實驗06植物組織中DNA的提取與測定（P226）一、實驗?zāi)康?/p>

1、提取DNA用于PCR等實驗

2、了解核酸提取的原理、各試劑的用途等二、原理——鹽溶法

1.鹽溶法：DNA溶于1mol/L的NaCl溶液，而RNA則不溶

2.

破碎細(xì)胞：機(jī)械處理：超聲波處理法、研磨法、勻漿法；化學(xué)處理：用SDS處理細(xì)胞。

3.

去除RNA：

DNA不溶于0.14mol/L的NaCl溶液，RNA可溶；

DNA溶于1mol/L的NaCl溶液，而RNA則不溶；

RNA酶，酶解RNA

4.

去除蛋白質(zhì)：加入SDS、高溫變性、有機(jī)溶劑（氯仿＋異戊醇）變性、檸檬酸、高氯酸等。

用高氯酸除去磷蛋白、糖類、磷脂、核苷酸類輔酶和游離核苷酸、酸溶性小分子物質(zhì)等雜質(zhì)。

氯仿除脂類分子5.

DNA酶失活：

DNA酶需二價離子Mg2+、Ca2+的激活，使用EDTA、檸檬酸鹽螯合二價陽離子，基本可抑制DNA酶活性。

6.

DNA提取：不溶于一般有機(jī)溶劑，在乙醇中不溶形成沉淀。

7.

測定與含量計算：DNA在260nm處對紫外光吸收最大。對純DNA樣品來說，濃度為1

μg/ml時，DNA鈉鹽的OD260＝0.02。即當(dāng)A260＝1時，dsDNA濃度約為50

μg/ml。三、材料、儀器、試劑

1.

材料：花棷菜、小麥芽等細(xì)胞分裂、DNA合成較旺盛的幼嫩組織器官。

2.

儀器：紫外分光光度計等。

3.

試劑：研磨緩沖液、10×SSC等、氯仿－異戊醇、高氯酸鈉、SDS等。四、實驗步驟1.

取花菜2－3g,剪碎置研缽中，加10ml預(yù)冷研磨緩沖液并加入0.1g左右的SDS，置冰浴上研磨成糊狀。2.

將勻漿無損轉(zhuǎn)入25ml刻度試管中，并將試管置65℃水浴中保溫15min，以滅活組織DNA酶，然后迅速冷卻到室溫。3.

向試管中加入等體積的氯仿－異戊醇混合液，加上塞子，劇烈振蕩0.5min，轉(zhuǎn)入塑料離心管。靜置片刻以脫除組織蛋白質(zhì)，配平，再以4000rpm離心5min。4.

離心后形成三層，小心地吸取上層清液（不用貪多）至刻度試管中，棄去中間層的細(xì)胞碎片、變性蛋白質(zhì)及下層的氯仿。5.

加5mol/L高氯酸鈉溶液(提取液與高氯酸鈉溶液體積比為4:1)，使溶液中高氯酸鈉的最終濃度為1mol/L。6.

再次加入等體積氯仿－異戊醇混合液至大試管中，振蕩1min，靜置后在室溫下離心(4000rpm)

5min后，取上清液置小燒杯中。7.

用滴管吸95％的預(yù)冷乙醇，慢慢地加入燒杯中上清液的表面上，直至乙醇的體積為上清液的兩倍，用玻璃棒單方向輕輕攪動。此時核酸迅速以纖維狀沉淀纏繞在玻璃棒上。8.

將核酸沉淀物在燒杯內(nèi)壁上輕輕擠壓，以除去乙醇，先用5ml的0.1×SSC溶液溶解，然后加入0.5ml的10×SSC，使最終濃度為1×SSC，即得到DNA粗制品。重復(fù)7與8步驟，直至沒有絲狀DNA纏繞在玻棒上。9.

在波長260nm下測定DNA的吸收值A(chǔ)260。如濃度過高，需適當(dāng)稀釋。（純DNA，A260/A280=1.8）五、原始數(shù)據(jù)與計算

W（樣品重量,g）＝

A260

＝N：稀釋倍數(shù)DNA含量

(μg/gFW)A260×50μg/ml×5.5ml×NWg=六、分析討論六分析討論

為什么在低溫下進(jìn)行？研磨緩沖液中NaCl、檸檬酸鈉和EDTA的作用?加SDS的作用？加NaCl的作用，為什么要加到1mol/L?加入異戊醇有什么作用？補充：操作中一定要把溶液混勻，這樣離心后除雜效果才好！混勻過程要溫柔，以免DNA斷裂。某些時候還需要用到酚。酚、氯仿是變性蛋白質(zhì)的（由于苯酚能溶進(jìn)少量水中損失的DNA，因此與氯仿一起使用，可減少DNA損失）。材料里蛋白不太多不用苯酚，氯仿：異戊醇24:1就可以了。酚：加速細(xì)胞裂解，使蛋白質(zhì)變性溶解，抑制DNase的降解作用

氯仿：變性沉淀蛋白質(zhì)，加速有機(jī)相與水相分層，去除核酸溶液中殘余的酚。

異戊醇：降低表面張力，減少氣泡產(chǎn)生（氣泡會損失DNA），使離心后的水相、變性蛋白相及有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定

乙醇沉淀：除鹽離子、糖、蛋白等雜質(zhì)，保證PCR