NLRP3炎癥小體在肝纖維化進程中的表達及機制探究一、引言1.1研究背景與意義肝纖維化（hepaticfibrosis，HF）是肝臟受到長期損傷后，以細胞外基質（extracellularmatrix，ECM）過度沉積為主要特征的病理過程，是多種慢性肝病如慢性病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、自身免疫性肝病以及遺傳代謝性肝病等發(fā)展至肝硬化的必經(jīng)階段。近年來，隨著生活方式的改變和老齡化社會的到來，慢性肝病的發(fā)病率呈上升趨勢，肝纖維化的患病人數(shù)也相應增加，嚴重威脅著人類的健康。據(jù)統(tǒng)計，全球約有17億人受到慢性肝病的影響，每年因肝纖維化相關疾病導致的死亡人數(shù)高達數(shù)百萬。在中國，僅慢性乙型肝炎病毒感染者就超過7000萬，其中相當一部分患者會進展為肝纖維化和肝硬化。肝纖維化若不能及時有效治療，會逐漸發(fā)展為肝硬化，導致肝功能衰竭，還會顯著增加肝癌的發(fā)生風險，給患者家庭和社會帶來沉重的經(jīng)濟負擔。目前，針對肝纖維化的治療主要是針對病因進行干預，如抗病毒治療、戒酒、控制血糖血脂等，但對于已經(jīng)形成的肝纖維化，缺乏特效的治療藥物。肝星狀細胞（hepaticstellatecells，HSC）的活化、增殖以及ECM的過度合成與降解失衡是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關鍵環(huán)節(jié)。然而，除了HSC外，越來越多的研究表明，炎癥反應在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中也起著至關重要的作用。炎癥小體作為固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分，能夠識別病原體相關分子模式（pathogen-associatedmolecularpatterns，PAMPs）和損傷相關分子模式（damage-associatedmolecularpatterns，DAMPs），激活半胱天冬酶-1（caspase-1），促進白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和白細胞介素-18（interleukin-18，IL-18）等促炎細胞因子的成熟與釋放，引發(fā)炎癥反應。NLRP3（NOD-likereceptorprotein3）炎癥小體是目前研究最為廣泛的一種炎癥小體，可被多種病原體和內源性危險信號激活，如細菌、病毒、尿酸結晶、ATP、活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS）等。在多種肝臟疾病中，NLRP3炎癥小體均被發(fā)現(xiàn)異常激活，并參與了肝臟炎癥、損傷和纖維化的病理過程。研究發(fā)現(xiàn)，在非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholicfattyliverdisease，NAFLD）模型中，NLRP3炎癥小體的活化與肝臟脂肪變性、炎癥浸潤和纖維化程度密切相關。在酒精性肝病中，酒精刺激可導致NLRP3炎癥小體激活，促進炎癥因子釋放，加重肝臟損傷和纖維化。此外，在乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus，HBV）和丙型肝炎病毒（hepatitisCvirus，HCV）感染相關的肝纖維化中，NLRP3炎癥小體也發(fā)揮著重要作用。深入研究NLRP3炎癥小體在肝纖維化中的表達變化及其作用機制，不僅有助于進一步闡明肝纖維化的發(fā)病機制，還可能為肝纖維化的治療提供新的靶點和策略。通過抑制NLRP3炎癥小體的激活，有望減輕肝臟炎癥反應，抑制HSC的活化，從而延緩或逆轉肝纖維化的進程。本研究旨在通過建立肝纖維化大鼠模型，觀察NLRP3炎癥小體在肝纖維化大鼠肝組織中的表達情況，并探討其在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用機制，為肝纖維化的防治提供理論依據(jù)和實驗基礎。1.2國內外研究現(xiàn)狀1.2.1肝纖維化發(fā)病機制的研究現(xiàn)狀肝纖維化的發(fā)病機制十分復雜，涉及多種細胞和信號通路的相互作用。目前認為，肝星狀細胞（HSC）的活化是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的核心環(huán)節(jié)。在正常肝臟中，HSC處于靜止狀態(tài)，主要儲存維生素A。當肝臟受到損傷時，如病毒感染、酒精刺激、脂肪堆積等，HSC被激活，發(fā)生表型轉化，從靜止的維生素A儲存細胞轉變?yōu)榫哂性鲋?、收縮和分泌細胞外基質能力的肌成纖維細胞樣細胞。激活的HSC大量合成和分泌膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白等細胞外基質成分，同時減少基質金屬蛋白酶（matrixmetalloproteinases，MMPs）的表達，增加金屬蛋白酶組織抑制因子（tissueinhibitorsofmetalloproteinases，TIMPs）的表達，導致細胞外基質的降解減少，過度沉積在肝臟組織中，引起肝纖維化。除了HSC，其他細胞如肝細胞、枯否細胞（Kupffercells，KC）、肝竇內皮細胞（sinusoidalendothelialcells，SEC）等也在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。肝細胞受損后，可釋放多種細胞因子和趨化因子，如轉化生長因子-β1（transforminggrowthfactor-β1，TGF-β1）、血小板衍生生長因子（platelet-derivedgrowthfactor，PDGF）、單核細胞趨化蛋白-1（monocytechemoattractantprotein-1，MCP-1）等，這些因子可以激活HSC，促進肝纖維化的發(fā)展。KC是肝臟內的固有巨噬細胞，可通過吞噬病原體和受損細胞，釋放炎癥介質和細胞因子，如腫瘤壞死因子-α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）、白細胞介素-1（interleukin-1，IL-1）等，參與肝臟的炎癥反應和免疫調節(jié)，間接影響HSC的活化和肝纖維化的進程。SEC可分泌多種細胞因子和生長因子，調節(jié)HSC的活化和增殖，同時，SEC的損傷和功能障礙也會導致肝竇毛細血管化，進一步加重肝纖維化。此外，多條信號通路參與了肝纖維化的調控，如TGF-β/Smad信號通路、PDGF/PI3K/Akt信號通路、NF-κB信號通路、Wnt/β-catenin信號通路等。TGF-β/Smad信號通路是目前研究最為深入的促纖維化信號通路之一，TGF-β1與受體結合后，激活Smad蛋白，Smad蛋白進入細胞核，與其他轉錄因子相互作用，調節(jié)纖維化相關基因的表達，促進HSC的活化和細胞外基質的合成。PDGF/PI3K/Akt信號通路可通過促進HSC的增殖和遷移，參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。NF-κB信號通路在肝臟炎癥反應中起關鍵作用，激活后可促進炎癥因子的表達，加重肝臟炎癥，進而促進肝纖維化。Wnt/β-catenin信號通路可調節(jié)HSC的活化和增殖，異常激活與肝纖維化的進展密切相關。1.2.2NLRP3炎癥小體的研究現(xiàn)狀NLRP3炎癥小體是一種由NLRP3蛋白、凋亡相關斑點樣蛋白（apoptosis-associatedspeck-likeproteincontainingaCARD，ASC）和半胱天冬酶-1（caspase-1）組成的多蛋白復合物，在固有免疫和炎癥反應中發(fā)揮重要作用。NLRP3蛋白屬于NOD樣受體（NOD-likereceptors，NLRs）家族，由N端的熱蛋白結構域（pyrindomain，PYD）、中間的核苷酸結合寡聚化結構域（nucleotide-bindingoligomerizationdomain，NOD）和C端的富含亮氨酸重復序列（leucine-richrepeats，LRR）組成。當細胞受到病原體相關分子模式（PAMPs）或損傷相關分子模式（DAMPs）刺激時，NLRP3蛋白首先通過其LRR結構域識別這些危險信號，發(fā)生構象變化，然后通過PYD結構域與ASC的PYD結構域相互作用，招募ASC。ASC再通過其CARD結構域與caspase-1的CARD結構域相互作用，募集并激活caspase-1。激活的caspase-1可將無活性的IL-1β前體和IL-18前體切割成具有生物活性的IL-1β和IL-18，釋放到細胞外，引發(fā)炎癥反應。此外，caspase-1還可激活gasderminD蛋白，導致細胞焦亡，進一步加重炎癥反應。NLRP3炎癥小體的激活需要兩個信號的協(xié)同作用。信號1通常由Toll樣受體（Toll-likereceptors，TLRs）等模式識別受體介導，通過激活NF-κB信號通路，促進NLRP3、IL-1β和IL-18前體的表達，使細胞處于“致敏”狀態(tài)。信號2則由多種刺激物提供，如ATP、鉀離子外流、活性氧（ROS）、線粒體DNA釋放等，這些刺激物可觸發(fā)NLRP3炎癥小體的組裝和激活。不同的刺激物可能通過不同的機制激活NLRP3炎癥小體，目前其具體激活機制尚未完全明確。近年來，NLRP3炎癥小體在多種疾病中的作用受到廣泛關注。在代謝性疾病如2型糖尿病、肥胖癥中，NLRP3炎癥小體的異常激活與慢性炎癥、胰島素抵抗等密切相關。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病如阿爾茨海默病、帕金森病中，NLRP3炎癥小體參與了神經(jīng)炎癥和神經(jīng)退行性變的過程。在心血管疾病如動脈粥樣硬化、心肌梗死中，NLRP3炎癥小體也發(fā)揮了重要作用，促進了炎癥反應和血管損傷。1.2.3NLRP3炎癥小體與肝纖維化關系的研究現(xiàn)狀越來越多的研究表明，NLRP3炎癥小體在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。在多種肝纖維化動物模型中，如四氯化碳（CCl4）誘導的肝纖維化模型、膽管結扎誘導的肝纖維化模型、高脂飲食誘導的非酒精性脂肪性肝病相關肝纖維化模型等，均發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體的表達和激活顯著增加。敲除NLRP3基因或使用NLRP3炎癥小體抑制劑，可減輕肝臟炎癥反應，抑制HSC的活化，減少細胞外基質的沉積，從而延緩肝纖維化的進展。NLRP3炎癥小體在肝纖維化中的作用機制可能涉及多個方面。一方面，NLRP3炎癥小體激活后釋放的IL-1β和IL-18等促炎細胞因子，可招募和激活免疫細胞，如巨噬細胞、中性粒細胞等，加重肝臟炎癥反應，炎癥微環(huán)境中的細胞因子和趨化因子又可進一步激活HSC，促進肝纖維化的發(fā)展。另一方面，NLRP3炎癥小體的激活可誘導肝細胞和HSC發(fā)生細胞焦亡，細胞焦亡過程中釋放的損傷相關分子模式（DAMPs）可進一步激活NLRP3炎癥小體和其他免疫細胞，形成惡性循環(huán)，加劇肝臟損傷和纖維化。此外，NLRP3炎癥小體還可能通過調節(jié)其他信號通路，如TGF-β/Smad信號通路、NF-κB信號通路等，間接影響肝纖維化的進程。盡管目前對NLRP3炎癥小體在肝纖維化中的作用有了一定的認識，但仍存在許多不足之處。首先，NLRP3炎癥小體在肝纖維化中的具體激活機制尚未完全闡明，不同刺激物如何協(xié)同作用激活NLRP3炎癥小體，以及NLRP3炎癥小體激活后如何精確調控下游信號通路，仍有待進一步研究。其次，NLRP3炎癥小體在肝纖維化不同階段的作用及機制是否存在差異，目前還不清楚。此外，針對NLRP3炎癥小體的治療策略在臨床應用中還面臨許多挑戰(zhàn)，如如何提高抑制劑的特異性和安全性，如何選擇合適的治療時機等，都需要進一步的研究和探索。1.3研究目標與內容本研究旨在深入探究NLRP3炎癥小體在肝纖維化大鼠肝組織中的表達變化規(guī)律，并闡明其在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中的作用機制，為肝纖維化的防治提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點。具體研究內容如下：觀察NLRP3炎癥小體在肝纖維化大鼠肝組織中的表達變化：通過建立四氯化碳（CCl4）誘導的肝纖維化大鼠模型，運用實時熒光定量PCR、Westernblot、免疫組織化學等技術，檢測不同時間點（如4周、8周、12周）大鼠肝組織中NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β、IL-18等NLRP3炎癥小體相關蛋白及基因的表達水平，明確NLRP3炎癥小體在肝纖維化進程中的表達變化趨勢，分析其表達與肝纖維化程度之間的相關性。探討NLRP3炎癥小體對肝纖維化大鼠肝組織炎癥反應的影響：檢測肝組織中炎癥細胞因子（如TNF-α、IL-6等）的表達水平，觀察炎癥細胞浸潤情況。通過體內實驗，給予NLRP3炎癥小體抑制劑（如MCC950）處理肝纖維化大鼠，比較抑制劑處理組與模型組大鼠肝組織的炎癥指標，評估NLRP3炎癥小體的抑制對肝臟炎癥反應的改善作用，明確NLRP3炎癥小體在肝纖維化相關炎癥反應中的關鍵作用。研究NLRP3炎癥小體對肝星狀細胞活化的調控機制：分離和培養(yǎng)原代肝星狀細胞，采用體外實驗方法，如RNA干擾技術沉默NLRP3基因表達，或用NLRP3激動劑激活NLRP3炎癥小體，檢測肝星狀細胞的活化標志物（如α-SMA、Col1α1等）的表達變化，觀察細胞增殖、遷移和收縮能力的改變。進一步研究NLRP3炎癥小體激活后對下游信號通路（如TGF-β/Smad、NF-κB等）的影響，揭示NLRP3炎癥小體調控肝星狀細胞活化的分子機制。分析NLRP3炎癥小體與其他信號通路的交互作用在肝纖維化中的作用：研究NLRP3炎癥小體與其他已知參與肝纖維化的信號通路（如PDGF/PI3K/Akt信號通路、Wnt/β-catenin信號通路等）之間的相互關系。通過體內外實驗，觀察阻斷或激活某一信號通路對NLRP3炎癥小體表達和活性的影響，以及對肝纖維化進程的調節(jié)作用，明確NLRP3炎癥小體與其他信號通路的交互作用在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中的作用機制。1.4研究方法與技術路線1.4.1實驗動物與分組選取健康雄性SD大鼠[X]只，體重200-220g，購自[動物供應商名稱]，動物生產(chǎn)許可證號：[許可證號]。大鼠在溫度（23±2）℃、相對濕度（50±10）%、12h光照/12h黑暗的環(huán)境中適應性飼養(yǎng)1周，自由攝食和飲水。將大鼠隨機分為正常對照組（NC組，n=[每組數(shù)量]）和肝纖維化模型組（HF組，n=[每組數(shù)量]）。1.4.2肝纖維化模型的建立采用經(jīng)典的四氯化碳（CCl4）誘導法建立大鼠肝纖維化模型。將CCl4用橄欖油稀釋成40%（v/v）的溶液，HF組大鼠按0.5mL/100g體重的劑量，通過腹腔注射40%CCl4橄欖油溶液，2次/周，持續(xù)12周；NC組大鼠則腹腔注射等體積的純橄欖油。在造模期間，密切觀察大鼠的精神狀態(tài)、飲食、體重變化及皮毛光澤等一般情況。每2周稱量一次大鼠體重，根據(jù)體重調整CCl4的注射劑量。1.4.3標本采集在造模第4周、8周、12周時，分別從NC組和HF組中隨機選取[每組選取數(shù)量]只大鼠，進行標本采集。大鼠經(jīng)10%水合氯醛（0.3mL/100g體重）腹腔注射麻醉后，打開腹腔，經(jīng)下腔靜脈取血，3000r/min離心15min，分離血清，-80℃保存，用于檢測肝功能指標（如谷丙轉氨酶ALT、谷草轉氨酶AST、總膽紅素TBIL等）。迅速取出肝臟，用預冷的生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干水分，稱取肝臟重量，計算肝臟指數(shù)（肝臟指數(shù)=肝臟重量/體重×100%）。取部分肝組織用4%多聚甲醛固定，用于制作石蠟切片，進行HE染色、Masson染色及免疫組織化學檢測；另取部分肝組織迅速放入液氮中速凍，然后轉移至-80℃冰箱保存，用于提取總RNA和總蛋白，進行實時熒光定量PCR和Westernblot檢測。1.4.4檢測指標與方法肝功能指標檢測：采用全自動生化分析儀（[儀器型號]）檢測血清中ALT、AST、TBIL等肝功能指標，嚴格按照試劑盒（[試劑盒生產(chǎn)廠家]）說明書進行操作。肝組織病理學觀察：將4%多聚甲醛固定的肝組織常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，制作厚度為4μm的石蠟切片。HE染色用于觀察肝組織的一般形態(tài)結構變化，Masson染色用于顯示肝組織中膠原纖維的沉積情況，在光學顯微鏡下（[顯微鏡型號]）觀察并拍照，根據(jù)肝纖維化分期標準（如Ishak評分系統(tǒng)）對肝纖維化程度進行評估。實時熒光定量PCR檢測：采用TRIzol試劑（[試劑品牌]）提取肝組織總RNA，用核酸蛋白測定儀（[儀器型號]）測定RNA的濃度和純度。取1μg總RNA，按照逆轉錄試劑盒（[試劑盒品牌]）說明書的步驟將其逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板，采用SYBRGreen熒光染料法（[試劑盒品牌]）在實時熒光定量PCR儀（[儀器型號]）上進行擴增。引物序列根據(jù)GenBank中大鼠NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β、IL-18及內參基因GAPDH的mRNA序列，利用PrimerPremier5.0軟件設計，由[引物合成公司]合成。反應條件為：95℃預變性30s；95℃變性5s，60℃退火30s，共40個循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量。Westernblot檢測：取適量肝組織，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液（[試劑品牌]），冰上勻漿裂解30min，12000r/min離心15min，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒（[試劑盒品牌]）測定蛋白濃度。取等量蛋白樣品，進行SDS-PAGE凝膠電泳，將分離后的蛋白電轉移至PVDF膜上。用5%脫脂奶粉室溫封閉2h，分別加入一抗（抗NLRP3、抗ASC、抗caspase-1、抗IL-1β、抗IL-18及抗GAPDH抗體，均購自[抗體品牌]），4℃孵育過夜。次日，TBST洗膜3次，每次10min，加入相應的二抗（[二抗品牌]），室溫孵育1h，TBST洗膜3次，每次10min。用化學發(fā)光底物（[底物品牌]）顯色，在凝膠成像系統(tǒng)（[儀器型號]）上曝光拍照，采用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內參蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。免疫組織化學檢測：將石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，用3%過氧化氫溶液室溫孵育10min以滅活內源性過氧化物酶，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5min。抗原修復后，滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20min，傾去血清，勿洗。分別滴加一抗（抗NLRP3、抗ASC、抗caspase-1、抗IL-1β、抗IL-18抗體），4℃孵育過夜。次日，PBS洗片3次，每次5min，滴加生物素標記的二抗，室溫孵育20min，PBS洗片3次，每次5min。滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉卵白素工作液，室溫孵育20min，PBS洗片3次，每次5min。DAB顯色，蘇木精復染，鹽酸酒精分化，氨水返藍，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。在光學顯微鏡下觀察并拍照，以陽性細胞數(shù)占總細胞數(shù)的百分比及陽性染色強度綜合判斷結果。1.4.5數(shù)據(jù)處理采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），兩兩比較采用LSD法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。1.4.6技術路線本研究的技術路線如圖1-1所示：首先進行實驗動物分組，然后通過腹腔注射CCl4橄欖油溶液建立肝纖維化大鼠模型，正常對照組注射橄欖油。在造模不同時間點采集大鼠血清和肝組織標本，分別進行肝功能指標檢測、肝組織病理學觀察、實時熒光定量PCR檢測、Westernblot檢測及免疫組織化學檢測，最后對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，得出研究結論。[此處插入技術路線圖，圖中清晰展示從動物分組、模型建立、標本采集、各項檢測指標到數(shù)據(jù)分析的整個流程，每個步驟之間用箭頭連接，標注關鍵時間點和操作內容]圖1-1技術路線圖二、相關理論基礎2.1肝纖維化概述肝纖維化是肝臟在受到各種慢性損傷因素作用下，以細胞外基質（ECM）過度沉積為主要特征的一種病理過程。從病理生理學角度來看，它是肝臟對慢性損傷的一種修復反應，但其修復過程失去了正常的調控，導致纖維組織異常增生。正常肝臟組織中，ECM的合成和降解處于動態(tài)平衡狀態(tài)，維持著肝臟的正常結構和功能。然而，當肝臟持續(xù)遭受損傷時，這種平衡被打破，ECM合成增多，降解減少，逐漸在肝臟內堆積，形成纖維化。肝纖維化的病因較為復雜，多種因素均可引發(fā)。慢性病毒性肝炎是導致肝纖維化的常見原因之一，其中乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染最為常見。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計，全球約有2.57億慢性HBV感染者和7100萬慢性HCV感染者，這些患者中相當一部分會逐漸發(fā)展為肝纖維化。病毒持續(xù)感染可引起機體的免疫反應，導致肝細胞反復受損，進而激活肝星狀細胞（HSC），引發(fā)纖維化。酒精性肝病也是肝纖維化的重要病因，長期大量飲酒會使肝臟代謝酒精的能力下降，產(chǎn)生的乙醛等有害物質會損傷肝細胞，刺激炎癥反應，促進HSC活化，最終導致肝纖維化。研究表明，每日飲酒量超過80g，持續(xù)5年以上，發(fā)生肝纖維化的風險顯著增加。非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）近年來發(fā)病率呈上升趨勢，也與肝纖維化密切相關。NAFLD包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）及其相關肝硬化，其中NASH患者更容易進展為肝纖維化。胰島素抵抗、氧化應激、脂肪因子失衡等因素在NAFLD相關肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。自身免疫性肝病如自身免疫性肝炎、原發(fā)性膽汁性膽管炎等，由于機體自身免疫系統(tǒng)攻擊肝臟組織，導致肝臟炎癥和損傷，也可引發(fā)肝纖維化。此外，遺傳代謝性肝病，如肝豆狀核變性、血色病等，因遺傳缺陷導致體內代謝異常，有害物質在肝臟沉積，損傷肝細胞，進而引起肝纖維化。肝纖維化是慢性肝病向肝硬化發(fā)展的關鍵階段，嚴重影響肝臟的正常功能。隨著肝纖維化程度的加重，肝臟逐漸失去彈性，質地變硬，正常的肝小葉結構被破壞，取而代之的是纖維組織增生形成的假小葉。這不僅會導致肝臟的代謝、解毒、合成等功能受損，還會引起門靜脈高壓，出現(xiàn)腹水、食管胃底靜脈曲張破裂出血等嚴重并發(fā)癥，增加患者的死亡風險。據(jù)統(tǒng)計，肝硬化患者5年生存率約為14%-35%，而肝纖維化若能早期發(fā)現(xiàn)并有效干預，部分患者的病情可得到逆轉，因此，深入研究肝纖維化的發(fā)病機制和防治措施具有重要的臨床意義。2.2NLRP3炎癥小體概述NLRP3炎癥小體是固有免疫系統(tǒng)的關鍵組成部分，在機體防御病原體入侵和維持內環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著重要作用。它是一種多蛋白復合物，主要由NLRP3蛋白、凋亡相關斑點樣蛋白（ASC）和半胱天冬酶-1（caspase-1）組成。NLRP3蛋白屬于NOD樣受體（NLRs）家族，其結構較為復雜，包含多個功能結構域。N端的熱蛋白結構域（PYD），約由90個氨基酸組成，主要介導蛋白質與蛋白質之間的相互作用，在NLRP3炎癥小體的組裝過程中，PYD結構域可與ASC的PYD結構域特異性結合。中間的核苷酸結合寡聚化結構域（NOD），也稱為NACHT結構域，具有ATP酶活性，在NLRP3炎癥小體的激活過程中，NOD結構域結合ATP并發(fā)生水解，為炎癥小體的組裝和激活提供能量。C端的富含亮氨酸重復序列（LRR），由多個亮氨酸重復單元組成，長度約為400-500個氨基酸，LRR結構域具有高度的可塑性和多樣性，能夠識別多種病原體相關分子模式（PAMPs）和損傷相關分子模式（DAMPs），如細菌細胞壁成分、病毒核酸、尿酸結晶、ATP、活性氧（ROS）等，是NLRP3炎癥小體識別危險信號的關鍵結構域。ASC是連接NLRP3和caspase-1的關鍵接頭蛋白，由N端的PYD結構域和C端的半胱天冬酶募集結構域（CARD）組成。當NLRP3蛋白識別并結合危險信號后發(fā)生構象變化，其PYD結構域與ASC的PYD結構域通過同型相互作用結合，形成NLRP3-ASC復合物。ASC再通過其CARD結構域與caspase-1的CARD結構域相互作用，招募caspase-1，從而形成完整的NLRP3炎癥小體復合物。caspase-1是一種半胱氨酸蛋白酶，在NLRP3炎癥小體中處于核心地位。在靜息狀態(tài)下，caspase-1以無活性的酶原形式存在。當NLRP3炎癥小體組裝完成后，caspase-1被招募到炎癥小體復合物中，其分子內的自我切割位點被激活，發(fā)生自我切割，從無活性的酶原形式轉化為具有活性的caspase-1。激活的caspase-1可特異性地切割無活性的白細胞介素-1β（IL-1β）前體和白細胞介素-18（IL-18）前體，將它們轉化為具有生物活性的IL-1β和IL-18。IL-1β和IL-18是重要的促炎細胞因子，釋放到細胞外后，可與靶細胞表面的相應受體結合，激活下游信號通路，招募和激活免疫細胞，如巨噬細胞、中性粒細胞等，引發(fā)炎癥反應。此外，激活的caspase-1還可作用于gasderminD蛋白，將其切割成具有活性的N端結構域，該結構域可在細胞膜上形成孔洞，導致細胞內的離子和小分子物質外流，細胞腫脹破裂，發(fā)生細胞焦亡。細胞焦亡是一種程序性壞死，在炎癥反應中，細胞焦亡不僅會釋放大量的促炎細胞因子和損傷相關分子模式（DAMPs），進一步放大炎癥反應，還會導致組織損傷和器官功能障礙。NLRP3炎癥小體的激活需要兩個信號的協(xié)同作用。信號1通常由Toll樣受體（TLRs）等模式識別受體介導，當細胞受到PAMPs或DAMPs刺激時，TLRs識別這些信號并激活下游的MyD88依賴或TRIF依賴的信號通路，最終激活核轉錄因子κB（NF-κB）。NF-κB進入細胞核，與NLRP3、IL-1β和IL-18等基因的啟動子區(qū)域結合，促進這些基因的轉錄和表達，使細胞處于“致敏”狀態(tài)。信號2則由多種刺激物提供，不同的刺激物可能通過不同的機制激活NLRP3炎癥小體。例如，ATP是一種常見的NLRP3炎癥小體激活劑，細胞外高濃度的ATP可通過P2X7受體介導鉀離子外流，導致細胞內鉀離子濃度降低，從而激活NLRP3炎癥小體?；钚匝酰≧OS）也是重要的激活信號，在細胞受到氧化應激時，線粒體等細胞器產(chǎn)生大量的ROS，ROS可直接或間接作用于NLRP3蛋白，促進其構象變化和炎癥小體的組裝。此外，尿酸結晶、二氧化硅顆粒等可通過吞噬作用進入細胞，在溶酶體中與NLRP3蛋白相互作用，導致溶酶體膜損傷，釋放組織蛋白酶B等物質，激活NLRP3炎癥小體。雖然目前對NLRP3炎癥小體的激活機制有了一定的認識，但仍存在許多未解之謎，如不同刺激物如何精確調控NLRP3炎癥小體的激活，以及NLRP3炎癥小體激活過程中各分子之間的動態(tài)相互作用等，有待進一步深入研究。大量研究表明，NLRP3炎癥小體在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。在代謝性疾病方面，如2型糖尿病，長期的高血糖狀態(tài)可導致氧化應激和內質網(wǎng)應激增加，產(chǎn)生大量的ROS和DAMPs，激活NLRP3炎癥小體。NLRP3炎癥小體激活后釋放的IL-1β和IL-18等促炎細胞因子，可引起胰島β細胞功能受損，胰島素分泌減少，同時還可導致胰島素抵抗增加，進一步加重血糖代謝紊亂。在肥胖癥中，脂肪組織的過度堆積會引發(fā)慢性炎癥，脂肪細胞和巨噬細胞等釋放的游離脂肪酸、脂多糖等物質可激活NLRP3炎癥小體，促進炎癥因子的釋放，導致全身炎癥反應和代謝紊亂。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，如阿爾茨海默病，大腦中β-淀粉樣蛋白（Aβ）的沉積可被小膠質細胞識別，激活NLRP3炎癥小體。激活的NLRP3炎癥小體釋放的炎癥因子會引起神經(jīng)炎癥，損傷神經(jīng)元，促進tau蛋白的磷酸化和聚集，加速神經(jīng)退行性變。在帕金森病中，α-突觸核蛋白的異常聚集和線粒體功能障礙可產(chǎn)生DAMPs和ROS，激活NLRP3炎癥小體，引發(fā)神經(jīng)炎癥，導致多巴胺能神經(jīng)元死亡。在心血管疾病中，NLRP3炎癥小體也發(fā)揮著重要作用。在動脈粥樣硬化中，氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）、膽固醇結晶等可激活血管內皮細胞、巨噬細胞和血管平滑肌細胞中的NLRP3炎癥小體，促進炎癥細胞的浸潤和炎癥因子的釋放，導致血管內皮損傷、斑塊不穩(wěn)定和血栓形成。在心肌梗死中，缺血再灌注損傷會產(chǎn)生大量的ROS和DAMPs，激活心肌細胞和巨噬細胞中的NLRP3炎癥小體，引發(fā)炎癥反應，加重心肌損傷和心肌重構。在肝臟疾病中，NLRP3炎癥小體同樣參與了多種病理過程。在非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）中，肝臟脂肪變性導致的氧化應激、內質網(wǎng)應激和脂毒性等可激活NLRP3炎癥小體，促進炎癥因子的釋放，加重肝臟炎癥和脂肪變性，進而發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎（NASH）和肝纖維化。在酒精性肝病中，酒精代謝產(chǎn)生的乙醛等有害物質可損傷肝細胞，激活免疫細胞，釋放DAMPs和PAMPs，激活NLRP3炎癥小體，引發(fā)肝臟炎癥和纖維化。在病毒性肝炎中，乙肝病毒（HBV）和丙肝病毒（HCV）感染可激活NLRP3炎癥小體，導致肝臟炎癥反應和免疫損傷，促進肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。因此，深入研究NLRP3炎癥小體的作用機制，對于理解多種疾病的發(fā)病機制和開發(fā)新的治療策略具有重要意義。2.3肝纖維化與NLRP3炎癥小體的潛在聯(lián)系肝纖維化的發(fā)生發(fā)展是一個復雜的病理過程，與炎癥反應、細胞外基質代謝、細胞凋亡等多種生物學過程密切相關，而NLRP3炎癥小體在這些過程中均可能發(fā)揮重要作用，從而與肝纖維化之間存在潛在聯(lián)系。在炎癥反應方面，肝纖維化通常伴隨著持續(xù)的肝臟炎癥。NLRP3炎癥小體作為固有免疫的重要組成部分，可被多種病原體相關分子模式（PAMPs）和損傷相關分子模式（DAMPs）激活。在肝臟疾病中，病毒感染（如HBV、HCV）、酒精性損傷、非酒精性脂肪性肝病等因素均可導致肝細胞受損，釋放DAMPs，如高遷移率族蛋白B1（HMGB1）、ATP、線粒體DNA等，這些DAMPs可激活NLRP3炎癥小體。NLRP3炎癥小體激活后，通過caspase-1的活化，促使無活性的IL-1β前體和IL-18前體切割成具有生物活性的IL-1β和IL-18。IL-1β和IL-18是強效的促炎細胞因子，可招募和激活巨噬細胞、中性粒細胞等免疫細胞，使其聚集在肝臟組織中，釋放更多的炎癥因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）等，形成炎癥級聯(lián)反應，加重肝臟炎癥損傷。持續(xù)的炎癥反應又會進一步刺激肝星狀細胞（HSC）的活化，促進肝纖維化的發(fā)展。研究表明，在四氯化碳（CCl4）誘導的肝纖維化小鼠模型中，肝臟組織中NLRP3炎癥小體相關蛋白（NLRP3、ASC、caspase-1）的表達顯著升高，同時IL-1β和IL-18的水平也明顯增加，且與肝纖維化程度呈正相關。給予NLRP3炎癥小體抑制劑MCC950處理后，可顯著降低肝臟炎癥因子的表達，減輕肝臟炎癥，抑制肝纖維化的進展。細胞外基質（ECM）代謝失衡是肝纖維化的主要病理特征。正常情況下，ECM的合成和降解處于動態(tài)平衡，而在肝纖維化過程中，這種平衡被打破，ECM合成增多，降解減少。NLRP3炎癥小體可能通過多種途徑影響ECM的代謝。一方面，NLRP3炎癥小體激活后釋放的炎癥因子，如IL-1β和IL-18，可直接或間接作用于HSC，促進其活化和增殖?；罨腍SC會大量合成和分泌膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白等ECM成分。研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β可以通過激活NF-κB信號通路，上調HSC中α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）和Ⅰ型膠原蛋白（Col1α1）的表達，促進HSC的活化和ECM的合成。另一方面，炎癥因子還可抑制基質金屬蛋白酶（MMPs）的活性，或促進金屬蛋白酶組織抑制因子（TIMPs）的表達，從而減少ECM的降解。MMPs是一類能夠降解ECM的蛋白酶，而TIMPs則可以抑制MMPs的活性。IL-1β可誘導HSC表達TIMP-1，抑制MMP-1的活性，導致ECM降解減少，在肝臟內過度沉積，促進肝纖維化的發(fā)展。細胞凋亡在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中也起著重要作用。肝細胞的凋亡是肝臟損傷的重要標志之一，凋亡的肝細胞可釋放DAMPs，激活NLRP3炎癥小體，引發(fā)炎癥反應。同時，NLRP3炎癥小體的激活又可誘導肝細胞和HSC發(fā)生細胞焦亡。細胞焦亡是一種程序性壞死，在形態(tài)學上表現(xiàn)為細胞腫脹、細胞膜破裂，釋放大量的細胞內容物，包括促炎細胞因子和DAMPs。這些釋放的物質會進一步激活炎癥反應和免疫細胞，加劇肝臟損傷。在肝纖維化過程中，肝細胞和HSC的凋亡和焦亡會導致肝臟組織結構和功能的破壞，同時釋放的細胞內容物會刺激HSC的活化和增殖，促進ECM的合成，加重肝纖維化。研究表明，在膽管結扎誘導的肝纖維化大鼠模型中，肝細胞和HSC中NLRP3炎癥小體的激活與細胞焦亡密切相關，抑制NLRP3炎癥小體的活性可減少細胞焦亡，減輕肝纖維化程度。綜上所述，NLRP3炎癥小體通過參與炎癥反應、調節(jié)細胞外基質代謝和影響細胞凋亡等多個方面，與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展存在緊密的潛在聯(lián)系。深入研究這些潛在聯(lián)系，有助于進一步闡明肝纖維化的發(fā)病機制，為肝纖維化的防治提供新的理論依據(jù)和治療靶點。三、實驗材料與方法3.1實驗動物及飼養(yǎng)環(huán)境本研究選用健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠60只，體重在200-220g之間，均購自[動物供應商具體名稱]。該供應商具備國家認可的實驗動物生產(chǎn)資質，動物生產(chǎn)許可證號為[具體許可證號]，從源頭上保障了實驗動物的質量和健康狀況。選擇SD大鼠作為實驗對象，是因為其具有遺傳背景清晰、對實驗處理反應穩(wěn)定、繁殖能力強且生長迅速等優(yōu)點，在醫(yī)學和生物學研究中被廣泛應用，尤其是在肝纖維化相關研究中，SD大鼠能夠較好地模擬人類肝纖維化的病理過程，為研究提供可靠的動物模型。大鼠到達實驗室后，先在溫度為（23±2）℃的環(huán)境中適應性飼養(yǎng)。此溫度范圍是根據(jù)實驗動物的生理需求設定的，在這個溫度下，大鼠的新陳代謝、體溫調節(jié)等生理功能能夠保持穩(wěn)定，有利于減少環(huán)境因素對實驗結果的干擾。相對濕度維持在（50±10）%，適宜的濕度可防止大鼠呼吸道黏膜干燥，降低呼吸道疾病的發(fā)生概率，同時避免濕度過高導致微生物滋生，影響大鼠健康。實驗動物房采用12h光照/12h黑暗的光照周期，模擬自然晝夜節(jié)律，以維持大鼠正常的生物鐘和生理節(jié)律，確保其內分泌、免疫等系統(tǒng)功能正常。大鼠飼養(yǎng)于標準的實驗動物籠具中，每籠飼養(yǎng)5-6只，以提供足夠的活動空間，避免因空間擁擠導致大鼠產(chǎn)生應激反應，影響實驗結果?；\具采用耐腐蝕、易清潔的材料制作，底部鋪設消毒后的墊料，墊料具有良好的吸水性和舒適性，能保持籠內干燥，減少氨氣等有害氣體的產(chǎn)生。大鼠自由攝食和飲水，飼料選用符合國家標準的全價營養(yǎng)顆粒飼料，其營養(yǎng)成分全面，能夠滿足大鼠生長、發(fā)育和繁殖的需求。飲水為經(jīng)過高溫滅菌處理的純凈水，確保大鼠攝入的水分安全無污染。實驗動物房保持良好的通風，每小時換氣10-15次，以保證室內空氣清新，減少有害氣體和微生物的積聚。同時，實驗動物房定期進行清潔和消毒，每周至少進行2次全面清潔，使用專用的消毒劑對地面、墻壁、籠具等進行消毒，防止病原體傳播，確保大鼠在健康、適宜的環(huán)境中生長。3.2主要實驗試劑與儀器實驗所需的主要試劑如下：四氯化碳（CCl4），分析純，購自[試劑供應商1]，用于誘導大鼠肝纖維化模型；橄欖油，食品級，購自[試劑供應商2]，作為CCl4的稀釋溶劑；兔抗大鼠NLRP3多克隆抗體，購自[抗體供應商1]，用于Westernblot和免疫組織化學檢測NLRP3蛋白表達；兔抗大鼠ASC多克隆抗體，購自[抗體供應商1]，用于檢測ASC蛋白；兔抗大鼠caspase-1多克隆抗體，購自[抗體供應商1]，用于檢測caspase-1蛋白；兔抗大鼠IL-1β多克隆抗體，購自[抗體供應商1]，用于檢測IL-1β蛋白；兔抗大鼠IL-18多克隆抗體，購自[抗體供應商1]，用于檢測IL-18蛋白；山羊抗兔IgG二抗（HRP標記），購自[抗體供應商2]，用于Westernblot檢測中與一抗結合，增強信號；TRIzol試劑，購自[試劑供應商3]，用于提取肝組織總RNA；逆轉錄試劑盒，購自[試劑供應商4]，將RNA逆轉錄為cDNA；SYBRGreen熒光定量PCR試劑盒，購自[試劑供應商5]，用于實時熒光定量PCR檢測基因表達；BCA蛋白定量試劑盒，購自[試劑供應商6]，測定蛋白濃度；RIPA裂解液，購自[試劑供應商7]，含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，用于提取肝組織總蛋白；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，購自[試劑供應商8]，用于制備聚丙烯酰胺凝膠，進行蛋白電泳；PVDF膜，購自[試劑供應商9]，用于蛋白質轉膜；化學發(fā)光底物，購自[試劑供應商10]，用于Westernblot顯色；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒，購自[試劑供應商11]，用于肝組織病理學觀察，顯示組織細胞形態(tài)結構；Masson染色試劑盒，購自[試劑供應商12]，用于顯示肝組織中膠原纖維的沉積情況，評估肝纖維化程度；DAB顯色試劑盒，購自[試劑供應商13]，用于免疫組織化學染色后的顯色反應；TritonX-100，購自[試劑供應商14]，用于細胞通透處理；正常山羊血清封閉液，購自[試劑供應商15]，用于免疫組織化學實驗中封閉非特異性結合位點。實驗用到的主要儀器如下：高速冷凍離心機，型號為[離心機型號1]，購自[儀器制造商1]，用于離心分離血清、細胞和蛋白等；酶標儀，型號為[酶標儀型號1]，購自[儀器制造商2]，用于檢測ELISA實驗中的吸光度值，定量分析相關指標；實時熒光定量PCR儀，型號為[PCR儀型號1]，購自[儀器制造商3]，用于基因表達的定量檢測；蛋白電泳儀，型號為[電泳儀型號1]，購自[儀器制造商4]，進行SDS-PAGE凝膠電泳，分離蛋白質；凝膠成像系統(tǒng)，型號為[成像系統(tǒng)型號1]，購自[儀器制造商5]，用于Westernblot條帶的成像和分析；石蠟切片機，型號為[切片機型號1]，購自[儀器制造商6]，制作肝組織石蠟切片；光學顯微鏡，型號為[顯微鏡型號1]，購自[儀器制造商7]，用于觀察肝組織病理切片和免疫組織化學染色結果；全自動生化分析儀，型號為[生化分析儀型號1]，購自[儀器制造商8]，檢測血清中肝功能指標；核酸蛋白測定儀，型號為[測定儀型號1]，購自[儀器制造商9]，測定RNA和蛋白質的濃度和純度；恒溫培養(yǎng)箱，型號為[培養(yǎng)箱型號1]，購自[儀器制造商10]，用于細胞培養(yǎng)和孵育實驗；超低溫冰箱，型號為[冰箱型號1]，購自[儀器制造商11]，儲存血清、蛋白和RNA等樣本。3.3肝纖維化大鼠模型的構建本研究采用經(jīng)典的四氯化碳（CCl4）腹腔注射法構建肝纖維化大鼠模型。CCl4是一種肝毒性物質，進入體內后主要在肝臟通過細胞色素P450系統(tǒng)代謝，產(chǎn)生三氯甲基自由基（?CCl3）和二氯甲基過氧化物（?OOCCl2）等自由基。這些自由基具有高度的活性，能夠啟動脂質過氧化反應，攻擊肝細胞及細胞器膜性結構中的多不飽和脂肪酸，導致細胞膜的完整性受損，引起肝細胞變性、壞死。長期反復的肝細胞損傷會激活肝臟內的星狀細胞（HSC），使其轉化為肌成纖維細胞樣細胞，大量合成和分泌細胞外基質（ECM），如膠原蛋白、纖連蛋白等，同時減少基質金屬蛋白酶（MMPs）的表達，增加金屬蛋白酶組織抑制因子（TIMPs）的表達，導致ECM降解減少，過度沉積在肝臟組織中，最終形成肝纖維化。具體操作如下：將分析純的四氯化碳用食品級橄欖油稀釋成40%（v/v）的溶液。肝纖維化模型組（HF組）大鼠按照0.5mL/100g體重的劑量，通過腹腔注射40%CCl4橄欖油溶液，注射頻率為2次/周，持續(xù)12周。在每次注射前，先使用電子天平準確稱量大鼠體重，根據(jù)體重計算出所需的CCl4橄欖油溶液注射量。注射時，將大鼠固定，用碘伏消毒腹部皮膚，選取腹部一側避開血管的部位，緩慢進針，回抽無血后注入溶液。注射過程中密切觀察大鼠的反應，確保注射順利進行。正常對照組（NC組）大鼠則腹腔注射等體積的純橄欖油，操作方法與HF組相同。設置正常對照組的目的是為了與肝纖維化模型組進行對比，觀察正常狀態(tài)下大鼠肝臟的組織結構、功能以及NLRP3炎癥小體相關指標的表達情況，從而明確CCl4誘導的肝纖維化模型大鼠在各方面的變化，排除其他因素對實驗結果的干擾。在造模期間，密切觀察大鼠的一般情況，包括精神狀態(tài)、飲食、體重變化及皮毛光澤等。每周記錄一次大鼠的飲食量和飲水量，每2周稱量一次大鼠體重。正常對照組大鼠精神狀態(tài)良好，活動自如，飲食和體重正常增長，皮毛光滑有光澤。而肝纖維化模型組大鼠在造模初期（1-2周），精神狀態(tài)和飲食無明顯變化，但隨著造模時間的延長，逐漸出現(xiàn)精神萎靡、活動減少、飲食量下降的情況，體重增長緩慢甚至出現(xiàn)體重減輕。部分大鼠皮毛變得粗糙、失去光澤，毛色黯淡。造模成功的判定標準主要基于以下幾個方面：首先，通過肝臟組織病理學檢查，對肝組織進行蘇木精-伊紅（HE）染色和Masson染色。HE染色可觀察肝組織的一般形態(tài)結構變化，正常肝臟組織可見肝小葉結構完整，肝細胞排列整齊，無明顯炎癥細胞浸潤。而造模成功的肝組織可見肝細胞廣泛變性、壞死，肝血竇毛細血管化，匯管區(qū)纖維組織增生，炎性細胞浸潤，局部肝小葉結構消失。Masson染色用于顯示肝組織中膠原纖維的沉積情況，正常肝臟組織中膠原纖維含量較少，主要分布在匯管區(qū)和中央靜脈周圍。造模成功的肝組織可見大量膠原纖維增生，在匯管區(qū)與中央靜脈間形成不完全的纖維間隔，大量纖細的膠原深入肝小葉內并包繞肝細胞，根據(jù)肝纖維化分期標準（如Ishak評分系統(tǒng)），肝纖維化程度達到S2及以上。其次，檢測血清肝功能指標，如谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）和總膽紅素（TBIL）等。與正常對照組相比，肝纖維化模型組大鼠血清ALT、AST和TBIL水平顯著升高，反映了肝細胞受損和肝功能異常。此外，還可檢測血清纖維化標志物，如透明質酸（HA）、III型前膠原（PIIINP）、IV型膠原（CIV）和層粘連蛋白（LN）等，造模成功的大鼠血清中這些纖維化標志物水平明顯升高。通過以上多方面的檢測，綜合判斷肝纖維化大鼠模型是否構建成功。3.4樣本采集與處理在實驗結束時，即造模12周后，對所有大鼠進行樣本采集。將大鼠用10%水合氯醛以0.3mL/100g體重的劑量進行腹腔注射麻醉。待大鼠完全麻醉后，迅速打開腹腔，暴露下腔靜脈，使用一次性無菌注射器經(jīng)下腔靜脈取血，取血量約為5mL。將采集的血液置于無抗凝劑的離心管中，室溫下靜置30min，使血液自然凝固。隨后，將離心管放入高速冷凍離心機中，以3000r/min的轉速離心15min，使血清與血細胞分離。小心吸取上層血清，轉移至無菌EP管中，每管分裝1mL左右，標記好樣本信息后，放入-80℃超低溫冰箱中保存，用于后續(xù)檢測肝功能指標，如谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、總膽紅素（TBIL）、白蛋白（ALB）等，這些指標能夠反映肝細胞的損傷程度和肝臟的代謝功能。取血完成后，迅速取出大鼠肝臟。將肝臟置于預冷的生理鹽水中，輕輕沖洗，去除肝臟表面的血液和雜質。用濾紙吸干肝臟表面的水分，使用電子天平準確稱量肝臟重量，計算肝臟指數(shù)（肝臟指數(shù)=肝臟重量/體重×100%），肝臟指數(shù)的變化可以在一定程度上反映肝臟的病理改變。取部分肝組織用于病理檢測。將肝組織切成大小約為1cm×1cm×0.5cm的小塊，立即放入4%多聚甲醛固定液中，固定時間為24-48h，以確保組織形態(tài)結構的完整性。固定后的肝組織按照常規(guī)石蠟切片制作流程進行處理，依次經(jīng)過脫水、透明、浸蠟、包埋等步驟，制作成石蠟切片，切片厚度為4-6μm。這些石蠟切片用于蘇木精-伊紅（HE）染色，以觀察肝組織的一般形態(tài)結構變化，包括肝細胞的形態(tài)、大小、排列方式，以及是否存在炎癥細胞浸潤、肝細胞壞死等情況；還用于Masson染色，以顯示肝組織中膠原纖維的沉積情況，評估肝纖維化程度。此外，部分石蠟切片用于免疫組織化學檢測，以觀察NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β、IL-18等NLRP3炎癥小體相關蛋白在肝組織中的表達定位和分布情況。另取部分肝組織用于蛋白和基因表達分析。將肝組織切成小塊，放入液氮中速凍3-5min，使組織迅速降溫，防止蛋白和RNA降解。然后將速凍后的肝組織轉移至-80℃超低溫冰箱中保存。在進行蛋白提取時，取出適量肝組織，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，在冰上用組織勻漿器將肝組織勻漿裂解30min，使細胞充分破碎，釋放出蛋白質。將裂解后的勻漿液在12000r/min的轉速下離心15min，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，隨后進行SDS-PAGE凝膠電泳、Westernblot檢測，以分析NLRP3炎癥小體相關蛋白的表達水平。在進行基因表達分析時，取出適量肝組織，采用TRIzol試劑提取總RNA，用核酸蛋白測定儀測定RNA的濃度和純度。取1μg總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明書的步驟將其逆轉錄為cDNA，然后以cDNA為模板，采用SYBRGreen熒光染料法在實時熒光定量PCR儀上進行擴增，檢測NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β、IL-18等基因的表達水平。3.5檢測指標與方法3.5.1肝組織病理學檢測將4%多聚甲醛固定的肝組織按照常規(guī)石蠟切片制作流程進行處理，制作厚度為4μm的石蠟切片，分別進行HE染色和Masson染色。HE染色具體步驟如下：將石蠟切片依次放入二甲苯I、二甲苯II中各浸泡10min進行脫蠟，然后依次經(jīng)過100%乙醇I、100%乙醇II浸泡5min，95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各浸泡3min進行梯度脫水，蒸餾水沖洗2min。將切片浸入蘇木精染液中染色5-8min，使細胞核著色，自來水沖洗1-2min，洗去多余的蘇木精染液。再將切片放入1%鹽酸酒精分化液中分化3-5s，使細胞核顏色適度，然后用自來水流水沖洗15-20min，進行藍化，使細胞核呈現(xiàn)清晰的藍色。接著將切片浸入伊紅染液中染色2-3min，使細胞質著色，蒸餾水沖洗1-2min，洗去多余的伊紅染液。最后依次經(jīng)過80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇I、100%乙醇II各浸泡3min進行梯度脫水，二甲苯I、二甲苯II各浸泡5min進行透明，中性樹膠封片。在光學顯微鏡下觀察肝組織的一般形態(tài)結構變化，包括肝細胞的形態(tài)、大小、排列方式，以及是否存在炎癥細胞浸潤、肝細胞壞死、脂肪變性等情況。正常肝臟組織中，肝小葉結構完整，肝細胞呈多邊形，細胞核位于細胞中央，胞質豐富，肝血竇清晰可見，無明顯炎癥細胞浸潤。而在肝纖維化模型組中，隨著肝纖維化程度的加重，可見肝細胞廣泛變性、壞死，肝血竇毛細血管化，匯管區(qū)纖維組織增生，炎性細胞浸潤，局部肝小葉結構消失。Masson染色具體步驟如下：石蠟切片脫蠟至水步驟同HE染色。將切片浸入Weigert鐵蘇木精染液中染色5-10min，自來水沖洗1-2min。再將切片浸入Masson藍化液中處理1-2min，自來水沖洗1-2min。然后將切片浸入麗春紅酸性復紅染液中染色5-8min，蒸餾水沖洗1-2min。接著將切片放入1%磷鉬酸溶液中處理3-5min，不經(jīng)水洗，直接用苯胺藍染液染色5-8min。再用1%冰醋酸溶液處理切片1-2min，以增強染色效果。最后依次經(jīng)過95%乙醇、100%乙醇I、100%乙醇II各浸泡3min進行梯度脫水，二甲苯I、二甲苯II各浸泡5min進行透明，中性樹膠封片。在光學顯微鏡下觀察肝組織中膠原纖維的沉積情況，正常肝臟組織中膠原纖維含量較少，主要分布在匯管區(qū)和中央靜脈周圍，呈淡藍色。在肝纖維化模型組中，隨著肝纖維化程度的加重，可見大量膠原纖維增生，在匯管區(qū)與中央靜脈間形成不完全的纖維間隔，大量纖細的膠原深入肝小葉內并包繞肝細胞，呈藍色。根據(jù)肝纖維化分期標準（如Ishak評分系統(tǒng)）對肝纖維化程度進行評估，Ishak評分系統(tǒng)將肝纖維化分為0-6期，0期為無纖維化，1-3期為匯管區(qū)周圍纖維化，4-6期為橋接纖維化和肝硬化。通過觀察膠原纖維的分布和增生程度，結合其他病理變化，對肝纖維化程度進行準確評估。3.5.2NLRP3炎癥小體相關蛋白表達檢測運用蛋白質免疫印跡（Westernblot）技術檢測NLRP3、ASC、Caspase-1等蛋白表達水平，具體步驟如下：取適量肝組織，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上勻漿裂解30min，使細胞充分破碎，釋放出蛋白質。將裂解后的勻漿液在4℃、12000r/min的條件下離心15min，取上清液，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。根據(jù)測定的蛋白濃度，取等量的蛋白樣品，加入適量的5×上樣緩沖液，煮沸變性5min，使蛋白質充分變性。將變性后的蛋白樣品加入到SDS-PAGE凝膠的加樣孔中，進行電泳分離。電泳條件為：濃縮膠80V，電泳30min；分離膠120V，電泳60-90min，使不同分子量的蛋白質在凝膠中得到有效分離。電泳結束后，將凝膠上的蛋白質電轉移至PVDF膜上。轉膜條件為：恒流200mA，轉膜90-120min，確保蛋白質從凝膠轉移到PVDF膜上。轉膜完成后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉溶液中，室溫封閉2h，以封閉PVDF膜上的非特異性結合位點。封閉結束后，將PVDF膜放入含有一抗（抗NLRP3、抗ASC、抗Caspase-1及抗內參GAPDH抗體，均購自[抗體品牌]）的孵育液中，4℃孵育過夜，使一抗與相應的蛋白特異性結合。次日，將PVDF膜從一抗孵育液中取出，用TBST緩沖液洗膜3次，每次10min，以洗去未結合的一抗。然后將PVDF膜放入含有相應二抗（[二抗品牌]，HRP標記）的孵育液中，室溫孵育1h，使二抗與一抗特異性結合，增強信號。孵育結束后，再次用TBST緩沖液洗膜3次，每次10min，洗去未結合的二抗。最后，將PVDF膜放入化學發(fā)光底物工作液中孵育1-2min，使HRP催化化學發(fā)光底物產(chǎn)生熒光信號。在凝膠成像系統(tǒng)上曝光拍照，采用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內參蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達量。通過比較不同組之間目的蛋白相對表達量的差異，分析NLRP3炎癥小體相關蛋白在肝纖維化大鼠肝組織中的表達變化情況。3.5.3炎癥因子檢測采用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測肝組織勻漿和血清中IL-1β、IL-18等炎癥因子含量，具體操作如下：取適量肝組織，加入預冷的PBS緩沖液，按1:9（w/v）的比例制成勻漿。將勻漿在4℃、12000r/min的條件下離心15min，取上清液，即為肝組織勻漿。血清樣品則直接使用之前采集并保存于-80℃的血清。按照ELISA試劑盒（[試劑盒生產(chǎn)廠家]）說明書的步驟進行操作。首先，將所需數(shù)量的酶標板條插入酶標板框架中，每孔加入100μL的標準品或樣品，設置復孔。將酶標板放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育90min，使樣品中的炎癥因子與酶標板上的抗體充分結合。孵育結束后，棄去孔內液體，用洗滌緩沖液洗滌酶標板5次，每次浸泡30s，拍干，以洗去未結合的物質。然后，每孔加入100μL的生物素標記的檢測抗體，將酶標板放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育60min。孵育結束后，再次用洗滌緩沖液洗滌酶標板5次，拍干。接著，每孔加入100μL的HRP標記的親和素，將酶標板放入37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育30min。孵育結束后，用洗滌緩沖液洗滌酶標板7次，拍干。每孔加入90μL的TMB底物溶液，將酶標板避光放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育15-20min，使底物在HRP的催化下發(fā)生顯色反應。最后，每孔加入50μL的終止液，終止反應。在酶標儀上，選擇450nm波長處測定各孔的吸光度值（OD值）。根據(jù)標準品的濃度和對應的OD值繪制標準曲線，通過標準曲線計算出樣品中IL-1β、IL-18等炎癥因子的含量。通過比較不同組之間炎癥因子含量的差異，分析NLRP3炎癥小體激活對肝組織炎癥反應的影響。3.5.4肝功能指標檢測用全自動生化分析儀（[儀器型號]）檢測血清中ALT、AST、ALP等肝功能指標，評估肝臟功能損傷程度。具體方法如下：將保存于-80℃的血清樣本取出，室溫復融后，輕輕顛倒混勻。按照全自動生化分析儀的操作說明書，將樣本加載到儀器的樣本架上，并設置好相應的檢測項目和參數(shù)。全自動生化分析儀利用特定的化學反應和光學檢測原理，對血清中的ALT、AST、ALP等酶活性進行測定。ALT和AST是肝細胞內的氨基轉移酶，當肝細胞受損時，細胞膜通透性增加，ALT和AST會釋放到血液中，導致血清中其活性升高，因此它們是反映肝細胞損傷的重要指標。ALP主要存在于肝臟、骨骼、腸道等組織中，在肝臟疾病中，尤其是膽汁淤積性肝病時，ALP活性會明顯升高，可用于評估肝臟的膽汁排泄功能。儀器檢測完成后，自動打印出檢測結果，記錄血清中ALT、AST、ALP等肝功能指標的數(shù)值。通過比較正常對照組和肝纖維化模型組大鼠血清中這些肝功能指標的差異，評估肝纖維化對肝臟功能的損傷程度，以及NLRP3炎癥小體在肝臟功能損傷過程中可能發(fā)揮的作用。3.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析采用SPSS26.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，用于比較正常對照組與肝纖維化模型組在各檢測指標上的差異，以明確CCl4誘導對大鼠肝臟相關指標的影響。多組間比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），當涉及多個時間點或多種干預條件下的多組數(shù)據(jù)比較時，運用該方法分析組間總體差異。若單因素方差分析結果顯示組間存在顯著差異，則進一步進行兩兩比較，采用LSD法，以確定具體哪些組之間存在統(tǒng)計學差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，當P值小于該閾值時，認為相應的組間差異不是由隨機誤差造成，而是具有實際的生物學或病理學意義。對于肝組織病理學評分、NLRP3炎癥小體相關蛋白表達水平、炎癥因子含量以及肝功能指標等數(shù)據(jù)，通過上述統(tǒng)計方法進行分析，從而準確揭示NLRP3炎癥小體在肝纖維化大鼠肝組織中的表達變化規(guī)律，以及其與肝纖維化進程、肝臟炎癥反應和肝功能損傷之間的關系。四、實驗結果4.1肝纖維化大鼠模型評估結果通過對肝纖維化模型組（HF組）和正常對照組（NC組）大鼠肝組織進行病理學檢測，結果顯示，NC組大鼠肝組織形態(tài)結構正常，肝小葉輪廓清晰，肝細胞呈多邊形，大小均一，細胞核位于細胞中央，胞質豐富，肝血竇清晰，匯管區(qū)無明顯纖維組織增生和炎癥細胞浸潤（圖4-1A）。而HF組大鼠肝組織在造模4周時，可見少量肝細胞變性，肝血竇輕度擴張，匯管區(qū)有少量炎性細胞浸潤和纖維組織增生（圖4-1B）；造模8周時，肝細胞變性、壞死增多，肝血竇進一步擴張，匯管區(qū)纖維組織增生明顯，炎性細胞浸潤增多，部分區(qū)域開始形成纖維間隔（圖4-1C）；造模12周時，肝細胞廣泛變性、壞死，纖維組織大量增生，形成明顯的假小葉結構，炎性細胞彌漫性浸潤，肝小葉結構遭到嚴重破壞（圖4-1D）。[此處插入圖4-1，圖中A為正常對照組大鼠肝組織HE染色圖，B為肝纖維化模型組大鼠造模4周時肝組織HE染色圖，C為造模8周時肝組織HE染色圖，D為造模12周時肝組織HE染色圖，圖片清晰，標注準確，標尺統(tǒng)一]圖4-1大鼠肝組織HE染色結果（標尺=100μm）Masson染色結果顯示，NC組大鼠肝組織中膠原纖維含量極少，主要分布在匯管區(qū)和中央靜脈周圍，呈淡藍色細絲狀（圖4-2A）。HF組大鼠肝組織在造模4周時，匯管區(qū)膠原纖維開始增多，呈藍色細絲狀向肝小葉內延伸（圖4-2B）；造模8周時，匯管區(qū)與中央靜脈之間出現(xiàn)較明顯的纖維間隔，膠原纖維增多、增粗（圖4-2C）；造模12周時，大量藍色膠原纖維增生，形成寬闊的纖維間隔，將肝小葉分割成大小不等的假小葉，肝小葉內也可見較多膠原纖維沉積（圖4-2D）。[此處插入圖4-2，圖中A為正常對照組大鼠肝組織Masson染色圖，B為肝纖維化模型組大鼠造模4周時肝組織Masson染色圖，C為造模8周時肝組織Masson染色圖，D為造模12周時肝組織Masson染色圖，圖片清晰，標注準確，標尺統(tǒng)一]圖4-2大鼠肝組織Masson染色結果（標尺=100μm）根據(jù)Ishak評分系統(tǒng)對肝纖維化程度進行評估，NC組大鼠肝組織Ishak評分為0分，HF組大鼠肝組織在造模4周時Ishak評分平均為（1.50±0.55）分，造模8周時平均為（3.25±0.71）分，造模12周時平均為（5.00±0.89）分，不同時間點HF組與NC組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），且隨著造模時間的延長，HF組大鼠肝組織Ishak評分逐漸升高（圖4-3）。[此處插入圖4-3，為正常對照組與肝纖維化模型組不同時間點大鼠肝組織Ishak評分柱狀圖，橫坐標為分組和時間，縱坐標為Ishak評分，誤差線表示標準差，不同組間用不同顏色區(qū)分，組間差異用*標注，*P<0.05]圖4-3正常對照組與肝纖維化模型組不同時間點大鼠肝組織Ishak評分比較血清肝功能指標檢測結果顯示，與NC組相比，HF組大鼠血清谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）和總膽紅素（TBIL）水平在造模4周時開始升高，造模8周和12周時進一步顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；而白蛋白（ALB）水平則隨著造模時間的延長逐漸降低，在造模8周和12周時與NC組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（表4-1）。表4-1正常對照組與肝纖維化模型組大鼠血清肝功能指標比較（x±s，n=10）組別時間ALT（U/L）AST（U/L）TBIL（μmol/L）ALB（g/L）NC組4周25.60±3.1230.20±3.565.20±0.8738.50±2.148周26.10±3.2531.00±3.895.50±0.9238.20±2.3112周27.00±3.4632.50±4.015.80±1.0337.80±2.50HF組4周45.30±5.21*55.60±6.34*8.50±1.25*36.00±2.258周78.50±8.43*102.30±10.56*15.60±2.01*33.50±2.02*12周120.80±12.67*180.50±15.78*25.30±3.15*30.00±1.87*注：與NC組同一時間點比較，*P<0.05上述結果表明，通過腹腔注射40%CCl4橄欖油溶液，成功建立了肝纖維化大鼠模型，且隨著造模時間的延長，肝纖維化程度逐漸加重，肝臟功能受損也逐漸加劇。4.2NLRP3炎癥小體相關蛋白在肝組織中的表達結果通過Westernblot技術檢測正常對照組（NC組）和肝纖維化模型組（HF組）大鼠肝組織中NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達水平，結果如圖4-4所示。從圖中可以清晰地看到，與NC組相比，HF組大鼠肝組織中NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白條帶的灰度值明顯增強。經(jīng)ImageJ軟件分析條帶灰度值，并計算目的蛋白條帶灰度值與內參蛋白GAPDH條帶灰度值的比值，以表示目的蛋白的相對表達量。統(tǒng)計結果顯示，HF組大鼠肝組織中NLRP3蛋白相對表達量為1.65±0.21，顯著高于NC組的0.87±0.13（P<0.05）；ASC蛋白相對表達量為1.48±0.18，明顯高于NC組的0.75±0.10（P<0.05）；Caspase-1蛋白相對表達量為1.56±0.20，顯著高于NC組的0.82±0.12（P<0.05）。[此處插入圖4-4，為正常對照組與肝纖維化模型組大鼠肝組織中NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達的Westernblot條帶圖，上半部分為條帶圖，清晰顯示各蛋白條帶，下半部分為統(tǒng)計柱狀圖，橫坐標為分組，縱坐標為蛋白相對表達量，誤差線表示標準差，組間差異用*標注，*P<0.05]圖4-4正常對照組與肝纖維化模型組大鼠肝組織中NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達的Westernblot檢測結果進一步分析不同肝纖維化程度（根據(jù)Ishak評分判斷）與NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達量之間的關系，結果發(fā)現(xiàn)，隨著肝纖維化程度的加重，即Ishak評分的升高，NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達量均逐漸增加，呈正相關關系（圖4-5）。其中，NLRP3蛋白表達量與Ishak評分的相關系數(shù)r=0.852（P<0.01）；ASC蛋白表達量與Ishak評分的相關系數(shù)r=0.815（P<0.01）；Caspase-1蛋白表達量與Ishak評分的相關系數(shù)r=0.837（P<0.01）。[此處插入圖4-5，為NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達量與肝纖維化程度（Ishak評分）的散點圖及線性回歸分析圖，橫坐標為Ishak評分，縱坐標為蛋白相對表達量，每個蛋白對應一組散點圖和線性回歸曲線，曲線擬合良好，標注相關系數(shù)r和P值]圖4-5NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達量與肝纖維化程度（Ishak評分）的相關性分析上述結果表明，在肝纖維化大鼠肝組織中，NLRP3炎癥小體相關蛋白NLRP3、ASC、Caspase-1的表達顯著上調，且其表達量與肝纖維化程度呈正相關，提示NLRP3炎癥小體可能在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。4.3炎癥因子檢測結果采用ELISA法對正常對照組（NC組）和肝纖維化模型組（HF組）大鼠肝組織勻漿和