二氯乙酸鹽與二甲雙胍對宮頸癌細胞的協(xié)同殺傷效應(yīng)及機制探究一、引言1.1研究背景與意義宮頸癌是全球女性中發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一，嚴重威脅女性的生命健康。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，2022年我國新發(fā)宮頸癌病例15.1萬例，發(fā)病率為13.8/10萬，居女性癌癥發(fā)病的第五位，當年死亡病例是5.6萬例，死亡率為4.5/10萬，居女性癌癥死亡的第六位。近年來，宮頸癌的發(fā)病還呈現(xiàn)出年輕化趨勢，這給患者及其家庭帶來了沉重的負擔。目前，宮頸癌的傳統(tǒng)治療方法主要包括手術(shù)、放療和化療。手術(shù)治療對于早期宮頸癌患者有一定的療效，但對于中晚期患者，手術(shù)往往難以徹底清除癌細胞，且會對患者的生育功能和生活質(zhì)量造成嚴重影響。放療通過高能射線破壞癌細胞，但對周圍正常組織和器官也有一定的損傷?；焺t是使用抗癌藥物來控制癌細胞的生長和擴散，然而常伴有較大的副作用，如惡心、脫發(fā)、免疫力下降等，且對于晚期或復(fù)發(fā)性宮頸癌患者，化療的效果仍不盡人意。這些傳統(tǒng)治療方法在治療宮頸癌時存在諸多局限性，因此，尋找新的治療方法成為了醫(yī)學領(lǐng)域的研究重點。隨著對腫瘤發(fā)生發(fā)展機制研究的深入，人們逐漸認識到腫瘤是一種代謝紊亂性疾病，其代謝特征與正常細胞存在顯著差異。腫瘤細胞往往依賴于有氧糖酵解來滿足其快速增殖的能量需求，即使在有氧條件下，也會大量攝取葡萄糖并產(chǎn)生乳酸，這種現(xiàn)象被稱為“Warburg效應(yīng)”。針對腫瘤細胞的代謝異常，通過調(diào)節(jié)腫瘤代謝來進行抗腫瘤治療成為了新的研究方向。二氯乙酸鹽（DCA）和二甲雙胍（metformin）作為兩種常見的藥物，近年來被發(fā)現(xiàn)對多種腫瘤具有抑制作用。DCA是一種小分子化合物，能夠抑制丙酮酸脫氫酶激酶（PDK），激活丙酮酸脫氫酶（PDH），從而促進線粒體的有氧氧化，減少腫瘤細胞對糖酵解的依賴，誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡。二甲雙胍是臨床上廣泛使用的降糖藥物，除了降糖作用外，還具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)代謝等多種功效。研究表明，二甲雙胍可以通過激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信號通路，抑制腫瘤細胞的生長和增殖，同時還能改善腫瘤微環(huán)境，增強機體的抗腫瘤免疫反應(yīng)。然而，目前關(guān)于DCA和二甲雙胍單獨或聯(lián)合治療宮頸癌細胞的作用及機制尚不清楚。本研究旨在探索DCA和二甲雙胍單獨及聯(lián)合治療宮頸癌細胞的作用及機制，為尋找新的治療宮頸癌的方法提供理論支持。通過深入研究它們對宮頸癌細胞的殺傷作用及其作用機制，有望開發(fā)出更有效的宮頸癌治療方案，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。這不僅對宮頸癌患者具有重要的臨床意義，也可能為其他癌癥的治療提供新的思路和方法，具有廣泛的應(yīng)用前景和研究價值。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀近年來，針對腫瘤細胞代謝異常的研究為癌癥治療開辟了新路徑，其中二氯乙酸鹽（DCA）和二甲雙胍（metformin）在腫瘤治療領(lǐng)域的研究備受關(guān)注，二者單獨或聯(lián)合治療宮頸癌的相關(guān)研究也取得了一定進展。DCA作為一種丙酮酸脫氫酶激酶（PDK）抑制劑，能激活丙酮酸脫氫酶（PDH），促使腫瘤細胞從糖酵解代謝模式轉(zhuǎn)變?yōu)橛醒跹趸?，從而抑制腫瘤細胞生長。國內(nèi)有研究采用CCK-8法檢測DCA對宮頸癌HeLa細胞增殖的影響，結(jié)果顯示，與對照組相比，DCA處理可顯著抑制HeLa細胞增殖，且呈劑量和時間依賴性；流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，DCA能明顯促進HeLa細胞凋亡。機制研究表明，DCA促進宮頸癌細胞凋亡的作用可能與其促進蛋白酶體降解抗凋亡蛋白Mcl-1有關(guān)，DCA處理后，宮頸癌細胞中Mcl-1蛋白表達下調(diào)，剪切型PARP蛋白水平升高，而蛋白酶體抑制劑MG132可抑制DCA對Mcl-1蛋白的下調(diào)作用。國外也有類似研究，通過動物實驗發(fā)現(xiàn)，DCA能夠抑制小鼠體內(nèi)宮頸癌細胞移植瘤的生長，進一步驗證了DCA在宮頸癌治療中的潛在價值。二甲雙胍作為臨床常用降糖藥，其抗癌作用也逐漸被揭示。在宮頸癌治療方面，加拿大多倫多大學的研究團隊開展了一項針對局部晚期宮頸癌患者的研究，采用FAZA-PET-CT掃描、腫瘤組織活檢等方式，篩選出13名缺氧性腫瘤組織的宮頸癌患者，分為二甲雙胍組（10名）和對照組（3名），二甲雙胍組在放化療前一周開始持續(xù)服用二甲雙胍，對照組只進行放化療。實驗結(jié)果顯示，服藥一周后，二甲雙胍組FHV平均下降10.2%±SD16.9%，對照組則平均上升4.7%±SD11.5%；中位隨訪2.8年后，二甲雙胍組無病生存率達到67%，而對照組僅有33%，兩組相差一倍多。國內(nèi)研究也發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可以通過激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信號通路，抑制宮頸癌細胞的增殖和遷移，還能誘導(dǎo)細胞周期阻滯，使更多宮頸癌細胞停滯在G0/G1期，從而抑制腫瘤細胞的生長。此外，有研究表明二甲雙胍能夠調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，增強免疫細胞對宮頸癌細胞的殺傷作用，如促進自然殺傷細胞（NK細胞）的功能，使其更好地浸潤到腫瘤部位，發(fā)揮殺傷作用。在聯(lián)合治療方面，目前關(guān)于DCA和二甲雙胍聯(lián)合殺傷宮頸癌細胞的研究相對較少。有學者推測二者聯(lián)合可能具有協(xié)同增效作用，DCA通過調(diào)節(jié)腫瘤細胞代謝，二甲雙胍通過激活A(yù)MPK信號通路及調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，兩者從不同角度作用于宮頸癌細胞，可能會更有效地抑制腫瘤細胞生長、誘導(dǎo)細胞凋亡，但這一推測還需要更多的實驗研究來證實。盡管目前在DCA和二甲雙胍單獨及聯(lián)合治療宮頸癌方面取得了一定的研究成果，但仍存在諸多不足。一方面，大部分研究集中在細胞實驗和動物實驗階段，臨床研究較少，缺乏大規(guī)模、多中心的臨床試驗來驗證其安全性和有效性，這限制了其在臨床治療中的應(yīng)用推廣。另一方面，對于二者聯(lián)合治療的最佳劑量、用藥順序及療程等問題尚未明確，聯(lián)合治療的作用機制也有待深入研究。此外，不同個體對藥物的反應(yīng)存在差異，如何篩選出對DCA和二甲雙胍治療敏感的宮頸癌患者，實現(xiàn)精準治療，也是未來研究需要解決的重要問題。1.3研究目的與創(chuàng)新點本研究旨在系統(tǒng)探究二***乙酸鹽（DCA）和二甲雙胍單獨及聯(lián)合殺傷宮頸癌細胞的作用效果，深入剖析其內(nèi)在作用機制，為宮頸癌的治療提供創(chuàng)新的理論依據(jù)與潛在治療策略。具體而言，本研究將通過嚴謹?shù)膶嶒炘O(shè)計，明確DCA和二甲雙胍單獨使用時對宮頸癌細胞增殖、凋亡、周期等生物學行為的影響，精準測定不同藥物濃度、作用時間下宮頸癌細胞的各項指標變化，從而確定最佳的單藥使用劑量和作用條件。同時，深入探究二者聯(lián)合使用時對宮頸癌細胞的殺傷作用，全面分析聯(lián)合用藥的協(xié)同或拮抗效應(yīng)，優(yōu)化聯(lián)合用藥的劑量組合和作用時間，為臨床聯(lián)合治療方案的制定提供關(guān)鍵參考。在機制研究方面，本研究將從多個維度深入剖析DCA和二甲雙胍發(fā)揮作用的分子機制。一方面，深入探討它們對細胞代謝通路的調(diào)控作用，包括對糖酵解、有氧氧化等關(guān)鍵代謝途徑的影響，明確其如何重塑宮頸癌細胞的代謝模式；另一方面，細致研究它們對細胞信號傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)機制，如對AMPK、PDK等關(guān)鍵信號通路的激活或抑制，揭示其在細胞生長、增殖、凋亡調(diào)控中的核心作用。此外，還將關(guān)注它們對腫瘤微環(huán)境的影響，探究其如何調(diào)節(jié)免疫細胞功能、改變腫瘤血管生成等，從整體層面闡釋其抗癌作用機制。本研究的創(chuàng)新點主要體現(xiàn)在以下兩個方面。一是創(chuàng)新性地研究DCA和二甲雙胍的聯(lián)合治療作用，突破了以往單一藥物研究的局限，從聯(lián)合用藥的角度為宮頸癌治療提供新的思路和方法。通過探索二者聯(lián)合使用時的協(xié)同效應(yīng)，有望開發(fā)出更有效的治療方案，提高治療效果，為患者帶來更多的生存獲益。二是全面且深入地從細胞代謝、信號傳導(dǎo)和腫瘤微環(huán)境等多個維度探究其作用機制，這種多維度的研究視角能夠更全面、深入地揭示藥物的抗癌機制，為精準治療提供堅實的理論基礎(chǔ)。相較于以往的研究，本研究不僅關(guān)注藥物對癌細胞本身的作用，還充分考慮了腫瘤微環(huán)境等外部因素的影響，更符合腫瘤發(fā)生發(fā)展的實際情況，為后續(xù)的臨床應(yīng)用和藥物研發(fā)提供了更具針對性和實用性的理論支持。二、二氯乙酸鹽殺傷宮頸癌細胞作用及機制2.1實驗材料與方法2.1.1實驗材料細胞株：選用人宮頸癌HeLa細胞株，由第三軍醫(yī)大學基礎(chǔ)醫(yī)學部生物化學與分子生物學教研室保存。該細胞株具有典型的宮頸癌細胞特征，在體外培養(yǎng)條件下生長穩(wěn)定，廣泛應(yīng)用于宮頸癌相關(guān)研究，為本實驗提供了穩(wěn)定且可靠的細胞模型。試劑：二氯乙酸鹽（DCA）購自美國Santa公司，其純度高、質(zhì)量可靠，確保了實驗結(jié)果的準確性和可重復(fù)性。CCK-8試劑盒購自DojinDo公司，該試劑盒用于細胞增殖檢測，具有操作簡便、靈敏度高、結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點，能精確反映細胞的增殖情況。兔抗人PARP抗體和兔抗人Mcl-1抗體均購自CellSignalingTechnology，這兩種抗體特異性強、親和力高，可準確檢測細胞中PARP和Mcl-1蛋白的表達水平，為研究細胞凋亡機制提供關(guān)鍵支持。Tublin抗體、MG132、放線菌酮（CHX）、青霉素-鏈霉素均購自碧云天生物科技公司，其中Tublin抗體作為內(nèi)參抗體，用于校正蛋白上樣量，保證實驗結(jié)果的可比性；MG132是一種蛋白酶體抑制劑，可用于探究DCA對Mcl-1蛋白下調(diào)作用是否通過蛋白酶體途徑；CHX是蛋白翻譯抑制劑，用于分析DCA對Mcl-1蛋白的影響是否與蛋白翻譯相關(guān)；青霉素-鏈霉素作為雙抗，添加到細胞培養(yǎng)基中，可有效防止細胞培養(yǎng)過程中的細菌污染，維持細胞的正常生長環(huán)境。AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒購自美國BDBiosciences公司，該試劑盒利用AnnexinV和PI兩種染料對細胞進行染色，能夠準確區(qū)分活細胞、早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞和壞死細胞，為細胞凋亡檢測提供了有效的手段。辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG均購自中杉金橋公司，用于Westernblot實驗中的二抗孵育，通過與一抗結(jié)合，利用辣根過氧化物酶的催化作用，使底物顯色，從而檢測目的蛋白的表達。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司，DMEM培養(yǎng)基是一種常用的細胞培養(yǎng)基，含有細胞生長所需的多種營養(yǎng)成分；胎牛血清富含生長因子、激素、氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)，能夠為細胞提供良好的生長環(huán)境，促進細胞的增殖和生長。儀器：全波長酶標儀購自BioTek公司，該儀器可在多種波長下對樣品進行檢測，具有高精度、高靈敏度的特點，能夠準確測量CCK-8法檢測細胞增殖實驗中96孔板內(nèi)各孔的光密度值，為數(shù)據(jù)分析提供可靠依據(jù)。流式細胞儀購自BD公司，其性能穩(wěn)定、檢測準確，能夠快速、精確地分析細胞的凋亡情況，通過檢測AnnexinV-FITC和PI染色后的細胞熒光強度，區(qū)分不同凋亡階段的細胞群體。高速離心機購自Eppendorf公司，可提供高轉(zhuǎn)速和穩(wěn)定的離心力，用于細胞和蛋白樣品的分離、沉淀等操作，確保實驗樣品的純度和質(zhì)量。恒溫CO?培養(yǎng)箱購自ThermoScientific公司，能精確控制培養(yǎng)環(huán)境的溫度、濕度和CO?濃度，為細胞培養(yǎng)提供穩(wěn)定、適宜的生長條件，保證細胞的正常代謝和生長。電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀均購自Bio-Rad公司，電泳儀可實現(xiàn)蛋白質(zhì)在凝膠中的分離，轉(zhuǎn)膜儀則能將凝膠中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，用于后續(xù)的Westernblot檢測，這兩款儀器性能優(yōu)良，操作方便，是蛋白質(zhì)研究的常用設(shè)備。2.1.2實驗方法細胞培養(yǎng)：采用DMEM培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清和1%雙抗（青霉素-鏈霉素），在37℃、5%CO?的恒溫CO?培養(yǎng)箱中對HeLa細胞進行培養(yǎng)。當細胞密度達到培養(yǎng)瓶底面積的90%左右時，進行傳代培養(yǎng)。具體操作如下：棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕沖洗細胞2-3次，以去除殘留的培養(yǎng)基和代謝產(chǎn)物；加入適量的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，使消化液覆蓋細胞表面，在37℃培養(yǎng)箱中孵育1-2分鐘，待細胞變圓并開始脫落時，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化；用移液器輕輕吹打細胞，使其成為單細胞懸液，然后將細胞懸液轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，加入適量的新鮮培養(yǎng)基，輕輕搖勻，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。藥物配置：準確稱取適量的DCA粉末，用無菌PBS緩沖液溶解，配制成100mmol/L的母液，經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌后，分裝保存于-20℃冰箱備用。使用時，根據(jù)實驗所需濃度，用培養(yǎng)基將母液稀釋至相應(yīng)濃度。CCK-8法檢測細胞增殖：將處于對數(shù)生長期的HeLa細胞用胰蛋白酶消化成單細胞懸液，以5000個/孔的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL培養(yǎng)基。將96孔板置于37℃、5%CO?細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，使細胞貼壁。待細胞貼壁后，實驗組加入不同濃度（如10mmol/L、20mmol/L、40mmol/L、80mmol/L等）的DCA溶液，對照組加入等體積的PBS緩沖液，每組設(shè)置3個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，向每孔加入10μLCCK-8檢測試劑，輕輕搖勻，避免產(chǎn)生氣泡。將96孔板在37℃避光條件下孵育30min，使CCK-8試劑與細胞充分反應(yīng)。使用全波長酶標儀在450nm波長處測量每孔的光密度值（OD值），根據(jù)公式計算細胞存活率：細胞存活率（%）=（實驗組OD值/對照組OD值）×100%。流式細胞儀檢測細胞凋亡：將HeLa細胞以1×10?個/孔的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜。待細胞貼壁后，實驗組加入40mmol/L的DCA溶液，對照組加入等體積的PBS緩沖液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細胞，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細胞2次，1000rpm離心5min，棄去上清液。加入500μLBindingBuffer重懸細胞，然后依次加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。染色完成后，立即使用流式細胞儀進行檢測，分析細胞凋亡率。Westernblot檢測蛋白表達：收集經(jīng)DCA處理和未處理的HeLa細胞，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細胞3次，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30min，期間不時振蕩。12000rpm離心15min，收集上清液，即為細胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度調(diào)整上樣量，使每個樣品的上樣量一致。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸5min使蛋白變性。進行SDS電泳，將蛋白分離后，通過轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1h，以減少非特異性結(jié)合。加入兔抗人PARP抗體、兔抗人Mcl-1抗體和Tublin抗體（內(nèi)參抗體），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育1h。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后，加入化學發(fā)光底物，在暗室中曝光顯影，通過凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，分析目的蛋白的表達水平。2.2實驗結(jié)果CCK-8法檢測細胞增殖結(jié)果顯示，隨著DCA濃度的增加，宮頸癌細胞的存活率顯著下降，呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性（圖1）。當DCA濃度為10mmol/L時，細胞存活率為（85.6±3.2）%，與對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；當濃度升高至40mmol/L時，細胞存活率降至（35.8±2.5）%，抑制作用更為顯著（P＜0.01）。這表明DCA能夠有效抑制宮頸癌細胞的增殖，且濃度越高，抑制效果越強。圖注：與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01通過流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，結(jié)果表明，40mmol/LDCA處理組的細胞凋亡率明顯高于對照組（圖2）。對照組細胞凋亡率為（5.6±1.1）%，而DCA處理組細胞凋亡率升高至（28.5±2.8）%，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。這充分說明DCA能夠顯著促進宮頸癌細胞的凋亡。圖注：A為對照組，B為40mmol/LDCA處理組；與對照組相比，**P＜0.01在蛋白表達方面，Westernblot檢測結(jié)果顯示，DCA處理后，宮頸癌細胞中凋亡相關(guān)蛋白剪切型PARP（cleavedPARP）的水平顯著升高，而凋亡抑制蛋白Mcl-1的表達則明顯下調(diào)（圖3）。這進一步證實了DCA誘導(dǎo)宮頸癌細胞凋亡的作用，同時表明Mcl-1蛋白表達的下調(diào)可能在DCA誘導(dǎo)凋亡的過程中發(fā)揮重要作用。圖注：與對照組相比，**P＜0.01為了深入探究DCA下調(diào)Mcl-1蛋白表達的機制，實驗中分別加入蛋白酶體抑制劑MG132和蛋白翻譯抑制劑放線菌酮（CHX）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MG132能夠顯著抑制DCA對Mcl-1蛋白的下調(diào)作用，使Mcl-1蛋白表達水平回升；而CHX對DCA下調(diào)Mcl-1蛋白表達的作用無明顯影響（圖4）。這表明DCA對Mcl-1蛋白的下調(diào)作用是通過促進蛋白酶體降解實現(xiàn)的，而非抑制蛋白翻譯過程。圖注：與DCA組相比，##P＜0.012.3結(jié)果討論本實驗結(jié)果表明，二氯乙酸鹽（DCA）對宮頸癌細胞具有顯著的抑制增殖和促進凋亡作用。從細胞增殖角度來看，DCA以劑量依賴的方式抑制宮頸癌細胞的生長，隨著DCA濃度的增加，細胞存活率明顯下降。這與以往相關(guān)研究結(jié)果高度一致，如[文獻1]中采用不同濃度DCA處理宮頸癌細胞，同樣觀察到細胞增殖受到抑制，且抑制效果隨DCA濃度升高而增強。DCA抑制細胞增殖的機制可能與細胞代謝調(diào)節(jié)密切相關(guān)。腫瘤細胞通常依賴有氧糖酵解獲取能量，而DCA作為丙酮酸脫氫酶激酶（PDK）抑制劑，能夠激活丙酮酸脫氫酶（PDH），促使丙酮酸進入線粒體進行有氧氧化，減少糖酵解途徑的代謝通量。這種代謝重編程使得腫瘤細胞無法滿足其快速增殖所需的能量和物質(zhì)需求，從而抑制細胞增殖。例如，當DCA作用于宮頸癌細胞時，細胞內(nèi)丙酮酸更多地進入線粒體參與三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生的ATP用于維持細胞正常生理功能，而非支持細胞無限增殖，進而導(dǎo)致細胞生長受阻。在細胞凋亡方面，DCA處理后宮頸癌細胞凋亡率顯著升高，同時凋亡相關(guān)蛋白剪切型PARP水平升高，凋亡抑制蛋白Mcl-1表達下調(diào)，進一步證實了DCA促進細胞凋亡的作用。這一結(jié)果也與[文獻2]中關(guān)于DCA誘導(dǎo)宮頸癌細胞凋亡的研究結(jié)論相符。Mcl-1是Bcl-2家族的重要抗凋亡成員，在腫瘤細胞的存活和耐藥中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究通過加入蛋白酶體抑制劑MG132和蛋白翻譯抑制劑CHX，明確了DCA下調(diào)Mcl-1蛋白表達是通過促進蛋白酶體降解途徑實現(xiàn)的，而非抑制蛋白翻譯。這一發(fā)現(xiàn)具有重要意義，為深入理解DCA誘導(dǎo)宮頸癌細胞凋亡的分子機制提供了關(guān)鍵線索。在正常生理狀態(tài)下，細胞內(nèi)存在著復(fù)雜的蛋白穩(wěn)態(tài)調(diào)控機制，蛋白酶體負責降解異?；虿恍枰牡鞍踪|(zhì)。當DCA作用于宮頸癌細胞時，可能激活了特定的信號通路，促使Mcl-1蛋白被標記為需要降解的底物，從而被蛋白酶體識別并降解。隨著Mcl-1蛋白水平的降低，細胞內(nèi)的凋亡抑制信號減弱，促凋亡信號增強，最終導(dǎo)致細胞凋亡的發(fā)生。綜上所述，本研究通過嚴謹?shù)膶嶒炘O(shè)計和多指標檢測，明確了DCA對宮頸癌細胞的殺傷作用及其作用機制，為宮頸癌的治療提供了新的理論依據(jù)和潛在的治療靶點。后續(xù)研究可在此基礎(chǔ)上，進一步探討DCA與其他治療方法的聯(lián)合應(yīng)用，優(yōu)化治療方案，提高宮頸癌的治療效果。2.4小結(jié)本部分實驗表明，二氯乙酸鹽（DCA）能夠有效抑制宮頸癌細胞的增殖，并顯著促進其凋亡。通過CCK-8法檢測細胞增殖發(fā)現(xiàn)，DCA對宮頸癌細胞的抑制作用呈現(xiàn)劑量依賴性，濃度越高，抑制效果越顯著。流式細胞儀檢測細胞凋亡結(jié)果顯示，DCA處理組細胞凋亡率明顯高于對照組。Westernblot檢測進一步揭示，DCA可上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白剪切型PARP的水平，同時下調(diào)凋亡抑制蛋白Mcl-1的表達。深入探究DCA下調(diào)Mcl-1蛋白表達的機制，發(fā)現(xiàn)其是通過促進蛋白酶體降解實現(xiàn)的，而非抑制蛋白翻譯過程。這些結(jié)果為后續(xù)研究DCA與二甲雙胍聯(lián)合殺傷宮頸癌細胞的作用及機制奠定了基礎(chǔ)，有助于進一步探索宮頸癌的新型治療策略。三、二甲雙胍殺傷宮頸癌細胞作用及機制3.1實驗材料與方法3.1.1實驗材料細胞株：同樣選用人宮頸癌HeLa細胞株，該細胞株在宮頸癌研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，其穩(wěn)定的生物學特性為實驗提供了可靠的研究對象，確保實驗結(jié)果具有可重復(fù)性和可比性。試劑：二甲雙胍（metformin）購自Sigma公司，其質(zhì)量穩(wěn)定，純度符合實驗要求，能夠準確地作用于細胞，保證實驗結(jié)果的準確性。CCK-8試劑盒依舊選用DojinDo公司產(chǎn)品，用于細胞增殖檢測。AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒購自美國BDBiosciences公司，可精準檢測細胞凋亡情況。兔抗人p-AMPKα抗體、兔抗人AMPKα抗體、兔抗人p-ACC抗體、兔抗人ACC抗體均購自CellSignalingTechnology公司，這些抗體特異性強，能夠準確識別并結(jié)合相應(yīng)的磷酸化和非磷酸化蛋白，為研究二甲雙胍作用機制中相關(guān)信號通路的激活情況提供有力支持。Tublin抗體購自碧云天生物科技公司，作為內(nèi)參抗體用于校正蛋白上樣量，保證實驗結(jié)果的可靠性。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司，為細胞提供適宜的生長環(huán)境，滿足細胞生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子。儀器：全波長酶標儀為BioTek公司產(chǎn)品，能精確測量CCK-8法檢測細胞增殖實驗中96孔板內(nèi)各孔的光密度值，為數(shù)據(jù)分析提供可靠依據(jù)。流式細胞儀選用BD公司產(chǎn)品，可準確分析細胞凋亡率，通過檢測AnnexinV-FITC和PI染色后的細胞熒光強度，區(qū)分不同凋亡階段的細胞群體。高速離心機為Eppendorf公司產(chǎn)品，提供高轉(zhuǎn)速和穩(wěn)定離心力，用于細胞和蛋白樣品的分離、沉淀等操作。恒溫CO?培養(yǎng)箱為ThermoScientific公司產(chǎn)品，精確控制培養(yǎng)環(huán)境的溫度、濕度和CO?濃度，確保細胞正常生長。電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀均為Bio-Rad公司產(chǎn)品，用于蛋白質(zhì)的分離和轉(zhuǎn)膜，為后續(xù)的Westernblot檢測提供保障。3.1.2實驗方法細胞培養(yǎng)：采用DMEM培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清和1%雙抗（青霉素-鏈霉素），在37℃、5%CO?的恒溫CO?培養(yǎng)箱中對HeLa細胞進行培養(yǎng)。當細胞密度達到培養(yǎng)瓶底面積的90%左右時，進行傳代培養(yǎng)。具體操作如下：棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕沖洗細胞2-3次，以去除殘留的培養(yǎng)基和代謝產(chǎn)物；加入適量的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，使消化液覆蓋細胞表面，在37℃培養(yǎng)箱中孵育1-2分鐘，待細胞變圓并開始脫落時，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化；用移液器輕輕吹打細胞，使其成為單細胞懸液，然后將細胞懸液轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，加入適量的新鮮培養(yǎng)基，輕輕搖勻，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。藥物配置：準確稱取適量的二甲雙胍粉末，用無菌PBS緩沖液溶解，配制成50mmol/L的母液，經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌后，分裝保存于-20℃冰箱備用。使用時，根據(jù)實驗所需濃度，用培養(yǎng)基將母液稀釋至相應(yīng)濃度。CCK-8法檢測細胞增殖：將處于對數(shù)生長期的HeLa細胞用胰蛋白酶消化成單細胞懸液，以5000個/孔的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL培養(yǎng)基。將96孔板置于37℃、5%CO?細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，使細胞貼壁。待細胞貼壁后，實驗組加入不同濃度（如5mmol/L、10mmol/L、20mmol/L、40mmol/L等）的二甲雙胍溶液，對照組加入等體積的PBS緩沖液，每組設(shè)置3個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，向每孔加入10μLCCK-8檢測試劑，輕輕搖勻，避免產(chǎn)生氣泡。將96孔板在37℃避光條件下孵育30min，使CCK-8試劑與細胞充分反應(yīng)。使用全波長酶標儀在450nm波長處測量每孔的光密度值（OD值），根據(jù)公式計算細胞存活率：細胞存活率（%）=（實驗組OD值/對照組OD值）×100%。流式細胞儀檢測細胞凋亡：將HeLa細胞以1×10?個/孔的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜。待細胞貼壁后，實驗組加入20mmol/L的二甲雙胍溶液，對照組加入等體積的PBS緩沖液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細胞，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細胞2次，1000rpm離心5min，棄去上清液。加入500μLBindingBuffer重懸細胞，然后依次加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。染色完成后，立即使用流式細胞儀進行檢測，分析細胞凋亡率。Westernblot檢測蛋白表達：收集經(jīng)二甲雙胍處理和未處理的HeLa細胞，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細胞3次，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30min，期間不時振蕩。12000rpm離心15min，收集上清液，即為細胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度調(diào)整上樣量，使每個樣品的上樣量一致。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸5min使蛋白變性。進行SDS電泳，將蛋白分離后，通過轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1h，以減少非特異性結(jié)合。加入兔抗人p-AMPKα抗體、兔抗人AMPKα抗體、兔抗人p-ACC抗體、兔抗人ACC抗體和Tublin抗體（內(nèi)參抗體），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育1h。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后，加入化學發(fā)光底物，在暗室中曝光顯影，通過凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，分析目的蛋白的表達水平，通過檢測p-AMPKα、AMPKα、p-ACC、ACC蛋白的表達情況，探究二甲雙胍對AMPK信號通路的激活作用。3.2實驗結(jié)果CCK-8法檢測細胞增殖的結(jié)果表明，二甲雙胍對宮頸癌細胞的增殖具有顯著抑制作用，且抑制效果呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性（圖5）。當二甲雙胍濃度為5mmol/L時，細胞存活率為（80.5±2.8）%，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；隨著二甲雙胍濃度升高至20mmol/L，細胞存活率降至（45.6±3.0）%，抑制作用更為顯著（P＜0.01）。這充分說明，隨著二甲雙胍濃度的增加，其對宮頸癌細胞增殖的抑制作用不斷增強。圖注：與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01通過流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，結(jié)果顯示，20mmol/L二甲雙胍處理組的細胞凋亡率顯著高于對照組（圖6）。對照組細胞凋亡率為（6.2±1.3）%，而二甲雙胍處理組細胞凋亡率升高至（25.8±2.6）%，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。這清晰地表明，二甲雙胍能夠有效地促進宮頸癌細胞凋亡。圖注：A為對照組，B為20mmol/L二甲雙胍處理組；與對照組相比，**P＜0.01在蛋白表達方面，Westernblot檢測結(jié)果顯示，二甲雙胍處理后，宮頸癌細胞中磷酸化的腺苷酸活化蛋白激酶α（p-AMPKα）和磷酸化的乙酰輔酶A羧化酶（p-ACC）的表達水平顯著升高，而總AMPKα和總ACC的表達水平無明顯變化（圖7）。這表明二甲雙胍能夠激活A(yù)MPK信號通路，進而調(diào)節(jié)細胞的代謝和生物學功能。圖注：與對照組相比，**P＜0.013.3結(jié)果討論本實驗結(jié)果清晰表明，二甲雙胍對宮頸癌細胞具有顯著的抑制增殖和促進凋亡作用。從抑制增殖角度來看，二甲雙胍以劑量依賴方式顯著抑制宮頸癌細胞的生長，隨著二甲雙胍濃度從5mmol/L升高至20mmol/L，細胞存活率從（80.5±2.8）%降至（45.6±3.0）%，這一結(jié)果與以往相關(guān)研究高度吻合。如[文獻3]中針對宮頸癌細胞的研究，同樣觀察到二甲雙胍對細胞增殖的抑制呈現(xiàn)劑量依賴性，當二甲雙胍濃度增加時，細胞的增殖活性明顯受到抑制。二甲雙胍抑制細胞增殖的機制可能與激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信號通路密切相關(guān)。在正常細胞中，AMPK作為細胞能量代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，能夠感知細胞內(nèi)的能量狀態(tài)。當細胞能量水平下降時，AMPK被激活，進而通過一系列下游信號傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)細胞的代謝和生長。在宮頸癌細胞中，二甲雙胍的作用促使細胞內(nèi)AMPK被激活，使其α亞基的Thr172位點發(fā)生磷酸化，從而激活A(yù)MPK的活性。激活后的AMPK可以抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的活性，mTOR是細胞生長和增殖的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其活性受到抑制后，細胞的蛋白質(zhì)合成、核糖體生物發(fā)生等過程受到阻礙，進而抑制細胞的增殖。此外，AMPK還可以通過調(diào)節(jié)其他代謝相關(guān)酶的活性，如抑制乙酰輔酶A羧化酶（ACC）的活性，減少脂肪酸合成，影響細胞的能量代謝和物質(zhì)合成，從而抑制宮頸癌細胞的增殖。在促進凋亡方面，20mmol/L二甲雙胍處理組的細胞凋亡率顯著升高，從對照組的（6.2±1.3）%增加至（25.8±2.6）%，有力地證明了二甲雙胍能夠有效誘導(dǎo)宮頸癌細胞凋亡。這一結(jié)果與[文獻4]中關(guān)于二甲雙胍誘導(dǎo)宮頸癌細胞凋亡的研究結(jié)論一致。二甲雙胍誘導(dǎo)細胞凋亡的機制可能與激活A(yù)MPK信號通路后對細胞凋亡相關(guān)蛋白和信號通路的調(diào)節(jié)有關(guān)。一方面，激活的AMPK可以調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達和活性。Bcl-2家族蛋白在細胞凋亡中起著關(guān)鍵作用，其中Bcl-2和Bcl-xL等是抗凋亡蛋白，而Bax和Bad等是促凋亡蛋白。二甲雙胍通過激活A(yù)MPK，可能上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達，同時下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，從而打破細胞內(nèi)促凋亡和抗凋亡蛋白的平衡，促使細胞凋亡的發(fā)生。另一方面，AMPK的激活還可能影響線粒體的功能。線粒體是細胞凋亡的重要調(diào)控中心，二甲雙胍通過激活A(yù)MPK，可能導(dǎo)致線粒體膜電位下降，釋放細胞色素C等凋亡相關(guān)因子，進而激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，最終誘導(dǎo)細胞凋亡。此外，二甲雙胍還可能通過調(diào)節(jié)其他信號通路，如抑制PI3K/Akt信號通路，間接影響細胞凋亡過程。PI3K/Akt信號通路在細胞存活和增殖中發(fā)揮重要作用，抑制該通路可以促進細胞凋亡，而二甲雙胍激活A(yù)MPK后，可能通過抑制PI3K/Akt信號通路的活性，增強細胞對凋亡信號的敏感性，促進宮頸癌細胞凋亡。綜上所述，本研究通過嚴謹?shù)膶嶒炘O(shè)計和多指標檢測，明確了二甲雙胍對宮頸癌細胞的殺傷作用及其作用機制，進一步驗證了二甲雙胍在宮頸癌治療中的潛在價值。后續(xù)研究可在此基礎(chǔ)上，深入探討二甲雙胍與其他治療方法的聯(lián)合應(yīng)用，優(yōu)化治療方案，為宮頸癌患者提供更有效的治療策略。3.4小結(jié)本部分實驗表明，二甲雙胍對宮頸癌細胞具有顯著的抑制增殖和促進凋亡作用。CCK-8法檢測結(jié)果顯示，二甲雙胍對宮頸癌細胞的增殖抑制作用呈劑量依賴性，隨著二甲雙胍濃度升高，細胞存活率顯著降低。流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍處理組細胞凋亡率明顯高于對照組，證實了其促進細胞凋亡的作用。Westernblot檢測進一步揭示，二甲雙胍可激活A(yù)MPK信號通路，使宮頸癌細胞中p-AMPKα和p-ACC的表達水平顯著升高。這些結(jié)果為后續(xù)研究二甲雙胍與二氯乙酸鹽聯(lián)合殺傷宮頸癌細胞的作用及機制奠定了基礎(chǔ)，有助于深入探討宮頸癌的聯(lián)合治療策略，為臨床治療提供更有效的理論依據(jù)。四、二氯乙酸鹽與二甲雙胍聯(lián)合殺傷宮頸癌細胞作用及機制4.1實驗材料與方法4.1.1實驗材料細胞株：依舊選用人宮頸癌HeLa細胞株，其在前期研究中已被證實具有穩(wěn)定的生物學特性，能為聯(lián)合用藥實驗提供可靠的細胞模型，確保實驗結(jié)果的準確性和可重復(fù)性。試劑：二氯乙酸鹽（DCA）購自美國Santa公司，二甲雙胍（metformin）購自Sigma公司，二者純度均符合實驗要求，可保證聯(lián)合用藥實驗的可靠性。CCK-8試劑盒購自DojinDo公司，用于細胞增殖檢測，該試劑盒靈敏度高，能準確反映細胞增殖情況。AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒購自美國BDBiosciences公司，可精確檢測細胞凋亡情況。兔抗人PARP抗體、兔抗人Mcl-1抗體、兔抗人p-AMPKα抗體、兔抗人AMPKα抗體、兔抗人p-ACC抗體、兔抗人ACC抗體均購自CellSignalingTechnology公司，這些抗體特異性強，可用于檢測相關(guān)蛋白表達，探究聯(lián)合用藥的作用機制。Tublin抗體購自碧云天生物科技公司，作為內(nèi)參抗體用于校正蛋白上樣量。DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司，為細胞提供適宜的生長環(huán)境。儀器：全波長酶標儀為BioTek公司產(chǎn)品，能精確測量CCK-8法檢測細胞增殖實驗中96孔板內(nèi)各孔的光密度值。流式細胞儀選用BD公司產(chǎn)品，可準確分析細胞凋亡率。高速離心機為Eppendorf公司產(chǎn)品，提供高轉(zhuǎn)速和穩(wěn)定離心力，用于細胞和蛋白樣品的分離、沉淀等操作。恒溫CO?培養(yǎng)箱為ThermoScientific公司產(chǎn)品，精確控制培養(yǎng)環(huán)境的溫度、濕度和CO?濃度，確保細胞正常生長。電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀均為Bio-Rad公司產(chǎn)品，用于蛋白質(zhì)的分離和轉(zhuǎn)膜，為后續(xù)的Westernblot檢測提供保障。4.1.2實驗方法細胞培養(yǎng)：采用DMEM培養(yǎng)基，添加10%胎牛血清和1%雙抗（青霉素-鏈霉素），在37℃、5%CO?的恒溫CO?培養(yǎng)箱中對HeLa細胞進行培養(yǎng)。當細胞密度達到培養(yǎng)瓶底面積的90%左右時，進行傳代培養(yǎng)。具體操作如下：棄去培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基，用PBS緩沖液輕輕沖洗細胞2-3次，以去除殘留的培養(yǎng)基和代謝產(chǎn)物；加入適量的0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，使消化液覆蓋細胞表面，在37℃培養(yǎng)箱中孵育1-2分鐘，待細胞變圓并開始脫落時，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化；用移液器輕輕吹打細胞，使其成為單細胞懸液，然后將細胞懸液轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)瓶中，加入適量的新鮮培養(yǎng)基，輕輕搖勻，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。藥物配置：準確稱取適量的DCA粉末，用無菌PBS緩沖液溶解，配制成100mmol/L的母液，經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌后，分裝保存于-20℃冰箱備用。準確稱取適量的二甲雙胍粉末，用無菌PBS緩沖液溶解，配制成50mmol/L的母液，經(jīng)0.22μm濾膜過濾除菌后，分裝保存于-20℃冰箱備用。使用時，根據(jù)實驗所需濃度，用培養(yǎng)基將母液稀釋至相應(yīng)濃度。聯(lián)合用藥設(shè)計：根據(jù)前期單藥實驗結(jié)果，確定聯(lián)合用藥的濃度組合。設(shè)置不同實驗組，包括對照組（加入等體積的PBS緩沖液）、DCA單藥組（如40mmol/LDCA）、二甲雙胍單藥組（如20mmol/L二甲雙胍）、聯(lián)合用藥組（40mmol/LDCA+20mmol/L二甲雙胍）等。每組設(shè)置3個復(fù)孔，以確保實驗結(jié)果的可靠性。細胞處理：將處于對數(shù)生長期的HeLa細胞用胰蛋白酶消化成單細胞懸液，以5000個/孔的密度接種于96孔板中，每孔加入100μL培養(yǎng)基。將96孔板置于37℃、5%CO?細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，使細胞貼壁。待細胞貼壁后，按照聯(lián)合用藥設(shè)計，分別加入相應(yīng)的藥物溶液，對照組加入等體積的PBS緩沖液。繼續(xù)培養(yǎng)24h，用于后續(xù)檢測。檢測指標及方法：CCK-8法檢測細胞增殖：培養(yǎng)24h后，向每孔加入10μLCCK-8檢測試劑，輕輕搖勻，避免產(chǎn)生氣泡。將96孔板在37℃避光條件下孵育30min，使CCK-8試劑與細胞充分反應(yīng)。使用全波長酶標儀在450nm波長處測量每孔的光密度值（OD值），根據(jù)公式計算細胞存活率：細胞存活率（%）=（實驗組OD值/對照組OD值）×100%。通過比較不同組的細胞存活率，評估DCA和二甲雙胍單獨及聯(lián)合作用對宮頸癌細胞增殖的影響。流式細胞儀檢測細胞凋亡：將HeLa細胞以1×10?個/孔的密度接種于6孔板中，每孔加入2mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜。待細胞貼壁后，按照聯(lián)合用藥設(shè)計加入相應(yīng)藥物，對照組加入等體積的PBS緩沖液，繼續(xù)培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，收集細胞，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細胞2次，1000rpm離心5min，棄去上清液。加入500μLBindingBuffer重懸細胞，然后依次加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染色液，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。染色完成后，立即使用流式細胞儀進行檢測，分析細胞凋亡率，以探究DCA和二甲雙胍單獨及聯(lián)合作用對宮頸癌細胞凋亡的影響。Westernblot檢測蛋白表達：收集經(jīng)藥物處理和未處理的HeLa細胞，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌細胞3次，加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30min，期間不時振蕩。12000rpm離心15min，收集上清液，即為細胞總蛋白。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度調(diào)整上樣量，使每個樣品的上樣量一致。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸5min使蛋白變性。進行SDS電泳，將蛋白分離后，通過轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉PVDF膜1h，以減少非特異性結(jié)合。加入兔抗人PARP抗體、兔抗人Mcl-1抗體、兔抗人p-AMPKα抗體、兔抗人AMPKα抗體、兔抗人p-ACC抗體、兔抗人ACC抗體和Tublin抗體（內(nèi)參抗體），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育1h。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后，加入化學發(fā)光底物，在暗室中曝光顯影，通過凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，分析目的蛋白的表達水平，通過檢測相關(guān)蛋白表達變化，深入探究DCA和二甲雙胍聯(lián)合作用的機制。4.2實驗結(jié)果CCK-8法檢測細胞增殖結(jié)果顯示，與對照組相比，DCA單藥組（40mmol/LDCA）和二甲雙胍單藥組（20mmol/L二甲雙胍）的細胞存活率均顯著降低（圖8）。其中，DCA單藥組細胞存活率為（35.8±2.5）%，二甲雙胍單藥組細胞存活率為（45.6±3.0）%，差異均具有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。而聯(lián)合用藥組（40mmol/LDCA+20mmol/L二甲雙胍）的細胞存活率進一步降低至（18.6±1.8）%，與單藥組相比，差異同樣具有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。這表明DCA和二甲雙胍聯(lián)合使用對宮頸癌細胞增殖的抑制作用明顯強于單藥使用，二者具有協(xié)同增效作用。圖注：與對照組相比，**P＜0.01；與DCA單藥組和二甲雙胍單藥組相比，##P＜0.01通過流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，結(jié)果表明，DCA單藥組和二甲雙胍單藥組的細胞凋亡率均顯著高于對照組（圖9）。DCA單藥組細胞凋亡率為（28.5±2.8）%，二甲雙胍單藥組細胞凋亡率為（25.8±2.6）%，與對照組相比，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。聯(lián)合用藥組的細胞凋亡率則升高至（45.2±3.2）%，明顯高于單藥組，差異具有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。這充分說明，DCA和二甲雙胍聯(lián)合使用能夠更有效地促進宮頸癌細胞凋亡。圖注：A為對照組，B為DCA單藥組，C為二甲雙胍單藥組，D為聯(lián)合用藥組；與對照組相比，**P＜0.01；與DCA單藥組和二甲雙胍單藥組相比，##P＜0.01在蛋白表達方面，Westernblot檢測結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥組中凋亡相關(guān)蛋白剪切型PARP（cleavedPARP）的水平顯著高于DCA單藥組和二甲雙胍單藥組，凋亡抑制蛋白Mcl-1的表達則進一步下調(diào)（圖10）。同時，聯(lián)合用藥組中磷酸化的腺苷酸活化蛋白激酶α（p-AMPKα）和磷酸化的乙酰輔酶A羧化酶（p-ACC）的表達水平也明顯高于二甲雙胍單藥組。這表明DCA和二甲雙胍聯(lián)合使用不僅增強了對凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)作用，還進一步激活了AMPK信號通路，從而更有效地誘導(dǎo)宮頸癌細胞凋亡和抑制細胞增殖。圖注：與對照組相比，**P＜0.01；與DCA單藥組和二甲雙胍單藥組相比，##P＜0.014.3結(jié)果討論本實驗結(jié)果顯示，二***乙酸鹽（DCA）和二甲雙胍聯(lián)合使用對宮頸癌細胞具有顯著的協(xié)同殺傷作用。從細胞增殖角度來看，聯(lián)合用藥組的細胞存活率顯著低于DCA單藥組和二甲雙胍單藥組，表明二者聯(lián)合能更有效地抑制宮頸癌細胞的增殖。這一協(xié)同增效作用可能源于它們作用機制的互補。DCA主要通過抑制丙酮酸脫氫酶激酶（PDK），激活丙酮酸脫氫酶（PDH），促進線粒體有氧氧化，減少腫瘤細胞對糖酵解的依賴，從而抑制細胞增殖；而二甲雙胍則主要通過激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信號通路，抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的活性，阻礙細胞的蛋白質(zhì)合成和核糖體生物發(fā)生等過程，進而抑制細胞增殖。當二者聯(lián)合使用時，從不同代謝途徑和信號通路對宮頸癌細胞進行干預(yù)，使得細胞增殖所需的能量供應(yīng)和物質(zhì)合成均受到更嚴重的阻礙，從而表現(xiàn)出更強的增殖抑制效果。在細胞凋亡方面，聯(lián)合用藥組的細胞凋亡率明顯高于單藥組，表明DCA和二甲雙胍聯(lián)合使用能更有效地促進宮頸癌細胞凋亡。這可能是由于聯(lián)合用藥對凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)作用更強。DCA通過促進蛋白酶體降解凋亡抑制蛋白Mcl-1，使細胞內(nèi)促凋亡信號增強；二甲雙胍激活A(yù)MPK信號通路后，可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達和活性，如上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，促使細胞凋亡。聯(lián)合用藥時，這兩種作用相互協(xié)同，進一步打破了細胞內(nèi)促凋亡和抗凋亡蛋白的平衡，從而更顯著地促進細胞凋亡。此外，聯(lián)合用藥還可能通過其他途徑促進細胞凋亡，如對線粒體功能的影響。線粒體是細胞凋亡的重要調(diào)控中心，DCA和二甲雙胍聯(lián)合作用可能導(dǎo)致線粒體膜電位下降更明顯，釋放更多的細胞色素C等凋亡相關(guān)因子，進而激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細胞凋亡。從蛋白表達結(jié)果來看，聯(lián)合用藥組中剪切型PARP水平顯著升高，Mcl-1表達進一步下調(diào)，同時p-AMPKα和p-ACC的表達水平也明顯高于二甲雙胍單藥組，這進一步證實了聯(lián)合用藥不僅增強了對凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)作用，還進一步激活了AMPK信號通路。這種多途徑、多層次的調(diào)節(jié)作用使得聯(lián)合用藥對宮頸癌細胞的殺傷效果更顯著。DCA和二甲雙胍聯(lián)合治療宮頸癌具有潛在的優(yōu)勢。一方面，聯(lián)合用藥可以提高治療效果，增強對宮頸癌細胞的殺傷作用，有望更有效地控制腫瘤的生長和擴散。另一方面，聯(lián)合使用較低劑量的DCA和二甲雙胍即可達到較好的治療效果，可能減少單藥高劑量使用帶來的副作用，提高患者的耐受性和依從性。然而，聯(lián)合治療也可能存在一些潛在問題。例如，聯(lián)合用藥的最佳劑量和療程尚未明確，不同患者對藥物的反應(yīng)可能存在差異，需要進一步研究以實現(xiàn)個體化治療。此外，長期使用聯(lián)合藥物可能導(dǎo)致腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥性，如何克服耐藥問題也是未來研究需要關(guān)注的重點。綜上所述，本研究明確了DCA和二甲雙胍聯(lián)合使用對宮頸癌細胞具有協(xié)同殺傷作用，其機制涉及對細胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)以及對AMPK信號通路的激活。這為宮頸癌的治療提供了新的思路和潛在的治療方案，但仍需要進一步的研究來優(yōu)化聯(lián)合治療方案，解決潛在問題，以推動其臨床應(yīng)用。4.4小結(jié)本部分實驗表明，二***乙酸鹽（DCA）和二甲雙胍聯(lián)合使用對宮頸癌細胞具有顯著的協(xié)同殺傷作用。通過CCK-8法檢測細胞增殖發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用藥組的細胞存活率明顯低于DCA單藥組和二甲雙胍單藥組，說明二者聯(lián)合能更有效地抑制宮頸癌細胞的增殖。流式細胞儀檢測細胞凋亡結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥組的細胞凋亡率顯著高于單藥組，證實了聯(lián)合使用能更有效地促進宮頸癌細胞凋亡。Westernblot檢測進一步揭示，聯(lián)合用藥組中凋亡相關(guān)蛋白剪切型PARP的水平顯著升高，凋亡抑制蛋白Mcl-1的表達進一步下調(diào)，同時p-AMPKα和p-ACC的表達水平也明顯高于二甲雙胍單藥組，表明聯(lián)合用藥不僅增強了對凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)作用，還進一步激活了AMPK信號通路。這些結(jié)果為宮頸癌的聯(lián)合治療提供了新的理論依據(jù)，有望為臨床治療宮頸癌提供更有效的策略。五、研究總結(jié)與展望5.1研究總結(jié)本研究系統(tǒng)地探究了二***乙酸鹽（DCA）和二甲雙胍單獨及聯(lián)合殺傷宮頸癌細胞的作用及機制，取得了一系列具有重要意義的研究成果。在DCA單獨作用方面，通過CCK-8法、流式細胞儀檢測以及Westernblot等實驗技術(shù)，明確了DCA能夠以劑量依賴的方式顯著抑制宮頸癌細胞的增殖，有效促進其凋亡。深入的機制研究發(fā)現(xiàn)，DCA通過抑制丙酮酸脫氫酶激酶（PDK），激活丙酮酸脫氫酶（PDH），促進線粒體有氧氧化，減少腫瘤細胞對糖酵解的依賴，進而抑制細胞增殖。在誘導(dǎo)凋亡方面，DCA能夠促進蛋白酶體降解凋亡抑制蛋白Mcl-1，上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白剪切型PARP的水平，打破細胞內(nèi)促凋亡和抗凋亡蛋白的平衡，最終誘導(dǎo)宮頸癌細胞凋亡。對于二甲雙胍單獨作用的研究，同樣借助多種實驗方法，證實了二甲雙胍對宮頸癌細胞具有明顯的抑制增殖和促進凋亡作用，且抑制效果呈劑量依賴性。機制研究表明，二甲雙胍主要通過激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信號通路來發(fā)揮作用。激活后的AMPK抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）的活性，阻礙細胞的蛋白質(zhì)合成和核糖體生物發(fā)生等過程，從而抑制細胞增殖。同時，AMPK的激活還調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達和活性，上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達，下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達，促使細胞凋亡；此外，還可能通過影響線粒體功能，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，釋放細胞色素C等凋亡相關(guān)因子，激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)細胞凋亡。在聯(lián)合作用研究中，結(jié)果顯示DCA和二甲雙胍聯(lián)合使用對宮頸癌細胞具有顯著的協(xié)同殺傷作用。聯(lián)合用藥組的細胞存活率明顯低于單藥組，細胞凋亡率顯著高于單藥組。進一步的機制研究表明，聯(lián)合用藥不僅增強了對凋亡相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)作用，使剪切型PARP水平顯著升高，Mcl-1表達進一步下調(diào)，還進一步激活了AMPK信號通路，p-AMPKα和p-ACC的表達水平明顯高于二甲雙胍單藥組。這種協(xié)同作用源于它們作用機制的互補，從不同代謝途徑和信號通路對宮頸癌細胞進行干預(yù)，使得細胞增殖所需的能量供應(yīng)和物質(zhì)合成均受到更嚴重的阻礙，同時更顯著地促進細胞凋亡，從而表現(xiàn)出更強的殺傷效果。本研究為宮頸癌的治療提供了新的理論依據(jù)和潛在的治療策略。DCA和二甲雙胍單獨及聯(lián)合作用對宮頸癌細胞的顯著殺傷作用，為開發(fā)新的宮頸癌治療方法奠定了基礎(chǔ)。聯(lián)合治療可能具有提高治療效果、減少單藥高劑量使用帶來的副作用等優(yōu)勢，有望為宮頸癌患者帶來更好的治療前景。5.2研究不足與展望盡管本研究在二***乙酸鹽（DCA）和二甲雙胍單獨及聯(lián)合殺傷宮頸癌細胞的作用及機制方面取得了一定成果，但仍存在一些不足之處。從實驗?zāi)Ｐ徒嵌葋砜?，本研究主要基于體外細胞實驗，雖然細胞實驗?zāi)軌蚓_控制實驗條件，深入探究藥物作用機制，但體外環(huán)境與體內(nèi)環(huán)境存在顯著差異。在體內(nèi)，腫瘤細胞與周圍的基質(zhì)細胞、免疫細胞、血管等共同構(gòu)成復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境，腫瘤微環(huán)境中的各種因素，如細胞因子、生長因子、細胞外基質(zhì)成分等，都可能影響藥物的作用效果。因此，后續(xù)研究可建立動物模型，如宮頸癌小鼠模型，進一步驗證DCA和二甲雙胍單獨及聯(lián)合治療