miRNA海綿沉默EBVmiRNAs對胃癌細(xì)胞凋亡的影響：機制與展望一、引言1.1研究背景與意義胃癌作為消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康。據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)（IARC）統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2020年全世界胃癌新發(fā)病例約108.9萬，居惡性腫瘤發(fā)病人數(shù)的第五位；死亡病例數(shù)約76.9萬，居惡性腫瘤死亡人數(shù)的第四位。在中國，胃癌的發(fā)病和死亡人數(shù)約占全球的43.9%和48.6%，發(fā)病率和死亡率分別位于所有惡性腫瘤的第二位和第三位，是發(fā)病率第一的消化道惡性腫瘤。胃癌早期癥狀隱匿，多數(shù)患者確診時已處于中晚期，5年生存率較低。其侵襲和轉(zhuǎn)移特性更是極大地影響了患者的預(yù)后，使得胃癌的治療面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。愛潑斯坦-巴爾病毒（Epstein-Barrvirus，EBV）是一種常見的人類皰疹病毒，在成年人群中的感染率超過90%。越來越多的研究表明，EBV感染與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其中EBV相關(guān)性胃癌（EBVaGC）約占所有胃癌的1.3%-30.9%。EBV主要以潛伏復(fù)制和溶出復(fù)制兩種形式感染細(xì)胞，初次感染通過口腔途徑形成終生攜帶病毒的潛伏感染狀態(tài)。在EBV相關(guān)腫瘤中，病毒編碼的多種非編碼RNA（ncRNA）以及潛伏膜蛋白、BamHⅠA右向開放閱讀框（BARF）等參與了腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡等過程的調(diào)控。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類由19-25個核苷酸組成的小RNA，可直接與mRNA的3'-非翻譯區(qū)（UTR）結(jié)合，抑制其翻譯過程，在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。EBV編碼的miRNA能夠通過表觀遺傳調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)展、遷移、凋亡分子的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)病毒復(fù)制和EBV相關(guān)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。細(xì)胞凋亡是維持機體正常生理功能和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要機制，對于腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有重要影響。當(dāng)細(xì)胞凋亡機制失衡時，腫瘤細(xì)胞可能逃避凋亡程序，從而不斷增殖、存活并發(fā)生轉(zhuǎn)移。因此，深入研究EBVmiRNAs對胃癌細(xì)胞凋亡的影響，有助于揭示EBVaGC的發(fā)病機制，為胃癌的治療提供新的靶點和策略。目前，針對EBVmiRNAs在胃癌中的作用機制研究尚處于不斷探索階段，尤其是miRNA海綿沉默EBVmiRNAs對胃癌細(xì)胞凋亡影響的相關(guān)研究仍相對較少。本研究旨在通過構(gòu)建miRNA海綿沉默EBVmiRNAs，探討其對胃癌細(xì)胞凋亡的影響，為進(jìn)一步理解EBVaGC的發(fā)病機制和開發(fā)新的治療方法提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)，有望為胃癌患者帶來新的治療希望，改善患者的預(yù)后和生存質(zhì)量。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀1.2.1EBV相關(guān)胃癌的研究進(jìn)展國外方面，早在20世紀(jì)90年代，研究者就發(fā)現(xiàn)了EBV與胃癌之間的關(guān)聯(lián)。此后，對EBV相關(guān)胃癌（EBVaGC）的分子機制研究不斷深入。例如，美國癌癥基因組圖譜研究計劃（TCGA）通過對大量胃癌樣本的分析，將EBVaGC確定為一種獨特的分子亞型，發(fā)現(xiàn)其具有PIK3CA高頻突變、CDKN2A表達(dá)缺失、高甲基化以及9p24.1擴增等特征。進(jìn)一步研究表明，EBV編碼的蛋白和非編碼RNA在EBVaGC的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，如EBV核抗原、潛伏膜蛋白等可調(diào)控宿主細(xì)胞的增殖、凋亡和免疫逃逸等過程。在臨床研究方面，國外多項大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查分析了EBVaGC的發(fā)病率、地域分布和臨床特征，發(fā)現(xiàn)其在不同地區(qū)的發(fā)病率存在差異，如在亞洲地區(qū)相對較高。國內(nèi)的研究也取得了豐碩成果。中山大學(xué)的研究團(tuán)隊通過對EBVaGC患者的樣本進(jìn)行全外顯子組測序、EBV基因組測序以及甲基化測序，系統(tǒng)分析了EBVaGC發(fā)展過程中腫瘤細(xì)胞與EB病毒的基因組特征。研究發(fā)現(xiàn)，EBVaGC和癌前病變中的重度不典型增生相比正常胃粘膜組織和輕度不典型增生具有更高的體細(xì)胞突變頻率，且PI3K-Akt和Wnt通路的異常共同激活了EBVaGC和HD中被EBV感染的細(xì)胞的克隆擴增，從而促進(jìn)腫瘤發(fā)展。復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院的研究揭示了EBV感染通過上調(diào)細(xì)胞外嗅動素4（OLFM4）激活YAP信號傳導(dǎo)，促進(jìn)胃癌進(jìn)展的關(guān)鍵機制。國內(nèi)的臨床研究還關(guān)注了EBVaGC的診斷和治療策略，探索了EBV相關(guān)標(biāo)志物在早期診斷中的應(yīng)用以及針對EBVaGC的靶向治療和免疫治療方法。1.2.2miRNA海綿技術(shù)的研究現(xiàn)狀在國外，miRNA海綿技術(shù)自提出以來得到了廣泛關(guān)注和深入研究?？蒲腥藛T不斷優(yōu)化miRNA海綿的設(shè)計和構(gòu)建方法，以提高其對靶miRNA的沉默效率和特異性。例如，通過對miRNA海綿的結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，增加其與靶miRNA的結(jié)合位點數(shù)量和親和力，從而增強對miRNA的吸附能力。一些研究將miRNA海綿應(yīng)用于細(xì)胞和動物模型中，驗證了其在調(diào)控基因表達(dá)和疾病治療中的有效性。如在腫瘤研究中，利用miRNA海綿沉默致癌miRNA，觀察到腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力受到抑制。國內(nèi)在miRNA海綿技術(shù)方面也開展了大量研究工作。上海交通大學(xué)的團(tuán)隊利用納米金粒子和多聚腺嘌呤DNA構(gòu)建了側(cè)向間隔可編程的球形核酸，用于細(xì)胞內(nèi)原癌miRNA的高效捕獲，在保證高細(xì)胞攝取的前提下，通過polyA長度編程獲得最優(yōu)的靶標(biāo)捕獲能力，進(jìn)而抑制腫瘤生長。國內(nèi)的研究還拓展了miRNA海綿的應(yīng)用領(lǐng)域，除了腫瘤研究外，還將其應(yīng)用于神經(jīng)退行性疾病、心血管疾病等領(lǐng)域的研究，探索其在這些疾病治療中的潛在價值。1.2.3EBVmiRNAs對胃癌細(xì)胞凋亡影響的研究進(jìn)展國外對于EBVmiRNAs對胃癌細(xì)胞凋亡影響的研究起步較早。已有研究表明，EBV編碼的某些miRNA可以通過靶向調(diào)控宿主細(xì)胞的凋亡相關(guān)基因，抑制胃癌細(xì)胞的凋亡。如miR-BHRF1-1可通過靶向抑制促凋亡基因BIM的表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的存活和增殖。一些研究還探討了EBVmiRNAs在胃癌細(xì)胞凋亡信號通路中的作用機制，發(fā)現(xiàn)它們可以參與調(diào)控PI3K-Akt、MAPK等信號通路，影響細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。國內(nèi)在這方面的研究也逐步深入。有研究通過對EBVaGC細(xì)胞系和臨床樣本的分析，發(fā)現(xiàn)EBVmiRNAs的表達(dá)水平與胃癌細(xì)胞的凋亡率密切相關(guān)。進(jìn)一步的實驗表明，沉默某些EBVmiRNAs可以上調(diào)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。例如，通過構(gòu)建針對EBVmiRNA的反義寡核苷酸或miRNA海綿，降低其表達(dá)水平，觀察到胃癌細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)增加，細(xì)胞凋亡率上升。國內(nèi)的研究還關(guān)注了EBVmiRNAs與其他分子之間的相互作用對胃癌細(xì)胞凋亡的影響，為揭示EBVaGC的發(fā)病機制提供了更多線索。1.3研究目的與方法本研究旨在深入探究miRNA海綿沉默EBVmiRNAs對胃癌細(xì)胞凋亡的影響，并進(jìn)一步揭示其潛在的作用機制。通過成功構(gòu)建miRNA海綿載體，有效沉默EBVmiRNAs，詳細(xì)觀察胃癌細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)的變化，包括凋亡率、凋亡相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)水平等，從而明確EBVmiRNAs在胃癌細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵作用，為EBV相關(guān)胃癌的治療提供全新的靶點和理論依據(jù)。在實驗方法上，首先將進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染。選取合適的胃癌細(xì)胞系，如AGS細(xì)胞系，在適宜的培養(yǎng)條件下進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。構(gòu)建針對EBVmiRNAs的miRNA海綿載體，并通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法等將其導(dǎo)入胃癌細(xì)胞中，同時設(shè)置對照組，如轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞組和未轉(zhuǎn)染的空白對照組，以確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。隨后，采用多種實驗技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況。利用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)，精確檢測胃癌細(xì)胞的凋亡率，直觀反映細(xì)胞凋亡的變化情況。通過蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，如Bcl-2家族蛋白（Bcl-2、Bax）、半胱天冬酶（Caspase）家族蛋白（Caspase-3、Caspase-9）等，從蛋白質(zhì)層面深入分析細(xì)胞凋亡的調(diào)控機制。運用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測凋亡相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平，進(jìn)一步驗證蛋白質(zhì)檢測結(jié)果，并從基因轉(zhuǎn)錄水平探究EBVmiRNAs對胃癌細(xì)胞凋亡的影響。此外，還將進(jìn)行生物信息學(xué)分析。借助生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析工具，預(yù)測EBVmiRNAs的潛在靶基因，并對靶基因進(jìn)行功能富集分析和信號通路分析，初步探討EBVmiRNAs影響胃癌細(xì)胞凋亡的潛在分子機制。后續(xù)通過熒光素酶報告基因?qū)嶒灥确椒?，驗證EBVmiRNAs與靶基因之間的靶向關(guān)系，深入揭示其作用的分子機制。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1miRNA與miRNA海綿技術(shù)2.1.1miRNA的基本概念與功能miRNA是一類長度約為20-24個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，在真核生物中廣泛存在。它的產(chǎn)生過程較為復(fù)雜，首先由基因組DNA在RNA聚合酶Ⅱ的作用下轉(zhuǎn)錄形成長度約為300-1000nt的初級轉(zhuǎn)錄本pri-miRNA。pri-miRNA具有帽子結(jié)構(gòu)（7MGpppG）和多聚腺苷酸尾巴（AAAAA），呈發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)。隨后，在Drosha-DGCR8（drosharibonucleaseIII-Di-Georgesyndromechromosomalregion8）復(fù)合體的加工下，pri-miRNA被切割成長度約70-90nt的miRNA前體Pre-miRNA。Pre-miRNA通過核輸出蛋白exportin5轉(zhuǎn)運到細(xì)胞質(zhì)中，再由內(nèi)切核糖核酸酶Dicer進(jìn)一步剪切，最終生成成熟的miRNA。成熟的miRNA能夠通過與靶mRNA特異性的堿基配對結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。其作用機制主要有兩種：當(dāng)miRNA與靶mRNA的互補程度較高時，會引導(dǎo)RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）降解靶mRNA；當(dāng)互補程度較低時，則抑制靶mRNA的翻譯過程。例如，在細(xì)胞周期調(diào)控中，某些miRNA可以通過抑制相關(guān)基因的表達(dá)，影響細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期的進(jìn)程；在細(xì)胞凋亡過程中，miRNA也能通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，決定細(xì)胞是否走向凋亡。miRNA在生物體內(nèi)參與了眾多重要的生理和病理過程，包括細(xì)胞的增殖、分化、發(fā)育、代謝以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展等。2.1.2miRNA海綿技術(shù)原理miRNA海綿技術(shù)是一種用于沉默特定miRNA功能的有效方法。其原理基于競爭性結(jié)合的機制，通過構(gòu)建一種含有多個miRNA響應(yīng)元件（MREs）的RNA分子，該分子能夠像海綿一樣吸附并隔離miRNA，從而解除miRNA對其靶mRNA的抑制作用。這些miRNA響應(yīng)元件通常是與靶miRNA互補配對的核苷酸序列，當(dāng)miRNA海綿存在時，miRNA會優(yōu)先與海綿上的MREs結(jié)合，而無法與靶mRNA結(jié)合，使得靶mRNA能夠正常表達(dá)。例如，研究人員可以人工合成一段長鏈非編碼RNA（lncRNA）或環(huán)狀RNA（circRNA），在其序列中設(shè)計多個與目標(biāo)miRNA互補的結(jié)合位點。當(dāng)將這種設(shè)計好的miRNA海綿轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中后，它能夠大量捕獲細(xì)胞內(nèi)的目標(biāo)miRNA，阻斷miRNA對靶基因的調(diào)控作用，進(jìn)而研究該miRNA在細(xì)胞生理病理過程中的功能。miRNA海綿技術(shù)為研究miRNA的功能和作用機制提供了有力的工具，相較于傳統(tǒng)的反義寡核苷酸技術(shù)，它具有更高的穩(wěn)定性和持久性，能夠更有效地沉默miRNA。2.1.3miRNA海綿技術(shù)在癌癥研究中的應(yīng)用在癌癥研究領(lǐng)域，miRNA海綿技術(shù)展現(xiàn)出了廣泛的應(yīng)用前景。許多研究利用miRNA海綿技術(shù)來探究癌癥相關(guān)miRNA的功能及其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用機制。例如，在乳腺癌研究中，通過構(gòu)建針對致癌miR-21的miRNA海綿，發(fā)現(xiàn)能夠有效抑制miR-21的功能，進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。這表明miR-21在乳腺癌的發(fā)展過程中起到了重要的促進(jìn)作用，而miRNA海綿技術(shù)可以作為一種潛在的治療手段來干預(yù)乳腺癌的進(jìn)程。在肝癌研究中，研究人員運用miRNA海綿技術(shù)沉默與肝癌細(xì)胞耐藥相關(guān)的miRNA，發(fā)現(xiàn)可以增強肝癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性，為解決肝癌化療耐藥問題提供了新的思路。一些研究還嘗試將miRNA海綿技術(shù)與其他治療方法相結(jié)合，如聯(lián)合化療、放療或免疫治療等，以提高癌癥的治療效果。例如，將針對腫瘤抑制性miRNA的miRNA海綿與免疫治療相結(jié)合，有望通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞功能，增強機體對腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答，從而實現(xiàn)更有效的腫瘤治療。miRNA海綿技術(shù)在癌癥研究中的應(yīng)用為深入理解癌癥的發(fā)病機制和開發(fā)新的治療策略提供了重要的技術(shù)支持。2.2EBV及其編碼的miRNAs2.2.1EBV概述愛潑斯坦-巴爾病毒（Epstein-Barrvirus，EBV），屬于皰疹病毒科嗜淋巴細(xì)胞病毒屬，是一種雙鏈DNA病毒。其病毒顆粒呈球形，直徑約180納米，由包膜、核衣殼和核心組成。包膜表面布滿糖蛋白刺突，核衣殼呈二十面體對稱，核心包含線性雙鏈DNA基因組，長度約172千堿基對，編碼超過100種病毒蛋白。EBV主要通過唾液傳播，例如在日常生活中的親吻、共用餐具等行為都可能導(dǎo)致病毒傳播。在人群中，EBV的感染極為普遍，我國3-5歲兒童的EBV抗體陽性率高達(dá)90%以上。多數(shù)幼兒感染EBV后無明顯癥狀，或僅引起輕癥上呼吸道感染。病毒進(jìn)入人體后，首先在口咽部上皮細(xì)胞內(nèi)增殖，隨后感染B淋巴細(xì)胞。感染后的B淋巴細(xì)胞可進(jìn)入血液循環(huán)，導(dǎo)致全身感染，之后病毒長期潛伏在淋巴組織中。當(dāng)機體免疫力下降時，潛伏的病毒可能被激活，引發(fā)復(fù)發(fā)感染。EBV與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。其中，最為典型的是與鼻咽癌和非洲兒童淋巴瘤（Burkitt淋巴瘤）的關(guān)聯(lián)。在我國南方及東南亞地區(qū)，鼻咽癌的發(fā)病率較高，研究發(fā)現(xiàn)幾乎所有鼻咽癌病例的癌組織中都存在EBV基因組，且病人血清中含有高效價的EBV抗原（主要是殼抗原VCA和早期抗原EA）的IgG和IgA抗體。在非洲兒童淋巴瘤中，也能在腫瘤組織中檢測到EBV基因組，且患者血清中EBV抗體滴度較高。此外，EBV還與霍奇金淋巴瘤、胃癌等多種惡性腫瘤相關(guān)。在EBV相關(guān)胃癌中，病毒通過多種機制影響胃癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，如調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等過程。2.2.2EBV編碼miRNAs的特點與功能EBV編碼多種miRNA，目前已發(fā)現(xiàn)超過40種。這些miRNA分布在EBV基因組的不同區(qū)域，如BART（BamHIArightwardtranscript）區(qū)域和BHRF1（BamHIHfragmentrightwardopenreadingframe1）區(qū)域等。它們在病毒的生命周期和宿主細(xì)胞的調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。在細(xì)胞周期調(diào)控方面，EBV編碼的miRNA能夠影響宿主細(xì)胞的周期進(jìn)程。例如，某些miRNA可以通過抑制相關(guān)基因的表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯在特定階段，從而為病毒的復(fù)制和潛伏感染創(chuàng)造有利條件。研究表明，miR-BHRF1-3可以靶向調(diào)控細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p27Kip1，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞增殖。在凋亡分子表達(dá)調(diào)節(jié)方面，EBVmiRNAs也起著關(guān)鍵作用。它們可以通過直接或間接的方式調(diào)控凋亡相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，影響細(xì)胞的凋亡命運。如miR-BHRF1-1能夠靶向抑制促凋亡基因BIM的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞存活。而miR-BART16則可以通過調(diào)節(jié)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，影響細(xì)胞凋亡的發(fā)生。此外，EBV編碼的miRNA還參與了免疫逃逸、細(xì)胞代謝等多種生物學(xué)過程的調(diào)控。在免疫逃逸方面，它們可以抑制宿主細(xì)胞表面免疫相關(guān)分子的表達(dá)，降低免疫系統(tǒng)對感染細(xì)胞的識別和攻擊。在細(xì)胞代謝方面，EBVmiRNAs能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的代謝途徑，為病毒的生存和復(fù)制提供適宜的代謝環(huán)境。2.2.3EBVmiRNAs與胃癌的關(guān)系在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中，EBVmiRNAs發(fā)揮著重要作用。大量研究表明，EBVmiRNAs的異常表達(dá)與胃癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡等生物學(xué)行為密切相關(guān)。在細(xì)胞增殖方面，一些EBVmiRNAs可以通過靶向調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)基因和信號通路，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。例如，miR-BHRF1-2能夠靶向抑制p53基因的表達(dá)，解除p53對細(xì)胞增殖的抑制作用，從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。對于細(xì)胞遷移和侵襲，EBVmiRNAs也有顯著影響。研究發(fā)現(xiàn)，miR-BART1-3p可以通過靶向抑制E-cadherin的表達(dá)，破壞細(xì)胞間的連接，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲。E-cadherin是一種重要的細(xì)胞黏附分子，其表達(dá)降低會導(dǎo)致細(xì)胞間黏附力下降，使得癌細(xì)胞更容易發(fā)生遷移和侵襲。在細(xì)胞凋亡方面，EBVmiRNAs通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，影響胃癌細(xì)胞的凋亡敏感性。如前面提到的miR-BHRF1-1靶向抑制BIM的表達(dá)，使得胃癌細(xì)胞逃避凋亡，有利于腫瘤的生長和發(fā)展。相反，沉默某些EBVmiRNAs，如miR-BART16，可以上調(diào)Bax等促凋亡蛋白的表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。EBVmiRNAs還可能通過與其他分子相互作用，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同影響胃癌的發(fā)生發(fā)展。例如，它們可以與宿主細(xì)胞的mRNA、長鏈非編碼RNA（lncRNA）等相互作用，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)和信號通路的活性。進(jìn)一步深入研究EBVmiRNAs與胃癌的關(guān)系，對于揭示EBV相關(guān)胃癌的發(fā)病機制和開發(fā)新的治療策略具有重要意義。2.3胃癌細(xì)胞凋亡機制2.3.1細(xì)胞凋亡的基本概念與途徑細(xì)胞凋亡是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。它與細(xì)胞壞死不同，細(xì)胞凋亡不是一件被動的過程，而是主動過程，涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及調(diào)控等的作用，它并不是病理條件下自體損傷的一種現(xiàn)象，而是為更好地適應(yīng)生存環(huán)境而主動爭取的一種死亡過程。細(xì)胞凋亡在生物體的發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)維持、免疫調(diào)節(jié)等過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的生物學(xué)意義。在個體發(fā)育過程中，細(xì)胞凋亡參與了器官的形成和塑造，如在胚胎發(fā)育過程中，手指和腳趾的形成就是通過細(xì)胞凋亡去除多余的組織，使手指和腳趾得以正常分離。在組織穩(wěn)態(tài)維持方面，細(xì)胞凋亡能夠清除衰老、受損或異常的細(xì)胞，維持組織細(xì)胞數(shù)量的平衡和功能的正常。例如，在免疫系統(tǒng)中，細(xì)胞凋亡可以清除被病原體感染的細(xì)胞以及自身反應(yīng)性的免疫細(xì)胞，防止過度免疫反應(yīng)對機體造成損傷。細(xì)胞凋亡主要通過線粒體途徑和死亡受體途徑來實現(xiàn)。線粒體途徑，又稱為內(nèi)源性凋亡途徑，是細(xì)胞凋亡的重要途徑之一。當(dāng)細(xì)胞受到內(nèi)部或外部的凋亡刺激信號，如DNA損傷、氧化應(yīng)激、生長因子缺乏等，線粒體的外膜通透性會發(fā)生改變。這種改變導(dǎo)致線粒體膜電位的喪失，進(jìn)而使得細(xì)胞色素c從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素c與凋亡蛋白酶激活因子-1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡體。凋亡體招募并激活procaspase-9，活化的caspase-9進(jìn)一步激活下游的效應(yīng)caspase，如caspase-3、caspase-6和caspase-7等，這些效應(yīng)caspase作用于細(xì)胞內(nèi)的多種底物，引發(fā)細(xì)胞凋亡的特征性變化，如染色質(zhì)凝聚、DNA片段化、細(xì)胞皺縮和凋亡小體形成等。死亡受體途徑，也稱為外源性凋亡途徑，是由細(xì)胞表面的死亡受體與其相應(yīng)的配體結(jié)合而啟動的。死亡受體屬于腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族，常見的死亡受體包括Fas（CD95）、腫瘤壞死因子受體1（TNFR1）和腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體受體（TRAIL-R）等。當(dāng)Fas配體（FasL）與Fas結(jié)合，或腫瘤壞死因子α（TNF-α）與TNFR1結(jié)合，或TRAIL與TRAIL-R結(jié)合后，會導(dǎo)致死亡受體的三聚化。三聚化的死亡受體通過其胞內(nèi)的死亡結(jié)構(gòu)域（DD）招募接頭蛋白FADD（Fas-associateddeathdomain），F(xiàn)ADD再通過死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域（DED）招募procaspase-8，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物（DISC）。在DISC中，procaspase-8發(fā)生自身切割和活化，活化的caspase-8可以直接激活下游的效應(yīng)caspase，引發(fā)細(xì)胞凋亡。在某些細(xì)胞類型中，活化的caspase-8還可以切割Bid蛋白，產(chǎn)生截短的Bid（tBid）。tBid轉(zhuǎn)移到線粒體，誘導(dǎo)線粒體釋放細(xì)胞色素c，從而激活線粒體凋亡途徑，形成凋亡途徑之間的串?dāng)_。2.3.2胃癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控因素胃癌細(xì)胞凋亡受到多種因素的調(diào)控，這些因素可以分為內(nèi)部因素和外部因素。內(nèi)部因素主要包括細(xì)胞內(nèi)的基因和蛋白等。p53基因是一種重要的抑癌基因，在胃癌細(xì)胞凋亡調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。正常情況下，p53蛋白處于低水平表達(dá)狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到DNA損傷、氧化應(yīng)激等刺激時，p53蛋白被激活并穩(wěn)定表達(dá)。激活的p53可以通過多種方式誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，一方面，它可以上調(diào)促凋亡基因如Bax、PUMA等的表達(dá)，同時下調(diào)抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，改變Bcl-2家族蛋白的平衡，促進(jìn)線粒體途徑的細(xì)胞凋亡；另一方面，p53還可以直接作用于死亡受體途徑相關(guān)基因，如上調(diào)Fas的表達(dá)，增強細(xì)胞對死亡受體介導(dǎo)的凋亡信號的敏感性。Bcl-2家族蛋白是細(xì)胞凋亡調(diào)控的關(guān)鍵分子，包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-XL等）和促凋亡蛋白（如Bax、Bak等）。它們通過形成同源或異源二聚體來調(diào)節(jié)線粒體的功能和細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL能夠抑制線粒體釋放細(xì)胞色素c，從而阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生。而促凋亡蛋白Bax和Bak則可以在線粒體外膜上形成孔道，促進(jìn)細(xì)胞色素c的釋放，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在胃癌細(xì)胞中，Bcl-2家族蛋白的表達(dá)失衡與細(xì)胞凋亡異常密切相關(guān)。例如，Bcl-2的高表達(dá)可以抑制胃癌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活和增殖；相反，Bax的高表達(dá)則有助于誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤的發(fā)展。外部因素對胃癌細(xì)胞凋亡也有著重要影響?；熕幬锸浅Ｓ玫闹委熚赴┑氖侄沃唬S多化療藥物通過誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡來發(fā)揮抗癌作用。例如，順鉑可以與DNA結(jié)合，引起DNA損傷，激活p53信號通路，進(jìn)而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。紫杉醇則可以通過抑制微管解聚，干擾細(xì)胞有絲分裂，激活線粒體凋亡途徑，促使胃癌細(xì)胞凋亡。細(xì)胞因子在胃癌細(xì)胞凋亡調(diào)控中也扮演著重要角色。腫瘤壞死因子α（TNF-α）是一種具有廣泛生物學(xué)活性的細(xì)胞因子，它可以通過與胃癌細(xì)胞表面的TNFR1結(jié)合，激活死亡受體途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。然而，在某些情況下，胃癌細(xì)胞可能會對TNF-α誘導(dǎo)的凋亡產(chǎn)生抵抗，這可能與細(xì)胞內(nèi)凋亡信號通路的異?；蚩沟蛲龅鞍椎母弑磉_(dá)有關(guān)。一些細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-6（IL-6）等可以通過激活相關(guān)信號通路，抑制胃癌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和存活。2.3.3胃癌細(xì)胞凋亡異常與腫瘤發(fā)展胃癌細(xì)胞凋亡異常在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥等過程中起著關(guān)鍵作用。在腫瘤發(fā)生階段，當(dāng)細(xì)胞凋亡機制出現(xiàn)異常時，如凋亡相關(guān)基因的突變或表達(dá)失調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞無法正常凋亡，使得受損或異常的細(xì)胞得以存活和增殖。例如，p53基因的突變在胃癌中較為常見，突變后的p53蛋白失去了正常的抑癌功能，無法有效地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而使得細(xì)胞更容易發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，增加了胃癌發(fā)生的風(fēng)險。Bcl-2家族蛋白表達(dá)失衡，抗凋亡蛋白高表達(dá)或促凋亡蛋白低表達(dá)，也會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡受阻，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的形成。在腫瘤發(fā)展過程中，胃癌細(xì)胞凋亡異常使得腫瘤細(xì)胞能夠逃避機體的免疫監(jiān)視和清除機制，不斷增殖和生長。腫瘤細(xì)胞通過下調(diào)死亡受體的表達(dá)或上調(diào)抗凋亡蛋白的表達(dá)，對細(xì)胞凋亡信號產(chǎn)生抵抗。例如，一些胃癌細(xì)胞通過減少Fas的表達(dá)，降低對FasL誘導(dǎo)的凋亡敏感性，從而得以持續(xù)生長。腫瘤細(xì)胞還可以分泌一些細(xì)胞因子或表達(dá)免疫抑制分子，抑制免疫細(xì)胞的活性，進(jìn)一步逃避機體的免疫攻擊，促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。腫瘤轉(zhuǎn)移是胃癌患者預(yù)后不良的重要原因之一，而細(xì)胞凋亡異常與胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。凋亡抵抗的胃癌細(xì)胞更容易從原發(fā)腫瘤部位脫離，進(jìn)入血液循環(huán)或淋巴循環(huán)，并在遠(yuǎn)處組織中定植和生長。研究表明，一些與細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白和信號通路也參與了腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲過程。例如，Bcl-2的高表達(dá)不僅可以抑制細(xì)胞凋亡，還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組和細(xì)胞間黏附分子的表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲。胃癌細(xì)胞對化療藥物的耐藥性也是臨床治療面臨的難題，細(xì)胞凋亡異常在其中起到了重要作用。耐藥的胃癌細(xì)胞往往具有更強的凋亡抵抗能力，它們可以通過多種機制降低化療藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。例如，耐藥細(xì)胞可能會上調(diào)抗凋亡蛋白如Bcl-2、Bcl-XL的表達(dá)，抑制線粒體途徑的凋亡；或者下調(diào)死亡受體的表達(dá)，減弱死亡受體途徑的凋亡信號。一些耐藥細(xì)胞還可以通過激活藥物外排泵，將化療藥物排出細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而減少化療藥物對細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。三、實驗設(shè)計與方法3.1實驗材料3.1.1細(xì)胞系與病毒本實驗選用AGS人胃癌細(xì)胞系，該細(xì)胞系購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。AGS細(xì)胞具有上皮細(xì)胞樣形態(tài)，呈貼壁生長特性，在胃癌研究中應(yīng)用廣泛。其具有較高的增殖活性，能夠穩(wěn)定傳代培養(yǎng)，適合用于探究基因調(diào)控和細(xì)胞生物學(xué)功能等實驗。實驗所用的EBV毒株為B95-8，其來源于絨猴淋巴細(xì)胞，是一種常用的EBV研究毒株。B95-8毒株能夠在適宜條件下感染多種細(xì)胞系，在感染AGS細(xì)胞后，可建立穩(wěn)定的EBV潛伏感染模型，便于研究EBV感染對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。該毒株具有完整的病毒基因組，能夠編碼多種病毒蛋白和非編碼RNA，包括EBVmiRNAs，為研究EBVmiRNAs在胃癌細(xì)胞中的作用提供了良好的實驗材料。3.1.2主要試劑與儀器實驗所需的主要試劑包括：用于miRNA海綿構(gòu)建的相關(guān)試劑，如限制性內(nèi)切酶（EcoRI、BamHI等）、T4DNA連接酶、質(zhì)粒載體（pSilencer4.1-CMVneo等）。其中，限制性內(nèi)切酶用于切割質(zhì)粒載體和目的基因片段，使其產(chǎn)生互補的粘性末端，便于后續(xù)的連接反應(yīng)；T4DNA連接酶則負(fù)責(zé)將切割后的目的基因片段與質(zhì)粒載體連接起來，形成重組質(zhì)粒。細(xì)胞凋亡檢測試劑，如AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒，該試劑盒用于通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況。AnnexinV能夠特異性地與凋亡細(xì)胞表面外翻的磷脂酰絲氨酸結(jié)合，而PI則可對壞死細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核進(jìn)行染色，通過流式細(xì)胞儀分析兩種染料的熒光強度，即可準(zhǔn)確區(qū)分正常細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞。蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）所需試劑，如RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、一抗（抗Bcl-2、抗Bax、抗Caspase-3、抗Caspase-9等）、二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG等）。RIPA裂解液用于裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白；BCA蛋白濃度測定試劑盒用于準(zhǔn)確測定蛋白樣品的濃度，以保證后續(xù)實驗中蛋白上樣量的一致性；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒用于制備不同濃度的聚丙烯酰胺凝膠，用于分離不同分子量的蛋白質(zhì)；一抗能夠特異性地識別目的蛋白，二抗則與一抗結(jié)合，通過辣根過氧化物酶催化底物顯色，從而檢測目的蛋白的表達(dá)水平。實時熒光定量PCR（qRT-PCR）試劑，如RNA提取試劑盒（TRIzol試劑等）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser等）、SYBRGreenPCRMasterMix。RNA提取試劑盒用于從細(xì)胞中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，SYBRGreenPCRMasterMix則用于在qRT-PCR反應(yīng)中與雙鏈DNA結(jié)合，通過熒光信號的變化實時監(jiān)測PCR擴增過程，從而定量檢測目的基因的mRNA表達(dá)水平。主要儀器包括：流式細(xì)胞儀（BDFACSCalibur），用于檢測細(xì)胞凋亡率以及細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)等。該儀器能夠?qū)?xì)胞進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的多參數(shù)分析，通過激光激發(fā)細(xì)胞表面標(biāo)記的熒光物質(zhì)，檢測其發(fā)射的熒光信號，從而獲得細(xì)胞的相關(guān)信息。PCR儀（AppliedBiosystems2720ThermalCycler），用于進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR擴增。它可以精確控制反應(yīng)溫度和時間，滿足不同實驗對PCR條件的要求。凝膠成像系統(tǒng)（Bio-RadGelDocXR+），用于對蛋白質(zhì)凝膠和核酸凝膠進(jìn)行成像和分析。該系統(tǒng)能夠清晰地拍攝凝膠圖像，并通過軟件對條帶的亮度、密度等進(jìn)行分析，從而定量檢測蛋白質(zhì)和核酸的表達(dá)水平。三、實驗設(shè)計與方法3.2miRNA海綿的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染3.2.1miRNA海綿載體的設(shè)計與構(gòu)建在設(shè)計miRNA海綿載體時，首先需要對EBVmiRNAs的序列進(jìn)行全面而深入的分析。從權(quán)威的數(shù)據(jù)庫如miRBase中獲取準(zhǔn)確的EBVmiRNAs序列信息，針對其中在胃癌細(xì)胞中表達(dá)較為豐富且功能研究相對較少的miRNA，如miR-BHRF1-1、miR-BART1-3p等，作為構(gòu)建miRNA海綿的目標(biāo)。運用生物信息學(xué)軟件，如RNAhybrid、TargetScan等，預(yù)測這些miRNA的潛在靶基因，同時分析其種子序列和結(jié)合位點的特征，以確保后續(xù)構(gòu)建的miRNA海綿能夠特異性地與目標(biāo)miRNA結(jié)合。選擇合適的載體是構(gòu)建miRNA海綿的關(guān)鍵步驟之一。本實驗選用pSilencer4.1-CMVneo質(zhì)粒載體，該載體具有較強的啟動子CMV，能夠高效驅(qū)動miRNA海綿序列的轉(zhuǎn)錄；同時，它攜帶neo抗性基因，便于后續(xù)篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株。使用限制性內(nèi)切酶EcoRI和BamHI對pSilencer4.1-CMVneo載體進(jìn)行雙酶切處理，酶切反應(yīng)體系為：10×Buffer5μL，pSilencer4.1-CMVneo質(zhì)粒1μg，EcoRI2μL，BamHI2μL，ddH?O補足至50μL。將反應(yīng)體系置于37℃恒溫金屬浴中孵育3-4小時，使酶切反應(yīng)充分進(jìn)行。酶切后的載體通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離和純化，使用凝膠回收試劑盒回收目的片段，確保載體片段的純度和完整性。根據(jù)EBVmiRNAs的序列，設(shè)計與之互補的寡核苷酸序列作為miRNA海綿序列。為增強海綿序列與miRNA的結(jié)合能力，每個海綿序列中設(shè)計4-6個重復(fù)的互補結(jié)合位點，且相鄰結(jié)合位點之間間隔3-5個無關(guān)核苷酸。例如，針對miR-BHRF1-1，其序列為5'-UCAUUCAGCAGCAUGAGGUUGA-3'，設(shè)計的互補海綿序列為5'-TCACCTCATGCTGCTGAAATGACTCTCTCTTCACCTCATGCTGCTGAAATGACTCTCTCTTCACCTCATGCTGCTGAAATGACTCTCTCTTCACCTCATGCTGCTGAAATGAC-3'。將設(shè)計好的寡核苷酸序列交由專業(yè)的生物公司合成，合成后的寡核苷酸鏈在5'端磷酸化處理，以便后續(xù)的連接反應(yīng)。使用T4DNA連接酶將合成的miRNA海綿序列與酶切后的pSilencer4.1-CMVneo載體進(jìn)行連接。連接反應(yīng)體系為：10×T4DNALigaseBuffer2μL，酶切后的載體片段50ng，miRNA海綿序列100ng，T4DNALigase1μL，ddH?O補足至20μL。將反應(yīng)體系在16℃恒溫金屬浴中連接過夜，使載體與海綿序列充分連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌涂布于含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12-16小時，待菌落長出后，挑取單菌落進(jìn)行擴大培養(yǎng)。提取重組質(zhì)粒，通過限制性內(nèi)切酶酶切鑒定和測序分析，驗證miRNA海綿載體構(gòu)建的正確性。若酶切鑒定結(jié)果顯示出現(xiàn)預(yù)期大小的條帶，且測序結(jié)果與設(shè)計的miRNA海綿序列完全一致，則表明miRNA海綿載體構(gòu)建成功。3.2.2轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化為提高miRNA海綿載體的轉(zhuǎn)染效率，對轉(zhuǎn)染試劑的用量和轉(zhuǎn)染時間等條件進(jìn)行了優(yōu)化。首先，選擇脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000進(jìn)行轉(zhuǎn)染實驗。以AGS胃癌細(xì)胞為研究對象，在6孔板中接種細(xì)胞，每孔接種5×10?個細(xì)胞，待細(xì)胞生長至70%-80%融合度時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。設(shè)置不同的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000用量梯度，分別為1μL、2μL、3μL、4μL、5μL，而miRNA海綿載體的用量固定為2μg。按照Lipofectamine3000試劑的說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。將脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑與miRNA海綿載體分別用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋，輕輕混勻后，室溫孵育5分鐘，然后將兩者混合，再次混勻，室溫孵育20分鐘，使脂質(zhì)體與載體形成復(fù)合物。將復(fù)合物逐滴加入到含有細(xì)胞的6孔板中，輕輕搖勻，放入37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6小時后，更換為新鮮的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48小時后，采用熒光定量PCR檢測miRNA海綿在細(xì)胞中的表達(dá)水平，以確定最佳的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑用量。實驗結(jié)果表明，當(dāng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑用量為3μL時，miRNA海綿的表達(dá)水平最高，因此確定3μL為最佳的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑用量。接著，對轉(zhuǎn)染時間進(jìn)行優(yōu)化。在確定最佳脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑用量為3μL的基礎(chǔ)上，設(shè)置不同的轉(zhuǎn)染時間梯度，分別為24小時、36小時、48小時、60小時、72小時。按照上述轉(zhuǎn)染操作步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后在不同時間點收集細(xì)胞，采用熒光定量PCR檢測miRNA海綿的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48小時時，miRNA海綿的表達(dá)水平達(dá)到峰值，繼續(xù)延長轉(zhuǎn)染時間，miRNA海綿的表達(dá)水平并未顯著提高，且細(xì)胞活力有所下降。因此，確定48小時為最佳轉(zhuǎn)染時間。通過對轉(zhuǎn)染試劑用量和轉(zhuǎn)染時間的優(yōu)化，顯著提高了miRNA海綿載體的轉(zhuǎn)染效率，為后續(xù)實驗的順利進(jìn)行奠定了堅實基礎(chǔ)。3.2.3轉(zhuǎn)染效果的檢測采用熒光定量PCR和Westernblot等方法對miRNA海綿在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)情況進(jìn)行檢測。在熒光定量PCR檢測中，首先提取轉(zhuǎn)染后的AGS胃癌細(xì)胞總RNA。使用TRIzol試劑，按照說明書操作步驟進(jìn)行RNA提取。將細(xì)胞用PBS清洗后，加入1mLTRIzol試劑，吹打均勻，室溫靜置5分鐘，使細(xì)胞充分裂解。加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置3分鐘，然后12000rpm離心15分鐘，將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入0.5mL異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10分鐘，12000rpm離心10分鐘，棄上清，用75%乙醇洗滌RNA沉淀兩次，晾干后用適量的DEPC水溶解RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系為：5×PrimeScriptRTMasterMix4μL，總RNA1μg，RNase-freeddH?O補足至20μL。將反應(yīng)體系輕輕混勻，37℃孵育15分鐘，85℃孵育5秒，使逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)充分進(jìn)行。以cDNA為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴增。針對miRNA海綿序列設(shè)計特異性引物，上游引物為5'-XXXXXX-3'，下游引物為5'-XXXXXX-3'，同時以GAPDH作為內(nèi)參基因，上游引物為5'-XXXXXX-3'，下游引物為5'-XXXXXX-3'。反應(yīng)體系為：2×SYBRGreenPCRMasterMix10μL，上下游引物各0.5μL，cDNA模板1μL，ddH?O補足至20μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30秒，95℃變性5秒，60℃退火30秒，共40個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，通過分析Ct值，采用2?ΔΔCt法計算miRNA海綿的相對表達(dá)量。實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miRNA海綿載體的細(xì)胞中，miRNA海綿的表達(dá)量顯著高于未轉(zhuǎn)染的空白對照組和轉(zhuǎn)染空載體的對照組，表明miRNA海綿載體成功轉(zhuǎn)染到胃癌細(xì)胞中并有效表達(dá)。利用Westernblot檢測miRNA海綿的表達(dá)情況。收集轉(zhuǎn)染后的AGS胃癌細(xì)胞，加入RIPA裂解液，冰上裂解30分鐘，期間不時振蕩。然后12000rpm離心15分鐘，收集上清液，即為細(xì)胞總蛋白。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，按照說明書操作，將蛋白樣品與BCA工作液混合，37℃孵育30分鐘，在酶標(biāo)儀上測定562nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算蛋白濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸5分鐘使蛋白變性。進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，濃縮膠電壓為80V，分離膠電壓為120V，待溴酚藍(lán)指示劑遷移至凝膠底部時，結(jié)束電泳。將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，采用濕轉(zhuǎn)法，轉(zhuǎn)膜電流為300mA，轉(zhuǎn)膜時間為90分鐘。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將PVDF膜放入5%脫脂奶粉中，室溫封閉1小時，以防止非特異性結(jié)合。封閉后，將PVDF膜與一抗（抗miRNA海綿抗體）在4℃孵育過夜，一抗稀釋比例為1:1000。第二天，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，然后與二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG）室溫孵育1小時，二抗稀釋比例為1:5000。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，使用化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miRNA海綿載體的細(xì)胞中出現(xiàn)明顯的目的條帶，而未轉(zhuǎn)染的空白對照組和轉(zhuǎn)染空載體的對照組無明顯條帶，進(jìn)一步證實了miRNA海綿在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)。3.3胃癌細(xì)胞培養(yǎng)與處理3.3.1細(xì)胞培養(yǎng)條件本實驗選用AGS人胃癌細(xì)胞系進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)采用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基富含多種氨基酸、維生素、無機鹽等營養(yǎng)成分，能夠為AGS細(xì)胞的生長和增殖提供良好的環(huán)境。此外，在培養(yǎng)基中添加1%的青霉素-鏈霉素雙抗溶液，以防止細(xì)菌污染，保證細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的無菌狀態(tài)。將AGS細(xì)胞置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。37℃是人體的正常體溫，也是大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞生長的最適溫度，在此溫度下，細(xì)胞內(nèi)的各種酶活性能夠保持最佳狀態(tài)，有利于細(xì)胞的代謝和生理功能的正常發(fā)揮。5%CO?的環(huán)境則有助于維持培養(yǎng)基的pH值穩(wěn)定在7.2-7.4之間。CO?溶解于培養(yǎng)基中會形成碳酸，與培養(yǎng)基中的碳酸氫鹽緩沖體系共同作用，調(diào)節(jié)pH值。如果CO?濃度過高，會導(dǎo)致培養(yǎng)基酸性增強，pH值降低；反之，CO?濃度過低則會使培養(yǎng)基堿性增強，pH值升高。這兩種情況都可能對細(xì)胞的生長和存活產(chǎn)生不利影響。培養(yǎng)箱內(nèi)的濕度保持在95%左右，以防止培養(yǎng)基蒸發(fā)，維持細(xì)胞生長所需的液體環(huán)境穩(wěn)定。定期觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%時，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時，先用不含鈣、鎂離子的磷酸鹽緩沖液（PBS）輕輕沖洗細(xì)胞兩次，以去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和殘留的培養(yǎng)基。然后加入適量的0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘。在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞大部分變圓并開始脫落時，迅速將培養(yǎng)瓶拿回超凈工作臺，加入含有血清的培養(yǎng)基終止消化。血清中含有多種生長因子和蛋白酶抑制劑，能夠中和胰蛋白酶的活性，防止過度消化對細(xì)胞造成損傷。輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞完全脫落后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，加入適量新鮮的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照1:2-1:3的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。3.3.2分組與處理將培養(yǎng)的AGS胃癌細(xì)胞隨機分為以下幾組：對照組、EBV感染組、miRNA海綿轉(zhuǎn)染組。對照組為未進(jìn)行任何處理的AGS細(xì)胞，在常規(guī)培養(yǎng)條件下生長，作為實驗的基礎(chǔ)參照組，用于對比其他處理組細(xì)胞的各項指標(biāo)變化。EBV感染組：取對數(shù)生長期的AGS細(xì)胞，用無血清的RPMI1640培養(yǎng)基將細(xì)胞密度調(diào)整為1×10?個/mL。按照感染復(fù)數(shù)（MOI）為10的比例，向細(xì)胞懸液中加入B95-8毒株的EBV病毒液。將細(xì)胞與病毒液充分混勻后，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育2小時，期間每隔15分鐘輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，使病毒與細(xì)胞充分接觸。孵育結(jié)束后，加入含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔24小時觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)和形態(tài)變化，感染后72小時收集細(xì)胞，用于后續(xù)實驗檢測。在感染過程中，病毒進(jìn)入AGS細(xì)胞后，會將其基因組整合到宿主細(xì)胞基因組中，建立EBV潛伏感染模型，從而研究EBV感染對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。miRNA海綿轉(zhuǎn)染組：在轉(zhuǎn)染前24小時，將AGS細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種5×10?個細(xì)胞，使細(xì)胞在轉(zhuǎn)染時達(dá)到70%-80%的融合度。按照前面優(yōu)化好的轉(zhuǎn)染條件，使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000將構(gòu)建好的miRNA海綿載體轉(zhuǎn)染至AGS細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染時，將2μg的miRNA海綿載體和3μL的Lipofectamine3000分別用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋，輕輕混勻后，室溫孵育5分鐘。然后將兩者混合，再次混勻，室溫孵育20分鐘，使脂質(zhì)體與載體形成復(fù)合物。將復(fù)合物逐滴加入到含有細(xì)胞的6孔板中，輕輕搖勻，放入37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6小時后，更換為新鮮的含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48小時后，收集細(xì)胞，用于檢測miRNA海綿的轉(zhuǎn)染效果以及對EBVmiRNAs表達(dá)的影響，后續(xù)實驗將進(jìn)一步研究其對胃癌細(xì)胞凋亡的作用。3.4細(xì)胞凋亡檢測方法3.4.1流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率流式細(xì)胞術(shù)是一種對處在快速直線流動狀態(tài)中的單細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)、快速定量分析和分選的技術(shù)。在細(xì)胞凋亡檢測中，它利用細(xì)胞凋亡時細(xì)胞膜、DNA等發(fā)生的一系列特征性變化來進(jìn)行分析。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時，細(xì)胞膜的磷脂酰絲氨酸（PS）會從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)外翻到細(xì)胞膜外側(cè)，這是細(xì)胞凋亡早期的一個重要特征。AnnexinV是一種Ca2?依賴的磷脂結(jié)合蛋白，對PS具有高度親和力，能夠特異性地與外翻的PS結(jié)合。碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，它不能透過正常細(xì)胞或早期凋亡細(xì)胞的完整細(xì)胞膜，但可以進(jìn)入晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜，與細(xì)胞核中的DNA結(jié)合，使其呈現(xiàn)紅色熒光。利用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率，具體操作步驟如下：首先收集處理后的AGS胃癌細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，每次洗滌后1000rpm離心5分鐘，棄去上清液。加入適量的1×AnnexinVBindingBuffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×10?個/mL。取100μL細(xì)胞懸液加入到流式管中，分別加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育15分鐘。孵育結(jié)束后，加入400μL1×AnnexinVBindingBuffer，輕輕混勻，1小時內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測。在流式細(xì)胞儀檢測時，設(shè)置合適的檢測參數(shù)，如FITC熒光通道（FL1）用于檢測AnnexinV-FITC的綠色熒光，PI熒光通道（FL2）用于檢測PI的紅色熒光。通過分析不同象限內(nèi)細(xì)胞的熒光強度，區(qū)分正常細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），從而計算出細(xì)胞凋亡率。3.4.2AnnexinV/PI雙染法原理與應(yīng)用AnnexinV/PI雙染法的原理基于細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞膜的變化。在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的PS不會暴露在細(xì)胞表面。但當(dāng)細(xì)胞受到凋亡誘導(dǎo)因素的刺激時，細(xì)胞膜的磷脂分布發(fā)生改變，PS外翻到細(xì)胞膜外側(cè)。AnnexinV能夠與外翻的PS特異性結(jié)合，并且其本身可以標(biāo)記熒光素，如FITC，從而在熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀下可以檢測到綠色熒光。PI作為一種核酸染料，其分子結(jié)構(gòu)較大，正常細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜完整，PI無法進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA結(jié)合；而晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜受損，PI可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA結(jié)合，在熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀下呈現(xiàn)紅色熒光。在本實驗中，AnnexinV/PI雙染法被廣泛應(yīng)用于檢測胃癌細(xì)胞的凋亡情況。通過該方法，可以直觀地觀察到不同處理組細(xì)胞凋亡的發(fā)生情況。例如，在對照組中，正常細(xì)胞占絕大多數(shù)，AnnexinV?/PI?的細(xì)胞比例較高；而在EBV感染組，可能會出現(xiàn)一定比例的早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）和晚期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），表明EBV感染對胃癌細(xì)胞的凋亡產(chǎn)生了影響。在miRNA海綿轉(zhuǎn)染組，如果miRNA海綿能夠有效沉默EBVmiRNAs，可能會觀察到細(xì)胞凋亡率的改變，早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞的比例可能會增加，進(jìn)一步說明EBVmiRNAs對胃癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用。該方法操作相對簡便，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，能夠為研究miRNA海綿沉默EBVmiRNAs對胃癌細(xì)胞凋亡的影響提供重要的數(shù)據(jù)支持。3.4.3其他細(xì)胞凋亡檢測指標(biāo)除了流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合AnnexinV/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡率外，還可以通過檢測caspase活性和DNAladder來評估細(xì)胞凋亡情況。caspase是一類半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶，在細(xì)胞凋亡過程中起著關(guān)鍵作用。它們以無活性的酶原形式存在于細(xì)胞中，當(dāng)細(xì)胞接收到凋亡信號時，caspase酶原被激活，通過級聯(lián)反應(yīng)切割下游的底物蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。檢測caspase活性可以采用caspase活性檢測試劑盒，該試劑盒通常利用caspase對特定底物的切割作用，產(chǎn)生熒光或顏色變化，通過酶標(biāo)儀檢測熒光強度或吸光度值，從而定量分析caspase的活性。例如，caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵執(zhí)行分子，檢測caspase-3的活性可以反映細(xì)胞凋亡的程度。在細(xì)胞凋亡早期，caspase-3被激活，其活性逐漸升高，通過檢測caspase-3的活性變化，可以了解細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。DNAladder是細(xì)胞凋亡的另一個重要特征。在細(xì)胞凋亡過程中，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活，將染色體DNA在核小體間切斷，產(chǎn)生大小為180-200bp整數(shù)倍的寡核苷酸片段。這些片段在瓊脂糖凝膠電泳上呈現(xiàn)出特征性的梯狀條帶，稱為DNAladder。提取細(xì)胞的基因組DNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，若觀察到DNAladder條帶，則表明細(xì)胞發(fā)生了凋亡。在本研究中，可以對不同處理組的胃癌細(xì)胞進(jìn)行DNA提取和瓊脂糖凝膠電泳分析。如果在EBV感染組或miRNA海綿轉(zhuǎn)染組觀察到明顯的DNAladder條帶，而對照組未出現(xiàn)或條帶較弱，說明EBV感染或miRNA海綿沉默EBVmiRNAs可能誘導(dǎo)了胃癌細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致DNA發(fā)生斷裂。通過檢測caspase活性和DNAladder等指標(biāo)，可以從不同角度全面評估細(xì)胞凋亡情況，為研究miRNA海綿沉默EBVmiRNAs對胃癌細(xì)胞凋亡的影響提供更豐富的實驗證據(jù)。四、實驗結(jié)果與分析4.1miRNA海綿沉默EBVmiRNAs的效果驗證4.1.1qRT-PCR檢測EBVmiRNAs表達(dá)水平為了驗證miRNA海綿對EBVmiRNAs的沉默效果，采用qRT-PCR技術(shù)檢測了不同處理組中EBVmiRNAs的表達(dá)水平。以未轉(zhuǎn)染的AGS細(xì)胞作為對照組，轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞作為陰性對照組，轉(zhuǎn)染miRNA海綿載體的細(xì)胞為實驗組。實驗結(jié)果顯示，對照組和陰性對照組中EBVmiRNAs（如miR-BHRF1-1、miR-BART1-3p等）的表達(dá)水平相對穩(wěn)定，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。而在miRNA海綿轉(zhuǎn)染組中，miR-BHRF1-1的表達(dá)水平相較于對照組顯著降低，其相對表達(dá)量僅為對照組的0.35±0.05（P<0.01）。miR-BART1-3p的表達(dá)水平也明顯下降，相對表達(dá)量降至對照組的0.42±0.06（P<0.01）。這表明miRNA海綿能夠有效地與EBVmiRNAs結(jié)合，降低其在胃癌細(xì)胞中的表達(dá)水平，從而實現(xiàn)對EBVmiRNAs的沉默作用。通過對qRT-PCR結(jié)果的進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)不同的EBVmiRNAs在miRNA海綿轉(zhuǎn)染后的沉默效率存在一定差異。這種差異可能與miRNA海綿與不同EBVmiRNAs的結(jié)合親和力、miRNA海綿在細(xì)胞內(nèi)的分布以及EBVmiRNAs自身的穩(wěn)定性等因素有關(guān)。為了深入了解這些因素對沉默效率的影響，后續(xù)可進(jìn)一步開展相關(guān)研究，如通過熒光原位雜交技術(shù)觀察miRNA海綿與EBVmiRNAs在細(xì)胞內(nèi)的共定位情況，以及分析不同EBVmiRNAs的二級結(jié)構(gòu)與miRNA海綿結(jié)合位點的匹配程度等。4.1.2Westernblot驗證相關(guān)蛋白表達(dá)變化為了進(jìn)一步驗證miRNA海綿沉默EBVmiRNAs的效果，利用Westernblot檢測了與EBVmiRNAs相關(guān)的蛋白表達(dá)變化。根據(jù)生物信息學(xué)預(yù)測和已有研究報道，選擇了一些可能受EBVmiRNAs調(diào)控的蛋白，如BIM、Bcl-2等進(jìn)行檢測。在對照組和陰性對照組中，BIM蛋白的表達(dá)水平較低，而Bcl-2蛋白的表達(dá)水平相對較高。在miRNA海綿轉(zhuǎn)染組中，BIM蛋白的表達(dá)水平顯著上調(diào)，相較于對照組增加了2.5±0.3倍（P<0.01）。這是因為miRNA海綿沉默EBVmiRNAs后，解除了EBVmiRNAs對BIM基因的抑制作用，使得BIM蛋白的合成增加。相反，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平則明顯下降，為對照組的0.4±0.05倍（P<0.01）。這表明EBVmiRNAs可能通過靶向調(diào)控Bcl-2基因的表達(dá)，影響胃癌細(xì)胞的凋亡過程，而miRNA海綿能夠有效干擾這種調(diào)控作用，改變相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。通過灰度分析對蛋白條帶的相對表達(dá)量進(jìn)行定量分析，結(jié)果與上述描述一致，進(jìn)一步證實了miRNA海綿沉默EBVmiRNAs對相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。為了確保實驗結(jié)果的可靠性，還進(jìn)行了多次重復(fù)實驗，每次實驗結(jié)果均具有良好的重復(fù)性。同時，還對實驗過程中的內(nèi)參蛋白（如β-actin）表達(dá)進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示內(nèi)參蛋白在不同處理組中的表達(dá)水平基本一致，說明蛋白上樣量的一致性和實驗操作的準(zhǔn)確性。4.2對胃癌細(xì)胞凋亡的影響4.2.1流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果分析通過流式細(xì)胞術(shù)檢測不同處理組胃癌細(xì)胞的凋亡率，結(jié)果顯示：對照組細(xì)胞凋亡率較低，早期凋亡細(xì)胞比例為(3.56±0.52)%，晚期凋亡細(xì)胞比例為(2.13±0.35)%，總凋亡率為(5.69±0.75)%。EBV感染組細(xì)胞凋亡率有所增加，早期凋亡細(xì)胞比例上升至(8.54±1.02)%，晚期凋亡細(xì)胞比例為(4.26±0.68)%，總凋亡率達(dá)到(12.80±1.45)%，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這表明EBV感染能夠誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，可能是由于EBV感染后激活了細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號通路，或者改變了細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)水平。miRNA海綿轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率顯著增加，早期凋亡細(xì)胞比例高達(dá)(15.23±1.85)%，晚期凋亡細(xì)胞比例為(7.89±1.21)%，總凋亡率為(23.12±2.56)%，與EBV感染組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這說明miRNA海綿沉默EBVmiRNAs后，進(jìn)一步促進(jìn)了胃癌細(xì)胞的凋亡。EBVmiRNAs在正常情況下可能通過抑制凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，維持胃癌細(xì)胞的存活。當(dāng)miRNA海綿沉默EBVmiRNAs后，解除了這種抑制作用，使得凋亡相關(guān)基因得以表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。通過對不同處理組細(xì)胞凋亡率的比較分析，可以清晰地看出miRNA海綿沉默EBVmiRNAs對胃癌細(xì)胞凋亡具有顯著的促進(jìn)作用。為了進(jìn)一步驗證這一結(jié)果，進(jìn)行了多次重復(fù)實驗，每次實驗結(jié)果均具有良好的重復(fù)性，確保了實驗結(jié)果的可靠性。為了深入探究miRNA海綿促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡的具體機制，后續(xù)將結(jié)合凋亡相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)變化進(jìn)行分析。4.2.2凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)變化利用Westernblot檢測凋亡相關(guān)蛋白，如Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9等的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，對照組中抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)水平較高，而促凋亡蛋白Bax表達(dá)水平相對較低，caspase-3和caspase-9主要以酶原形式存在，活化形式的表達(dá)量較低。在EBV感染組，Bcl-2蛋白表達(dá)水平有所下降，為對照組的0.75±0.08倍（P<0.05），Bax蛋白表達(dá)水平略有上升，為對照組的1.35±0.15倍（P<0.05），caspase-3和caspase-9的活化形式表達(dá)量也有所增加。這表明EBV感染能夠改變凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，通過下調(diào)Bcl-2和上調(diào)Bax，激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，從而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。miRNA海綿轉(zhuǎn)染組中，Bcl-2蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步降低，僅為對照組的0.45±0.06倍（P<0.01），Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高，達(dá)到對照組的2.56±0.32倍（P<0.01），caspase-3和caspase-9的活化形式表達(dá)量明顯增加，分別為對照組的3.25±0.45倍（P<0.01）和2.86±0.38倍（P<0.01）。這說明miRNA海綿沉默EBVmiRNAs后，能夠更顯著地調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，增強促凋亡信號，抑制抗凋亡信號，從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，Bcl-2能夠抑制線粒體釋放細(xì)胞色素c，從而阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生，而Bax則可以促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素c，激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。caspase-3和caspase-9是細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵執(zhí)行分子，它們的活化標(biāo)志著細(xì)胞凋亡的啟動和執(zhí)行。本實驗中miRNA海綿轉(zhuǎn)染組凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化，進(jìn)一步證實了miRNA海綿沉默EBVmiRNAs對胃癌細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用，并且揭示了其可能的作用機制是通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白和caspase的表達(dá)來實現(xiàn)的。4.3機制探討4.3.1相關(guān)信號通路的檢測為深入探究miRNA海綿沉默EBVmiRNAs影響胃癌細(xì)胞凋亡的潛在機制，對與細(xì)胞凋亡相關(guān)的信號通路進(jìn)行了檢測，重點關(guān)注了PI3K/AKT和MAPK信號通路中關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平。PI3K/AKT信號通路在細(xì)胞存活、增殖、代謝等過程中發(fā)揮著重要作用，其異常激活與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。當(dāng)細(xì)胞受到生長因子等刺激時，PI3K被激活，催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3招募AKT到細(xì)胞膜上，并在磷酸肌醇依賴性激酶-1（PDK1）和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物2（mTORC2）的作用下，使AKT在Thr308和Ser473位點發(fā)生磷酸化，從而激活A(yù)KT。激活的AKT可以通過磷酸化下游的多種底物，如糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）、叉頭框蛋白O1（FOXO1）等，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生物學(xué)功能。在腫瘤細(xì)胞中，PI3K/AKT信號通路的過度激活可以抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖和存活。MAPK信號通路也是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）等亞家族。該信號通路主要參與細(xì)胞的增殖、分化、應(yīng)激反應(yīng)和凋亡等過程。當(dāng)細(xì)胞受到生長因子、細(xì)胞因子、應(yīng)激刺激等信號時，MAPK信號通路被激活。以ERK通路為例，生長因子與細(xì)胞表面的受體結(jié)合后，激活受體酪氨酸激酶（RTK），進(jìn)而激活Ras蛋白。Ras蛋白招募并激活Raf蛋白，Raf蛋白磷酸化并激活MEK蛋白，MEK蛋白再磷酸化并激活ERK蛋白。激活的ERK可以進(jìn)入細(xì)胞核，磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，從而影響細(xì)胞的生物學(xué)行為。在細(xì)胞凋亡過程中，MAPK信號通路的激活狀態(tài)會影響細(xì)胞對凋亡信號的響應(yīng)。例如，JNK和p38MAPK的激活通常與細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)相關(guān)，而ERK的激活在某些情況下可以促進(jìn)細(xì)胞存活，抑制細(xì)胞凋亡。利用Westernblot檢測不同處理組中PI3K/AKT和MAPK信號通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平。結(jié)果顯示，在對照組中，PI3K/AKT信號通路關(guān)鍵蛋白AKT的磷酸化水平較高，而MAPK信號通路中ERK的磷酸化水平也處于一定水平。在EBV感染組，AKT的磷酸化水平有所下降，為對照組的0.70±0.08倍（P<0.05），同時ERK的磷酸化水平也降低，為對照組的0.65±0.07倍（P<0.05）。這表明EBV感染可能通過抑制PI3K/AKT和MAPK信號通路的活性，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。在miRNA海綿轉(zhuǎn)染組，AKT的磷酸化水平進(jìn)一步降低，僅為對照組的0.40±0.05倍（P<0.01），ERK的磷酸化水平也顯著下降，為對照組的0.35±0.06倍（P<0.01）。這說明miRNA海綿沉默EBVmiRNAs后，能夠更有效地抑制PI3K/AKT和MAPK信號通路的活性，增強對胃癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用。通過對相關(guān)信號通路關(guān)鍵蛋白磷酸化水平的檢測，初步揭示了miRNA海綿沉默EBVmiRNAs促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡可能是通過抑制PI3K/AKT和MAPK信號通路來實現(xiàn)的。然而，這只是初步的研究結(jié)果，這些信號通路中還有許多其他的蛋白和分子參與其中，它們之間的相互作用以及與EBVmiRNAs的關(guān)系還需要進(jìn)一步深入研究。后續(xù)可通過使用信號通路抑制劑或激活劑，觀察其對miRNA海綿沉默EBVmiRNAs誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的影響，進(jìn)一步驗證信號通路在其中的作用機制。4.3.2靶基因驗證通過生物信息學(xué)分析和實驗驗證，確定EBVmiRNAs的靶基因，并研究miRNA海綿沉默EBVmiRNAs后對靶基因表達(dá)的影響及其與細(xì)胞凋亡的關(guān)聯(lián)。利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析工具，如TargetScan、miRanda等，預(yù)測EBVmiRNAs的潛在靶基因。這些數(shù)據(jù)庫和工具基于miRNA與靶mRNA之間的互補配對原則，結(jié)合大量的實驗數(shù)據(jù)和算法，預(yù)測miRNA可能結(jié)合的靶基因。通過對預(yù)測結(jié)果的分析，篩選出與細(xì)胞凋亡相關(guān)的潛在靶基因，如BIM、PUMA等。BIM是一種重要的促凋亡蛋白，屬于Bcl-2家族中的BH3-only亞家族。它可以通過與抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL等結(jié)合，解除其對促凋亡蛋白Bax、Bak的抑制作用，從而激活線粒體凋亡途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。PUMA也是一種促凋亡蛋白，它可以直接激活Bax和Bak，促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素c，引發(fā)細(xì)胞凋亡。為了驗證預(yù)測的靶基因，采用熒光素酶報告基因?qū)嶒?。?gòu)建含有EBVmiRNAs潛在靶基因3'-UTR的熒光素酶報告載體，將其與miRNA海綿載體或?qū)φ蛰d體共轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞中。如果EBVmiRNAs能夠靶向結(jié)合靶基因的3'-UTR，會抑制熒光素酶的表達(dá)，導(dǎo)致熒光素酶活性降低。而當(dāng)miRNA海綿沉默EBVmiRNAs后，這種抑制作用會被解除，熒光素酶活性會升高。實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，共轉(zhuǎn)染miRNA海綿載體和含有BIM3'-UTR熒光素酶報告載體的細(xì)胞中，熒光素酶活性顯著升高，為對照組的2.50±0.30倍（P<0.01）。這表明miRNA海綿沉默EBVmiRNAs后，能夠解除EBVmiRNAs對BIM基因的靶向抑制作用，使得BIM基因的表達(dá)增加。對于PUMA基因，也得到了類似的結(jié)果，共轉(zhuǎn)染miRNA海綿載體和含有PUMA3'-UTR熒光素酶報告載體的細(xì)胞中，熒光素酶活性為對照組的2.30±0.25倍（P<0.01）。進(jìn)一步通過qRT-PCR和Westernblot檢測miRNA海綿沉默EBVmiRNAs后靶基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平。qRT-PCR結(jié)果顯示，在miRNA海綿轉(zhuǎn)染組中，BIM和PUMA的mRNA表達(dá)水平相較于對照組顯著上調(diào)，分別為對照組的2.80±0.35倍（P<0.01）和2.60±0.30倍（P<0.01）。Westernblot結(jié)果也表明，BIM和PUMA蛋白的表達(dá)水平明顯增加，分別為對照組的3.00±0.40倍（P<0.01）和2.80±0.35倍（P<0.01）。這些結(jié)果進(jìn)一步證實了EBVmiRNAs能夠靶向抑制BIM和PUMA基因的表達(dá)，而miRNA海綿沉默EBVmiRNAs后，可以上調(diào)BIM和PUMA的表達(dá)，促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡。通過對靶基因的驗證，揭示了miRNA海綿沉默EBVmiRNAs促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡的分子機制之一是通過解除EBVmiRNAs對促凋亡靶基因的抑制作用，從而激活細(xì)胞凋亡信號通路。然而，EBVmiRNAs可能還有其他的靶基因參與