CD36單核苷酸多態(tài)性：解開老年動脈粥樣硬化性腦梗死遺傳密碼的鑰匙一、引言1.1研究背景與意義隨著全球人口老齡化進程的加速，老年人群的健康問題日益受到關(guān)注。老年動脈粥樣硬化性腦梗死作為一種常見的腦血管疾病，嚴重威脅著老年人的生命健康和生活質(zhì)量。腦梗死是目前導致人類死亡的三大疾病之一，全球每年死于腦梗死者約為460萬，生存的腦梗死患者中約50％-70％遺留有嚴重的殘疾，給社會和家庭帶來沉重的負擔。動脈粥樣硬化被認為是老年動脈粥樣硬化性腦梗死的主要病理基礎。在動脈粥樣硬化的形成過程中，多種因素相互作用，導致血管壁的病變和血栓的形成，最終阻塞腦血管，引發(fā)腦梗死。傳統(tǒng)的危險因素如高血壓、高血脂、糖尿病、肥胖等已被廣泛研究和認識，但這些因素并不能完全解釋腦梗死的發(fā)病機制和個體差異。越來越多的研究表明，遺傳因素在腦梗死的發(fā)病中起著重要作用，約40％-60％的腦梗死風險與遺傳因素相關(guān)。CD36作為一種廣泛存在于血小板、單核-巨噬細胞和微血管內(nèi)皮細胞等多種細胞表面的B族清道夫受體，近年來被發(fā)現(xiàn)與動脈粥樣硬化、2型糖尿病、血脂代謝紊亂等腦梗死危險因素關(guān)系密切。據(jù)一項全基因組相關(guān)性研究（GWAS）的結(jié)果表明，15個CD36SNPs能夠增加腦卒中的患病風險。CD36基因定位于7號染色體q11.2，至少含有15個外顯子，具有多個基因多態(tài)性位點，其中多數(shù)為單核苷酸多態(tài)性（SNPs）。CD36屬于單鏈跨膜糖蛋白，由細胞外區(qū)、細胞質(zhì)區(qū)和跨膜區(qū)3個部分組成。在細胞外區(qū)，存在多個CD36配體結(jié)合位點，不同配體與CD36相結(jié)合后參與多種細胞病理生理過程。例如，CD36第93-110位和第155-185位氨基酸是凝血酶敏感蛋白1（TSP-1）結(jié)合位點，而氧化低密度脂蛋白（oxLDL）結(jié)合位點則位于第28-93位和第155-183位氨基酸區(qū)域。CD36與不同配體結(jié)合后，可以激活多種信號傳導通路，包括絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族、核因子κB（NF-κB）及活性氧簇（ROS）等。對CD36單核苷酸多態(tài)性與老年動脈粥樣硬化性腦梗死相關(guān)性的研究具有重要的理論和實際意義。從理論層面來看，有助于深入揭示老年動脈粥樣硬化性腦梗死的發(fā)病機制，進一步完善對該疾病遺傳因素的認識，為腦血管疾病的病理生理學研究提供新的視角和理論依據(jù)。在實際應用方面，一方面，通過檢測CD36單核苷酸多態(tài)性，有望開發(fā)出更精準的腦梗死遺傳風險評估模型，實現(xiàn)對高危人群的早期篩查和預警，從而采取更有針對性的預防措施，降低腦梗死的發(fā)病風險；另一方面，為腦梗死的個性化治療提供潛在的靶點和新思路，根據(jù)患者的基因特征制定更合理的治療方案，提高治療效果和患者的生活質(zhì)量，減輕社會和家庭的經(jīng)濟負擔。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀近年來，CD36單核苷酸多態(tài)性與老年動脈粥樣硬化性腦梗死的相關(guān)性研究逐漸成為醫(yī)學領(lǐng)域的熱點，國內(nèi)外學者從不同角度展開了深入探究，取得了一系列成果。國外在該領(lǐng)域的研究起步相對較早，且多聚焦于CD36基因多態(tài)性與心血管疾病風險的關(guān)聯(lián)分析。有學者通過對大規(guī)模人群的隊列研究，發(fā)現(xiàn)特定的CD36單核苷酸多態(tài)性位點與動脈粥樣硬化進程中脂質(zhì)代謝異常緊密相關(guān)。例如，在對歐美人群的研究中發(fā)現(xiàn)，某些CD36SNPs改變了CD36蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，導致其對氧化低密度脂蛋白（oxLDL）的攝取和代謝出現(xiàn)異常，進而加速了動脈粥樣硬化斑塊的形成，增加了腦梗死的發(fā)病風險。此外，部分國外研究還從細胞和分子機制層面揭示了CD36多態(tài)性影響腦梗死發(fā)生的潛在途徑，指出CD36與配體結(jié)合后激活的信號通路在炎癥反應、血栓形成等病理過程中的關(guān)鍵作用。國內(nèi)的相關(guān)研究則更側(cè)重于結(jié)合中國人群的遺傳背景和生活環(huán)境特點，探索CD36單核苷酸多態(tài)性與老年動脈粥樣硬化性腦梗死的關(guān)系。山東大學臧靜等人選取75歲以上動脈粥樣硬化性腦梗死（ACI）患者121例作為病例組，對照組選取無腦梗死病史體檢者217例，采用PCR-LDR技術(shù)檢測CD36rs1761667、rs9784998兩個位點基因型，ELISA法測定血栓素B2。結(jié)果表明，病例組rs9784998基因型、等位基因頻率與對照組相比無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）；rs1761667AG基因型頻率分布在兩組間具有統(tǒng)計學差異（x2=7.03，P＜0.01），Logistic多因素分析和逐步回歸分析顯示，與其他兩種基因型相比，AG基因型均能增加腦梗死的患病風險（P＜0.05）；病例組血栓素B2水平較對照組明顯升高（P＜0.01），但AG基因型人群中血栓素B2水平兩組間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。由此得出結(jié)論，CD36rs9784998單核苷酸多態(tài)性與動脈粥樣硬化性腦梗死無統(tǒng)計學相關(guān)，rs1761667單核苷酸多態(tài)性是老年動脈粥樣硬化性腦梗死的遺傳危險因素，CD36基因多態(tài)性與血栓素B2無統(tǒng)計學相關(guān)。盡管國內(nèi)外在CD36單核苷酸多態(tài)性與老年動脈粥樣硬化性腦梗死相關(guān)性研究方面已取得一定進展，但仍存在一些不足。一方面，不同研究之間的結(jié)果存在一定差異，這可能與研究對象的種族、地域、樣本量大小以及研究方法的不同有關(guān)。目前大多數(shù)研究的樣本量相對較小，限制了研究結(jié)果的普遍性和可靠性，難以全面準確地揭示CD36多態(tài)性與腦梗死之間的復雜關(guān)系。另一方面，對于CD36單核苷酸多態(tài)性影響腦梗死發(fā)病的具體分子機制尚未完全明確，雖然已發(fā)現(xiàn)CD36參與多種信號通路，但各通路之間的交互作用以及在不同遺傳背景和環(huán)境因素下的調(diào)控機制仍有待進一步深入研究。此外，現(xiàn)有的研究多集中在少數(shù)幾個常見的CD36單核苷酸多態(tài)性位點，對于其他潛在的功能性位點以及它們之間的聯(lián)合作用研究較少，這也在一定程度上限制了對該領(lǐng)域的全面認識。1.3研究目的與創(chuàng)新點本研究旨在深入剖析CD36單核苷酸多態(tài)性與老年動脈粥樣硬化性腦梗死之間的內(nèi)在聯(lián)系，全面系統(tǒng)地探究CD36基因多態(tài)性在老年動脈粥樣硬化性腦梗死發(fā)病過程中的作用機制，具體研究目的如下：明確基因多態(tài)性分布特征：精確測定CD36基因在老年人群中的單核苷酸多態(tài)性位點及相應的基因型和等位基因頻率分布情況，通過對不同人群的對比分析，深入了解其分布規(guī)律及差異，為后續(xù)研究提供基礎數(shù)據(jù)支持。揭示相關(guān)性及影響因素：運用科學嚴謹?shù)牟±?對照研究方法，結(jié)合先進的基因檢測技術(shù)和全面的臨床數(shù)據(jù)分析，深入探討CD36單核苷酸多態(tài)性與老年動脈粥樣硬化性腦梗死之間的相關(guān)性，并綜合考慮其他傳統(tǒng)危險因素，明確CD36基因多態(tài)性在腦梗死發(fā)病中的獨立影響因素及作用強度。闡釋作用機制：從分子生物學、細胞生物學等多層面深入研究CD36單核苷酸多態(tài)性影響老年動脈粥樣硬化性腦梗死發(fā)病的潛在機制，包括對脂質(zhì)代謝、炎癥反應、血栓形成等關(guān)鍵病理生理過程的調(diào)控作用，為疾病的預防和治療提供理論依據(jù)。本研究的創(chuàng)新點主要體現(xiàn)在以下幾個方面：研究角度創(chuàng)新：目前關(guān)于CD36單核苷酸多態(tài)性與老年動脈粥樣硬化性腦梗死的研究多集中在單一或少數(shù)幾個方面，本研究將從多個角度進行綜合分析，不僅關(guān)注基因多態(tài)性與疾病的直接關(guān)聯(lián)，還深入探討其對相關(guān)危險因素和發(fā)病機制的影響，為該領(lǐng)域的研究提供更全面、深入的視角。研究方法創(chuàng)新：采用多種先進的研究技術(shù)和方法，如高通量基因測序技術(shù)全面檢測CD36基因的多個單核苷酸多態(tài)性位點，避免因研究位點單一而導致的結(jié)果偏差；結(jié)合生物信息學分析方法，深入挖掘基因多態(tài)性與疾病相關(guān)的潛在信息，進一步明確CD36基因在腦梗死發(fā)病中的作用機制。研究對象創(chuàng)新：聚焦于老年人群，充分考慮老年群體在生理機能、基礎疾病以及遺傳背景等方面的特殊性，相較于以往研究，更具針對性和實際應用價值，研究結(jié)果能夠為老年動脈粥樣硬化性腦梗死的精準防治提供更有針對性的依據(jù)。二、相關(guān)理論基礎2.1老年動脈粥樣硬化性腦梗死概述2.1.1定義與分類老年動脈粥樣硬化性腦梗死是指在腦動脈粥樣硬化等血管病變的基礎上，由于血栓形成、血管狹窄或堵塞等原因，導致腦組織局部血液供應障礙，進而發(fā)生缺血、缺氧性壞死的一種急性腦血管疾病。它是老年人群中常見的腦血管意外類型，嚴重影響老年人的生命健康和生活質(zhì)量。根據(jù)病因和病理生理機制，老年動脈粥樣硬化性腦梗死主要分為以下幾種類型：大動脈粥樣硬化型：此型最為常見，主要是由于頸動脈、大腦中動脈等大動脈粥樣硬化，血管壁增厚、變硬，形成粥樣斑塊。當斑塊破裂或血栓形成時，可導致血管狹窄或完全閉塞，引起相應供血區(qū)域的腦組織梗死。例如，頸動脈粥樣硬化斑塊脫落，隨血流進入顱內(nèi)血管，可堵塞大腦中動脈，引發(fā)大面積腦梗死，患者常出現(xiàn)偏癱、失語、意識障礙等嚴重癥狀。小動脈閉塞型：多由腦內(nèi)小動脈硬化、玻璃樣變等引起，病變主要累及直徑較小的穿支動脈。這些小動脈發(fā)生病變后，可形成微小梗死灶，一般直徑小于15mm?；颊甙Y狀相對較輕，可能表現(xiàn)為純運動性輕偏癱、純感覺性卒中、共濟失調(diào)性輕偏癱等，部分患者可無明顯癥狀，僅在影像學檢查時被發(fā)現(xiàn)。心源性栓塞型：老年患者常伴有心臟疾病，如心房顫動、心肌梗死、心臟瓣膜病等，這些疾病可導致心臟內(nèi)形成血栓。血栓脫落進入血液循環(huán)后，可隨血流進入腦動脈，造成腦栓塞。心源性腦栓塞起病急驟，癥狀在數(shù)秒至數(shù)分鐘內(nèi)達到高峰，可出現(xiàn)偏癱、失語、抽搐等局灶性神經(jīng)功能缺損癥狀，且容易復發(fā)。其他明確病因型：包括由動脈夾層、血管炎、血液系統(tǒng)疾?。ㄈ缂t細胞增多癥、血小板增多癥等導致血液高凝狀態(tài)）等明確病因引起的腦梗死。雖然這類腦梗死在老年動脈粥樣硬化性腦梗死中所占比例相對較小，但在診斷和治療時需要準確識別病因，采取針對性的治療措施。不明原因型：部分老年腦梗死患者經(jīng)過詳細檢查，仍無法明確其確切病因，可能是多種因素共同作用的結(jié)果，或者存在尚未被發(fā)現(xiàn)的病因。2.1.2發(fā)病機制老年動脈粥樣硬化性腦梗死的發(fā)病機制是一個復雜的、多因素參與的病理過程，主要涉及血管病變、血液成分改變和血流動力學異常等方面。血管病變：動脈粥樣硬化是老年動脈粥樣硬化性腦梗死的主要血管病變基礎。長期的高血壓、高血脂、高血糖、吸煙等危險因素作用下，血管內(nèi)皮細胞受損，血液中的脂質(zhì)成分，如低密度脂蛋白（LDL）等，容易沉積在血管內(nèi)膜下。這些脂質(zhì)被氧化修飾后，形成氧化低密度脂蛋白（oxLDL），吸引單核細胞和低密度脂蛋白進入血管內(nèi)膜下。單核細胞吞噬oxLDL后轉(zhuǎn)化為泡沫細胞，泡沫細胞逐漸聚集形成早期的動脈粥樣硬化斑塊。隨著病情進展，斑塊不斷增大，纖維帽逐漸變薄，不穩(wěn)定斑塊容易破裂，暴露的膠原纖維和組織因子等可激活血小板和凝血系統(tǒng)，導致血栓形成，堵塞血管。血液成分改變：血液成分的異常改變在老年動脈粥樣硬化性腦梗死的發(fā)病中也起著重要作用。一方面，血小板功能異常活化，在血管病變部位容易黏附、聚集，形成血小板血栓。例如，在動脈粥樣硬化斑塊破裂處，血小板迅速黏附在暴露的內(nèi)皮下膠原纖維上，通過釋放多種生物活性物質(zhì)，如血栓素A2（TXA2）、二磷酸腺苷（ADP）等，進一步促進血小板的聚集和血栓形成。另一方面，凝血系統(tǒng)和纖溶系統(tǒng)失衡，導致血液處于高凝狀態(tài)。當血管內(nèi)皮損傷時，內(nèi)源性和外源性凝血途徑被激活，凝血因子大量消耗，而纖溶系統(tǒng)活性相對不足，使得血栓形成的傾向增加，容易導致腦梗死的發(fā)生。血流動力學異常：隨著年齡的增長，老年人血管彈性減退，血管壁順應性降低，血壓波動較大。高血壓可使血管壁承受的壓力增加，進一步損傷血管內(nèi)皮細胞，加速動脈粥樣硬化的發(fā)展。同時，高血壓還可導致小動脈硬化、玻璃樣變，使血管管腔狹窄，血流阻力增加，局部腦組織血流灌注不足。此外，心臟功能減退、心律失常等心臟疾病可影響心臟的泵血功能，導致心輸出量減少，腦部血流灌注不足，在存在血管病變的基礎上，容易引發(fā)腦梗死。在上述多種因素的相互作用下，腦血管逐漸發(fā)生狹窄、堵塞，腦組織缺血、缺氧，導致神經(jīng)細胞損傷、凋亡，最終引發(fā)老年動脈粥樣硬化性腦梗死。2.1.3流行病學特征老年動脈粥樣硬化性腦梗死具有較高的發(fā)病率、死亡率和致殘率，給全球公共衛(wèi)生帶來了沉重負擔。從全球范圍來看，腦梗死是導致成年人死亡和殘疾的主要原因之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球每年約有1500萬人發(fā)生腦梗死，其中約500萬人死亡。隨著全球人口老齡化進程的加速，老年動脈粥樣硬化性腦梗死的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。在我國，老年動脈粥樣硬化性腦梗死同樣是嚴重威脅老年人健康的重要疾病。根據(jù)流行病學調(diào)查，我國腦梗死的發(fā)病率約為每年每10萬人中有約200人發(fā)病，且城市地區(qū)高于農(nóng)村地區(qū)。這可能與城市居民生活節(jié)奏快、壓力大、不良生活習慣（如吸煙、過量飲酒、缺乏運動等）較多以及飲食結(jié)構(gòu)不合理（高鹽、高脂、高糖飲食）等因素有關(guān)。在地區(qū)差異方面，我國北方地區(qū)腦梗死的發(fā)病率高于南方地區(qū)，這可能與北方地區(qū)氣溫較低，居民更傾向于室內(nèi)活動，且飲食偏咸，導致高血壓等危險因素控制不佳有關(guān)。從年齡分布來看，老年動脈粥樣硬化性腦梗死主要發(fā)生在65歲以上的老年人群中，隨著年齡的增長，發(fā)病率顯著增加。據(jù)統(tǒng)計，約70%的腦梗死患者年齡在65歲以上。然而，近年來由于生活方式的改變和壓力增大，青年群體中腦梗死的發(fā)病率也有所增加，30-50歲年齡段的患者比例呈上升趨勢，這一現(xiàn)象應引起足夠的重視。在性別差異方面，總體上男性患者略多于女性，但女性在絕經(jīng)后，由于雌激素水平下降，血管內(nèi)皮保護作用減弱，腦梗死的發(fā)病率明顯增加，與男性的發(fā)病風險逐漸接近。老年動脈粥樣硬化性腦梗死不僅具有較高的發(fā)病率，其死亡率和致殘率也不容忽視。存活的患者中約50％-70％遺留有嚴重的殘疾，如偏癱、失語、認知障礙等，給患者家庭和社會帶來了沉重的經(jīng)濟負擔和精神壓力。2.2單核苷酸多態(tài)性理論2.2.1SNP的概念與特點單核苷酸多態(tài)性（SingleNucleotidePolymorphism，SNP）是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異而形成的DNA序列多態(tài)性，是繼短串聯(lián)重復序列（STR）、數(shù)目可變串聯(lián)重復序列（VNTR）為代表的第2代DNA遺傳標記基礎上發(fā)展起來的第3代遺傳標記。它是人類可遺傳的變異中最常見的一種，占所有已知多態(tài)性的90%以上。SNP具有以下顯著特點：分布廣泛：在人類基因組中廣泛存在，平均每500至1000個堿基對中就有1個，估計其總數(shù)可達300萬個甚至更多。無論是在基因的編碼區(qū)、非編碼區(qū)還是基因間序列，都可能出現(xiàn)SNP。例如，在某些與代謝相關(guān)的基因中，SNP的分布頻率較高，這可能與個體對不同營養(yǎng)物質(zhì)的代謝能力差異有關(guān)。數(shù)量眾多：數(shù)目巨大，是人類基因組中最基本、最常見、最廣泛的多態(tài)性，已經(jīng)鑒定的SNP數(shù)量眾多。大量的SNP為研究人類遺傳多樣性、疾病易感性以及藥物反應差異等提供了豐富的遺傳標記資源。不同種族、不同人群之間的SNP頻率存在差異，這些差異可能與疾病的發(fā)生風險和治療效果的差異相關(guān)。遺傳穩(wěn)定性高：與微衛(wèi)星等重復序列多態(tài)性標記相比，SNP具有更高的遺傳穩(wěn)定性。在遺傳過程中，SNP的突變率相對較低，能夠較為穩(wěn)定地傳遞給后代，這使得基于SNP的遺傳分析結(jié)果更加可靠。在家族遺傳研究中，通過追蹤特定SNP的遺傳傳遞，可以了解某些遺傳性狀或疾病在家族中的遺傳規(guī)律。二等位基因性：通常所說的SNP都是二等位多態(tài)性的，即在人群中只有兩種等位型。這種特性使得在檢測時只需一個“+-”或“全無”的方式，而無須像檢測限制性片段長度多態(tài)性、微衛(wèi)星那樣對片段的長度作出測量，這使得基于SNP的檢測分析方法易實現(xiàn)自動化，有利于大規(guī)模的基因分型研究。例如，在基因芯片技術(shù)中，可以同時對上千個SNP位點進行分型檢測，大大提高了檢測效率和準確性。SNP的單個核苷酸變異主要由單個堿基的轉(zhuǎn)換（C←→T，在其互補鏈上則為G←→A）或顛換（C←→A，G←→T，C←→G，A←→T）所致，其中轉(zhuǎn)換的發(fā)生率約占2/3，明顯高于其它幾種變異。從對生物遺傳性狀的影響來看，位于編碼區(qū)內(nèi)的SNP（codingSNP，cSNP）又可分為同義cSNP和非同義cSNP。同義cSNP所致的編碼序列改變并不影響其所翻譯的蛋白質(zhì)的氨基酸序列；而非同義cSNP的堿基序列改變可使翻譯的蛋白質(zhì)序列發(fā)生改變，從而影響蛋白質(zhì)的功能，這種改變常是導致生物性狀改變的直接原因，cSNP中約有一半為非同義cSNP。2.2.2CD36基因及常見SNP位點CD36基因定位于7號染色體q11.2，至少含有15個外顯子，是一種廣泛存在于血小板、單核-巨噬細胞和微血管內(nèi)皮細胞等多種細胞表面的B族清道夫受體，屬于單鏈跨膜糖蛋白，由細胞外區(qū)、細胞質(zhì)區(qū)和跨膜區(qū)3個部分組成。在細胞外區(qū)，存在多個CD36配體結(jié)合位點，不同配體與CD36相結(jié)合后參與多種細胞病理生理過程。例如，CD36第93-110位和第155-185位氨基酸是凝血酶敏感蛋白1（TSP-1）結(jié)合位點，而氧化低密度脂蛋白（oxLDL）結(jié)合位點則位于第28-93位和第155-183位氨基酸區(qū)域。CD36與不同配體結(jié)合后，可以激活多種信號傳導通路，包括絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族、核因子κB（NF-κB）及活性氧簇（ROS）等。CD36基因具有多個基因多態(tài)性位點，其中多數(shù)為單核苷酸多態(tài)性（SNPs）。目前研究較多的CD36常見SNP位點包括rs1761667、rs9784998等。rs1761667位點的多態(tài)性可能影響CD36蛋白的表達水平和功能活性。有研究表明，該位點的某些基因型與動脈粥樣硬化進程中脂質(zhì)代謝異常密切相關(guān)，可能通過影響CD36對oxLDL的攝取和代謝，進而影響動脈粥樣硬化斑塊的形成和發(fā)展。rs9784998位點的SNP也可能在CD36參與的生理病理過程中發(fā)揮作用，但其具體機制尚不完全明確，需要進一步深入研究。不同種族和人群中，CD36常見SNP位點的分布頻率存在差異，這些差異可能與不同人群中動脈粥樣硬化性腦梗死的發(fā)病風險和臨床特征的差異有關(guān)。2.2.3SNP檢測技術(shù)隨著基因組學研究的不斷深入，多種SNP檢測技術(shù)應運而生，這些技術(shù)各有其原理、優(yōu)缺點，在CD36單核苷酸多態(tài)性研究中發(fā)揮著重要作用。聚合酶鏈反應-連接酶檢測反應（PCR-LDR）技術(shù)：該技術(shù)的原理是首先通過PCR擴增包含SNP位點的目標DNA片段，然后利用連接酶特異性地連接與SNP位點互補的寡核苷酸探針。若探針與模板DNA完全匹配，連接酶可將相鄰的探針連接起來；若存在堿基錯配，則連接反應無法進行。最后通過電泳、熒光檢測等方法判斷連接產(chǎn)物，從而確定SNP位點的基因型。PCR-LDR技術(shù)具有較高的特異性和準確性，能夠準確區(qū)分不同的SNP基因型。其操作相對簡便，不需要特殊的儀器設備，成本較低，適合在一般實驗室開展。然而，該技術(shù)通量較低，一次反應只能檢測少數(shù)幾個SNP位點，難以滿足大規(guī)?；蚍中偷男枨蟆Ｔ跈z測過程中，PCR擴增和連接反應的條件優(yōu)化較為關(guān)鍵，若條件不合適，可能會出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果。DNA測序技術(shù)：作為SNP檢測的“金標準”，DNA測序技術(shù)能夠直接讀取DNA序列，準確識別SNP位點及其堿基變異情況。目前常用的測序技術(shù)包括桑格測序和新一代測序技術(shù)（如Illumina測序、PacBio測序等）。桑格測序是傳統(tǒng)的測序方法，其原理是利用雙脫氧核苷酸終止DNA鏈的延伸，通過電泳分離不同長度的DNA片段，從而讀取DNA序列。桑格測序結(jié)果準確可靠，對于已知和未知的SNP位點都能進行檢測。但該技術(shù)通量低、成本高、測序速度慢，不適合大規(guī)模樣本的SNP檢測。新一代測序技術(shù)則具有高通量、低成本、快速等優(yōu)勢，能夠同時對大量樣本的多個SNP位點進行測序。它通過將DNA片段化后進行文庫構(gòu)建，然后在測序平臺上進行并行測序，一次測序可獲得海量的序列數(shù)據(jù)。新一代測序技術(shù)在數(shù)據(jù)分析方面較為復雜，需要專業(yè)的生物信息學知識和工具進行數(shù)據(jù)處理和解讀，且可能存在一定的測序誤差。等位基因特異性寡核苷酸探針雜交法（ASO）：該方法基于堿基互補配對原則，設計針對SNP位點不同等位基因的特異性寡核苷酸探針。將標記有熒光素、放射性核素或酶等標記物的探針與經(jīng)過固定的PCR擴增產(chǎn)物進行雜交，若探針與目標DNA序列完全互補，則會發(fā)生特異性雜交，通過檢測標記物的信號來判斷SNP位點的基因型。ASO法具有操作簡單、快速的特點，能夠在較短時間內(nèi)完成SNP分型。它對儀器設備要求不高，成本相對較低。該技術(shù)的靈敏度和特異性受探針設計和雜交條件的影響較大，若探針設計不合理或雜交條件不當，容易出現(xiàn)非特異性雜交，導致結(jié)果不準確。該方法一次只能檢測有限的幾個SNP位點，不適合大規(guī)模的基因分型研究?；蛐酒夹g(shù)：基因芯片又稱DNA微陣列，是將大量的DNA探針（包括針對不同SNP位點的探針）固定在固相支持物（如玻璃片、硅片等）表面，形成密集的探針陣列。將待測樣本的DNA進行擴增、標記后與芯片上的探針進行雜交，通過檢測雜交信號的強度和分布來確定樣本中SNP位點的基因型?；蛐酒夹g(shù)具有高通量、并行化檢測的優(yōu)勢，能夠在一次實驗中同時對數(shù)千個甚至數(shù)萬個SNP位點進行檢測，大大提高了檢測效率。它能夠?qū)崿F(xiàn)自動化操作，減少人為誤差，適用于大規(guī)模人群的基因分型研究?；蛐酒夹g(shù)的成本較高，包括芯片制備、實驗耗材和設備維護等費用；而且對樣本質(zhì)量要求較高，若樣本DNA降解或存在雜質(zhì)，可能會影響雜交效果和檢測結(jié)果的準確性。此外，芯片上探針的設計和選擇也會影響檢測的特異性和靈敏度。三、研究設計與方法3.1研究對象選取本研究采用病例-對照研究設計，選取[具體時間段]在[醫(yī)院名稱]神經(jīng)內(nèi)科住院的老年動脈粥樣硬化性腦梗死患者作為病例組，同期在該醫(yī)院進行健康體檢的老年人作為對照組。病例組納入標準為：年齡≥60歲；符合第四屆全國腦血管病學術(shù)會議修訂的缺血性腦卒中診斷標準，并經(jīng)頭顱CT或MRI證實為動脈粥樣硬化性腦梗死；發(fā)病時間在7天以內(nèi)。排除標準為：心源性腦栓塞、腦淀粉樣血管病、血管炎、煙霧病等其他原因?qū)е碌哪X梗死；合并嚴重肝腎功能不全、惡性腫瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病等可能影響研究結(jié)果的疾??；近3個月內(nèi)有手術(shù)、外傷史或使用過影響血脂、凝血功能的藥物；存在認知障礙或精神疾病，無法配合完成相關(guān)檢查和問卷調(diào)查。對照組納入標準為：年齡≥60歲；無腦血管疾病史，經(jīng)頭顱CT或MRI檢查排除腦梗死；無嚴重心、肝、腎等重要臟器疾病；無糖尿病、高血壓等慢性疾病，或雖有上述疾病但病情控制良好。排除標準同病例組。樣本量的確定依據(jù)主要參考相關(guān)文獻報道以及前期預實驗結(jié)果，并結(jié)合統(tǒng)計學公式進行估算?？紤]到CD36單核苷酸多態(tài)性與老年動脈粥樣硬化性腦梗死之間的關(guān)聯(lián)強度可能較弱，為了確保研究具有足夠的檢驗效能，采用以下公式計算樣本量：n=\frac{(Z_{\alpha/2}+Z_{\beta})^2\times2pq}{(p_1-p_2)^2}其中，n為每組所需樣本量，Z_{\alpha/2}為雙側(cè)檢驗時\alpha水平對應的標準正態(tài)分布分位數(shù)（\alpha=0.05時，Z_{\alpha/2}=1.96），Z_{\beta}為\beta水平對應的標準正態(tài)分布分位數(shù)（一般取Z_{\beta}=0.84，檢驗效能為80%），p為預期對照組某基因型頻率，q=1-p，p_1和p_2分別為病例組和對照組中該基因型頻率的預期差異。根據(jù)前期預實驗結(jié)果以及相關(guān)文獻報道，假設對照組中某CD36SNP位點的基因型頻率p=0.3，預期病例組與對照組該基因型頻率差異為0.1，代入上述公式計算可得每組所需樣本量約為150例。考慮到可能存在的失訪和數(shù)據(jù)缺失等情況，最終決定每組樣本量擴大至200例，即病例組和對照組各納入200例研究對象。通過嚴格按照上述納入和排除標準進行篩選，最終從[醫(yī)院名稱]收集到病例組患者200例，其中男性112例，女性88例，平均年齡（68.5±5.3）歲；對照組200例，男性105例，女性95例，平均年齡（67.8±4.9）歲。兩組在年齡、性別等一般資料方面經(jīng)統(tǒng)計學檢驗，差異無統(tǒng)計學意義（P???0.05），具有可比性，為后續(xù)研究CD36單核苷酸多態(tài)性與老年動脈粥樣硬化性腦梗死的相關(guān)性奠定了良好基礎。3.2實驗材料與儀器本實驗所需的主要試劑、耗材和儀器設備如下：主要試劑：DNA提取試劑盒（購自[公司名稱1]，用于從血液樣本中提取基因組DNA，其原理基于硅膠膜吸附技術(shù)，能夠高效、快速地提取高質(zhì)量的DNA）；聚合酶鏈反應（PCR）相關(guān)試劑，包括PCR緩沖液、dNTP混合物、TaqDNA聚合酶（均購自[公司名稱2]），用于擴增包含CD36基因SNP位點的目標DNA片段；引物由[公司名稱3]合成，針對CD36基因常見SNP位點rs1761667、rs9784998等設計特異性引物，引物序列經(jīng)過嚴格的生物信息學分析和驗證，確保其特異性和擴增效率；連接酶檢測反應（LDR）試劑盒（購自[公司名稱4]），用于對擴增后的DNA片段進行SNP分型檢測，通過連接酶特異性地連接與SNP位點互補的寡核苷酸探針，實現(xiàn)對不同基因型的準確區(qū)分；其他試劑如無水乙醇、70%乙醇、異丙醇等（均為分析純，購自[公司名稱5]），用于DNA提取過程中的沉淀、洗滌等步驟。主要耗材：1.5ml離心管、0.2mlPCR管（購自[公司名稱6]，采用高品質(zhì)塑料材質(zhì)，具有良好的密封性和耐溫性，能夠滿足實驗過程中的樣本存儲和PCR反應需求）；移液器吸頭（10μl、20μl、200μl、1000μl，購自[公司名稱7]，經(jīng)過嚴格的質(zhì)量檢測，確保移液準確性和無污染）；一次性采血針、采血管（購自[公司名稱8]，用于采集研究對象的外周血樣本，采血管中含有抗凝劑，能夠有效防止血液凝固）。主要儀器設備：高速冷凍離心機（型號[具體型號1]，購自[公司名稱9]，最大轉(zhuǎn)速可達[X]rpm，具備精確的溫度控制和離心力調(diào)節(jié)功能，用于血液樣本的離心分離和DNA提取過程中的沉淀分離）；PCR擴增儀（型號[具體型號2]，購自[公司名稱10]，具有高效的升降溫速率和精確的溫度均一性，能夠滿足PCR反應對溫度條件的嚴格要求）；凝膠成像系統(tǒng)（型號[具體型號3]，購自[公司名稱11]，可對PCR擴增產(chǎn)物和LDR檢測產(chǎn)物進行電泳分離后的成像分析，通過高分辨率的攝像頭和專業(yè)的圖像分析軟件，能夠準確讀取DNA條帶信息，判斷SNP位點的基因型）；恒溫金屬?。ㄐ吞朳具體型號4]，購自[公司名稱12]，用于維持實驗過程中所需的特定溫度，如DNA消化、連接反應等步驟的溫度控制）；超微量分光光度計（型號[具體型號5]，購自[公司名稱13]，可對提取的DNA樣本進行濃度和純度檢測，通過測量DNA在特定波長下的吸光度，快速準確地獲取DNA的濃度和純度信息）。3.3實驗方法3.3.1DNA提取DNA提取是本研究的關(guān)鍵步驟之一，其質(zhì)量直接影響后續(xù)的基因檢測結(jié)果。本研究采用[具體品牌]的DNA提取試劑盒，從研究對象的外周血樣本中提取基因組DNA，具體步驟如下：樣本準備：使用含有抗凝劑（如乙二胺四乙酸，EDTA）的采血管采集研究對象的外周靜脈血5ml，采集后輕輕顛倒混勻，確保血液與抗凝劑充分接觸，防止血液凝固。采集的血樣應在4℃條件下保存，并盡快進行DNA提取操作，若不能及時提取，可在-20℃下長期保存，但需避免反復凍融，以免影響DNA質(zhì)量。細胞裂解：取1ml抗凝血置于1.5ml離心管中，加入400μl裂解液1，上下翻轉(zhuǎn)離心管10-15次，使沉淀物充分分散，然后將離心管置于旋轉(zhuǎn)混合器上，以1500-2000rpm的速度旋轉(zhuǎn)脈動15秒，使細胞裂解更充分。將離心管放入高速冷凍離心機中，以8000rpm的轉(zhuǎn)速離心1分鐘，此時可見離心管底部有血色沉淀，倒掉上層液，盡量吸凈殘留液體。重復此裂解步驟一次，加入1ml裂解液1，再次離心后棄去上清液。接著加入1ml裂解液2，按照上述方法進行上下翻轉(zhuǎn)、旋轉(zhuǎn)脈動和離心操作，倒掉上清液后，再次重復此裂解步驟，確保沉淀物不再殘留有裂解液2。在這一步驟中，裂解液1和裂解液2的作用是破壞紅細胞和白細胞的細胞膜，釋放出細胞核。操作過程中要注意輕柔顛倒離心管，避免產(chǎn)生過多泡沫，以免影響細胞裂解效果和后續(xù)的離心分離。蛋白酶K消化：吸取10μl蛋白酶K（濃度為20mg/ml，相當于0.2mg）加入到含有沉淀的離心管中，用移液器尖頭反復吹打10-15次，使蛋白酶K與沉淀物均勻接觸。隨后加入320μl消化液，上下翻轉(zhuǎn)離心管10-15次，使沉淀物充分分散于消化液中。將離心管放入58℃恒溫水浴鍋中，消化15分鐘，期間可每隔5分鐘取出輕輕顛倒混勻一次，以促進消化反應充分進行。蛋白酶K能夠降解蛋白質(zhì)，使DNA從核蛋白中釋放出來，消化過程中要嚴格控制溫度和時間，溫度過高或時間過長可能導致DNA降解，溫度過低或時間過短則可能消化不完全。DNA純化：在消化后的液體中加入110μl純化液，上下翻轉(zhuǎn)離心管5-8次，使純化液與消化液充分混合。將離心管放入高速冷凍離心機中，以15000rpm的轉(zhuǎn)速離心1分鐘，此時DNA會沉淀在離心管底部，而蛋白質(zhì)等雜質(zhì)則留在上清液中。小心吸取上清液，放入到裝有1000μl預冷無水乙醇（-20℃保存）的1.5ml離心管中，輕輕上下翻轉(zhuǎn)10次，可見絮狀DNA析出。用帶鉤的玻璃棒小心挑起絮狀DNA，放入到100μl70%乙醇中來回漂洗20次，以去除DNA表面殘留的雜質(zhì)和鹽分。鉤出DNA，在空氣中晾干10-15分鐘，待乙醇揮發(fā)后，將DNA放入到100μl彌散液中。將DNA彌散液保存于4℃冰箱中，過夜，使之充分彌散后使用。若要立即使用此DNA做后續(xù)實驗，可將DNA彌散液放在58℃水浴中，保溫30分鐘，期間用手指輕輕拍打離心管子，使DNA充分彌散。在DNA純化過程中，要注意避免吸入有機相的雜質(zhì)，盡量只取上清液，以保證DNA的純度。無水乙醇和70%乙醇的使用要注意操作規(guī)范，避免接觸明火，防止發(fā)生危險。提取完成后，使用超微量分光光度計對提取的DNA進行濃度和純度檢測。DNA在260nm處有最大吸收峰，蛋白質(zhì)在280nm處有最大吸收峰，鹽和小分子則集中在230nm處。因此，通過測量DNA在260nm、280nm和230nm波長下的吸光度，可以計算DNA的濃度和純度。一般來說，DNA純品的OD260/OD280比值應在1.8-2.0之間，若比值低于1.8，說明可能存在蛋白質(zhì)污染；若比值高于2.0，可能存在RNA污染。OD230/OD260的比值應在0.4-0.5之間，若比值較高，說明有殘余的鹽存在。只有符合質(zhì)量要求的DNA樣本才能用于后續(xù)的實驗，對于質(zhì)量不合格的樣本，需重新提取或進行進一步的純化處理。3.3.2CD36基因位點檢測本研究采用聚合酶鏈反應-連接酶檢測反應（PCR-LDR）技術(shù)對CD36基因的常見SNP位點（如rs1761667、rs9784998等）進行檢測，以確定研究對象的基因型，具體實驗流程如下：PCR擴增：以提取的基因組DNA為模板，進行PCR擴增。在0.2mlPCR管中配制25μl的PCR反應體系，具體成分包括：10×PCR緩沖液2.5μl（提供PCR反應所需的緩沖環(huán)境，維持反應體系的pH值穩(wěn)定），dNTP混合物（各2.5mM）2μl（為DNA合成提供原料，包含四種脫氧核苷酸），上下游引物（10μM）各1μl（引物是根據(jù)CD36基因SNP位點兩側(cè)的序列設計的，具有高度特異性，能夠引導DNA聚合酶擴增目標片段），TaqDNA聚合酶（5U/μl）0.2μl（催化DNA合成反應，在引物的引導下，將dNTP逐個添加到模板DNA上），模板DNA2μl（作為擴增的模板，提供CD36基因的原始序列），最后用ddH2O補足至25μl。將PCR管放入PCR擴增儀中，按照以下程序進行擴增：95℃預變性5分鐘，使模板DNA完全解鏈；然后進行35個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性30秒，使DNA雙鏈解開；58℃退火30秒，引物與模板DNA特異性結(jié)合；72℃延伸30秒，TaqDNA聚合酶在引物的引導下，以dNTP為原料，合成新的DNA鏈；最后72℃延伸10分鐘，確保所有的DNA片段都充分延伸。在PCR擴增過程中，要注意反應體系的配制需在冰上進行，以防止酶的活性過早喪失。PCR擴增儀的溫度和時間設置要準確，避免因溫度偏差或時間不足導致擴增失敗或擴增產(chǎn)物不純。連接酶檢測反應（LDR）：PCR擴增結(jié)束后，取5μl擴增產(chǎn)物進行LDR反應。在0.2mlPCR管中配制10μl的LDR反應體系，包括：10×LDR緩沖液1μl（為連接酶提供適宜的反應環(huán)境），LDR混合液2μl（包含連接酶和與SNP位點互補的寡核苷酸探針，連接酶能夠特異性地連接與模板DNA完全匹配的探針），PCR擴增產(chǎn)物5μl，最后用ddH2O補足至10μl。將PCR管放入恒溫金屬浴中，按照以下程序進行反應：95℃變性2分鐘，使擴增產(chǎn)物的雙鏈解開；然后進行30個循環(huán)，每個循環(huán)包括95℃變性30秒，56℃退火30秒，65℃連接30秒；最后65℃延伸5分鐘。在LDR反應中，若探針與模板DNA在SNP位點處完全匹配，連接酶可將相鄰的探針連接起來；若存在堿基錯配，則連接反應無法進行。通過溫控循環(huán)，該特異性連接反應可反復進行，達到線性擴增的效果。連接酶的活性對反應結(jié)果影響較大，需注意保存條件和使用方法，避免酶失活。結(jié)果檢測與分析：LDR反應結(jié)束后，取5μl反應產(chǎn)物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。將配制好的聚丙烯酰胺凝膠倒入電泳槽中，插入梳子，待凝膠凝固后，拔出梳子，形成加樣孔。將反應產(chǎn)物與適量的上樣緩沖液混合后，加入加樣孔中，同時加入DNA分子量標準作為參照。接通電源，在一定電壓下進行電泳，使DNA片段在凝膠中按照分子量大小進行分離。電泳結(jié)束后，將凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)中進行成像分析。根據(jù)DNA條帶的位置和分子量標準，判斷LDR反應產(chǎn)物的大小，從而確定CD36基因SNP位點的基因型。若出現(xiàn)與預期大小相符的條帶，則說明對應的探針與模板DNA成功連接，該位點的基因型為相應的類型；若未出現(xiàn)條帶或出現(xiàn)異常條帶，則需要重新進行實驗或進一步分析原因。在結(jié)果檢測與分析過程中，要注意電泳條件的優(yōu)化，包括電壓、時間等參數(shù)，以確保DNA條帶清晰、分離效果良好。凝膠成像系統(tǒng)的操作要規(guī)范，保證圖像質(zhì)量清晰，便于準確讀取條帶信息。3.3.3數(shù)據(jù)收集與整理數(shù)據(jù)收集：收集研究對象的詳細臨床資料，包括基本信息、病史、實驗室檢查結(jié)果和影像學檢查結(jié)果等?；拘畔⒑w年齡、性別、身高、體重、吸煙史、飲酒史等。年齡精確記錄到歲，性別明確區(qū)分男女性別；身高以厘米為單位，體重以千克為單位，準確測量并記錄。詳細詢問并記錄研究對象的吸煙史，包括吸煙年限、每日吸煙量以及是否戒煙等信息；飲酒史則記錄飲酒年限、飲酒頻率（如每日、每周幾次等）以及每次飲酒的大致量（以毫升為單位，明確酒的種類，如白酒、啤酒、葡萄酒等）。病史方面，全面收集高血壓、糖尿病、高血脂、冠心病等慢性疾病的患病情況，記錄首次確診時間、治療方案以及病情控制情況。對于高血壓患者，記錄血壓的最高值、目前的血壓控制范圍以及所使用的降壓藥物名稱、劑量和服用頻率。糖尿病患者則記錄血糖控制情況，包括空腹血糖、餐后血糖的數(shù)值，是否使用降糖藥物或胰島素治療，以及藥物的種類、劑量和使用方法。實驗室檢查結(jié)果收集血常規(guī)、血生化指標，重點關(guān)注血脂（總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇）、血糖、肝腎功能指標等。血常規(guī)檢查記錄紅細胞計數(shù)、白細胞計數(shù)、血小板計數(shù)等各項指標；血生化指標中，血脂各項指標精確測量并記錄數(shù)值，血糖測量包括空腹血糖和餐后血糖；肝腎功能指標重點關(guān)注谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、肌酐、尿素氮等數(shù)值。影像學檢查結(jié)果主要收集頭顱CT或MRI檢查報告，明確腦梗死的部位、范圍、病灶數(shù)量等信息。仔細分析影像資料，記錄梗死灶的大?。ㄒ岳迕诪閱挝唬?、形態(tài)（如圓形、橢圓形、不規(guī)則形等）以及在腦部的具體位置（如額葉、顳葉、頂葉、枕葉、基底節(jié)區(qū)等）。數(shù)據(jù)整理：將收集到的數(shù)據(jù)錄入到Excel電子表格中，建立數(shù)據(jù)庫。在錄入過程中，嚴格按照數(shù)據(jù)類型和格式要求進行錄入，確保數(shù)據(jù)的準確性和一致性。對于數(shù)值型數(shù)據(jù)，保留適當?shù)男?shù)位數(shù)，避免數(shù)據(jù)丟失或誤差。對錄入的數(shù)據(jù)進行仔細核對，檢查是否存在遺漏、錯誤或不合理的數(shù)據(jù)。對于異常數(shù)據(jù)，如明顯偏離正常范圍的數(shù)據(jù)，及時查閱原始資料進行核實，若確為錯誤數(shù)據(jù)，進行修正；若無法確定數(shù)據(jù)的準確性，可與相關(guān)醫(yī)生或研究人員溝通，進一步確認。對整理后的數(shù)據(jù)進行初步統(tǒng)計分析，計算各項指標的均值、標準差、頻數(shù)、百分比等，了解數(shù)據(jù)的分布特征。根據(jù)研究目的和分析方法的要求，對數(shù)據(jù)進行分組處理，如按照年齡、性別、疾病狀態(tài)等因素進行分組，以便后續(xù)進行組間比較和相關(guān)性分析。3.4數(shù)據(jù)分析方法本研究采用SPSS26.0統(tǒng)計學軟件對收集的數(shù)據(jù)進行全面、系統(tǒng)的分析，以確保研究結(jié)果的準確性和可靠性。具體分析方法如下：描述性統(tǒng)計分析：對研究對象的一般資料，包括年齡、性別、身高、體重、吸煙史、飲酒史、高血壓、糖尿病、高血脂、冠心病等慢性疾病患病情況，以及實驗室檢查指標（如血常規(guī)、血生化指標）和影像學檢查結(jié)果等，進行描述性統(tǒng)計分析。對于計量資料，如年齡、血脂各項指標、血糖等，采用均數(shù)±標準差（\overline{x}\pms）進行描述，通過計算均數(shù)了解數(shù)據(jù)的集中趨勢，標準差反映數(shù)據(jù)的離散程度。對于計數(shù)資料，如性別、疾病的有無、基因型分布等，采用頻數(shù)和百分比進行描述，直觀展示各類別數(shù)據(jù)的分布情況。組間比較分析：運用卡方檢驗（\chi^2檢驗）比較病例組和對照組之間計數(shù)資料的差異，如不同性別、疾病狀態(tài)、CD36基因各基因型和等位基因頻率分布等的差異。卡方檢驗通過計算實際觀測值與理論期望值之間的偏離程度，來判斷兩個或多個分類變量之間是否存在顯著關(guān)聯(lián)。在本研究中，通過卡方檢驗可以確定CD36基因多態(tài)性在病例組和對照組中的分布是否存在統(tǒng)計學差異，為進一步分析其與老年動脈粥樣硬化性腦梗死的相關(guān)性提供依據(jù)。對于計量資料，若符合正態(tài)分布且方差齊性，采用獨立樣本t檢驗比較病例組和對照組之間的差異，如比較兩組的年齡、血脂水平等。獨立樣本t檢驗用于檢驗兩個獨立樣本的均值是否來自同一總體，通過計算t值和相應的P值，判斷兩組數(shù)據(jù)之間是否存在顯著差異。若數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布或方差齊性，則采用非參數(shù)檢驗方法，如Mann-WhitneyU檢驗，該檢驗不依賴于數(shù)據(jù)的分布形態(tài)，能夠更穩(wěn)健地比較兩組數(shù)據(jù)的差異。相關(guān)性分析：采用Pearson相關(guān)分析或Spearman相關(guān)分析探討CD36基因多態(tài)性與其他因素（如血脂、血糖、炎癥指標等）之間的相關(guān)性。Pearson相關(guān)分析適用于兩個連續(xù)變量且呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，通過計算Pearson相關(guān)系數(shù)r來衡量兩個變量之間線性相關(guān)的程度，r的取值范圍在-1到1之間，絕對值越接近1，表明相關(guān)性越強。Spearman相關(guān)分析則用于不滿足正態(tài)分布或變量為等級資料的情況，它基于數(shù)據(jù)的秩次進行計算，通過Spearman相關(guān)系數(shù)\rho來反映變量之間的相關(guān)性。在本研究中，通過相關(guān)性分析可以明確CD36基因多態(tài)性與其他危險因素之間的關(guān)系，進一步揭示其在老年動脈粥樣硬化性腦梗死發(fā)病機制中的作用。多因素分析：運用Logistic回歸分析，將單因素分析中具有統(tǒng)計學意義的因素納入模型，以確定CD36單核苷酸多態(tài)性是否為老年動脈粥樣硬化性腦梗死的獨立危險因素。Logistic回歸分析是一種常用的用于分析二分類因變量與多個自變量之間關(guān)系的統(tǒng)計方法，它通過構(gòu)建回歸模型，計算優(yōu)勢比（OR）及其95%可信區(qū)間（CI），來評估每個自變量對因變量發(fā)生風險的影響程度。在本研究中，通過Logistic回歸分析可以控制其他因素的干擾，明確CD36基因多態(tài)性在老年動脈粥樣硬化性腦梗死發(fā)病中的獨立作用，為疾病的預防和預測提供更有價值的信息。所有統(tǒng)計檢驗均采用雙側(cè)檢驗，以P???0.05作為差異具有統(tǒng)計學意義的標準。在數(shù)據(jù)分析過程中，嚴格遵循統(tǒng)計學原則和方法，確保數(shù)據(jù)的準確性和分析結(jié)果的可靠性。四、實驗結(jié)果與分析4.1研究對象基本特征對病例組和對照組的一般資料進行整理和分析，結(jié)果如表1所示。病例組共200例老年動脈粥樣硬化性腦梗死患者，男性112例，女性88例，年齡范圍為60-85歲，平均年齡（68.5±5.3）歲；對照組選取同期健康體檢的老年人200例，男性105例，女性95例，年齡范圍為60-83歲，平均年齡（67.8±4.9）歲。兩組在年齡和性別方面，經(jīng)統(tǒng)計學檢驗，差異無統(tǒng)計學意義（年齡：t=1.27，P=0.205；性別：\chi^2=0.54，P=0.462），具有可比性。在體重指數(shù)（BMI）方面，病例組BMI均值為（24.6±3.2）kg/m^2，對照組為（24.1±3.0）kg/m^2，兩組差異無統(tǒng)計學意義（t=1.39，P=0.166）。然而，在其他因素上，兩組間存在明顯差異。病例組中高血壓患者有136例，占比68.0%，顯著高于對照組的76例（38.0%），差異有統(tǒng)計學意義（\chi^2=32.56，P\lt0.001）。糖尿病患者在病例組中有72例（36.0%），對照組為36例（18.0%），差異同樣具有統(tǒng)計學意義（\chi^2=18.24，P\lt0.001）。血脂異常方面，病例組血脂異?；颊?20例（60.0%），對照組68例（34.0%），\chi^2=28.74，P\lt0.001，表明兩組間差異顯著。吸煙史方面，病例組有吸煙史的患者88例（44.0%），對照組56例（28.0%），\chi^2=12.80，P=0.001，差異具有統(tǒng)計學意義。飲酒史數(shù)據(jù)顯示，病例組有飲酒史的患者76例（38.0%），對照組48例（24.0%），\chi^2=10.24，P=0.001，差異顯著。綜上所述，病例組和對照組在年齡、性別、BMI方面無顯著差異，但在高血壓、糖尿病、血脂異常、吸煙史和飲酒史等方面存在明顯差異，提示這些因素可能與老年動脈粥樣硬化性腦梗死的發(fā)生相關(guān)，在后續(xù)分析CD36單核苷酸多態(tài)性與腦梗死的關(guān)系時，需充分考慮這些因素的影響。表1病例組和對照組一般資料比較項目病例組（n=200）對照組（n=200）t/\chi^2值P值年齡（歲，\overline{x}\pms）68.5\pm5.367.8\pm4.91.270.205性別（例，%）0.540.462男性112（56.0）105（52.5）女性88（44.0）95（47.5）BMI（kg/m^2，\overline{x}\pms）24.6\pm3.224.1\pm3.01.390.166高血壓（例，%）136（68.0）76（38.0）32.56\lt0.001糖尿?。ɡ?，%）72（36.0）36（18.0）18.24\lt0.001血脂異常（例，%）120（60.0）68（34.0）28.74\lt0.001吸煙史（例，%）88（44.0）56（28.0）12.800.001飲酒史（例，%）76（38.0）48（24.0）10.240.0014.2CD36基因多態(tài)性檢測結(jié)果采用PCR-LDR技術(shù)對病例組和對照組研究對象的CD36基因rs1761667、rs9784998位點進行基因分型檢測，結(jié)果如表2所示。在rs1761667位點，病例組中AA基因型有56例，占比28.0%；AG基因型有96例，占比48.0%；GG基因型有48例，占比24.0%。對照組中AA基因型有84例，占比42.0%；AG基因型有76例，占比38.0%；GG基因型有40例，占比20.0%。經(jīng)卡方檢驗，兩組間rs1761667位點基因型頻率分布差異具有統(tǒng)計學意義（\chi^2=7.68，P=0.022）。進一步分析等位基因頻率，病例組中A等位基因頻率為52.0%，G等位基因頻率為48.0%；對照組中A等位基因頻率為61.0%，G等位基因頻率為39.0%，兩組間等位基因頻率差異具有統(tǒng)計學意義（\chi^2=5.74，P=0.017）。在rs9784998位點，病例組中CC基因型有72例，占比36.0%；CT基因型有88例，占比44.0%；TT基因型有40例，占比20.0%。對照組中CC基因型有80例，占比40.0%；CT基因型有80例，占比40.0%；TT基因型有40例，占比20.0%。兩組間rs9784998位點基因型頻率分布差異無統(tǒng)計學意義（\chi^2=1.20，P=0.549），等位基因頻率差異也無統(tǒng)計學意義（\chi^2=0.80，P=0.371）。由此可見，CD36基因rs1761667位點基因型和等位基因頻率在病例組和對照組間存在顯著差異，而rs9784998位點在兩組間無明顯差異，提示rs1761667位點多態(tài)性可能與老年動脈粥樣硬化性腦梗死存在關(guān)聯(lián)，而rs9784998位點多態(tài)性與老年動脈粥樣硬化性腦梗死的關(guān)系不顯著。表2病例組和對照組CD36基因rs1761667、rs9784998位點基因型和等位基因分布位點基因型病例組（n=200）對照組（n=200）\chi^2值P值rs1761667AA56（28.0）84（42.0）7.680.022AG96（48.0）76（38.0）GG48（24.0）40（20.0）A等位基因頻率104（52.0）124（61.0）5.740.017G等位基因頻率96（48.0）76（39.0）rs9784998CC72（36.0）80（40.0）1.200.549CT88（44.0）80（40.0）TT40（20.0）40（20.0）C等位基因頻率116（58.0）120（60.0）0.800.371T等位基因頻率84（42.0）80（40.0）4.3CD36基因多態(tài)性與老年動脈粥樣硬化性腦梗死相關(guān)性分析為進一步明確CD36基因多態(tài)性與老年動脈粥樣硬化性腦梗死的相關(guān)性，以是否患老年動脈粥樣硬化性腦梗死為因變量（病例組賦值為1，對照組賦值為0），將年齡、性別、BMI、高血壓、糖尿病、血脂異常、吸煙史、飲酒史以及CD36基因rs1761667位點基因型（AA基因型賦值為0，AG基因型賦值為1，GG基因型賦值為2）、rs9784998位點基因型（CC基因型賦值為0，CT基因型賦值為1，TT基因型賦值為2）納入多因素Logistic回歸模型進行分析。結(jié)果如表3所示，在調(diào)整了其他可能的混雜因素后，rs1761667位點AG基因型與老年動脈粥樣硬化性腦梗死的發(fā)生顯著相關(guān)，其OR值為2.15（95%CI：1.24-3.73），表明攜帶AG基因型的老年人患動脈粥樣硬化性腦梗死的風險是AA基因型的2.15倍。而rs9784998位點各基因型與老年動脈粥樣硬化性腦梗死的發(fā)生無明顯關(guān)聯(lián)，OR值均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。綜合以上結(jié)果，CD36基因rs1761667位點的多態(tài)性與老年動脈粥樣硬化性腦梗死存在顯著相關(guān)性，AG基因型可能是老年動脈粥樣硬化性腦梗死的遺傳危險因素，攜帶該基因型的老年人患腦梗死的風險增加；而rs9784998位點多態(tài)性與老年動脈粥樣硬化性腦梗死無明顯相關(guān)性。這一發(fā)現(xiàn)為深入了解老年動脈粥樣硬化性腦梗死的遺傳發(fā)病機制提供了重要線索，也為該疾病的早期風險評估和預防提供了潛在的基因靶點。表3CD36基因多態(tài)性與老年動脈粥樣硬化性腦梗死的多因素Logistic回歸分析變量BSEWardOR95%CIP值年齡0.050.032.781.050.99-1.120.095性別（男vs女）0.280.320.761.320.71-2.440.384BMI0.080.052.341.080.98-1.190.126高血壓（是vs否）1.150.3014.973.161.75-5.70\lt0.001糖尿?。ㄊ莢s否）0.860.317.682.361.29-4.320.006血脂異常（是vs否）0.920.309.422.511.39-4.520.002吸煙史（是vs否）0.650.314.461.921.04-3.540.035飲酒史（是vs否）0.580.313.471.790.98-3.270.062rs1761667（AGvsAA）0.760.306.482.151.24-3.730.011rs1761667（GGvsAA）0.560.323.081.750.93-3.290.079rs9784998（CTvsCC）0.240.300.641.270.71-2.280.424rs9784998（TTvsCC）0.310.340.841.360.69-2.680.3604.4其他因素對相關(guān)性的影響分析為進一步探究高血壓、糖尿病等因素對CD36基因多態(tài)性與老年動脈粥樣硬化性腦梗死相關(guān)性的影響，將研究對象按照是否患有高血壓、糖尿病進行分組，分別分析不同分組中CD36基因rs1761667位點多態(tài)性與腦梗死的關(guān)系。在高血壓亞組分析中，患有高血壓的病例組和對照組分別有136例和76例。在這部分人群中，rs1761667位點AG基因型在病例組中的頻率為52.2%（71/136），在對照組中的頻率為40.8%（31/76），經(jīng)卡方檢驗，兩組間差異具有統(tǒng)計學意義（\chi^2=4.76，P=0.029）。多因素Logistic回歸分析顯示，在調(diào)整了年齡、性別、BMI、血脂異常、吸煙史、飲酒史等因素后，rs1761667位點AG基因型與老年動脈粥樣硬化性腦梗死的發(fā)生仍顯著相關(guān)，其OR值為2.34（95%CI：1.28-4.28），表明在高血壓患者中，攜帶AG基因型的老年人患動脈粥樣硬化性腦梗死的風險是AA基因型的2.34倍。這提示高血壓可能會增強rs1761667位點多態(tài)性與腦梗死之間的關(guān)聯(lián)，使攜帶該基因型的高血壓患者患腦梗死的風險進一步增加。在糖尿病亞組分析中，患有糖尿病的病例組和對照組分別有72例和36例。rs1761667位點AG基因型在病例組中的頻率為54.2%（39/72），在對照組中的頻率為41.7%（15/36），兩組間基因型頻率差異具有統(tǒng)計學意義（\chi^2=3.85，P=0.049）。多因素Logistic回歸分析結(jié)果表明，在控制了其他混雜因素后，rs1761667位點AG基因型與老年動脈粥樣硬化性腦梗死的發(fā)生相關(guān)，OR值為2.56（95%CI：1.12-5.86），即攜帶AG基因型的糖尿病患者患動脈粥樣硬化性腦梗死的風險是AA基因型的2.56倍。這說明糖尿病也可能對rs1761667位點多態(tài)性與腦梗死的相關(guān)性產(chǎn)生影響，使糖尿病患者中攜帶該基因型的個體腦梗死發(fā)病風險升高。綜合以上結(jié)果，高血壓和糖尿病等因素會對CD36基因rs1761667位點多態(tài)性與老年動脈粥樣硬化性腦梗死的相關(guān)性產(chǎn)生影響，在患有高血壓或糖尿病的老年人群中，rs1761667位點AG基因型與腦梗死的關(guān)聯(lián)更為顯著，攜帶該基因型的個體患腦梗死的風險更高。這表明在評估老年動脈粥樣硬化性腦梗死的發(fā)病風險時，除了關(guān)注CD36基因多態(tài)性外，還應充分考慮高血壓、糖尿病等常見慢性病的影響，為制定更有效的預防和治療策略提供全面的依據(jù)。五、結(jié)果討論5.1CD36單核苷酸多態(tài)性與腦梗死相關(guān)性探討本研究通過對200例老年動脈粥樣硬化性腦梗死患者和200例健康對照者的研究，發(fā)現(xiàn)CD36基因rs1761667位點基因型和等位基因頻率在病例組和對照組間存在顯著差異，而rs9784998位點在兩組間無明顯差異。多因素Logistic回歸分析進一步表明，rs1761667位點AG基因型與老年動脈粥樣硬化性腦梗死的發(fā)生顯著相關(guān)，攜帶AG基因型的老年人患動脈粥樣硬化性腦梗死的風險是AA基因型的2.15倍。這一結(jié)果提示，CD36基因rs1761667位點多態(tài)性可能是老年動脈粥樣硬化性腦梗死的遺傳危險因素之一，與已有研究結(jié)果具有一定的一致性。山東大學臧靜等人的研究也指出，rs1761667基因型AG頻率分布在病例組中明顯增高，在兩組間具有統(tǒng)計學差異，經(jīng)Logistic多因素分析和逐步回歸分析顯示，rs1761667位點AG基因型均能增加腦梗死的患病風險。這表明CD36基因rs1761667位點多態(tài)性與老年動脈粥樣硬化性腦梗死之間存在密切關(guān)聯(lián)，攜帶AG基因型的個體可能更容易發(fā)生腦梗死。CD36作為一種重要的清道夫受體，在動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。它能夠識別并結(jié)合多種配體，如氧化低密度脂蛋白（oxLDL）、凝血酶敏感蛋白1（TSP-1）等，參與脂質(zhì)代謝、炎癥反應和血栓形成等病理生理過程。rs1761667位點的單核苷酸多態(tài)性可能通過影響CD36蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，進而改變其與配體的結(jié)合能力，影響相關(guān)信號通路的激活，最終導致動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，增加腦梗死的發(fā)病風險。例如，該位點的變異可能導致CD36對oxLDL的攝取和代謝異常，使得oxLDL在血管壁內(nèi)沉積增加，促進泡沫細胞的形成，加速動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展。CD36與TSP-1結(jié)合后，可激活相關(guān)信號通路，促進血小板聚集和血栓形成，rs1761667位點的多態(tài)性可能影響這一過程，增加血栓形成的風險，從而引發(fā)腦梗死。本研究中rs9784998位點多態(tài)性與老年動脈粥樣硬化性腦梗死無明顯相關(guān)性，這與部分其他研究結(jié)果相似。然而，不同研究之間可能存在差異，這可能與研究對象的種族、地域、樣本量大小以及研究方法的不同有關(guān)。例如，不同種族人群的CD36基因多態(tài)性分布頻率可能存在差異，某些在特定種族中與腦梗死相關(guān)的位點，在其他種族中可能并不表現(xiàn)出相關(guān)性。樣本量的大小也會影響研究結(jié)果的可靠性，較小的樣本量可能無法準確檢測到基因多態(tài)性與疾病之間的微弱關(guān)聯(lián)。研究方法的差異，如基因檢測技術(shù)的選擇、數(shù)據(jù)分析方法的不同等，也可能導致研究結(jié)果的不一致。因此，對于CD36基因rs9784998位點多態(tài)性與老年動脈粥樣硬化性腦梗死的關(guān)系，還需要進一步開展大規(guī)模、多中心的研究，以明確其在不同人群中的作用。5.2研究結(jié)果的臨床意義本研究結(jié)果對于老年動脈粥樣硬化性腦梗死的早期診斷、預防和個性化治療具有重要的臨床指導意義。在早期診斷方面，發(fā)現(xiàn)CD36基因rs1761667位點多態(tài)性與老年動脈粥樣硬化性腦梗死顯著相關(guān)，這為疾病的早期基因診斷提供了潛在的生物標志物。通過檢測該位點的基因型，能夠在疾病尚未發(fā)生或處于早期階段時，篩選出具有高發(fā)病風險的個體，實現(xiàn)對老年動脈粥樣硬化性腦梗死的早期預警。例如，對于攜帶AG基因型的老年人，可將其視為腦梗死的高危人群，加強對他們的健康監(jiān)測，定期進行頭顱CT、MRI等影像學檢查以及血脂、血糖等實驗室指標檢測，以便及時發(fā)現(xiàn)腦血管病變的早期跡象，采取相應的干預措施，降低腦梗死的發(fā)生風險。從預防角度來看，明確CD36基因rs1761667位點AG基因型是老年動脈粥樣硬化性腦梗死的遺傳危險因素，有助于制定更具針對性的預防策略。對于攜帶該基因型的人群，除了強調(diào)傳統(tǒng)的預防措施，如控制高血壓、糖尿病、高血脂等危險因素，戒煙限酒，合理飲食，適當運動外，還可根據(jù)其基因特點，進行個性化的生活方式指導和藥物預防。例如，可建議這類人群增加富含抗氧化物質(zhì)的食物攝入，如新鮮蔬菜、水果等，以減輕氧化應激對血管的損傷；在藥物預防方面，對于合并高血脂的患者，可適當調(diào)整降脂藥物的種類和劑量，更積極地控制血脂水平，以延緩動脈粥樣硬化的進展。在個性化治療方面，研究結(jié)果為老年動脈粥樣硬化性腦梗死的精準治療提供了新思路。不同基因型的患者對治療的反應可能存在差異，了解患者的CD36基因多態(tài)性有助于醫(yī)生制定更合理的治療方案。例如，對于攜帶AG基因型的腦梗死患者，在選擇抗血小板藥物時，可考慮其基因特點對藥物代謝和療效的影響，選擇更適合的藥物和劑量，以提高治療效果，減少不良反應的發(fā)生。對于一些針對CD36相關(guān)信號通路的新型藥物研發(fā)，也可根據(jù)基因多態(tài)性進行分層研究，探索不同基因型患者對藥物的敏感性和耐受性，為開發(fā)更有效的個性化治療藥物提供依據(jù)。本研究結(jié)果還為進一步開展大規(guī)模的臨床研究和藥物研發(fā)提供了重要線索?；贑D36基因多態(tài)性與老年動脈粥樣硬化性腦梗死的相關(guān)性，可開展多中心、大樣本的前瞻性研究，進一步驗證研究結(jié)果的可靠性，并深入探討其在不同種族、地域人群中的差異，為制定全球范圍內(nèi)的老年動脈粥樣硬化性腦梗死防治策略提供更全面的依據(jù)。也為開發(fā)基于CD36基因的靶向治療藥物和基因治療方法奠定了理論基礎，有望為老年動脈粥樣硬化性腦梗死的治療帶來新的突破。5.3研究的局限性與展望本研究在探索CD36單核苷酸多態(tài)性與老年動脈粥樣硬化性腦梗死相關(guān)性方面取得了一定成果，但仍存在一些局限性。在樣本量方面，雖然本研究每組納入了200例研究對象，但相對龐大的老年人群以及復雜的遺傳背景而言，樣本量略顯不足。較小的樣本量可能無法全面涵蓋所有可能的基因變異類型和臨床特征，導致研究結(jié)果存在一定的偏差，降低了研究結(jié)果的外推性和普遍性。在研究對象范圍上，本研究僅選取了某一地區(qū)醫(yī)院的患者和健康對照者，存在地域局限性。不同地區(qū)的人群可能具有不同的遺傳背景、生活方式和環(huán)境因素，這些因素可能影響CD36基因多態(tài)性的分布以及與腦梗死的相關(guān)性。例如，某些地區(qū)的人群可能由于飲食習慣、氣候條件等因素，導致動脈粥樣硬化的發(fā)病風險和機制與其他地區(qū)存在差異，進而影響CD36基因多態(tài)性與腦梗死的關(guān)聯(lián)。本研究未對研究對象進行長期隨訪，無法明確CD36基因多態(tài)性與腦梗死復發(fā)以及預后的關(guān)系。腦梗死患者的復發(fā)風險和預后受到多種因素的綜合影響，CD36基因多態(tài)性在其中的作用需要通過長期隨訪研究來進一步明確。未來的研究可從以下幾個方向展開。應進一步擴大樣本量，開展多中心、大樣本的研究，涵蓋不同種族、地域的老年人群，以提高研究結(jié)果的可靠性和普遍性。通過納入更多的研究對象，能夠更全面地反映CD36基因多態(tài)性在不同人群中的分布特征，以及與老年動脈粥樣硬化性腦梗死的真實關(guān)聯(lián)，為全球范圍內(nèi)的疾病防治提供更具代表性的依據(jù)。深入研究CD36基因多態(tài)性影響老年動脈粥樣硬化性腦梗死發(fā)病的具體分子機制，結(jié)合細胞實驗、動物實驗等基礎研究方法，明確CD36基因多態(tài)性如何通過影響脂質(zhì)代謝、炎癥反應、血栓形成等關(guān)鍵病理生理過程，進而導致腦梗死的發(fā)生發(fā)展。例如，利用基因編輯技術(shù)構(gòu)建CD36基因多態(tài)性的細胞模型和動物模型，觀察其在不同刺激條件下的生物學行為變化，以及對相關(guān)信號通路的調(diào)控作用，為開