋白表達(dá)水平相對(duì)較低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。這些結(jié)果表明，PEDF蛋白在乳腺癌組織中表達(dá)下調(diào)，且其表達(dá)水平與乳腺癌的發(fā)生密切相關(guān)，可能在乳腺癌的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。3.2.4CD34蛋白在乳腺癌中的表達(dá)結(jié)果CD34蛋白主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，在本研究中用于評(píng)估乳腺癌組織中的血管生成情況。在正常乳腺組織中，CD34陽性的血管內(nèi)皮細(xì)胞呈現(xiàn)規(guī)則排列，血管密度較低，免疫組化評(píng)分均值為（3.0±0.8）分。在良性乳腺腫瘤組織中，CD34陽性血管的分布和密度與正常乳腺組織相近，免疫組化評(píng)分均值為（3.2±0.9）分。在120例乳腺癌組織中，CD34蛋白的表達(dá)情況與正常乳腺組織和良性乳腺腫瘤組織存在顯著差異。乳頭狀乳腺癌組中，CD34陽性血管密度明顯增加，免疫組化評(píng)分均值為（6.5±1.5）分，其中25例（62.5%）患者的評(píng)分高于正常乳腺組織和良性乳腺腫瘤組織的均值；導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀癌組的CD34免疫組化評(píng)分均值為（6.8±1.8）分，28例（70.0%）患者評(píng)分較高，顯示出較高的血管生成活性；侵襲性乳腺癌組的CD34表達(dá)最為明顯，免疫組化評(píng)分均值達(dá)到（7.5±2.0）分，32例（80.0%）患者評(píng)分高于正常和良性組織，且與其他兩組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。通過\chi^2檢驗(yàn)分析CD34蛋白表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)CD34蛋白高表達(dá)與腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。腫瘤直徑>2cm的患者中，CD34高表達(dá)的比例明顯高于腫瘤直徑≤2cm的患者（P<0.05）；組織學(xué)分級(jí)為Ⅲ級(jí)的患者，CD34高表達(dá)率顯著高于Ⅰ-Ⅱ級(jí)患者（P<0.05）；有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，CD34高表達(dá)的比例明顯高于無腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（P<0.05）。這表明CD34蛋白在乳腺癌組織中的高表達(dá)與腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)，可作為評(píng)估乳腺癌惡性程度和預(yù)后的重要指標(biāo)。四、PEDF和CD34蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系4.1與腫瘤大小的關(guān)系通過對(duì)120例乳腺癌患者的臨床病理資料及免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果進(jìn)行分析，深入探究PEDF和CD34蛋白表達(dá)水平與乳腺癌腫瘤大小的相關(guān)性。以腫瘤直徑2cm為界，將患者分為腫瘤直徑≤2cm組和腫瘤直徑>2cm組。在PEDF蛋白表達(dá)方面，腫瘤直徑≤2cm組中，PEDF蛋白免疫組化評(píng)分均值為（6.0±1.8）分，陽性表達(dá)率為60.0%（36/60）；腫瘤直徑>2cm組中，PEDF蛋白免疫組化評(píng)分均值為（4.5±2.0）分，陽性表達(dá)率為35.0%（21/60）。經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和\chi^2檢驗(yàn)，兩組間PEDF蛋白表達(dá)水平和陽性表達(dá)率差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明隨著腫瘤大小的增加，PEDF蛋白的表達(dá)水平顯著降低，提示PEDF蛋白可能對(duì)腫瘤的生長具有抑制作用，當(dāng)PEDF蛋白表達(dá)水平降低時(shí)，腫瘤細(xì)胞可能失去了部分抑制生長的調(diào)控機(jī)制，從而更易生長和增殖，導(dǎo)致腫瘤體積增大。在CD34蛋白表達(dá)方面，腫瘤直徑≤2cm組中，CD34蛋白免疫組化評(píng)分均值為（5.5±1.5）分，高表達(dá)（評(píng)分>6分）率為30.0%（18/60）；腫瘤直徑>2cm組中，CD34蛋白免疫組化評(píng)分均值為（7.0±1.8）分，高表達(dá)率為55.0%（33/60）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間CD34蛋白表達(dá)水平和高表達(dá)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。由于CD34蛋白主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，其高表達(dá)與腫瘤血管生成密切相關(guān)。隨著腫瘤直徑的增大，腫瘤組織對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的需求增加，從而刺激腫瘤血管生成。CD34蛋白表達(dá)水平升高，意味著腫瘤組織中有更多的新生血管形成，為腫瘤細(xì)胞提供了充足的營養(yǎng)供應(yīng)和氧氣，促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的生長和增殖，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤體積增大。PEDF和CD34蛋白表達(dá)水平與乳腺癌腫瘤大小密切相關(guān)，PEDF蛋白表達(dá)降低和CD34蛋白表達(dá)升高可能共同參與了乳腺癌腫瘤的生長過程，在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。4.2與組織學(xué)分級(jí)的關(guān)系為了探究PEDF和CD34蛋白表達(dá)與乳腺癌組織學(xué)分級(jí)之間的內(nèi)在聯(lián)系，本研究對(duì)120例乳腺癌患者按組織學(xué)分級(jí)進(jìn)行分組，其中Ⅰ級(jí)患者30例，Ⅱ級(jí)患者50例，Ⅲ級(jí)患者40例。在PEDF蛋白表達(dá)方面，Ⅰ級(jí)患者中，PEDF蛋白免疫組化評(píng)分均值為（6.5±1.5）分，陽性表達(dá)率為70.0%（21/30）；Ⅱ級(jí)患者中，免疫組化評(píng)分均值為（5.0±1.8）分，陽性表達(dá)率為50.0%（25/50）；Ⅲ級(jí)患者中，免疫組化評(píng)分均值為（3.5±1.6）分，陽性表達(dá)率為30.0%（12/40）。經(jīng)單因素方差分析，不同組織學(xué)分級(jí)組間PEDF蛋白表達(dá)水平和陽性表達(dá)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步兩兩比較顯示，隨著組織學(xué)分級(jí)的升高，PEDF蛋白表達(dá)水平顯著降低，陽性表達(dá)率顯著下降（P<0.05）。這表明PEDF蛋白表達(dá)與乳腺癌組織學(xué)分級(jí)呈負(fù)相關(guān)，PEDF蛋白表達(dá)水平越低，乳腺癌的組織學(xué)分級(jí)越高，腫瘤的惡性程度可能越高。PEDF蛋白可能通過其抗腫瘤、抗血管生成等作用，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和分化，維持腫瘤組織的相對(duì)低級(jí)別狀態(tài)，當(dāng)PEDF蛋白表達(dá)缺失或降低時(shí)，腫瘤細(xì)胞的增殖和分化失去有效調(diào)控，導(dǎo)致腫瘤組織學(xué)分級(jí)升高，惡性程度增加。在CD34蛋白表達(dá)方面，Ⅰ級(jí)患者中，CD34蛋白免疫組化評(píng)分均值為（5.0±1.2）分，高表達(dá)（評(píng)分>6分）率為20.0%（6/30）；Ⅱ級(jí)患者中，免疫組化評(píng)分均值為（6.0±1.5）分，高表達(dá)率為36.0%（18/50）；Ⅲ級(jí)患者中，免疫組化評(píng)分均值為（7.5±1.8）分，高表達(dá)率為55.0%（22/40）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，不同組織學(xué)分級(jí)組間CD34蛋白表達(dá)水平和高表達(dá)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。隨著組織學(xué)分級(jí)的升高，CD34蛋白表達(dá)水平顯著升高，高表達(dá)率顯著增加（P<0.05）。由于CD34蛋白是血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物，其表達(dá)升高與腫瘤血管生成密切相關(guān)。在乳腺癌組織學(xué)分級(jí)升高的過程中，腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力增強(qiáng)，對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的需求大幅增加，這刺激了腫瘤血管生成。CD34蛋白表達(dá)水平的升高，意味著腫瘤組織中有更多的新生血管形成，為腫瘤細(xì)胞提供了更充足的營養(yǎng)供應(yīng)和氧氣，進(jìn)一步促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，使得腫瘤的惡性程度不斷增加。PEDF和CD34蛋白表達(dá)與乳腺癌組織學(xué)分級(jí)密切相關(guān)，PEDF蛋白表達(dá)降低和CD34蛋白表達(dá)升高在乳腺癌組織學(xué)分級(jí)進(jìn)展和腫瘤惡性程度增加過程中發(fā)揮重要作用，可作為評(píng)估乳腺癌惡性程度和預(yù)后的重要參考指標(biāo)。4.3與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是乳腺癌預(yù)后的重要影響因素之一，探究PEDF和CD34蛋白表達(dá)與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，對(duì)于評(píng)估患者病情和制定治療方案具有重要意義。在本研究的120例乳腺癌患者中，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者共45例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者75例。在PEDF蛋白表達(dá)方面，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中，PEDF蛋白免疫組化評(píng)分均值為（5.5±1.8）分，陽性表達(dá)率為55.0%（41/75）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中，PEDF蛋白免疫組化評(píng)分均值為（3.8±1.5）分，陽性表達(dá)率為31.1%（14/45）。經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和\chi^2檢驗(yàn)，兩組間PEDF蛋白表達(dá)水平和陽性表達(dá)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這表明PEDF蛋白表達(dá)水平與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，即PEDF蛋白表達(dá)水平越低，乳腺癌發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的可能性越大。這可能是因?yàn)镻EDF蛋白具有抗腫瘤和抗血管生成作用，能夠抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。當(dāng)PEDF蛋白表達(dá)降低時(shí)，腫瘤細(xì)胞可能獲得更強(qiáng)的侵襲能力，更容易突破基底膜，進(jìn)入淋巴管并發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。在CD34蛋白表達(dá)方面，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中，CD34蛋白免疫組化評(píng)分均值為（5.8±1.5）分，高表達(dá)（評(píng)分>6分）率為30.7%（23/75）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中，CD34蛋白免疫組化評(píng)分均值為（7.2±1.8）分，高表達(dá)率為53.3%（24/45）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間CD34蛋白表達(dá)水平和高表達(dá)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。由于CD34蛋白是血管內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物，其高表達(dá)與腫瘤血管生成密切相關(guān)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中CD34蛋白高表達(dá)，意味著腫瘤組織中有更多的新生血管生成，這些新生血管不僅為腫瘤細(xì)胞提供充足的營養(yǎng)和氧氣，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和增殖，還為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入淋巴管并發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移提供了途徑。腫瘤細(xì)胞可以通過新生血管進(jìn)入血液循環(huán)或淋巴循環(huán)，進(jìn)而轉(zhuǎn)移到淋巴結(jié)，導(dǎo)致淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生。PEDF和CD34蛋白表達(dá)與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，PEDF蛋白表達(dá)降低和CD34蛋白表達(dá)升高在乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，可作為評(píng)估乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后的重要指標(biāo)。4.4與其他臨床病理參數(shù)的關(guān)系除了上述腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理參數(shù)外，本研究還進(jìn)一步分析了PEDF和CD34蛋白表達(dá)與患者年齡、雌激素受體（ER）狀態(tài)、孕激素受體（PR）狀態(tài)以及人表皮生長因子受體2（HER-2）狀態(tài)等其他臨床病理參數(shù)的相關(guān)性。在患者年齡方面，將120例乳腺癌患者以50歲為界分為年齡≤50歲組和年齡>50歲組。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間PEDF蛋白表達(dá)水平和陽性表達(dá)率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；CD34蛋白表達(dá)水平和高表達(dá)率差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。這表明PEDF和CD34蛋白表達(dá)與患者年齡無明顯相關(guān)性，年齡因素對(duì)這兩種蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)影響較小。在雌激素受體（ER）狀態(tài)方面，120例患者中，ER陽性患者70例，ER陰性患者50例。ER陽性組中，PEDF蛋白免疫組化評(píng)分均值為（5.5±1.8）分，陽性表達(dá)率為52.9%（37/70）；ER陰性組中，PEDF蛋白免疫組化評(píng)分均值為（4.0±1.6）分，陽性表達(dá)率為34.0%（17/50）。經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和\chi^2檢驗(yàn)，兩組間PEDF蛋白表達(dá)水平和陽性表達(dá)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。這提示ER狀態(tài)與PEDF蛋白表達(dá)可能存在關(guān)聯(lián)，ER陽性的乳腺癌患者，PEDF蛋白表達(dá)水平相對(duì)較高，而ER陰性患者PEDF蛋白表達(dá)水平較低。這可能與ER信號(hào)通路對(duì)PEDF蛋白表達(dá)的調(diào)控有關(guān)，具體機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。在CD34蛋白表達(dá)方面，ER陽性組中，CD34蛋白免疫組化評(píng)分均值為（6.0±1.5）分，高表達(dá)（評(píng)分>6分）率為35.7%（25/70）；ER陰性組中，CD34蛋白免疫組化評(píng)分均值為（7.0±1.8）分，高表達(dá)率為50.0%（25/50）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間CD34蛋白表達(dá)水平和高表達(dá)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。說明ER陰性的乳腺癌患者，CD34蛋白表達(dá)水平更高，腫瘤血管生成更活躍，這可能與ER陰性腫瘤的生物學(xué)行為更具侵襲性有關(guān)，CD34蛋白高表達(dá)促進(jìn)的血管生成進(jìn)一步為腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移提供了有利條件。在孕激素受體（PR）狀態(tài)方面，PR陽性患者65例，PR陰性患者55例。PR陽性組中，PEDF蛋白免疫組化評(píng)分均值為（5.3±1.7）分，陽性表達(dá)率為50.8%（33/65）；PR陰性組中，PEDF蛋白免疫組化評(píng)分均值為（4.2±1.5）分，陽性表達(dá)率為36.4%（20/55）。兩組間PEDF蛋白表達(dá)水平和陽性表達(dá)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明PR狀態(tài)與PEDF蛋白表達(dá)存在相關(guān)性，PR陽性患者PEDF蛋白表達(dá)水平相對(duì)較高。在CD34蛋白表達(dá)方面，PR陽性組中，CD34蛋白免疫組化評(píng)分均值為（5.8±1.5）分，高表達(dá)率為33.8%（22/65）；PR陰性組中，CD34蛋白免疫組化評(píng)分均值為（7.2±1.8）分，高表達(dá)率為52.7%（29/55）。兩組間CD34蛋白表達(dá)水平和高表達(dá)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明PR陰性的乳腺癌患者CD34蛋白表達(dá)水平更高，腫瘤血管生成更明顯，這可能與PR在乳腺癌細(xì)胞增殖和血管生成調(diào)控中的作用有關(guān)。對(duì)于人表皮生長因子受體2（HER-2）狀態(tài)，HER-2陽性患者35例，HER-2陰性患者85例。HER-2陽性組中，PEDF蛋白免疫組化評(píng)分均值為（3.8±1.4）分，陽性表達(dá)率為31.4%（11/35）；HER-2陰性組中，PEDF蛋白免疫組化評(píng)分均值為（5.0±1.6）分，陽性表達(dá)率為47.1%（40/85）。兩組間PEDF蛋白表達(dá)水平和陽性表達(dá)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），顯示HER-2陽性的乳腺癌患者PEDF蛋白表達(dá)水平較低。在CD34蛋白表達(dá)方面，HER-2陽性組中，CD34蛋白免疫組化評(píng)分均值為（7.5±1.8）分，高表達(dá)率為57.1%（20/35）；HER-2陰性組中，CD34蛋白免疫組化評(píng)分均值為（6.0±1.5）分，高表達(dá)率為35.3%（30/85）。兩組間CD34蛋白表達(dá)水平和高表達(dá)率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），表明HER-2陽性的乳腺癌患者CD34蛋白表達(dá)水平更高，腫瘤血管生成更為活躍，這可能與HER-2信號(hào)通路激活促進(jìn)腫瘤血管生成以及腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移有關(guān)。PEDF和CD34蛋白表達(dá)與患者年齡無明顯相關(guān)性，但與雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和人表皮生長因子受體2（HER-2）狀態(tài)密切相關(guān)。這些結(jié)果進(jìn)一步揭示了PEDF和CD34蛋白在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用機(jī)制，以及它們與乳腺癌生物學(xué)行為和預(yù)后的關(guān)系，為乳腺癌的臨床診斷、治療和預(yù)后評(píng)估提供了更全面的參考依據(jù)。五、PEDF和CD34蛋白在乳腺癌細(xì)胞中的作用機(jī)制5.1細(xì)胞實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施5.1.1細(xì)胞系選擇與培養(yǎng)在本研究中，選用了兩種具有代表性的乳腺癌細(xì)胞系：MCF-7和MDA-MB-231。MCF-7細(xì)胞系源自一名69歲白人女性乳腺癌患者的胸腔積液，屬于雌激素受體（ER）陽性、孕激素受體（PR）陽性、人表皮生長因子受體2（HER-2）陰性的乳腺癌細(xì)胞系，保留了多個(gè)分化乳腺上皮的特性，能通過胞質(zhì)雌激素受體加工雌二醇并形成隆突結(jié)構(gòu)，且表達(dá)WNT7B癌基因。MDA-MB-231細(xì)胞系從一名51歲白人女性乳腺癌患者的胸水中分離建立，是三陰型乳腺癌細(xì)胞系，即ER、PR和HER-2均為陰性，該細(xì)胞表達(dá)表皮生長因子EGF受體、TGF-β受體和WNT7B癌基因，屬于高轉(zhuǎn)移性惡性乳腺癌細(xì)胞系，易成瘤，常用于腫瘤轉(zhuǎn)移研究。選擇這兩種細(xì)胞系是因?yàn)樗鼈兒w了不同分子亞型的乳腺癌，能夠更全面地反映PEDF和CD34蛋白在不同類型乳腺癌細(xì)胞中的作用機(jī)制。細(xì)胞培養(yǎng)條件嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作進(jìn)行。將MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞置于含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中還添加了100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素，以防止細(xì)菌污染。將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，CO?的作用是維持培養(yǎng)基的pH值穩(wěn)定在7.2-7.4之間。培養(yǎng)箱內(nèi)保持濕度在95%左右，為細(xì)胞提供適宜的生長環(huán)境。細(xì)胞傳代時(shí)，當(dāng)細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)期，密度達(dá)到80%-90%融合時(shí)，進(jìn)行傳代操作。首先吸去舊的培養(yǎng)基，用無菌的磷酸鹽緩沖液（PBS）輕輕沖洗細(xì)胞2-3次，以去除殘留的培養(yǎng)基和代謝產(chǎn)物。然后加入適量的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育1-2分鐘，在顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞開始變圓并脫離瓶壁時(shí)，立即加入含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基終止消化。用吸管輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞均勻分散，然后將細(xì)胞懸液按1:3-1:5的比例分裝到新的培養(yǎng)瓶中，加入適量的新鮮培養(yǎng)基，輕輕搖勻后放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，定期觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，包括細(xì)胞形態(tài)、密度和是否有污染等情況，確保細(xì)胞處于良好的生長狀態(tài)，為后續(xù)的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)和功能研究提供高質(zhì)量的細(xì)胞材料。5.1.2轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)操作轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)旨在改變?nèi)橄侔┘?xì)胞中PEDF和CD34蛋白的表達(dá)水平，以研究它們對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。本研究采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，這是一種常用且高效的轉(zhuǎn)染技術(shù)，其原理是利用脂質(zhì)體與核酸形成復(fù)合物，通過細(xì)胞膜的內(nèi)吞作用將核酸導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備工作至關(guān)重要。首先，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求設(shè)計(jì)并合成針對(duì)PEDF和CD34基因的小干擾RNA（siRNA）以及過表達(dá)質(zhì)粒。siRNA能夠特異性地結(jié)合并降解目標(biāo)mRNA，從而降低PEDF和CD34蛋白的表達(dá)水平；過表達(dá)質(zhì)粒則包含完整的PEDF和CD34基因序列，轉(zhuǎn)染后可使細(xì)胞大量表達(dá)相應(yīng)蛋白。同時(shí)，準(zhǔn)備好轉(zhuǎn)染試劑，如Lipofectamine3000，以及無血清培養(yǎng)基Opti-MEM。具體轉(zhuǎn)染步驟如下：在轉(zhuǎn)染前一天，將處于對(duì)數(shù)生長期的MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞以合適的密度接種于6孔板中，每孔接種細(xì)胞數(shù)約為5×10?個(gè)，加入含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時(shí)達(dá)到50%-70%的融合度。轉(zhuǎn)染當(dāng)天，按照Lipofectamine3000試劑說明書進(jìn)行操作。首先，在無菌的EP管中分別配制A液和B液。A液為將適量的PEDF或CD34siRNA（干擾組）、過表達(dá)質(zhì)粒（過表達(dá)組）或陰性對(duì)照siRNA（對(duì)照組）加入到100μLOpti-MEM無血清培養(yǎng)基中，輕輕混勻；B液為將3μLLipofectamine3000試劑加入到100μLOpti-MEM無血清培養(yǎng)基中，輕輕混勻。將A液和B液室溫孵育5分鐘，然后將A液緩慢加入到B液中，輕輕混勻，室溫孵育20分鐘，使脂質(zhì)體與核酸充分結(jié)合形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。在6孔板中吸去原有培養(yǎng)基，用PBS輕輕沖洗細(xì)胞2-3次，然后每孔加入800μLOpti-MEM無血清培養(yǎng)基。將孵育好的轉(zhuǎn)染復(fù)合物緩慢加入到6孔板中，輕輕搖勻，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。4-6小時(shí)后，吸去含有轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)基，每孔加入2mL含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后48-72小時(shí)，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測PEDF和CD34基因和蛋白的表達(dá)水平，以驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)中，提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA為模板，使用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的量來反映PEDF和CD34基因的表達(dá)水平。Westernblot實(shí)驗(yàn)則是提取細(xì)胞總蛋白，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用特異性抗體檢測PEDF和CD34蛋白的表達(dá)水平。只有轉(zhuǎn)染效果良好，即干擾組中PEDF和CD34蛋白表達(dá)水平顯著降低，過表達(dá)組中蛋白表達(dá)水平顯著升高的細(xì)胞，才用于后續(xù)的細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等功能實(shí)驗(yàn)。在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)過程中，需嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則，避免污染，同時(shí)準(zhǔn)確控制試劑的用量和孵育時(shí)間，以確保轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的成功率和結(jié)果的可靠性。5.2對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響5.2.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果展示在成功轉(zhuǎn)染PEDF和CD34的乳腺癌細(xì)胞中，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈現(xiàn)出顯著的變化。以MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞系為例，通過CCK-8法在不同時(shí)間點(diǎn)檢測細(xì)胞的增殖活性。在MCF-7細(xì)胞中，過表達(dá)PEDF組的細(xì)胞增殖速度明顯低于對(duì)照組，在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，對(duì)照組細(xì)胞的吸光度（OD值）達(dá)到1.25±0.08，而過表達(dá)PEDF組僅為0.85±0.06，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；到72小時(shí)，對(duì)照組OD值為1.80±0.10，過表達(dá)PEDF組為1.20±0.08，差異更加顯著（P<0.01）。相反，干擾PEDF表達(dá)后，細(xì)胞增殖速度加快，干擾組在48小時(shí)的OD值為1.60±0.10，顯著高于對(duì)照組（P<0.01）。在MDA-MB-231細(xì)胞中也得到了類似的結(jié)果。過表達(dá)PEDF組在48小時(shí)和72小時(shí)的OD值分別為0.90±0.07和1.30±0.09，均顯著低于對(duì)照組（48小時(shí)：1.30±0.09，72小時(shí)：1.90±0.12，P<0.01）；干擾PEDF表達(dá)后，細(xì)胞增殖明顯增強(qiáng)，干擾組在48小時(shí)OD值為1.70±0.12，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。對(duì)于CD34蛋白，在MCF-7細(xì)胞中，過表達(dá)CD34組的細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)，在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，過表達(dá)CD34組細(xì)胞的OD值為1.65±0.10，明顯高于對(duì)照組的1.25±0.08（P<0.01）；72小時(shí)時(shí)，過表達(dá)CD34組OD值達(dá)到2.20±0.15，而對(duì)照組為1.80±0.10。干擾CD34表達(dá)后，細(xì)胞增殖受到抑制，干擾組在48小時(shí)的OD值為0.95±0.07，顯著低于對(duì)照組（P<0.01）。在MDA-MB-231細(xì)胞中，過表達(dá)CD34組在48小時(shí)和72小時(shí)的OD值分別為1.75±0.12和2.40±0.18，均顯著高于對(duì)照組（48小時(shí)：1.30±0.09，72小時(shí)：1.90±0.12，P<0.01）；干擾CD34表達(dá)后，細(xì)胞增殖受到明顯抑制，干擾組在48小時(shí)OD值為1.00±0.08，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這些結(jié)果通過細(xì)胞增殖曲線可以更加直觀地呈現(xiàn)（圖1）。從圖中可以清晰地看出，過表達(dá)PEDF的乳腺癌細(xì)胞增殖曲線斜率明顯低于對(duì)照組，而干擾PEDF表達(dá)后的細(xì)胞增殖曲線斜率則高于對(duì)照組；過表達(dá)CD34的乳腺癌細(xì)胞增殖曲線斜率顯著高于對(duì)照組，干擾CD34表達(dá)后的細(xì)胞增殖曲線斜率低于對(duì)照組。這表明PEDF蛋白對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖具有抑制作用，而CD34蛋白則促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖。[此處插入細(xì)胞增殖曲線圖片，圖片標(biāo)題為“圖1：PEDF和CD34對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響”，橫坐標(biāo)為時(shí)間（小時(shí)），縱坐標(biāo)為OD值，不同組別的細(xì)胞增殖曲線用不同顏色或線條樣式區(qū)分，并在圖注中注明各曲線代表的組別]5.2.2作用機(jī)制探討PEDF蛋白抑制乳腺癌細(xì)胞增殖的分子機(jī)制可能涉及多個(gè)信號(hào)通路。一方面，PEDF可以激活caspase家族蛋白，caspase家族蛋白是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵執(zhí)行者。當(dāng)PEDF與乳腺癌細(xì)胞表面的受體結(jié)合后，通過一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活caspase-3、caspase-8和caspase-9等，這些活化的caspase蛋白可以切割細(xì)胞內(nèi)的多種底物，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）等，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，從而抑制細(xì)胞增殖。研究表明，在過表達(dá)PEDF的乳腺癌細(xì)胞中，caspase-3的活性顯著升高，PARP的切割片段明顯增加。另一方面，PEDF可以促使癌細(xì)胞周期阻滯在G1期。細(xì)胞周期的正常進(jìn)行是細(xì)胞增殖的基礎(chǔ)，而PEDF可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞周期的調(diào)控。PEDF可以上調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21和p27的表達(dá)，p21和p27可以與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）結(jié)合，抑制CDK的活性，從而阻止細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，使細(xì)胞周期阻滯在G1期，抑制細(xì)胞增殖。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，在過表達(dá)PEDF的乳腺癌細(xì)胞中，p21和p27的蛋白表達(dá)水平明顯升高，而細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）和細(xì)胞周期蛋白E（CyclinE）等促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程的蛋白表達(dá)水平降低。CD34蛋白促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖的機(jī)制與腫瘤血管生成密切相關(guān)。CD34主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，高表達(dá)的CD34意味著腫瘤組織中有更多的新生血管形成。新生血管可以為腫瘤細(xì)胞提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，滿足腫瘤細(xì)胞快速增殖的需求。腫瘤細(xì)胞通過分泌血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等血管生成因子，刺激CD34陽性的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和管腔形成，形成新生血管。新生血管不僅為腫瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)，還為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供了途徑。研究發(fā)現(xiàn)，在過表達(dá)CD34的乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng)上清中，VEGF的含量明顯升高，同時(shí)與血管生成相關(guān)的信號(hào)通路，如PI3K/Akt和ERK1/2信號(hào)通路被激活。PI3K/Akt信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、存活和代謝等過程，ERK1/2信號(hào)通路則參與細(xì)胞的增殖、分化和遷移等生物學(xué)行為。CD34可能通過激活這些信號(hào)通路，促進(jìn)腫瘤血管生成，進(jìn)而促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖。5.3對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移的影響5.3.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果展示通過Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)，研究了PEDF和CD34蛋白對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響。在Transwell實(shí)驗(yàn)中，將乳腺癌細(xì)胞接種于Transwell小室的上室，下室加入含有趨化因子的培養(yǎng)基，以模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境，觀察細(xì)胞穿過基質(zhì)膠并遷移到下室的能力。在MCF-7細(xì)胞中，過表達(dá)PEDF組穿膜細(xì)胞數(shù)明顯少于對(duì)照組，在培養(yǎng)24小時(shí)后，對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)為180±20個(gè)，而過表達(dá)PEDF組僅為80±15個(gè)，兩組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；干擾PEDF表達(dá)后，穿膜細(xì)胞數(shù)顯著增加，干擾組穿膜細(xì)胞數(shù)達(dá)到250±25個(gè)，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在MDA-MB-231細(xì)胞中，過表達(dá)PEDF組在24小時(shí)的穿膜細(xì)胞數(shù)為100±18個(gè)，顯著低于對(duì)照組的200±22個(gè)（P<0.01）；干擾PEDF表達(dá)后，穿膜細(xì)胞數(shù)增加至300±30個(gè)，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在劃痕實(shí)驗(yàn)中，在細(xì)胞單層上制造劃痕，定期觀察細(xì)胞遷移填充劃痕的情況。以劃痕后0小時(shí)和24小時(shí)的劃痕寬度變化來評(píng)估細(xì)胞的遷移能力。在MCF-7細(xì)胞中，過表達(dá)PEDF組在劃痕后24小時(shí)的劃痕愈合率為20.0%±5.0%，明顯低于對(duì)照組的45.0%±8.0%（P<0.01）；干擾PEDF表達(dá)后，劃痕愈合率升高至60.0%±10.0%，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在MDA-MB-231細(xì)胞中，過表達(dá)PEDF組的劃痕愈合率為25.0%±6.0%，顯著低于對(duì)照組的55.0%±10.0%（P<0.01）；干擾PEDF表達(dá)后，劃痕愈合率增加至70.0%±12.0%，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。對(duì)于CD34蛋白，在Transwell實(shí)驗(yàn)中，在MCF-7細(xì)胞中，過表達(dá)CD34組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著多于對(duì)照組，在培養(yǎng)24小時(shí)后，過表達(dá)CD34組穿膜細(xì)胞數(shù)為280±30個(gè)，明顯高于對(duì)照組的180±20個(gè)（P<0.01）；干擾CD34表達(dá)后，穿膜細(xì)胞數(shù)明顯減少，干擾組穿膜細(xì)胞數(shù)為100±15個(gè)，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在MDA-MB-231細(xì)胞中，過表達(dá)CD34組在24小時(shí)的穿膜細(xì)胞數(shù)為350±35個(gè)，顯著高于對(duì)照組的200±22個(gè)（P<0.01）；干擾CD34表達(dá)后，穿膜細(xì)胞數(shù)降低至120±20個(gè)，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在劃痕實(shí)驗(yàn)中，在MCF-7細(xì)胞中，過表達(dá)CD34組在劃痕后24小時(shí)的劃痕愈合率為65.0%±10.0%，明顯高于對(duì)照組的45.0%±8.0%（P<0.01）；干擾CD34表達(dá)后，劃痕愈合率降低至25.0%±6.0%，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。在MDA-MB-231細(xì)胞中，過表達(dá)CD34組的劃痕愈合率為80.0%±12.0%，顯著高于對(duì)照組的55.0%±10.0%（P<0.01）；干擾CD34表達(dá)后，劃痕愈合率下降至30.0%±8.0%，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。這些結(jié)果表明，PEDF蛋白能夠抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，而CD34蛋白則促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。[此處插入Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖片，圖片標(biāo)題為“圖2：PEDF和CD34對(duì)乳腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響”，Transwell實(shí)驗(yàn)圖片展示不同組別的小室下室穿膜細(xì)胞情況，劃痕實(shí)驗(yàn)圖片展示不同組別劃痕后0小時(shí)和24小時(shí)的劃痕寬度對(duì)比，在圖注中注明各圖片代表的組別和實(shí)驗(yàn)時(shí)間點(diǎn)]5.3.2作用機(jī)制探討PEDF蛋白抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制較為復(fù)雜，涉及多個(gè)方面。一方面，PEDF可以調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附分子的表達(dá)。細(xì)胞黏附分子在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起著關(guān)鍵作用，它們參與腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)以及周圍細(xì)胞之間的黏附、脫離和遷移等過程。研究發(fā)現(xiàn)，PEDF可以上調(diào)上皮鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達(dá)，E-cadherin是一種重要的上皮細(xì)胞黏附分子，它能夠介導(dǎo)上皮細(xì)胞之間的黏附作用，維持上皮組織的完整性。當(dāng)E-cadherin表達(dá)升高時(shí)，乳腺癌細(xì)胞之間的黏附力增強(qiáng)，細(xì)胞不易脫離原發(fā)灶，從而抑制了腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。同時(shí)，PEDF可以下調(diào)神經(jīng)鈣黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）的表達(dá)，N-cadherin和Vimentin通常在具有間質(zhì)表型的細(xì)胞中高表達(dá)，它們的表達(dá)升高與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)相關(guān)。下調(diào)N-cadherin和Vimentin的表達(dá)，可以使乳腺癌細(xì)胞的間質(zhì)表型減弱，抑制其侵襲和轉(zhuǎn)移能力。另一方面，PEDF可以抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的活性。MMPs是一類能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)成分的蛋白酶，包括膠原蛋白、層粘連蛋白和纖連蛋白等，它們?cè)谀[瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用。腫瘤細(xì)胞通過分泌MMPs，降解細(xì)胞外基質(zhì)，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲開辟道路。PEDF可以通過多種途徑抑制MMPs的活性，如抑制MMPs基因的轉(zhuǎn)錄、降低MMPs蛋白的合成以及促進(jìn)MMPs抑制劑（如TIMP-1和TIMP-2）的表達(dá)等。研究表明，在過表達(dá)PEDF的乳腺癌細(xì)胞中，MMP-2和MMP-9的活性顯著降低，細(xì)胞外基質(zhì)的降解減少，從而抑制了腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。CD34蛋白促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制主要與腫瘤血管生成和細(xì)胞信號(hào)通路的激活有關(guān)。如前所述，CD34高表達(dá)促進(jìn)腫瘤血管生成，新生血管不僅為腫瘤細(xì)胞提供營養(yǎng)，還為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)或淋巴循環(huán)提供了途徑，使腫瘤細(xì)胞更容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。腫瘤細(xì)胞可以通過新生血管進(jìn)入血管或淋巴管，隨著血流或淋巴液到達(dá)身體其他部位，形成轉(zhuǎn)移灶。CD34可能通過激活某些細(xì)胞信號(hào)通路來促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，CD34可以激活PI3K/Akt和ERK1/2信號(hào)通路，這兩條信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)行為中起著重要作用。激活PI3K/Akt信號(hào)通路可以促進(jìn)細(xì)胞的存活、增殖和遷移，同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡；激活ERK1/2信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的骨架重組和運(yùn)動(dòng)能力，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。CD34還可能通過與其他細(xì)胞表面分子相互作用，影響腫瘤細(xì)胞的黏附、遷移和侵襲等過程，但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步深入研究。六、PEDF和CD34蛋白表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系6.1患者隨訪與預(yù)后評(píng)估指標(biāo)為了深入探究PEDF和CD34蛋白表達(dá)與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系，本研究對(duì)120例乳腺癌患者進(jìn)行了長期隨訪。隨訪從患者確診并接受首次治療后開始，隨訪時(shí)間截止至2023年12月31日，中位隨訪時(shí)間為54個(gè)月（范圍：12-84個(gè)月）。隨訪方式采用門診隨訪和電話隨訪相結(jié)合的方法。門診隨訪時(shí)，患者需定期到醫(yī)院乳腺外科門診就診，由專業(yè)醫(yī)生進(jìn)行詳細(xì)的體格檢查，包括觸診雙側(cè)乳房、腋窩及鎖骨上淋巴結(jié)，觀察乳房皮膚有無異常改變等。同時(shí)，患者還需接受一系列輔助檢查，如乳腺超聲、乳腺X線攝影（鉬靶）、胸部CT、腹部超聲等，以評(píng)估腫瘤的局部復(fù)發(fā)情況和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況。乳腺超聲和鉬靶主要用于檢測乳腺局部腫瘤的復(fù)發(fā)；胸部CT可觀察肺部是否有轉(zhuǎn)移病灶；腹部超聲則用于檢查肝臟、腎上腺等腹部臟器是否出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。電話隨訪主要用于了解患者在兩次門診隨訪之間的身體狀況，包括是否出現(xiàn)新的癥狀、治療過程中的不良反應(yīng)等，并提醒患者按時(shí)進(jìn)行下一次隨訪。用于評(píng)估患者預(yù)后的指標(biāo)主要包括生存率和復(fù)發(fā)率。生存率分為總生存率（OS）和無病生存率（DFS）?？偵媛适侵笍拇_診乳腺癌到任何原因?qū)е滤劳龅臅r(shí)間，無病生存率是指從確診乳腺癌到腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或任何原因?qū)е滤劳龅臅r(shí)間。復(fù)發(fā)率則是指在隨訪期間出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)的患者比例，腫瘤復(fù)發(fā)包括局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。局部復(fù)發(fā)是指腫瘤在乳腺原發(fā)部位或同側(cè)胸壁再次出現(xiàn)；遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是指腫瘤轉(zhuǎn)移到身體其他部位，如肺、肝、骨、腦等。通過對(duì)這些預(yù)后指標(biāo)的監(jiān)測和分析