miR-34a對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞介導(dǎo)血管新生的調(diào)控機(jī)制探究一、引言1.1研究背景血管新生，亦被稱作血管再生或血管重建，是機(jī)體在損傷或疾病狀態(tài)下，借助自身細(xì)胞和組織修復(fù)與再生能力，形成新血管的過(guò)程。這一過(guò)程在正常生理?xiàng)l件下也持續(xù)進(jìn)行，對(duì)維持血管系統(tǒng)的健康與功能意義重大。在胚胎發(fā)育階段，血管新生確保了各個(gè)器官和組織能夠及時(shí)獲得充足的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)與氧氣，為其正常發(fā)育提供保障。在成年后，當(dāng)機(jī)體遭遇創(chuàng)傷時(shí)，如皮膚破損、骨折等，血管新生能夠迅速啟動(dòng)，促進(jìn)受損組織的修復(fù)和愈合，及時(shí)為受損部位輸送必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和免疫細(xì)胞，加速傷口的恢復(fù)。在缺血性疾病，如心肌梗死、腦梗死等中，血管新生對(duì)于改善缺血組織的血液供應(yīng)，挽救瀕臨死亡的組織細(xì)胞，降低疾病的嚴(yán)重程度和死亡率起著關(guān)鍵作用。倘若血管新生功能出現(xiàn)異常，不僅會(huì)影響傷口的正常愈合，還可能導(dǎo)致組織缺血缺氧，引發(fā)一系列嚴(yán)重的健康問(wèn)題，如慢性潰瘍、器官功能衰竭等。由此可見(jiàn)，深入探究血管新生的機(jī)制，對(duì)于開(kāi)發(fā)新的治療策略，提高疾病的治療效果具有至關(guān)重要的意義。內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，在血管新生中扮演著舉足輕重的角色。在生理或病理因素的刺激下，EPC可從骨髓中被動(dòng)員至外周血，并歸巢至組織損傷或需要血管新生的位點(diǎn)。一旦到達(dá)目標(biāo)位置，EPC能夠分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞，直接參與新血管的形成。在心肌梗死發(fā)生后，骨髓中的EPC會(huì)被大量動(dòng)員釋放到外周血中，隨后遷移至梗死心肌區(qū)域，分化為內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)新血管的生成，改善心肌的血液供應(yīng)。EPC還能分泌多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）等，這些因子可以招募周?chē)膬?nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，促進(jìn)它們的增殖和遷移，間接促進(jìn)血管新生。EPC旁分泌的VEGF能夠與內(nèi)皮細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活下游信號(hào)通路，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，形成新的血管結(jié)構(gòu)。另外，EPC還可以通過(guò)與已有的血管內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，整合入血管壁，增強(qiáng)血管的穩(wěn)定性和功能。所以，EPC在血管新生中的關(guān)鍵作用使其成為了治療缺血性疾病和組織修復(fù)的潛在重要靶點(diǎn)。近年來(lái)，隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)MicroRNA（miRNA）在血管新生的調(diào)控中發(fā)揮著不可或缺的作用。miRNA是一類長(zhǎng)度約為19-25個(gè)核苷酸的非編碼調(diào)控型RNA，廣泛存在于動(dòng)植物、病毒以及單細(xì)胞生物體中。它們雖然不參與編碼蛋白質(zhì)，但在基因轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平能夠通過(guò)降解mRNA或抑制蛋白質(zhì)翻譯等方式，精準(zhǔn)調(diào)控基因的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過(guò)程產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。在血管新生過(guò)程中，多種miRNA參與其中，它們通過(guò)靶向作用于不同的信號(hào)通路和關(guān)鍵基因，對(duì)血管新生進(jìn)行精細(xì)的調(diào)控。miR-126能夠通過(guò)抑制Spred-1基因的表達(dá)，激活PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，從而增強(qiáng)血管新生；而miR-221/222則通過(guò)靶向抑制c-Kit基因，抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖和存活，進(jìn)而抑制血管新生。MicroRNA-34a（miR-34a）作為miRNA家族中的重要成員，近年來(lái)逐漸成為心血管領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。已有研究表明，miR-34a在多種心血管疾病中呈現(xiàn)出異常表達(dá)。在動(dòng)脈粥樣硬化患者的血管組織中，miR-34a的表達(dá)水平顯著升高，并且其表達(dá)量與斑塊的穩(wěn)定性密切相關(guān)。在心肌缺血再灌注損傷模型中，miR-34a的表達(dá)也明顯上調(diào)，參與了心肌細(xì)胞凋亡和心臟功能損傷的病理過(guò)程。然而，miR-34a對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞介導(dǎo)的血管新生的調(diào)控作用及機(jī)制，目前仍不完全清楚。深入研究miR-34a在這一過(guò)程中的作用機(jī)制，不僅有助于我們進(jìn)一步揭示血管新生的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，還可能為心血管疾病的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。比如，若能明確miR-34a對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞的具體調(diào)控機(jī)制，或許可以通過(guò)調(diào)節(jié)miR-34a的表達(dá)來(lái)增強(qiáng)內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能，促進(jìn)血管新生，從而為治療心肌梗死、下肢缺血等缺血性疾病開(kāi)辟新的途徑。因此，本研究聚焦于miR-34a調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞介導(dǎo)的血管新生這一課題，具有重要的理論意義和潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的與意義本研究的核心目的在于深入探究MicroRNA-34a（miR-34a）對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）介導(dǎo)的血管新生的調(diào)控作用及分子機(jī)制。通過(guò)一系列體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，全面分析miR-34a在不同條件下對(duì)EPC生物學(xué)功能的影響，包括EPC的增殖、遷移、分化以及管腔形成能力等，確定其在血管新生過(guò)程中的具體作用環(huán)節(jié)。同時(shí)，運(yùn)用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，明確miR-34a的下游靶基因及相關(guān)信號(hào)通路，揭示miR-34a調(diào)控血管新生的內(nèi)在分子機(jī)制。本研究具有多方面的重要意義。在理論層面，目前雖然已知miRNA在血管新生中發(fā)揮作用，但miR-34a對(duì)EPC介導(dǎo)的血管新生的具體調(diào)控機(jī)制仍存在諸多空白。本研究的開(kāi)展將有助于填補(bǔ)這一領(lǐng)域的知識(shí)空白，進(jìn)一步完善血管新生的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)理論，為深入理解血管生理和病理過(guò)程提供新的理論依據(jù)。通過(guò)明確miR-34a與EPC之間的調(diào)控關(guān)系，能夠更全面地認(rèn)識(shí)細(xì)胞分化、增殖和組織修復(fù)的分子機(jī)制，為相關(guān)基礎(chǔ)研究拓展新的思路。從臨床應(yīng)用角度來(lái)看，心血管疾病嚴(yán)重威脅人類健康，如心肌梗死、缺血性腦卒中、下肢缺血性疾病等，這些疾病的發(fā)生發(fā)展往往與血管新生異常密切相關(guān)。若能揭示miR-34a對(duì)EPC介導(dǎo)血管新生的調(diào)控機(jī)制，就有可能為心血管疾病的治療開(kāi)辟新的途徑?？梢詫iR-34a及其相關(guān)信號(hào)通路作為潛在的治療靶點(diǎn)，開(kāi)發(fā)基于miR-34a調(diào)控的新型治療策略，如設(shè)計(jì)miR-34a的模擬物或抑制劑，用于調(diào)節(jié)EPC的功能，促進(jìn)缺血組織的血管新生，改善血液供應(yīng)，從而為心血管疾病患者帶來(lái)新的治療希望。這不僅有助于提高心血管疾病的治療效果，降低患者的死亡率和致殘率，還能減輕社會(huì)和家庭的醫(yī)療負(fù)擔(dān)，具有顯著的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。1.3研究現(xiàn)狀血管新生的研究歷史悠久，自20世紀(jì)中期起，科研人員便開(kāi)始深入探究其機(jī)制。早期研究主要聚焦于血管新生的形態(tài)學(xué)變化，隨著技術(shù)的不斷進(jìn)步，逐漸深入到細(xì)胞和分子層面。目前已明確，血管新生涉及多種細(xì)胞和復(fù)雜的信號(hào)通路。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）信號(hào)通路在血管新生中占據(jù)核心地位。VEGF與其受體結(jié)合后，能夠激活下游的Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/AKT等信號(hào)通路，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成。血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）等細(xì)胞因子也通過(guò)各自的信號(hào)通路，協(xié)同參與血管新生的調(diào)控。在對(duì)缺血性疾病的治療研究中，基于血管新生機(jī)制的治療策略不斷涌現(xiàn)，如基因治療中通過(guò)導(dǎo)入VEGF基因促進(jìn)缺血組織的血管新生；細(xì)胞治療中利用內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）移植來(lái)增強(qiáng)血管新生能力。然而，這些治療方法仍存在諸多局限性，基因治療面臨基因載體的安全性和靶向性問(wèn)題，細(xì)胞治療則存在細(xì)胞來(lái)源有限、體外擴(kuò)增困難以及免疫排斥等挑戰(zhàn)。內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）的研究始于20世紀(jì)90年代。最初，研究人員發(fā)現(xiàn)外周血中存在能夠分化為內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞群體，隨后將其命名為EPC。隨著研究的深入，EPC的生物學(xué)特性逐漸被揭示。EPC具有自我更新和多向分化的能力，在特定條件下可分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞。EPC在心血管疾病、組織修復(fù)等領(lǐng)域的潛在應(yīng)用價(jià)值受到廣泛關(guān)注。在心肌梗死的治療研究中，將EPC移植到梗死心肌區(qū)域，可促進(jìn)新血管生成，改善心肌功能；在糖尿病足的治療中，EPC治療也顯示出促進(jìn)潰瘍愈合、改善下肢血流的效果。然而，EPC的臨床應(yīng)用仍面臨諸多障礙，EPC在體內(nèi)的存活時(shí)間較短，移植后細(xì)胞的歸巢效率較低，且其分化調(diào)控機(jī)制尚未完全明確，這些問(wèn)題限制了EPC在臨床治療中的效果和廣泛應(yīng)用。MicroRNA（miRNA）的研究起步于20世紀(jì)末，隨著對(duì)其認(rèn)識(shí)的不斷加深，miRNA在生命活動(dòng)中的重要調(diào)控作用逐漸被揭示。在血管新生領(lǐng)域，多種miRNA被發(fā)現(xiàn)參與其中。miR-126通過(guò)靶向抑制Spred-1，激活PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)血管新生；miR-210在缺氧條件下表達(dá)上調(diào)，通過(guò)調(diào)控多個(gè)靶基因，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，增強(qiáng)血管新生能力。關(guān)于MicroRNA-34a（miR-34a）的研究，近年來(lái)逐漸成為熱點(diǎn)。已有研究表明，miR-34a在心血管疾病中表達(dá)異常。在動(dòng)脈粥樣硬化患者的血管組織中，miR-34a表達(dá)升高，且與斑塊的穩(wěn)定性相關(guān)；在心肌缺血再灌注損傷模型中，miR-34a表達(dá)上調(diào)，參與心肌細(xì)胞凋亡和心臟功能損傷的病理過(guò)程。在對(duì)miR-34a與血管新生關(guān)系的研究中，發(fā)現(xiàn)其可能通過(guò)靶向作用于某些基因來(lái)影響血管新生。然而，miR-34a對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞介導(dǎo)的血管新生的具體調(diào)控機(jī)制仍存在大量未知。目前尚不清楚miR-34a如何影響EPC的增殖、遷移、分化等生物學(xué)功能，以及其在體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境下對(duì)血管新生的調(diào)控作用，也未明確miR-34a的下游靶基因及相關(guān)信號(hào)通路。綜上所述，盡管血管新生、內(nèi)皮祖細(xì)胞以及MicroRNA-34a各自的研究都取得了一定進(jìn)展，但miR-34a對(duì)EPC介導(dǎo)的血管新生的調(diào)控機(jī)制仍亟待深入探究。本研究將圍繞這一關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題展開(kāi)，有望為血管新生相關(guān)疾病的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點(diǎn)。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1血管新生概述2.1.1血管新生的概念與過(guò)程血管新生指的是在機(jī)體的特定生理或病理?xiàng)l件下，從已存在的血管系統(tǒng)中，通過(guò)一系列復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程形成新血管的現(xiàn)象。這一過(guò)程在生物體的整個(gè)生命周期中都發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在胚胎發(fā)育階段，血管新生是構(gòu)建完善血管網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵機(jī)制，為胚胎的正常發(fā)育和器官形成提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣供應(yīng)。從最初的血管萌芽到逐漸形成復(fù)雜的血管網(wǎng)絡(luò)，血管新生確保了胚胎各個(gè)組織和器官能夠及時(shí)獲得所需的物質(zhì)，對(duì)胚胎的生長(zhǎng)和發(fā)育起到了決定性作用。在成年期，血管新生同樣不可或缺，它參與了機(jī)體的多種生理和病理過(guò)程。在傷口愈合過(guò)程中，血管新生能夠促進(jìn)受損組織的修復(fù)和再生，為傷口部位提供必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和免疫細(xì)胞，加速傷口的愈合進(jìn)程。當(dāng)機(jī)體發(fā)生缺血性疾病時(shí)，如心肌梗死、腦梗死等，血管新生則是機(jī)體試圖恢復(fù)缺血組織血液供應(yīng)的重要代償機(jī)制。血管新生主要包含兩種方式：血管生成（vasculogenesis）和血管新生（angiogenesis）。血管生成是指在胚胎發(fā)育早期，由血管內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）直接分化形成原始血管網(wǎng)絡(luò)的過(guò)程。在胚胎發(fā)育的特定時(shí)期，中胚層來(lái)源的成血管細(xì)胞聚集并分化為內(nèi)皮祖細(xì)胞，這些內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)一步相互連接，形成最初的血管雛形。隨后，這些原始血管在多種生長(zhǎng)因子和信號(hào)通路的調(diào)控下，不斷進(jìn)行分支和重塑，逐漸構(gòu)建起復(fù)雜的血管網(wǎng)絡(luò)，為胚胎的發(fā)育提供血液供應(yīng)。而血管新生則是指在胚胎發(fā)育后期以及成年生物體中，從已有的血管以出芽或套疊等方式長(zhǎng)出新毛細(xì)血管的過(guò)程。在出芽式血管新生中，首先，血管內(nèi)皮細(xì)胞在多種生長(zhǎng)因子（如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF等）的刺激下，發(fā)生增殖和遷移。血管基底膜在基質(zhì)金屬蛋白酶等酶類的作用下發(fā)生降解，為內(nèi)皮細(xì)胞的遷移提供空間。內(nèi)皮細(xì)胞從母血管的邊緣伸出偽足，形成血管芽。這些血管芽不斷延伸，并吸引周?chē)钠交〖?xì)胞、周細(xì)胞等參與，逐漸形成新的血管分支。相鄰的血管分支相互連接，形成完整的血管回路，實(shí)現(xiàn)血液的流通。套疊式血管新生則是通過(guò)已存在血管的內(nèi)皮細(xì)胞向血管腔內(nèi)突出，形成柱狀結(jié)構(gòu)，隨后這些柱狀結(jié)構(gòu)進(jìn)一步分隔，將一條血管分成兩條或多條血管，從而實(shí)現(xiàn)血管的新生。這種方式在一些器官的生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中，如肺、肝臟等，起到了重要的作用，有助于器官在不增加過(guò)多能量消耗的情況下，快速增加血管的數(shù)量和表面積，以滿足器官功能的需求。2.1.2血管新生的影響因素血管新生是一個(gè)受到多種因素精密調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程，生長(zhǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞因子以及多種信號(hào)通路等都在其中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。生長(zhǎng)因子在血管新生中占據(jù)核心地位。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是目前研究最為深入的促血管生成因子之一。VEGF家族包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D以及胎盤(pán)生長(zhǎng)因子（PlGF）等成員，它們通過(guò)與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的特異性受體（VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3等）結(jié)合，激活下游的多條信號(hào)通路，如Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/AKT等，從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成。VEGF-A與VEGFR-2結(jié)合后，能夠激活PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的存活和增殖；同時(shí)，激活Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）也是一種重要的促血管生成因子，它可以與肝素硫酸蛋白聚糖結(jié)合，激活其受體FGFR，進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和分化，在血管新生的起始和發(fā)展階段都發(fā)揮著重要作用。血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）則主要參與血管新生過(guò)程中平滑肌細(xì)胞和周細(xì)胞的募集和增殖，這些細(xì)胞對(duì)于新生血管的穩(wěn)定性和成熟至關(guān)重要。PDGF通過(guò)與PDGFR結(jié)合，激活下游信號(hào)通路，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞和周細(xì)胞的遷移和增殖，使其圍繞在內(nèi)皮細(xì)胞形成的血管結(jié)構(gòu)周?chē)?，形成穩(wěn)定的血管壁。細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）不僅為細(xì)胞提供物理支撐，還在血管新生過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。ECM主要由膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白等成分組成。在血管新生過(guò)程中，ECM的降解和重塑是內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管芽形成的重要前提?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一類能夠降解ECM的酶類，它們?cè)谘苄律^(guò)程中表達(dá)上調(diào)。MMP-2和MMP-9可以降解膠原蛋白和明膠等ECM成分，為內(nèi)皮細(xì)胞的遷移開(kāi)辟通道。整合素是一類細(xì)胞表面受體，能夠介導(dǎo)細(xì)胞與ECM之間的相互作用。在血管新生過(guò)程中，整合素αvβ3和α5β1等與ECM中的纖連蛋白、層粘連蛋白等結(jié)合，不僅為內(nèi)皮細(xì)胞提供附著位點(diǎn)，還能夠激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和存活。細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素（IL）、腫瘤壞死因子（TNF）等也參與了血管新生的調(diào)控。IL-8可以通過(guò)趨化作用吸引內(nèi)皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞，促進(jìn)血管新生。在炎癥部位，IL-8的表達(dá)升高，吸引內(nèi)皮細(xì)胞向炎癥區(qū)域遷移，參與血管新生，為炎癥部位提供營(yíng)養(yǎng)和免疫細(xì)胞，促進(jìn)炎癥的消退和組織的修復(fù)。TNF-α在低濃度時(shí)可以促進(jìn)血管新生，它通過(guò)激活內(nèi)皮細(xì)胞表面的受體，誘導(dǎo)VEGF等促血管生成因子的表達(dá)，間接促進(jìn)血管新生；但在高濃度時(shí)，TNF-α則可能抑制血管新生，甚至導(dǎo)致血管損傷。另外，Notch信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路等多種信號(hào)通路在血管新生過(guò)程中也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。Notch信號(hào)通路主要參與血管新生過(guò)程中內(nèi)皮細(xì)胞的分化和血管分支的形成。在血管新生過(guò)程中，Notch信號(hào)通路的激活可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞向頂端細(xì)胞（tipcell）分化，促進(jìn)其向柄細(xì)胞（stalkcell）分化，從而調(diào)節(jié)血管分支的數(shù)量和形態(tài)。Wnt信號(hào)通路則通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、遷移和分化，影響血管新生。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，Wnt信號(hào)通路的激活可以促進(jìn)血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖和分化，參與血管生成；在成年生物體中，Wnt信號(hào)通路也參與了傷口愈合和缺血組織血管新生等過(guò)程。這些因素相互作用、相互影響，共同構(gòu)成了一個(gè)復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，確保血管新生在正常生理和病理?xiàng)l件下能夠有序進(jìn)行。2.2內(nèi)皮祖細(xì)胞與血管新生2.2.1內(nèi)皮祖細(xì)胞的生物學(xué)特性內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，在血管新生和血管修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其生物學(xué)特性獨(dú)特，與血管新生密切相關(guān)。EPC的來(lái)源較為廣泛。在胚胎發(fā)育階段，EPC主要起源于中胚層的成血管細(xì)胞。在胚胎早期，卵黃囊的血島中就存在著能夠分化為EPC的細(xì)胞群體，這些細(xì)胞隨后參與了胚胎血管系統(tǒng)的構(gòu)建。隨著胚胎的發(fā)育，EPC逐漸遷移至骨髓、肝臟等造血器官，并在這些器官中儲(chǔ)存。在成年個(gè)體中，骨髓是EPC的主要儲(chǔ)存庫(kù)。當(dāng)機(jī)體受到生理或病理刺激時(shí)，骨髓中的EPC可被動(dòng)員進(jìn)入外周血。在心肌梗死、缺血性腦卒中、下肢缺血等缺血性疾病發(fā)生時(shí)，機(jī)體缺血缺氧的微環(huán)境會(huì)刺激骨髓釋放EPC，使其進(jìn)入外周血循環(huán)。外周血中的EPC數(shù)量相對(duì)較少，但它們具有較強(qiáng)的遷移和歸巢能力，能夠被募集到缺血組織或損傷部位，參與血管新生和組織修復(fù)。除了骨髓和外周血，EPC還可以從臍血、胚胎肝等組織中分離培養(yǎng)得到。臍血中含有豐富的EPC，且臍血來(lái)源的EPC具有增殖能力強(qiáng)、免疫原性低等優(yōu)點(diǎn)，在細(xì)胞治療和組織工程領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。EPC的表面標(biāo)志物具有重要的鑒定意義。目前，常用的EPC表面標(biāo)志物包括CD34、CD133、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（VEGFR-2）等。CD34是一種高度糖基化的跨膜蛋白，主要表達(dá)于造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞表面，在EPC表面也有較高表達(dá)。CD133，又稱Prominin-1，是一種五跨膜糖蛋白，最初被認(rèn)為是造血干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，后來(lái)發(fā)現(xiàn)它也在EPC表面特異性表達(dá)，尤其是在早期EPC中表達(dá)更為顯著。VEGFR-2，即激酶插入結(jié)構(gòu)域受體（KDR），是血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的主要受體之一，在EPC和成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞表面均有表達(dá)。VEGFR-2與VEGF結(jié)合后，能夠激活下游的信號(hào)通路，促進(jìn)EPC的增殖、遷移和分化。除了這些主要標(biāo)志物外，EPC還表達(dá)其他一些表面分子，如CXCR4、CD105等。CXCR4是基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（SDF-1）的受體，在EPC的歸巢過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。SDF-1與CXCR4結(jié)合后，能夠引導(dǎo)EPC遷移至缺血組織或損傷部位。CD105，又稱內(nèi)皮糖蛋白，是一種轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）的輔助受體，在EPC表面表達(dá)，參與EPC的增殖、分化和血管新生過(guò)程。需要注意的是，EPC的表面標(biāo)志物表達(dá)并非一成不變，在不同的分化階段和培養(yǎng)條件下，其表面標(biāo)志物的表達(dá)會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化。在EPC的分化過(guò)程中，隨著其逐漸向成熟內(nèi)皮細(xì)胞分化，CD133的表達(dá)會(huì)逐漸降低，而一些成熟內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物，如VE-cadherin、vonWillebrandfactor（vWF）等的表達(dá)會(huì)逐漸升高。EPC具有較強(qiáng)的分化潛能，在適宜的條件下，EPC能夠分化為成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞。這一過(guò)程受到多種生長(zhǎng)因子和信號(hào)通路的調(diào)控。VEGF是誘導(dǎo)EPC分化的關(guān)鍵因子之一。VEGF與其受體VEGFR-2結(jié)合后，激活下游的PI3K/AKT和MAPK等信號(hào)通路，促進(jìn)EPC的增殖和分化。在VEGF的刺激下，EPC會(huì)逐漸表達(dá)成熟內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物，如VE-cadherin、vWF等，同時(shí)獲得內(nèi)皮細(xì)胞的功能，如形成管腔結(jié)構(gòu)、攝取乙酰化低密度脂蛋白等。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）等生長(zhǎng)因子也能協(xié)同VEGF，促進(jìn)EPC的分化。bFGF可以促進(jìn)EPC的增殖和遷移，并增強(qiáng)VEGF對(duì)EPC分化的誘導(dǎo)作用。IGF-1則通過(guò)激活PI3K/AKT信號(hào)通路，促進(jìn)EPC的存活和分化。另外，Notch信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路等在EPC的分化過(guò)程中也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。Notch信號(hào)通路的激活可以抑制EPC向頂端細(xì)胞分化，促進(jìn)其向柄細(xì)胞分化，從而調(diào)節(jié)血管新生過(guò)程中血管分支的形成和形態(tài)。Wnt信號(hào)通路通過(guò)調(diào)節(jié)EPC的增殖、遷移和分化，參與血管新生過(guò)程。在EPC分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞后，它們能夠整合到已有的血管網(wǎng)絡(luò)中，或者形成新的血管結(jié)構(gòu)，直接參與血管新生過(guò)程。EPC還可以通過(guò)旁分泌作用，分泌多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，如VEGF、bFGF、血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）等，這些因子可以招募周?chē)膬?nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，促進(jìn)它們的增殖和遷移，間接促進(jìn)血管新生。2.2.2內(nèi)皮祖細(xì)胞介導(dǎo)血管新生的過(guò)程內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）介導(dǎo)血管新生是一個(gè)多步驟、復(fù)雜且有序的過(guò)程，在機(jī)體應(yīng)對(duì)缺血、損傷等情況時(shí)發(fā)揮著關(guān)鍵作用，具體過(guò)程如下：動(dòng)員：在正常生理狀態(tài)下，EPC主要存在于骨髓中，處于相對(duì)靜止的狀態(tài)。當(dāng)機(jī)體受到缺血、缺氧、炎癥、創(chuàng)傷等刺激時(shí)，骨髓中的EPC會(huì)被動(dòng)員進(jìn)入外周血循環(huán)。這一過(guò)程受到多種細(xì)胞因子和信號(hào)通路的調(diào)控。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是誘導(dǎo)EPC動(dòng)員的關(guān)鍵因子之一。當(dāng)組織缺血缺氧時(shí)，局部組織細(xì)胞會(huì)分泌大量的VEGF，VEGF與骨髓中EPC表面的VEGFR-2結(jié)合，激活下游的PI3K/AKT、MAPK等信號(hào)通路。這些信號(hào)通路的激活可以促進(jìn)EPC的增殖，并調(diào)節(jié)EPC表面黏附分子的表達(dá)，如整合素、選擇素等，使EPC與骨髓基質(zhì)細(xì)胞之間的黏附力減弱，從而使EPC能夠穿越骨髓竇狀內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)入外周血循環(huán)。血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）、干細(xì)胞因子（SCF）等細(xì)胞因子也參與了EPC的動(dòng)員過(guò)程。PDGF可以通過(guò)與EPC表面的PDGFR結(jié)合，激活相關(guān)信號(hào)通路，協(xié)同VEGF促進(jìn)EPC的動(dòng)員。FGF能夠刺激骨髓微環(huán)境中的細(xì)胞分泌其他促動(dòng)員因子，間接促進(jìn)EPC的動(dòng)員。SCF則可以增強(qiáng)EPC的存活和增殖能力，有助于EPC的動(dòng)員。另外，一些趨化因子如基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（SDF-1）也在EPC的動(dòng)員中發(fā)揮作用。SDF-1主要由骨髓基質(zhì)細(xì)胞分泌，它與EPC表面的受體CXCR4結(jié)合，形成SDF-1/CXCR4軸，引導(dǎo)EPC從骨髓向血管壁遷移，并進(jìn)入外周血循環(huán)。歸巢：進(jìn)入外周血循環(huán)的EPC會(huì)被募集到缺血組織或血管損傷部位，這一過(guò)程稱為歸巢。EPC的歸巢是一個(gè)高度特異性的過(guò)程，受到多種因素的精確調(diào)控。SDF-1在EPC歸巢中起著核心作用。缺血組織會(huì)大量分泌SDF-1，形成一個(gè)從缺血組織到外周血的濃度梯度。EPC表面表達(dá)的CXCR4能夠感知SDF-1的濃度梯度，并引導(dǎo)EPC沿著濃度梯度向缺血組織遷移。在遷移過(guò)程中，EPC與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的黏附分子相互作用，如選擇素E、血管細(xì)胞黏附分子-1（VCAM-1）等。選擇素E可以與EPC表面的糖類配體結(jié)合，使EPC在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面發(fā)生滾動(dòng)，減緩EPC的流速。隨后，EPC表面的整合素α4β1等與VCAM-1結(jié)合，使EPC牢固地黏附在血管內(nèi)皮細(xì)胞上。VEGF也參與了EPC的歸巢過(guò)程。VEGF可以通過(guò)活化缺血組織內(nèi)皮細(xì)胞中的Akt信號(hào)通路，上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞表面黏附分子的表達(dá)，增強(qiáng)EPC與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，從而促進(jìn)EPC的歸巢。另外，炎癥反應(yīng)也可以促進(jìn)EPC的歸巢。在炎癥部位，炎癥細(xì)胞會(huì)釋放多種細(xì)胞因子和趨化因子，這些因子可以激活微血管內(nèi)皮表面的膜結(jié)合配體mbKitL的表達(dá)，進(jìn)而通過(guò)c-Kit和mbKitL的相互作用，將EPC募集到病變部位。分化與參與血管新生：歸巢到缺血組織或損傷部位的EPC，在局部微環(huán)境的作用下，開(kāi)始分化為成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞。這一過(guò)程受到多種生長(zhǎng)因子和信號(hào)通路的調(diào)控。在VEGF、bFGF、IGF-1等生長(zhǎng)因子的刺激下，EPC逐漸表達(dá)成熟內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物，如VE-cadherin、vWF、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）等。同時(shí)，EPC的形態(tài)也逐漸發(fā)生改變，從圓形或橢圓形逐漸變?yōu)樗笮?，并具有形成管腔結(jié)構(gòu)的能力。在分化過(guò)程中，EPC通過(guò)增殖和遷移，逐漸整合到已有的血管網(wǎng)絡(luò)中，或者與其他EPC以及周?chē)膬?nèi)皮細(xì)胞相互連接，形成新的血管芽。這些血管芽不斷延伸、分支，并吸引周?chē)钠交〖?xì)胞、周細(xì)胞等參與，逐漸形成新的血管結(jié)構(gòu)。EPC還可以通過(guò)旁分泌作用，分泌多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，如VEGF、bFGF、PDGF等，這些因子可以招募周?chē)膬?nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，促進(jìn)它們的增殖和遷移，間接促進(jìn)血管新生。EPC分泌的VEGF可以作用于周?chē)膬?nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，增強(qiáng)血管新生能力。EPC分泌的PDGF則可以招募平滑肌細(xì)胞和周細(xì)胞，這些細(xì)胞圍繞在新生血管周?chē)纬煞€(wěn)定的血管壁結(jié)構(gòu)，有助于新生血管的成熟和穩(wěn)定。在血管新生過(guò)程中，EPC還可以通過(guò)與其他細(xì)胞的相互作用，如與巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等，調(diào)節(jié)血管新生的微環(huán)境，促進(jìn)血管新生的進(jìn)行。巨噬細(xì)胞可以分泌多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等，這些因子可以調(diào)節(jié)EPC的功能，促進(jìn)血管新生。成纖維細(xì)胞則可以分泌細(xì)胞外基質(zhì)成分，為EPC的黏附和生長(zhǎng)提供支持，同時(shí)也參與了血管新生過(guò)程中血管壁的構(gòu)建。2.3MicroRNA-34a的特性與功能2.3.1MicroRNA-34a的結(jié)構(gòu)與作用機(jī)制MicroRNA-34a（miR-34a）是一種高度保守的內(nèi)源性非編碼小分子RNA，其成熟序列長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸。miR-34a基因位于人類染色體1p36.22區(qū)域，該區(qū)域在多種腫瘤中常發(fā)生缺失或低表達(dá)。miR-34a基因的轉(zhuǎn)錄受到多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，p53是其重要的上游調(diào)控因子。在DNA損傷、氧化應(yīng)激等刺激下，p53蛋白被激活，它可以結(jié)合到miR-34a基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)miR-34a的轉(zhuǎn)錄。在腫瘤細(xì)胞中，當(dāng)細(xì)胞受到化療藥物等刺激導(dǎo)致DNA損傷時(shí)，p53被激活，進(jìn)而上調(diào)miR-34a的表達(dá)。miR-34a的原始轉(zhuǎn)錄本（pri-miR-34a）首先在細(xì)胞核內(nèi)由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄生成。pri-miR-34a長(zhǎng)度可達(dá)數(shù)千個(gè)核苷酸，具有典型的莖環(huán)結(jié)構(gòu)。隨后，在核酸酶Drosha及其輔助因子DGCR8的作用下，pri-miR-34a被切割成約70-100個(gè)核苷酸的前體miRNA（pre-miR-34a）。pre-miR-34a仍然具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)，它通過(guò)Exportin-5轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)。在細(xì)胞質(zhì)中，pre-miR-34a被核酸酶Dicer識(shí)別并進(jìn)一步切割，形成長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的雙鏈miR-34a。雙鏈miR-34a中的一條鏈會(huì)被降解，另一條鏈則與AGO蛋白等結(jié)合，形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）。miR-34a主要通過(guò)與靶mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）互補(bǔ)配對(duì)，發(fā)揮其調(diào)控基因表達(dá)的作用。當(dāng)miR-34a與靶mRNA的3'UTR完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，RISC中的核酸酶會(huì)切割靶mRNA，導(dǎo)致其降解，從而抑制基因的表達(dá)。當(dāng)miR-34a與靶mRNA的3'UTR不完全互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，RISC會(huì)抑制靶mRNA的翻譯過(guò)程，使mRNA無(wú)法翻譯成蛋白質(zhì)，同樣達(dá)到抑制基因表達(dá)的效果。研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a可以靶向作用于沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）的mRNA。miR-34a與SIRT1mRNA的3'UTR互補(bǔ)配對(duì)，抑制SIRT1的表達(dá)。SIRT1是一種去乙?；?，在細(xì)胞衰老、凋亡等過(guò)程中發(fā)揮重要作用。miR-34a對(duì)SIRT1的抑制，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白的乙?；缴?，進(jìn)而影響細(xì)胞的生物學(xué)功能。miR-34a還可以通過(guò)調(diào)控其他信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)，間接影響細(xì)胞的生理過(guò)程。miR-34a可以靶向作用于Notch信號(hào)通路中的關(guān)鍵基因，抑制Notch信號(hào)通路的激活，從而影響細(xì)胞的分化和增殖。2.3.2MicroRNA-34a在疾病中的作用MicroRNA-34a（miR-34a）在多種疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色，其異常表達(dá)與疾病的進(jìn)程和預(yù)后密切相關(guān)。在腫瘤領(lǐng)域，miR-34a被廣泛認(rèn)為是一種抑癌基因。在多種腫瘤細(xì)胞中，如肺癌、乳腺癌、肝癌、結(jié)直腸癌等，miR-34a的表達(dá)水平顯著低于正常組織。這種低表達(dá)狀態(tài)使得miR-34a對(duì)其靶基因的抑制作用減弱，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力增強(qiáng)。在肺癌細(xì)胞中，miR-34a可以通過(guò)靶向抑制原癌基因SIRT1、c-Myc、Notch1等的表達(dá)，發(fā)揮其抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用。miR-34a與SIRT1mRNA的3'UTR互補(bǔ)結(jié)合，抑制SIRT1的表達(dá)，從而阻斷SIRT1介導(dǎo)的細(xì)胞周期調(diào)控和抗凋亡信號(hào)通路，誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，抑制其增殖。在乳腺癌細(xì)胞中，miR-34a可以靶向抑制Met基因的表達(dá)，Met是一種肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體，其異常激活與乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。miR-34a通過(guò)抑制Met的表達(dá)，降低乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。另外，miR-34a還可以通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞功能，影響腫瘤的免疫逃逸。研究表明，miR-34a可以促進(jìn)樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟和功能，增強(qiáng)其抗原呈遞能力，從而激活T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫反應(yīng)。在心血管疾病方面，miR-34a同樣發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，miR-34a的表達(dá)水平在血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中均發(fā)生變化。在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定區(qū)域，miR-34a的表達(dá)顯著升高。miR-34a可以通過(guò)靶向抑制多個(gè)基因的表達(dá)，影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能、平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移以及巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。miR-34a可以靶向抑制SIRT1的表達(dá)，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞中一氧化氮（NO）的生成減少，血管舒張功能受損。miR-34a還可以靶向抑制KLF4等基因的表達(dá)，促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，加速動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成和發(fā)展。在心肌缺血再灌注損傷中，miR-34a的表達(dá)也明顯上調(diào)。miR-34a通過(guò)靶向抑制SIRT1、Bcl-2等基因的表達(dá)，促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，加重心肌損傷。miR-34a抑制SIRT1后，會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激水平升高，線粒體功能受損，從而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，miR-34a也參與了疾病的病理過(guò)程。在阿爾茨海默病患者的腦組織中，miR-34a的表達(dá)水平升高。miR-34a可以通過(guò)靶向抑制多個(gè)與神經(jīng)細(xì)胞存活、突觸可塑性和β-淀粉樣蛋白代謝相關(guān)的基因，如SIRT1、BACE1等，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，加重認(rèn)知功能障礙。miR-34a抑制SIRT1后，會(huì)影響神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)的能量代謝和抗氧化防御機(jī)制，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的敏感性增加。miR-34a抑制BACE1后，會(huì)導(dǎo)致β-淀粉樣蛋白的生成增加，促進(jìn)其在腦組織中的沉積，形成老年斑，進(jìn)一步損害神經(jīng)細(xì)胞的功能。在帕金森病模型中，miR-34a的異常表達(dá)也與多巴胺能神經(jīng)元的損傷和凋亡有關(guān)。miR-34a通過(guò)靶向抑制相關(guān)基因的表達(dá)，影響多巴胺能神經(jīng)元的存活和功能，參與帕金森病的發(fā)病機(jī)制。三、MicroRNA-34a對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞的調(diào)控作用3.1MicroRNA-34a與內(nèi)皮祖細(xì)胞的關(guān)系3.1.1內(nèi)皮祖細(xì)胞中MicroRNA-34a的表達(dá)情況內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）在血管新生中扮演著關(guān)鍵角色，而MicroRNA-34a（miR-34a）在EPC中的表達(dá)情況及其動(dòng)態(tài)變化，對(duì)理解血管新生的調(diào)控機(jī)制至關(guān)重要。在正常生理?xiàng)l件下，EPC中miR-34a呈現(xiàn)出一定水平的基礎(chǔ)表達(dá)。研究表明，在健康個(gè)體的骨髓來(lái)源EPC中，miR-34a維持著相對(duì)穩(wěn)定的低表達(dá)狀態(tài)。這種低表達(dá)狀態(tài)對(duì)于維持EPC的正常生物學(xué)功能具有重要意義。低水平的miR-34a能夠保證EPC內(nèi)相關(guān)基因的正常表達(dá)，從而維持EPC的增殖、存活、遷移和分化等功能的平衡。有研究通過(guò)對(duì)小鼠骨髓EPC的體外培養(yǎng)和檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，正常培養(yǎng)條件下，miR-34a的表達(dá)量相對(duì)穩(wěn)定，且處于較低水平，此時(shí)EPC能夠正常增殖和分化，表現(xiàn)出良好的生物學(xué)活性。當(dāng)機(jī)體受到缺血、缺氧等病理刺激時(shí)，EPC中miR-34a的表達(dá)會(huì)發(fā)生顯著變化。在心肌梗死、下肢缺血等缺血性疾病模型中，研究人員發(fā)現(xiàn)缺血組織局部的EPC中miR-34a的表達(dá)明顯上調(diào)。在小鼠心肌梗死模型中，通過(guò)對(duì)梗死心肌區(qū)域周?chē)技腅PC進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-34a的表達(dá)水平較正常對(duì)照組顯著升高。這種表達(dá)上調(diào)可能是機(jī)體對(duì)缺血缺氧的一種應(yīng)激反應(yīng)。缺血缺氧微環(huán)境中的多種因素，如低氧誘導(dǎo)因子（HIF）等，可能通過(guò)調(diào)控miR-34a基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致其表達(dá)增加。研究表明，HIF-1α可以與miR-34a基因的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，從而使EPC中miR-34a的表達(dá)上調(diào)。衰老也是影響EPC中miR-34a表達(dá)的重要因素。隨著年齡的增長(zhǎng)，機(jī)體的血管新生能力逐漸下降，這與EPC功能的衰退密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，老年個(gè)體的EPC中miR-34a的表達(dá)水平明顯高于年輕個(gè)體。對(duì)老年小鼠和年輕小鼠的骨髓EPC進(jìn)行對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，老年小鼠EPC中miR-34a的表達(dá)量顯著增加。衰老過(guò)程中，氧化應(yīng)激水平升高、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的改變等因素可能導(dǎo)致miR-34a的表達(dá)上調(diào)。衰老過(guò)程中產(chǎn)生的過(guò)多活性氧（ROS）可以激活相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)miR-34a的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而導(dǎo)致其在EPC中的表達(dá)升高。疾病狀態(tài)同樣會(huì)對(duì)EPC中miR-34a的表達(dá)產(chǎn)生影響。在糖尿病患者中，由于長(zhǎng)期的高血糖狀態(tài)以及由此引發(fā)的一系列代謝紊亂，EPC的功能受到抑制，同時(shí)miR-34a的表達(dá)也發(fā)生改變。研究表明，糖尿病患者外周血EPC中miR-34a的表達(dá)明顯升高。高血糖環(huán)境可以通過(guò)多種途徑，如激活蛋白激酶C（PKC）信號(hào)通路、增加晚期糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）的生成等，影響miR-34a的表達(dá)。AGEs可以與EPC表面的受體結(jié)合，激活下游信號(hào)通路，導(dǎo)致miR-34a的表達(dá)上調(diào)。EPC中miR-34a的表達(dá)變化在不同生理和病理?xiàng)l件下具有重要意義。在缺血缺氧條件下，miR-34a表達(dá)上調(diào)可能是機(jī)體的一種自我保護(hù)機(jī)制，但其過(guò)度表達(dá)也可能對(duì)EPC的功能產(chǎn)生負(fù)面影響。在衰老和疾病狀態(tài)下，miR-34a表達(dá)的異常升高可能是導(dǎo)致EPC功能衰退的重要原因之一。深入研究這些表達(dá)變化的機(jī)制，有助于揭示血管新生的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為相關(guān)疾病的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。3.1.2MicroRNA-34a對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞功能的影響MicroRNA-34a（miR-34a）作為一種重要的非編碼RNA，對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）的多種功能具有顯著的調(diào)控作用，這些作用對(duì)于血管新生過(guò)程至關(guān)重要。對(duì)增殖的影響：大量研究表明，miR-34a對(duì)EPC的增殖具有抑制作用。通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)，將miR-34a模擬物轉(zhuǎn)染到EPC中，使EPC內(nèi)miR-34a的表達(dá)上調(diào)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EPC的增殖能力明顯下降。研究人員利用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-34a模擬物的EPC在培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞增殖速率顯著低于對(duì)照組。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a可能通過(guò)靶向作用于與細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)的基因，如沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）等，來(lái)抑制EPC的增殖。SIRT1是一種去乙?；?，在細(xì)胞增殖和衰老過(guò)程中發(fā)揮重要作用。miR-34a與SIRT1mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）互補(bǔ)配對(duì)，抑制SIRT1的表達(dá)，從而導(dǎo)致EPC內(nèi)相關(guān)蛋白的乙?；缴?，細(xì)胞周期阻滯在G1期，抑制EPC的增殖。對(duì)存活的影響：miR-34a對(duì)EPC的存活也有著重要影響。在氧化應(yīng)激等病理?xiàng)l件下，EPC的存活能力受到挑戰(zhàn)，而miR-34a的表達(dá)變化會(huì)進(jìn)一步影響EPC的存活。當(dāng)EPC受到氧化應(yīng)激損傷時(shí)，如暴露于過(guò)氧化氫（H2O2）環(huán)境中，miR-34a的表達(dá)會(huì)上調(diào)，導(dǎo)致EPC的凋亡增加，存活能力下降。研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a可以通過(guò)靶向抑制抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，使EPC對(duì)氧化應(yīng)激更加敏感，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。miR-34a與Bcl-2mRNA的3'UTR結(jié)合，抑制Bcl-2的翻譯，導(dǎo)致Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，從而削弱了EPC的抗凋亡能力。相反，抑制miR-34a的表達(dá)，可以減少EPC在氧化應(yīng)激條件下的凋亡，提高其存活能力。通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-34a抑制劑，降低EPC內(nèi)miR-34a的表達(dá)，再給予氧化應(yīng)激刺激，發(fā)現(xiàn)EPC的凋亡率明顯降低，存活細(xì)胞數(shù)量增加。對(duì)遷移的影響：EPC的遷移能力對(duì)于其歸巢到缺血組織或損傷部位，參與血管新生至關(guān)重要，而miR-34a在這一過(guò)程中發(fā)揮著調(diào)控作用。研究表明，miR-34a過(guò)表達(dá)會(huì)抑制EPC的遷移能力。利用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EPC的遷移能力，當(dāng)EPC轉(zhuǎn)染miR-34a模擬物后，穿過(guò)Transwell小室膜的細(xì)胞數(shù)量明顯少于對(duì)照組。深入研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a可能通過(guò)靶向作用于與細(xì)胞遷移相關(guān)的基因和信號(hào)通路來(lái)抑制EPC的遷移。miR-34a可以抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)，MMPs能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，為EPC的遷移提供條件。miR-34a通過(guò)抑制MMP-2和MMP-9等的表達(dá)，使細(xì)胞外基質(zhì)的降解減少，阻礙了EPC的遷移。miR-34a還可能影響EPC表面黏附分子的表達(dá)，如整合素等，降低EPC與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附能力，從而抑制其遷移。對(duì)分化的影響：EPC向成熟內(nèi)皮細(xì)胞的分化是血管新生的關(guān)鍵步驟，miR-34a在這一過(guò)程中也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a過(guò)表達(dá)會(huì)抑制EPC的分化。在體外誘導(dǎo)EPC分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，轉(zhuǎn)染miR-34a模擬物的EPC，其分化為表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物（如VE-cadherin、vonWillebrandfactor等）的成熟內(nèi)皮細(xì)胞的比例明顯低于對(duì)照組。進(jìn)一步研究表明，miR-34a可能通過(guò)靶向作用于與EPC分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)通路來(lái)抑制分化。miR-34a可以抑制Krüppel樣因子4（KLF4）的表達(dá)，KLF4是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，在EPC分化過(guò)程中發(fā)揮促進(jìn)作用。miR-34a與KLF4mRNA的3'UTR結(jié)合，抑制KLF4的表達(dá)，從而阻礙EPC向成熟內(nèi)皮細(xì)胞的分化。miR-34a對(duì)EPC的增殖、存活、遷移和分化等功能均具有顯著的調(diào)控作用。這些調(diào)控作用在不同的生理和病理?xiàng)l件下，對(duì)EPC介導(dǎo)的血管新生過(guò)程產(chǎn)生重要影響。深入研究miR-34a對(duì)EPC功能的調(diào)控機(jī)制，有助于揭示血管新生的分子機(jī)制，為相關(guān)疾病的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。3.2MicroRNA-34a調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞的分子機(jī)制3.2.1靶向SIRT1調(diào)控細(xì)胞周期和凋亡MicroRNA-34a（miR-34a）對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）的調(diào)控作用在很大程度上是通過(guò)靶向沉默信息調(diào)節(jié)因子1（SIRT1）來(lái)實(shí)現(xiàn)的，這一調(diào)控過(guò)程對(duì)EPC的細(xì)胞周期和凋亡產(chǎn)生重要影響。SIRT1是一種NAD+依賴的去乙?；?，在細(xì)胞的生理過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色，尤其在細(xì)胞周期調(diào)控和抗凋亡方面作用顯著。在EPC中，SIRT1通過(guò)對(duì)多種關(guān)鍵蛋白的去乙?；揎?，維持細(xì)胞周期的正常進(jìn)行和細(xì)胞的存活。SIRT1可以使p53蛋白去乙?；?，抑制p53的活性，從而避免p53誘導(dǎo)的細(xì)胞周期阻滯和凋亡。當(dāng)細(xì)胞受到DNA損傷等應(yīng)激時(shí)，p53會(huì)被乙酰化激活，導(dǎo)致細(xì)胞周期停滯在G1期或G2期，甚至引發(fā)細(xì)胞凋亡。而SIRT1的去乙?；饔每梢允筽53失活，保證細(xì)胞周期的正常推進(jìn)。SIRT1還可以對(duì)FOXO家族轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行去乙?；揎?。FOXO轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞內(nèi)參與多種生物學(xué)過(guò)程，包括細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡和抗氧化應(yīng)激等。SIRT1對(duì)FOXO的去乙酰化可以抑制FOXO的轉(zhuǎn)錄活性，減少其對(duì)細(xì)胞周期抑制蛋白和促凋亡蛋白的轉(zhuǎn)錄激活，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖和存活。miR-34a與SIRT1之間存在著精確的靶向調(diào)控關(guān)系。miR-34a的種子序列能夠與SIRT1mRNA的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）互補(bǔ)配對(duì)。當(dāng)miR-34a表達(dá)上調(diào)時(shí)，它會(huì)與SIRT1mRNA結(jié)合，招募RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）。RISC中的核酸酶會(huì)切割SIRT1mRNA，或者抑制其翻譯過(guò)程，導(dǎo)致SIRT1蛋白表達(dá)水平降低。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)可以驗(yàn)證這種靶向關(guān)系。將包含SIRT1mRNA3'UTR的熒光素酶報(bào)告載體與miR-34a模擬物共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的熒光素酶活性顯著降低，表明miR-34a能夠特異性地靶向SIRT1mRNA。miR-34a對(duì)SIRT1的靶向抑制，會(huì)對(duì)EPC的細(xì)胞周期和凋亡產(chǎn)生明顯影響。在細(xì)胞周期方面，由于SIRT1表達(dá)降低，其對(duì)p53和FOXO等蛋白的去乙?；饔脺p弱。p53蛋白乙?；缴撸せ頿53下游的細(xì)胞周期抑制基因，如p21等。p21可以與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）結(jié)合，抑制CDK的活性，從而使細(xì)胞周期阻滯在G1期，抑制EPC的增殖。研究表明，在miR-34a過(guò)表達(dá)的EPC中，p21蛋白表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞周期分布發(fā)生明顯改變，G1期細(xì)胞比例增加，S期和G2/M期細(xì)胞比例減少。在細(xì)胞凋亡方面，SIRT1表達(dá)下降會(huì)導(dǎo)致FOXO轉(zhuǎn)錄因子的乙?；缴?，激活FOXO下游的促凋亡基因，如Bim、PUMA等。這些促凋亡蛋白可以激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，細(xì)胞色素c釋放，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-34a過(guò)表達(dá)的EPC在受到氧化應(yīng)激等刺激時(shí)，細(xì)胞凋亡率明顯增加，Bim、PUMA等促凋亡蛋白表達(dá)上調(diào)，caspase-3的活性也顯著增強(qiáng)。3.2.2對(duì)其他相關(guān)信號(hào)通路的影響除了通過(guò)靶向SIRT1對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）產(chǎn)生直接影響外，MicroRNA-34a（miR-34a）還能夠?qū)I3K/Akt、MAPK等多條信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)控，從而間接影響EPC的功能。PI3K/Akt信號(hào)通路在EPC的增殖、存活、遷移和分化等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。正常情況下，當(dāng)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等生長(zhǎng)因子與EPC表面的受體結(jié)合后，會(huì)激活受體酪氨酸激酶，使PI3K的p85亞基與受體結(jié)合并激活p110亞基。激活的PI3K催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3）。PIP3可以招募Akt到細(xì)胞膜上，并在PDK1和mTORC2等激酶的作用下使Akt磷酸化激活。激活的Akt可以通過(guò)多種途徑促進(jìn)EPC的功能。Akt可以磷酸化并抑制糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）的活性，從而穩(wěn)定細(xì)胞周期蛋白D1，促進(jìn)細(xì)胞周期從G1期向S期的過(guò)渡，促進(jìn)EPC的增殖。Akt還可以磷酸化并激活抗凋亡蛋白Bcl-2家族成員，如Bcl-XL等，抑制促凋亡蛋白Bad的活性，從而抑制EPC的凋亡，提高其存活能力。Akt可以調(diào)節(jié)EPC表面黏附分子和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)，促進(jìn)EPC的遷移和分化。miR-34a可以通過(guò)多種方式對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路進(jìn)行調(diào)控。miR-34a可能靶向作用于PI3K/Akt信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子。研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a可以靶向抑制PI3K的調(diào)節(jié)亞基p85α的表達(dá)。miR-34a與p85αmRNA的3'UTR互補(bǔ)配對(duì)，抑制p85α的翻譯，導(dǎo)致PI3K的活性降低，進(jìn)而抑制Akt的磷酸化激活。在miR-34a過(guò)表達(dá)的EPC中，p85α蛋白表達(dá)水平明顯下降，Akt的磷酸化水平也顯著降低，EPC的增殖、存活和遷移能力受到抑制。miR-34a還可以通過(guò)影響其他信號(hào)通路，間接調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路。miR-34a對(duì)SIRT1的抑制可能會(huì)影響SIRT1對(duì)Akt的調(diào)節(jié)作用。SIRT1可以使Akt去乙酰化，增強(qiáng)Akt的活性。當(dāng)miR-34a抑制SIRT1表達(dá)后，Akt的去乙酰化水平降低，活性受到抑制，從而影響EPC的功能。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路也是EPC功能調(diào)控的重要信號(hào)通路之一，主要包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK三條主要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。在EPC中，MAPK信號(hào)通路參與了細(xì)胞增殖、分化、遷移和凋亡等多種生物學(xué)過(guò)程。當(dāng)EPC受到生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等刺激時(shí)，MAPK信號(hào)通路被激活。以ERK途徑為例，生長(zhǎng)因子與受體結(jié)合后，通過(guò)Ras-Raf-MEK-ERK的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使ERK磷酸化激活。激活的ERK可以進(jìn)入細(xì)胞核，磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子，如Elk-1、c-Myc等，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)基因和生長(zhǎng)因子的表達(dá)，促進(jìn)EPC的增殖和分化。JNK和p38MAPK信號(hào)通路在EPC受到應(yīng)激刺激時(shí)被激活，它們可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡和炎癥反應(yīng)。在氧化應(yīng)激條件下，JNK和p38MAPK被激活，促進(jìn)EPC的凋亡。miR-34a同樣可以對(duì)MAPK信號(hào)通路產(chǎn)生調(diào)控作用。研究表明，miR-34a過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致EPC中ERK的磷酸化水平降低。miR-34a可能通過(guò)靶向作用于MAPK信號(hào)通路中的上游調(diào)節(jié)分子，如Ras、Raf等，抑制MAPK信號(hào)通路的激活。miR-34a與RasmRNA的3'UTR結(jié)合，抑制Ras的表達(dá)，從而阻斷Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使ERK的磷酸化水平下降，EPC的增殖和分化能力受到抑制。miR-34a對(duì)JNK和p38MAPK信號(hào)通路也有影響。在氧化應(yīng)激條件下，miR-34a過(guò)表達(dá)會(huì)增強(qiáng)JNK和p38MAPK的激活，促進(jìn)EPC的凋亡。這可能是因?yàn)閙iR-34a通過(guò)抑制某些抗凋亡基因的表達(dá)，使EPC對(duì)氧化應(yīng)激更加敏感，從而增強(qiáng)了JNK和p38MAPK信號(hào)通路介導(dǎo)的凋亡信號(hào)。四、MicroRNA-34a調(diào)控內(nèi)皮祖細(xì)胞介導(dǎo)血管新生的研究案例4.1動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究4.1.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法為深入探究MicroRNA-34a（miR-34a）對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）介導(dǎo)血管新生的調(diào)控作用，研究人員精心設(shè)計(jì)了一系列動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，以小鼠后肢缺血模型為主要研究對(duì)象。在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇上，優(yōu)先選用健康成年的C57BL/6小鼠。這類小鼠具有遺傳背景清晰、免疫反應(yīng)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于心血管疾病相關(guān)研究。將小鼠隨機(jī)分為多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組小鼠數(shù)量依據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)要求合理設(shè)定，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性和統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。具體分組如下：正常對(duì)照組，該組小鼠僅接受假手術(shù)處理，即只進(jìn)行麻醉、切開(kāi)皮膚等操作，但不結(jié)扎后肢動(dòng)脈，以此作為正常生理狀態(tài)下的對(duì)照；模型對(duì)照組，對(duì)小鼠進(jìn)行后肢缺血模型構(gòu)建，但不進(jìn)行任何miR-34a相關(guān)干預(yù)，用于觀察缺血模型自然發(fā)展過(guò)程中的血管新生情況；miR-34a過(guò)表達(dá)組，在構(gòu)建后肢缺血模型的基礎(chǔ)上，通過(guò)特定方式使小鼠體內(nèi)的miR-34a表達(dá)上調(diào)；miR-34a抑制組，構(gòu)建后肢缺血模型后，采取措施抑制小鼠體內(nèi)miR-34a的表達(dá)。小鼠后肢缺血模型的構(gòu)建采用經(jīng)典的股動(dòng)脈結(jié)扎法。具體操作過(guò)程為：首先對(duì)小鼠進(jìn)行全身麻醉，常用10%水合氯醛腹腔注射，劑量為3ml/kg。待小鼠麻醉生效后，將其仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，使用碘伏對(duì)手術(shù)區(qū)域進(jìn)行消毒處理。在小鼠大腿內(nèi)側(cè)作一縱行切口，鈍性分離皮下組織，暴露股動(dòng)脈。使用4-0絲線雙重結(jié)扎股動(dòng)脈，然后在兩結(jié)扎點(diǎn)之間剪斷血管，以確保后肢動(dòng)脈血流完全阻斷，從而成功建立后肢缺血模型。術(shù)后密切觀察小鼠的一般狀態(tài)，如飲食、活動(dòng)、傷口愈合等情況。針對(duì)不同實(shí)驗(yàn)組，采用不同的miR-34a干預(yù)方式。在miR-34a過(guò)表達(dá)組，通過(guò)尾靜脈注射的方式給予小鼠miR-34a模擬物。miR-34a模擬物是經(jīng)過(guò)人工合成的，能夠模擬內(nèi)源性miR-34a的功能，其序列與天然成熟的miR-34a一致。為了確保模擬物能夠有效進(jìn)入細(xì)胞并發(fā)揮作用，將其包裹在脂質(zhì)體中。脂質(zhì)體具有良好的生物相容性和膜融合特性，能夠幫助miR-34a模擬物順利穿透細(xì)胞膜。注射劑量根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行優(yōu)化，一般為每只小鼠每次注射50nmol/kg，每周注射2次，連續(xù)注射4周。在miR-34a抑制組，同樣通過(guò)尾靜脈注射給予小鼠miR-34a抑制劑。miR-34a抑制劑是一種與miR-34a互補(bǔ)的寡核苷酸序列，能夠特異性地結(jié)合miR-34a，抑制其與靶mRNA的相互作用，從而降低miR-34a的功能。抑制劑也采用脂質(zhì)體包裹的方式進(jìn)行注射，劑量為每只小鼠每次注射100nmol/kg，每周注射2次，連續(xù)注射4周。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件。小鼠飼養(yǎng)于恒溫（22±2℃）、恒濕（50±10%）的環(huán)境中，保持12h光照/12h黑暗的晝夜節(jié)律，自由進(jìn)食和飲水。定期對(duì)小鼠進(jìn)行稱重和健康檢查，確保小鼠處于良好的生理狀態(tài)。在手術(shù)操作過(guò)程中，嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則，減少感染等因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。4.1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的干預(yù)和觀察，研究人員對(duì)各實(shí)驗(yàn)組小鼠進(jìn)行了全面的檢測(cè)和分析，以評(píng)估MicroRNA-34a（miR-34a）對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）介導(dǎo)血管新生的影響。在血流灌注方面，利用激光多普勒血流儀對(duì)小鼠后肢血流灌注情況進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，正常對(duì)照組小鼠后肢血流灌注穩(wěn)定且良好，左右后肢血流灌注比值接近1。模型對(duì)照組小鼠在術(shù)后即刻，手術(shù)側(cè)后肢血流灌注急劇下降，與對(duì)側(cè)正常后肢相比，血流灌注比值顯著降低。隨著時(shí)間的推移，模型對(duì)照組小鼠手術(shù)側(cè)后肢血流灌注雖有一定程度的恢復(fù)，但仍明顯低于正常對(duì)照組。在miR-34a過(guò)表達(dá)組，小鼠術(shù)后手術(shù)側(cè)后肢血流灌注同樣顯著下降，但在后續(xù)的恢復(fù)過(guò)程中，血流灌注的恢復(fù)程度明顯低于模型對(duì)照組，術(shù)后2周和4周時(shí)，手術(shù)側(cè)與對(duì)側(cè)后肢血流灌注比值均顯著低于模型對(duì)照組。這表明miR-34a過(guò)表達(dá)抑制了后肢缺血后的血流恢復(fù)，提示其可能對(duì)血管新生產(chǎn)生了負(fù)面影響。相反，在miR-34a抑制組，小鼠手術(shù)側(cè)后肢血流灌注在術(shù)后恢復(fù)情況明顯優(yōu)于模型對(duì)照組，術(shù)后2周和4周時(shí)，手術(shù)側(cè)與對(duì)側(cè)后肢血流灌注比值均顯著高于模型對(duì)照組。這說(shuō)明抑制miR-34a的表達(dá)能夠促進(jìn)后肢缺血后的血流恢復(fù)，暗示miR-34a的抑制有利于血管新生。通過(guò)免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)小鼠后肢缺血部位的血管密度。結(jié)果表明，正常對(duì)照組小鼠后肢組織中血管分布均勻，血管密度較高。模型對(duì)照組小鼠缺血部位的血管密度在術(shù)后有所增加，這是機(jī)體對(duì)缺血的一種代償性反應(yīng)。然而，miR-34a過(guò)表達(dá)組小鼠缺血部位的血管密度明顯低于模型對(duì)照組，新生血管數(shù)量顯著減少。這進(jìn)一步證實(shí)了miR-34a過(guò)表達(dá)抑制了血管新生。在miR-34a抑制組，缺血部位的血管密度顯著高于模型對(duì)照組，新生血管數(shù)量明顯增多。這表明抑制miR-34a能夠促進(jìn)血管新生，增加缺血部位的血管密度。對(duì)小鼠后肢缺血部位的EPC相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。利用流式細(xì)胞術(shù)分析缺血部位組織中EPC的數(shù)量和比例。結(jié)果顯示，模型對(duì)照組小鼠缺血部位EPC的數(shù)量和比例在術(shù)后有所增加，這是機(jī)體為促進(jìn)血管新生而動(dòng)員EPC的結(jié)果。在miR-34a過(guò)表達(dá)組，EPC的數(shù)量和比例明顯低于模型對(duì)照組。這說(shuō)明miR-34a過(guò)表達(dá)抑制了EPC向缺血部位的募集和歸巢。相反，miR-34a抑制組小鼠缺血部位EPC的數(shù)量和比例顯著高于模型對(duì)照組。這表明抑制miR-34a能夠促進(jìn)EPC向缺血部位的募集和歸巢，為血管新生提供更多的前體細(xì)胞。通過(guò)檢測(cè)EPC表面標(biāo)志物（如CD34、CD133、VEGFR-2等）的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)miR-34a過(guò)表達(dá)組EPC表面標(biāo)志物的表達(dá)水平明顯降低，提示miR-34a過(guò)表達(dá)抑制了EPC的功能和分化能力。而miR-34a抑制組EPC表面標(biāo)志物的表達(dá)水平顯著升高，表明抑制miR-34a能夠增強(qiáng)EPC的功能和分化能力。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，miR-34a對(duì)EPC介導(dǎo)的血管新生具有重要的調(diào)控作用。過(guò)表達(dá)miR-34a抑制了EPC向缺血部位的募集和歸巢，降低了EPC的功能和分化能力，進(jìn)而抑制了血管新生，導(dǎo)致后肢缺血部位血流灌注恢復(fù)不佳。相反，抑制miR-34a則能夠促進(jìn)EPC的募集和歸巢，增強(qiáng)EPC的功能和分化能力，從而促進(jìn)血管新生，改善后肢缺血部位的血流灌注。這些結(jié)果為深入理解miR-34a在血管新生中的作用機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。4.2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究4.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）的培養(yǎng)是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)。本研究主要采用密度梯度離心法結(jié)合貼壁篩選法，從人臍血中分離EPC。具體操作如下：首先，采集新鮮的人臍血，置于含有抗凝劑的無(wú)菌采血管中。將臍血以1:1的比例與PBS緩沖液混合均勻，然后緩慢加至預(yù)先制備好的Ficoll淋巴細(xì)胞分離液上層。在室溫下，以2000r/min的轉(zhuǎn)速離心20min。離心后，管內(nèi)液體分為四層，從上層至下層依次為血漿層、單個(gè)核細(xì)胞層、Ficoll分離液層和紅細(xì)胞層。小心吸取單個(gè)核細(xì)胞層，轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入適量的PBS緩沖液，以1500r/min的轉(zhuǎn)速離心10min，洗滌細(xì)胞2-3次，去除殘留的Ficoll分離液。將洗滌后的單個(gè)核細(xì)胞重懸于含有10%胎牛血清（FBS）、10ng/mL血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、5ng/mL堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）和1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的M199培養(yǎng)液中。將細(xì)胞懸液接種于預(yù)先用纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中，每3-4天更換一次培養(yǎng)液，去除未貼壁的細(xì)胞。一般在培養(yǎng)4-7天后，可觀察到貼壁的EPC呈梭形或多角形，逐漸形成集落。培養(yǎng)10-14天后，EPC可達(dá)到80%-90%融合，此時(shí)可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，先用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液消化細(xì)胞，待細(xì)胞變圓脫落后，加入含有血清的培養(yǎng)液終止消化，然后將細(xì)胞懸液以1:2或1:3的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。為了研究MicroRNA-34a（miR-34a）對(duì)EPC的調(diào)控作用，需要對(duì)EPC進(jìn)行miR-34a相關(guān)的處理。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、miR-34amimic組和miR-34ainhibitor組。miR-34amimic是人工合成的雙鏈RNA，其序列與天然成熟的miR-34a一致，能夠模擬內(nèi)源性miR-34a的功能，使細(xì)胞內(nèi)miR-34a的表達(dá)上調(diào)。miR-34ainhibitor則是與miR-34a互補(bǔ)的寡核苷酸序列，能夠特異性地結(jié)合miR-34a，抑制其與靶mRNA的相互作用，從而降低miR-34a的功能。在轉(zhuǎn)染前，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EPC以合適的密度接種于24孔板或6孔板中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至70%-80%融合時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，具體步驟如下：首先，在無(wú)菌EP管中分別配制脂質(zhì)體試劑和miR-34amimic或inhibitor的稀釋液。將適量的脂質(zhì)體試劑加入到無(wú)血清的Opti-MEM培養(yǎng)液中，輕輕混勻，室溫孵育5min。同時(shí)，將一定量的miR-34amimic或inhibitor加入到另一管無(wú)血清的Opti-MEM培養(yǎng)液中，輕輕混勻。然后，將稀釋好的脂質(zhì)體試劑和miR-34amimic或inhibitor溶液混合，輕輕混勻，室溫孵育20min，使脂質(zhì)體與miR-34amimic或inhibitor形成復(fù)合物。將培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液吸出，用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次，然后加入適量含有復(fù)合物的無(wú)血清Opti-MEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)4-6h后，吸出含有復(fù)合物的培養(yǎng)液，加入完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后48-72h，可進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，如實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-34a的表達(dá)水平，以驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。4.2.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論通過(guò)一系列細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，深入分析了MicroRNA-34a（miR-34a）對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）小管形成能力、增殖能力和遷移能力的影響。在小管形成能力方面，采用Matrigel基質(zhì)膠小管形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。將Matrigel基質(zhì)膠在4℃冰箱中過(guò)夜融化，然后迅速鋪于預(yù)先預(yù)冷的96孔板中，每孔50μL，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育30min，使Matrigel基質(zhì)膠凝固形成三維凝膠結(jié)構(gòu)。將轉(zhuǎn)染后的EPC用無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌2次，然后用含0.5%胎牛血清的M199培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL。將細(xì)胞懸液接種于Matrigel基質(zhì)膠上，每孔100μL，每組設(shè)置3-5個(gè)復(fù)孔。將96孔板置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6-8h后，在倒置顯微鏡下觀察并拍照。通過(guò)ImageJ軟件分析小管形成的長(zhǎng)度、節(jié)點(diǎn)數(shù)和管腔面積等參數(shù)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-34amimic組EPC的小管形成能力明顯減弱，小管長(zhǎng)度縮短，節(jié)點(diǎn)數(shù)減少，管腔面積減小。而miR-34ainhibitor組EPC的小管形成能力顯著增強(qiáng)，小管長(zhǎng)度增加，節(jié)點(diǎn)數(shù)增多，管腔面積增大。這表明miR-34a過(guò)表達(dá)抑制了EPC的小管形成能力，而抑制miR-34a的表達(dá)則促進(jìn)了EPC的小管形成能力。這一結(jié)果與miR-34a對(duì)EPC分化和遷移能力的影響一致。因?yàn)樾」苄纬蛇^(guò)程涉及EPC的分化、遷移和相互連接等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程，miR-34a對(duì)這些過(guò)程的抑制或促進(jìn)作用直接反映在小管形成能力上。在增殖能力方面，利用CCK-8法檢測(cè)EPC的增殖活性。將轉(zhuǎn)染后的EPC以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中，每組設(shè)置5-6個(gè)復(fù)孔。在培養(yǎng)的不同時(shí)間點(diǎn)（如24h、48h、72h），向每孔中加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-2h。然后，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光度值（OD值）。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞增殖曲線。結(jié)果表明，miR-34amimic組EPC的增殖速率明顯低于對(duì)照組，在培養(yǎng)48h和72h時(shí)，miR-34amimic組的OD值顯著低于對(duì)照組。相反，miR-34ainhibitor組EPC的增殖速率顯著高于對(duì)照組，在相同時(shí)間點(diǎn)，miR-34ainhibitor組的OD值明顯高于對(duì)照組。這說(shuō)明miR-34a過(guò)表達(dá)抑制了EPC的增殖能力，而抑制miR-34a的表達(dá)則促進(jìn)了EPC的增殖。這與之前關(guān)于miR-34a對(duì)EPC細(xì)胞周期調(diào)控的研究結(jié)果相符。miR-34a通過(guò)靶向抑制SIRT1等基因的表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯在G1期，從而抑制EPC的增殖。在遷移能力方面，采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EPC的遷移能力。Transwell小室的上室為無(wú)血清培養(yǎng)液，下室為含有10%胎牛血清的M199培養(yǎng)液，形成趨化梯度。將轉(zhuǎn)染后的EPC用無(wú)血清培養(yǎng)液洗滌2次，然后用含0.5%胎牛血清的M199培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL。取100μL細(xì)胞懸液加入到Transwell小室的上室中，下室加入600μL含有10%胎牛血清的M199培養(yǎng)液。將Transwell小室置于24孔板中，每組設(shè)置3-4個(gè)復(fù)孔。將24孔板置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，取出Transwell小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞。將Transwell小室用4%多聚甲醛固定15min，然后用0.1%結(jié)晶紫染色10min。在倒置顯微鏡下觀察并拍照，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果顯示，miR-34amimic組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量明顯少于對(duì)照組，而miR-34ainhibitor組遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量顯著多于對(duì)照組。這表明miR-34a過(guò)表達(dá)抑制了EPC的遷移能力，而抑制miR-34a的表達(dá)則促進(jìn)了EPC的遷移。這可能是因?yàn)閙iR-34a通過(guò)靶向作用于與細(xì)胞遷移相關(guān)的基因和信號(hào)通路，如抑制MMPs的表達(dá)，影響細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而阻礙EPC的遷移。綜合以上細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果，miR-34a對(duì)EPC的小管形成能力、增殖能力和遷移能力均具有顯著的調(diào)控作用。過(guò)表達(dá)miR-34a抑制了EPC的這些生物學(xué)功能，而抑制miR-34a的表達(dá)則促進(jìn)了EPC的功能。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了miR-34a在EPC介導(dǎo)的血管新生過(guò)程中起著重要的負(fù)調(diào)控作用。深入研究miR-34a對(duì)EPC的調(diào)控機(jī)制，有助于為血管新生相關(guān)疾病的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。五、影響MicroRNA-34a調(diào)控作用的因素5.1衰老對(duì)MicroRNA-34a調(diào)控的影響5.1.1衰老狀態(tài)下MicroRNA-34a的表達(dá)變化隨著機(jī)體年齡的不斷增長(zhǎng)，衰老成為不可避免的生理過(guò)程，這一過(guò)程對(duì)MicroRNA-34a（miR-34a）的表達(dá)產(chǎn)生了顯著影響，進(jìn)而對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）介導(dǎo)的血管新生產(chǎn)生重要作用。在老年個(gè)體中，多項(xiàng)研究表明miR-34a的表達(dá)水平呈現(xiàn)明顯上