β-欖香烯誘導(dǎo)的缺氧誘導(dǎo)因子在MG-63細(xì)胞凋亡中的保護(hù)機(jī)制探究一、引言1.1研究背景惡性腫瘤嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康，是全球范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的主要原因之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)年全球新增癌癥病例1929萬(wàn)例，癌癥死亡病例996萬(wàn)例。在中國(guó)，癌癥的發(fā)病率和死亡率也呈上升趨勢(shì)，給社會(huì)和家庭帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。因此，尋找有效的抗腫瘤藥物和治療方法一直是醫(yī)學(xué)研究的重要領(lǐng)域。β-欖香烯是從姜科植物溫郁金揮發(fā)油中分離出的一種倍半萜烯類(lèi)化合物，作為我國(guó)自行開(kāi)發(fā)研制的抗腫瘤藥物，其主要有效成分為β-欖香烯，化學(xué)名稱為1-甲基-1-乙烯基-2,4-二異丙基環(huán)己烷，分子式為C15H24，相對(duì)分子質(zhì)量為204.355。自1981年我國(guó)學(xué)者首次從傳統(tǒng)活血化瘀中藥溫郁金揮發(fā)油中分離出β-欖香烯以來(lái)，對(duì)其研究不斷深入。1995年，以β-欖香烯為主要成分的欖香烯乳注射液被國(guó)家批準(zhǔn)為二類(lèi)抗癌新藥，開(kāi)啟了其在腫瘤治療領(lǐng)域的應(yīng)用。目前，β-欖香烯在臨床上應(yīng)用廣泛，單獨(dú)使用或與化療藥物聯(lián)合使用，對(duì)肺癌、肝癌、消化道腫瘤、乳腺癌等多種惡性腫瘤均取得了顯著療效。研究表明，β-欖香烯的抗癌機(jī)制具有多效性。它能夠降低腫瘤細(xì)胞有絲分裂能力，使腫瘤細(xì)胞的增殖受到抑制，從而減少腫瘤細(xì)胞的數(shù)量。通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，促使腫瘤細(xì)胞走向程序性死亡，達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的。β-欖香烯還能抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，影響腫瘤細(xì)胞的代謝過(guò)程，阻斷其營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)和能量來(lái)源，限制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和擴(kuò)散。在增強(qiáng)化療療效方面，β-欖香烯可以增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，提高化療藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的濃度，增強(qiáng)化療藥物的殺傷作用。與此同時(shí)，β-欖香烯還能提高宿主機(jī)體免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視和免疫攻擊能力，減少化療藥物對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)的抑制作用，降低毒副反應(yīng)，提高患者的生活質(zhì)量。骨肉瘤是一種常見(jiàn)的原發(fā)性惡性骨腫瘤，好發(fā)于青少年，惡性程度高，預(yù)后較差。MG-63細(xì)胞是一種人骨肉瘤細(xì)胞系，常被用于骨肉瘤的相關(guān)研究。研究β-欖香烯與MG-63細(xì)胞凋亡的關(guān)系具有重要意義。深入探究β-欖香烯對(duì)MG-63細(xì)胞凋亡的影響，有助于揭示β-欖香烯治療骨肉瘤的潛在機(jī)制，為骨肉瘤的治療提供新的理論依據(jù)和治療策略。這對(duì)于提高骨肉瘤的治療效果、改善患者預(yù)后具有重要的臨床價(jià)值，有望為骨肉瘤患者帶來(lái)新的治療希望。1.2研究目的本研究旨在深入探究β-欖香烯誘導(dǎo)的缺氧誘導(dǎo)因子對(duì)MG-63細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及其潛在的分子機(jī)制。具體而言，一方面，通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，觀察不同濃度β-欖香烯作用下MG-63細(xì)胞的凋亡情況，明確β-欖香烯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的劑量效應(yīng)關(guān)系。利用分子生物學(xué)技術(shù)，檢測(cè)缺氧誘導(dǎo)因子在β-欖香烯處理后的MG-63細(xì)胞中的表達(dá)變化，確定β-欖香烯與缺氧誘導(dǎo)因子之間的關(guān)聯(lián)。另一方面，通過(guò)基因敲除、過(guò)表達(dá)等實(shí)驗(yàn)手段，改變?nèi)毖跽T導(dǎo)因子的表達(dá)水平，觀察其對(duì)β-欖香烯誘導(dǎo)的MG-63細(xì)胞凋亡的影響，從而驗(yàn)證缺氧誘導(dǎo)因子對(duì)MG-63細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。此外，深入研究缺氧誘導(dǎo)因子發(fā)揮保護(hù)作用所涉及的下游信號(hào)通路，如PI3K/AKT、MAPK等信號(hào)通路，揭示其在保護(hù)細(xì)胞凋亡過(guò)程中的具體調(diào)控機(jī)制。本研究的成果將為骨肉瘤的治療提供新的理論依據(jù)和潛在的治療靶點(diǎn)，有助于開(kāi)發(fā)更加有效的骨肉瘤治療策略，提高患者的生存率和生活質(zhì)量。1.3研究意義從理論層面來(lái)看，本研究具有多方面的重要意義。深入剖析β-欖香烯誘導(dǎo)的缺氧誘導(dǎo)因子對(duì)MG-63細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用，有助于填補(bǔ)β-欖香烯抗腫瘤機(jī)制研究在骨肉瘤領(lǐng)域的部分空白。目前，雖然對(duì)β-欖香烯的抗癌機(jī)制已有一定認(rèn)識(shí)，但其與缺氧誘導(dǎo)因子以及細(xì)胞凋亡之間的具體關(guān)聯(lián)，尤其是在骨肉瘤細(xì)胞中的作用機(jī)制，仍存在諸多未知。本研究將系統(tǒng)地探究這些關(guān)系，為全面理解β-欖香烯的抗腫瘤作用提供新的視角，豐富和完善骨肉瘤發(fā)病機(jī)制和腫瘤細(xì)胞凋亡調(diào)控的理論體系。在實(shí)踐應(yīng)用方面，本研究成果具有廣闊的應(yīng)用前景和潛在價(jià)值。一方面，對(duì)于骨肉瘤的臨床治療，本研究有望為其提供新的治療策略和潛在靶點(diǎn)。若能明確缺氧誘導(dǎo)因子在β-欖香烯誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞凋亡中的保護(hù)作用及機(jī)制，就可以針對(duì)這一過(guò)程開(kāi)發(fā)新的治療方法，例如通過(guò)調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)因子的表達(dá)或活性，增強(qiáng)β-欖香烯對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的殺傷作用，提高治療效果。另一方面，本研究有助于優(yōu)化β-欖香烯的臨床應(yīng)用。通過(guò)深入了解其作用機(jī)制，可以更加合理地選擇用藥劑量、用藥時(shí)機(jī)以及聯(lián)合用藥方案，在提高治療效果的同時(shí)，減少藥物的不良反應(yīng)，提高患者的生活質(zhì)量。此外，研究成果還可能為其他惡性腫瘤的治療提供借鑒和啟示，推動(dòng)整個(gè)腫瘤治療領(lǐng)域的發(fā)展。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1β-欖香烯概述2.1.1β-欖香烯的來(lái)源與性質(zhì)β-欖香烯主要來(lái)源于姜科植物溫郁金（CurcumarcenyujinY.H.ChenetC.Ling）的揮發(fā)油。溫郁金作為一種傳統(tǒng)的中藥材，在中國(guó)有著悠久的藥用歷史，其性辛、苦，寒，具有行氣化瘀、清心解郁、利膽退黃等功效。1981年，我國(guó)學(xué)者首次從溫郁金揮發(fā)油中成功分離出β-欖香烯，這一發(fā)現(xiàn)為其后續(xù)的研究和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上看，β-欖香烯的化學(xué)名稱為1-甲基-1-乙烯基-2,4-二異丙基環(huán)己烷，分子式為C15H24，相對(duì)分子質(zhì)量為204.355。其分子結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出獨(dú)特的環(huán)狀烯烴結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)賦予了β-欖香烯一些特殊的物理和化學(xué)性質(zhì)。在物理性質(zhì)方面，β-欖香烯為無(wú)色至淡黃色的油狀液體，具有特殊的香氣。其密度為0.862g/cm3，沸點(diǎn)為252.1℃，閃點(diǎn)為98.3℃，儲(chǔ)存條件一般要求在2-8℃為宜，以保證其穩(wěn)定性。由于β-欖香烯分子中不含氧原子，且具有較大的脂溶性基團(tuán)，導(dǎo)致其極性小，不溶于水，這一特性在一定程度上限制了其在體內(nèi)的吸收和分布，也對(duì)其制劑研發(fā)和臨床應(yīng)用提出了挑戰(zhàn)。然而，正是這種特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)，使得β-欖香烯具有較強(qiáng)的脂溶性，能夠更容易地穿透細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，從而發(fā)揮其藥理作用。2.1.2β-欖香烯的藥理作用β-欖香烯具有廣泛的藥理作用，在抗腫瘤、抗炎、抗菌等方面都展現(xiàn)出顯著的活性，其中抗腫瘤作用是其最為重要的藥理特性。在抗腫瘤方面，β-欖香烯對(duì)多種惡性腫瘤細(xì)胞具有抑制作用。研究表明，β-欖香烯能夠通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤功效。它可以降低腫瘤細(xì)胞的有絲分裂能力，使腫瘤細(xì)胞的增殖受到抑制。通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號(hào)通路，促使腫瘤細(xì)胞走向程序性死亡，達(dá)到抑制腫瘤生長(zhǎng)的目的。β-欖香烯還能抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，降低腫瘤細(xì)胞分裂能力，壓制腫瘤細(xì)胞繁殖生長(zhǎng)，同時(shí)提高腫瘤細(xì)胞的免疫原性，抑制腫瘤的復(fù)發(fā)以及轉(zhuǎn)移。它能夠抑制腫瘤血管生成，通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞中血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)，對(duì)VEGF誘導(dǎo)的血管生成有明顯的抑制作用，從而使腫瘤失去養(yǎng)分，無(wú)法生長(zhǎng)繁殖。β-欖香烯還可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞多藥耐藥，干擾腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)代謝，誘發(fā)腫瘤細(xì)胞快速發(fā)生細(xì)胞凋亡，降低腫瘤細(xì)胞分裂能力，抑制其增殖，幫助患者逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞的耐藥性。在臨床應(yīng)用中，單獨(dú)使用β-欖香烯或與化療藥物聯(lián)合使用，對(duì)肺癌、肝癌、消化道腫瘤、乳腺癌等多種惡性腫瘤均取得了顯著療效。β-欖香烯還具有一定的抗炎作用。它可以調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)的信號(hào)通路，抑制炎癥介質(zhì)的釋放，從而減輕炎癥反應(yīng)。在一些炎癥相關(guān)的疾病模型中，β-欖香烯能夠降低炎癥因子的水平，緩解炎癥癥狀，對(duì)炎癥性疾病的治療具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。在抗菌方面，β-欖香烯對(duì)部分細(xì)菌和真菌具有抑制作用。其抗菌機(jī)制可能與破壞細(xì)菌和真菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、影響其代謝過(guò)程等有關(guān)。雖然β-欖香烯的抗菌作用相對(duì)較弱，但其在一些特定的感染性疾病治療中，仍可能作為輔助治療藥物發(fā)揮一定的作用。2.2缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）2.2.1HIF的結(jié)構(gòu)與功能缺氧誘導(dǎo)因子（Hypoxia-induciblefactor，HIF）是一種在缺氧條件下廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，在維持細(xì)胞氧穩(wěn)態(tài)和適應(yīng)缺氧環(huán)境中發(fā)揮著核心作用。它由一個(gè)氧敏感的α亞單位（HIF-α）和一個(gè)組成性表達(dá)的β亞單位（HIF-β）組成異二聚體。其中，HIF-α亞基是HIF發(fā)揮功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)亞基，對(duì)氧氣濃度變化極為敏感，在常氧和缺氧條件下其穩(wěn)定性和活性存在顯著差異。目前已發(fā)現(xiàn)三種HIF-α亞型，即HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α，它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)和功能上既有相似之處，又存在一定差異。在結(jié)構(gòu)方面，三種HIF-α亞型在N末端都含有一個(gè)堿性螺旋-環(huán)-螺旋（bHLH）和兩個(gè)Per-Arnt-Sim（PAS）結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域?qū)τ贖IF-α與HIF-β的二聚化以及與DNA的結(jié)合至關(guān)重要。在C末端，它們都含有氧依賴性降解結(jié)構(gòu)域（ODD），該結(jié)構(gòu)域在常氧條件下可被脯氨酰羥化酶（PHD）羥基化修飾，進(jìn)而介導(dǎo)HIF-α的泛素化和蛋白酶體降解。HIF-1α和HIF-2α還含有反式激活結(jié)構(gòu)域（TAD），分別為N-TAD和C-TAD，這些結(jié)構(gòu)域能夠招募轉(zhuǎn)錄共激活因子，如p300/CBP，從而激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。而HIF-3α缺乏完整的反式激活結(jié)構(gòu)域，其功能較為復(fù)雜，目前研究認(rèn)為它可能作為一種抑制元件，對(duì)HIF信號(hào)通路起到負(fù)調(diào)控作用。在功能上，HIF的激活過(guò)程與氧氣濃度密切相關(guān)。在常氧條件下，HIF-α亞基的脯氨酸殘基（Pro402和Pro564）在PHD的作用下發(fā)生羥基化修飾。羥基化后的HIF-α能夠與vonHippel-Lindau蛋白（pVHL）結(jié)合，pVHL是一種E3泛素連接酶復(fù)合物的組成部分，它可以將泛素分子連接到HIF-α上，使其被蛋白酶體識(shí)別并降解，從而維持HIF在細(xì)胞內(nèi)的低水平表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞處于缺氧環(huán)境時(shí)，由于氧氣供應(yīng)不足，PHD的活性受到抑制，HIF-α的羥基化修飾減少，無(wú)法與pVHL結(jié)合，從而避免了被蛋白酶體降解。此時(shí)，穩(wěn)定積累的HIF-α迅速轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，與組成性表達(dá)的HIF-β亞基結(jié)合，形成具有活性的HIF轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。該復(fù)合物能夠與位于靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的缺氧反應(yīng)元件（HRE）結(jié)合，招募轉(zhuǎn)錄共激活因子p300/CBP等，進(jìn)而激活一系列與缺氧適應(yīng)相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄，如促紅細(xì)胞生成素（EPO）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（GLUT1）等，這些基因的表達(dá)產(chǎn)物能夠通過(guò)多種途徑幫助細(xì)胞適應(yīng)缺氧環(huán)境。以VEGF基因?yàn)槔?，?dāng)HIF與VEGF基因啟動(dòng)子區(qū)域的HRE結(jié)合后，能夠促進(jìn)VEGF基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。VEGF是一種重要的血管生成因子，它可以刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和存活，促進(jìn)新血管的生成，從而改善組織的氧氣供應(yīng)，為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移提供必要的條件。又如GLUT1基因，在HIF的調(diào)控下，GLUT1的表達(dá)上調(diào)，它可以增加細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，為細(xì)胞在缺氧條件下進(jìn)行糖酵解提供更多的底物，維持細(xì)胞的能量供應(yīng)。2.2.2HIF在細(xì)胞生理病理過(guò)程中的作用HIF在細(xì)胞的生理和病理過(guò)程中都扮演著至關(guān)重要的角色，其作用涉及細(xì)胞適應(yīng)缺氧、增殖、凋亡、血管生成等多個(gè)方面。在細(xì)胞適應(yīng)缺氧方面，HIF通過(guò)調(diào)節(jié)一系列基因的表達(dá)，幫助細(xì)胞維持能量代謝平衡和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。如前文所述，HIF上調(diào)GLUT1的表達(dá)，增加細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取，同時(shí)激活糖酵解途徑相關(guān)酶的基因表達(dá)，如己糖激酶、磷酸果糖激酶、乳酸脫氫酶等，使細(xì)胞能夠在缺氧條件下通過(guò)糖酵解產(chǎn)生ATP，維持細(xì)胞的基本功能。HIF還可以調(diào)節(jié)線粒體的功能，通過(guò)抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合物的活性，減少氧的消耗，降低活性氧（ROS）的產(chǎn)生，從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。在低氧條件下，HIF-1α可以抑制線粒體融合相關(guān)蛋白MFN1和MFN2的表達(dá)，使線粒體形態(tài)發(fā)生改變，減少線粒體的能量消耗，提高細(xì)胞在缺氧環(huán)境下的生存能力。細(xì)胞增殖和凋亡是細(xì)胞生命活動(dòng)的兩個(gè)重要過(guò)程，HIF在這兩個(gè)過(guò)程中也發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。在一定程度的缺氧條件下，HIF可以促進(jìn)細(xì)胞增殖。它可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)，如上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，加速細(xì)胞周期進(jìn)程，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖。然而，當(dāng)缺氧程度嚴(yán)重或持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，HIF也可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。HIF可以上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，改變Bax/Bcl-2的比值，使線粒體膜通透性增加，釋放細(xì)胞色素C，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在缺氧的腫瘤細(xì)胞中，當(dāng)缺氧程度超過(guò)一定閾值時(shí)，HIF-1α可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這可能是機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的一種自我限制機(jī)制。血管生成對(duì)于組織的生長(zhǎng)、發(fā)育和修復(fù)至關(guān)重要，HIF在血管生成過(guò)程中起著核心調(diào)控作用。HIF通過(guò)誘導(dǎo)VEGF等血管生成因子的表達(dá)，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成。VEGF可以與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活下游的信號(hào)通路，如Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/AKT等，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移。HIF還可以調(diào)節(jié)其他血管生成相關(guān)因子的表達(dá)，如血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）等，協(xié)同促進(jìn)血管生成。在腫瘤生長(zhǎng)過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞常處于缺氧微環(huán)境，HIF的持續(xù)激活導(dǎo)致VEGF等血管生成因子大量表達(dá)，促使腫瘤組織中新生血管的形成，為腫瘤細(xì)胞提供充足的營(yíng)養(yǎng)和氧氣，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，HIF也發(fā)揮著復(fù)雜而重要的作用。一方面，HIF可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活和增殖，通過(guò)調(diào)節(jié)代謝相關(guān)基因的表達(dá)，為腫瘤細(xì)胞提供能量和物質(zhì)基礎(chǔ)，同時(shí)促進(jìn)血管生成，為腫瘤生長(zhǎng)提供必要的營(yíng)養(yǎng)和氧氣供應(yīng)。另一方面，HIF也可以影響腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。HIF可以上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等蛋白的表達(dá)，這些蛋白能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。HIF還可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞表面的黏附分子表達(dá)，改變腫瘤細(xì)胞與周?chē)M織的黏附特性，有利于腫瘤細(xì)胞的遷移。在乳腺癌細(xì)胞中，HIF-1α的高表達(dá)與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，通過(guò)抑制HIF-1α的表達(dá)可以降低乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。2.3MG-63細(xì)胞MG-63細(xì)胞是一種人骨肉瘤細(xì)胞系，在腫瘤研究領(lǐng)域中具有重要地位。它源自14歲患有骨肉瘤的白人男性，具有上皮細(xì)胞樣形態(tài)，呈貼壁生長(zhǎng)特性。MG-63細(xì)胞的倍增時(shí)間約為2-3天，這意味著在適宜的培養(yǎng)條件下，細(xì)胞數(shù)量大約每2-3天就會(huì)翻倍，這種相對(duì)較快的增殖速度使其能夠在較短時(shí)間內(nèi)獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，通常采用MEM培養(yǎng)基并添加10%的胎牛血清（FBS）來(lái)滿足其生長(zhǎng)需求，培養(yǎng)條件為氣相中空氣占95%、CO?占5%，溫度維持在37℃。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以保持細(xì)胞的良好生長(zhǎng)狀態(tài)。在骨肉瘤研究中，MG-63細(xì)胞被廣泛應(yīng)用。骨肉瘤是一種常見(jiàn)的原發(fā)性惡性骨腫瘤，好發(fā)于青少年，其惡性程度高，預(yù)后較差，嚴(yán)重威脅著青少年的健康和生命。MG-63細(xì)胞作為骨肉瘤細(xì)胞系的代表，能夠模擬骨肉瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性，為研究骨肉瘤的發(fā)病機(jī)制、治療方法等提供了重要的實(shí)驗(yàn)材料。通過(guò)對(duì)MG-63細(xì)胞的研究，可以深入了解骨肉瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲等生物學(xué)行為，以及腫瘤細(xì)胞與周?chē)h(huán)境的相互作用。研究人員可以利用MG-63細(xì)胞研究腫瘤細(xì)胞的耐藥機(jī)制，為克服骨肉瘤的多藥耐藥性提供理論依據(jù)；還可以通過(guò)在MG-63細(xì)胞中進(jìn)行基因編輯、藥物干預(yù)等實(shí)驗(yàn)，探索新的治療靶點(diǎn)和治療方法，為骨肉瘤的臨床治療提供新的思路和策略。2.4細(xì)胞凋亡2.4.1細(xì)胞凋亡的概念與機(jī)制細(xì)胞凋亡，又被稱為程序性細(xì)胞死亡，是一種由基因調(diào)控的主動(dòng)性細(xì)胞死亡方式，在多細(xì)胞生物體的發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)維持以及疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。與細(xì)胞壞死這種被動(dòng)性的、病理性的細(xì)胞死亡方式不同，細(xì)胞凋亡具有明顯的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征，是細(xì)胞在內(nèi)外環(huán)境刺激下，主動(dòng)啟動(dòng)內(nèi)部死亡程序的過(guò)程。從形態(tài)學(xué)特征來(lái)看，細(xì)胞凋亡過(guò)程可分為多個(gè)階段。在凋亡早期，細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞膜皺縮，表面微絨毛減少，同時(shí)線粒體膜電位下降，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張。隨著凋亡進(jìn)程的推進(jìn)，細(xì)胞核染色質(zhì)逐漸凝聚，邊緣化，形成新月形或塊狀結(jié)構(gòu)。隨后，細(xì)胞核裂解，細(xì)胞進(jìn)一步碎片化，形成多個(gè)凋亡小體。這些凋亡小體含有完整的細(xì)胞器和核碎片，表面包裹著細(xì)胞膜，最終被周?chē)耐淌杉?xì)胞如巨噬細(xì)胞識(shí)別并吞噬清除，整個(gè)過(guò)程不會(huì)引發(fā)炎癥反應(yīng)，對(duì)周?chē)M織和細(xì)胞的影響極小。細(xì)胞凋亡的發(fā)生受到一系列復(fù)雜信號(hào)通路的精確調(diào)控，主要包括內(nèi)在凋亡途徑和外在凋亡途徑。內(nèi)在凋亡途徑，也稱為線粒體途徑，主要由細(xì)胞內(nèi)的應(yīng)激信號(hào)如DNA損傷、氧化應(yīng)激、生長(zhǎng)因子缺乏等觸發(fā)。當(dāng)細(xì)胞受到這些應(yīng)激刺激時(shí)，線粒體的功能和結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變。線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）開(kāi)放，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，釋放出細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子到細(xì)胞質(zhì)中。細(xì)胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）結(jié)合，形成凋亡體。凋亡體招募并激活半胱天冬酶9（caspase-9），caspase-9進(jìn)而激活下游的效應(yīng)caspases，如caspase-3、caspase-6和caspase-7，這些效應(yīng)caspases通過(guò)切割細(xì)胞內(nèi)的多種重要蛋白質(zhì)，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）、細(xì)胞骨架蛋白等，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在DNA損傷導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡中，p53基因被激活，p53蛋白作為一種轉(zhuǎn)錄因子，上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，Bax可以插入線粒體膜，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，從而啟動(dòng)內(nèi)在凋亡途徑。外在凋亡途徑，又稱死亡受體途徑，主要由細(xì)胞外的死亡信號(hào)激活。腫瘤壞死因子（TNF）超家族成員如TNF-α、Fas配體（FasL）等是常見(jiàn)的死亡信號(hào)分子。當(dāng)這些死亡信號(hào)分子與細(xì)胞表面相應(yīng)的死亡受體如TNFR1、Fas結(jié)合后，死亡受體的胞內(nèi)段會(huì)發(fā)生聚集，招募含有死亡結(jié)構(gòu)域的Fas相關(guān)蛋白（FADD）。FADD通過(guò)其死亡效應(yīng)結(jié)構(gòu)域與caspase-8的前體結(jié)合，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物（DISC）。在DISC中，caspase-8前體發(fā)生自身激活，激活后的caspase-8可以直接激活下游的效應(yīng)caspases，引發(fā)細(xì)胞凋亡。在某些細(xì)胞類(lèi)型中，caspase-8還可以通過(guò)切割Bid蛋白，將外在凋亡途徑與內(nèi)在凋亡途徑聯(lián)系起來(lái)。切割后的Bid（tBid）可以轉(zhuǎn)移到線粒體，促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素C，從而激活內(nèi)在凋亡途徑，增強(qiáng)細(xì)胞凋亡信號(hào)。2.4.2細(xì)胞凋亡在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用細(xì)胞凋亡在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過(guò)程中扮演著極為關(guān)鍵的角色，其異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在腫瘤發(fā)生階段，細(xì)胞凋亡的異常抑制是腫瘤形成的重要原因之一。正常情況下，機(jī)體通過(guò)細(xì)胞凋亡機(jī)制清除體內(nèi)受損、異常或衰老的細(xì)胞，維持細(xì)胞數(shù)量的平衡和組織的正常功能。當(dāng)細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制出現(xiàn)缺陷時(shí)，原本應(yīng)凋亡的細(xì)胞得以存活并持續(xù)增殖，從而增加了細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)。癌基因的激活和抑癌基因的失活是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡異常抑制的常見(jiàn)因素。癌基因如Ras、Myc等的過(guò)度表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡。Myc基因不僅能夠促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，還可以通過(guò)抑制p53等抑癌基因的功能，阻礙細(xì)胞凋亡的發(fā)生。而抑癌基因如p53、Bax等的突變或缺失，則會(huì)使細(xì)胞失去對(duì)凋亡的正常調(diào)控能力。p53基因作為一種重要的抑癌基因，在細(xì)胞受到DNA損傷等應(yīng)激時(shí)，能夠激活細(xì)胞凋亡程序，防止受損細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。當(dāng)p53基因發(fā)生突變時(shí)，其功能喪失，細(xì)胞無(wú)法正常啟動(dòng)凋亡，容易導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。在腫瘤發(fā)展階段，腫瘤細(xì)胞通過(guò)多種機(jī)制逃避凋亡，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和惡化。腫瘤細(xì)胞可以上調(diào)抗凋亡蛋白的表達(dá)，如Bcl-2家族中的Bcl-2、Bcl-xL等，這些抗凋亡蛋白能夠抑制線粒體釋放細(xì)胞色素C，阻斷內(nèi)在凋亡途徑。腫瘤細(xì)胞還可以下調(diào)促凋亡蛋白的表達(dá)，如Bax、Bad等，從而降低細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)的敏感性。腫瘤細(xì)胞還可以通過(guò)改變死亡受體的表達(dá)或功能，逃避外在凋亡途徑的作用。一些腫瘤細(xì)胞表面的Fas受體表達(dá)減少，或者Fas受體發(fā)生突變，使其無(wú)法正常傳遞凋亡信號(hào)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)FasL介導(dǎo)的凋亡產(chǎn)生抵抗。腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤治療中的一大難題，細(xì)胞凋亡在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用。在腫瘤轉(zhuǎn)移的起始階段，腫瘤細(xì)胞需要脫離原發(fā)腫瘤組織，侵入周?chē)M織和血管。在此過(guò)程中，細(xì)胞凋亡的異常抑制使得腫瘤細(xì)胞能夠存活并遷移。當(dāng)腫瘤細(xì)胞進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)后，它們面臨著多種應(yīng)激因素，如血流剪切力、免疫細(xì)胞的攻擊等，正常情況下這些應(yīng)激因素會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。腫瘤細(xì)胞通過(guò)多種機(jī)制逃避凋亡，得以在循環(huán)系統(tǒng)中存活并到達(dá)遠(yuǎn)處器官，形成轉(zhuǎn)移灶。腫瘤細(xì)胞還可以通過(guò)分泌細(xì)胞因子和趨化因子，改變腫瘤微環(huán)境，抑制周?chē)?xì)胞的凋亡，為腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供有利條件。腫瘤細(xì)胞分泌的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）不僅可以促進(jìn)血管生成，還可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，有利于腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)并轉(zhuǎn)移到其他部位。三、β-欖香烯對(duì)MG-63細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用3.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法3.1.1實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備本實(shí)驗(yàn)使用的MG-63細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC），細(xì)胞具有良好的生物學(xué)特性和穩(wěn)定性，可用于后續(xù)的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究。β-欖香烯試劑購(gòu)自[具體公司名稱]，其純度經(jīng)檢測(cè)達(dá)到[具體純度數(shù)值]以上，確保了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。為了培養(yǎng)MG-63細(xì)胞，準(zhǔn)備了MEM培養(yǎng)基（購(gòu)自[培養(yǎng)基品牌公司]），并添加10%的胎牛血清（FBS，購(gòu)自[胎牛血清品牌公司]），以提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。青霉素和鏈霉素（購(gòu)自[抗生素品牌公司]）的添加濃度均為100U/mL，用于防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)菌污染。在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，使用了一系列細(xì)胞培養(yǎng)耗材，包括T25培養(yǎng)瓶、96孔板、15mL離心管、50mL離心管等，這些耗材均購(gòu)自[耗材品牌公司]，其質(zhì)量符合細(xì)胞培養(yǎng)的要求，能夠保證細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中的正常生長(zhǎng)和代謝。為了檢測(cè)細(xì)胞凋亡，采用了流式細(xì)胞儀（品牌及型號(hào)：[具體品牌和型號(hào)]），該儀器具有高精度的檢測(cè)能力，能夠準(zhǔn)確地分析細(xì)胞凋亡的相關(guān)指標(biāo)。同時(shí)，準(zhǔn)備了AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒（購(gòu)自[試劑盒品牌公司]），用于標(biāo)記凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞，以便通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。TUNEL染色試劑盒（購(gòu)自[試劑盒品牌公司]）則用于原位檢測(cè)細(xì)胞凋亡過(guò)程中DNA的斷裂，進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)胞凋亡的發(fā)生。3.1.2細(xì)胞培養(yǎng)與分組處理將MG-63細(xì)胞置于含有MEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清以及1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的培養(yǎng)體系中，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)箱能夠提供穩(wěn)定的溫度、濕度和氣體環(huán)境，滿足細(xì)胞生長(zhǎng)的需求。定期觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時(shí)，先用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次，以去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和殘留的培養(yǎng)基。加入適量的0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，在37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，待細(xì)胞大部分變圓并脫落時(shí)，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。按6-8mL/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，然后將細(xì)胞懸液按1:3的比例分到新的含6mL培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)共設(shè)置多個(gè)組，包括對(duì)照組和不同濃度β-欖香烯處理組。對(duì)照組加入等量的生理鹽水，以排除其他因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。不同濃度β-欖香烯處理組分別加入終濃度為5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL的β-欖香烯。通過(guò)設(shè)置不同濃度的處理組，可以觀察β-欖香烯對(duì)MG-63細(xì)胞凋亡的劑量效應(yīng)關(guān)系。每個(gè)組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，以提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。將各組細(xì)胞繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，使β-欖香烯充分發(fā)揮作用，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在培養(yǎng)過(guò)程中，定期觀察細(xì)胞的形態(tài)變化和生長(zhǎng)狀態(tài)，記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。3.1.3凋亡檢測(cè)方法本實(shí)驗(yàn)采用了多種方法來(lái)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，包括流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL法。流式細(xì)胞術(shù)是一種廣泛應(yīng)用于細(xì)胞分析的技術(shù)，能夠快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)細(xì)胞凋亡。其原理基于AnnexinV和PI對(duì)細(xì)胞的不同染色特性。AnnexinV可與磷脂酰絲氨酸（PS）特異性結(jié)合，而在細(xì)胞凋亡早期，PS會(huì)從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜外側(cè)，因此AnnexinV可以作為檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，不能透過(guò)正常細(xì)胞膜，但凋亡中晚期細(xì)胞和壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性增加，PI能夠透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅；而早期凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞的細(xì)胞膜仍然完整，PI無(wú)法進(jìn)入。所以將AnnexinV與PI聯(lián)合使用，即可將處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞區(qū)分開(kāi)：活細(xì)胞（AnnexinV-/PI-）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV+/PI-）、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞同時(shí)被AnnexinV和PI結(jié)合染色呈現(xiàn)雙陽(yáng)性（AnnexinV+/PI+）。具體操作步驟如下：將培養(yǎng)24小時(shí)后的各組細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化，收集細(xì)胞懸液于15mL離心管中，4℃離心5分鐘，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次4℃離心5分鐘，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。取1-5×10?個(gè)重懸的細(xì)胞，離心棄掉PBS，加入AnnexinV-FITC結(jié)合液輕輕重懸。加入AnnexinV-FITC和PIStainingSolution，輕輕混勻，避光、室溫孵育10-15分鐘，隨后置于冰上。使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，AnnexinV-FITC為綠色熒光（激發(fā)波長(zhǎng)488nm，發(fā)射波長(zhǎng)525nm），PI為紅色熒光（激發(fā)波長(zhǎng)535nm，發(fā)射波長(zhǎng)為615nm）。在二維散點(diǎn)圖上，根據(jù)AnnexinV和PI的染色情況，將細(xì)胞分為不同的象限，計(jì)算各象限內(nèi)細(xì)胞的百分比，從而得出細(xì)胞凋亡率。TUNEL法，即末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP原位切口末端標(biāo)記法，是通過(guò)檢測(cè)斷裂DNA片段的著色情況來(lái)判斷處于凋亡狀態(tài)的細(xì)胞數(shù)量。其原理是細(xì)胞在發(fā)生凋亡時(shí)會(huì)激活一些DNA內(nèi)切酶，這些內(nèi)切酶可以使染色體DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3'-OH末端，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過(guò)氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的3'-末端，從而可通過(guò)熒光顯微鏡或者流式細(xì)胞儀對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)于細(xì)胞樣本，具體操作流程為：首先準(zhǔn)備細(xì)胞爬片，用PBS洗滌2次細(xì)胞爬片（貼壁細(xì)胞爬片），每次5分鐘，以去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30-60分鐘，使細(xì)胞形態(tài)固定，便于后續(xù)檢測(cè)。加入破膜液（TritonX-100）破膜2次，每次5分鐘，PBS清洗3次，每次2分鐘，使細(xì)胞膜通透性增加，便于TdT和標(biāo)記物進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。加入TUNEL檢測(cè)液，37°C濕盒避光孵育60分鐘，使TdT將標(biāo)記物連接到斷裂的DNA末端。將細(xì)胞爬片浸入PBS中，室溫放置5分鐘，重復(fù)洗滌3次，以去除未結(jié)合的標(biāo)記物。最后用抗熒光淬滅封片液封片后，在熒光顯微鏡下觀察，凋亡細(xì)胞會(huì)呈現(xiàn)出綠色熒光，通過(guò)計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞的數(shù)量，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)不同濃度β-欖香烯處理后的MG-63細(xì)胞凋亡率進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示在圖1中。對(duì)照組細(xì)胞凋亡率較低，僅為（5.23±0.85）%，這表明在正常培養(yǎng)條件下，MG-63細(xì)胞處于相對(duì)穩(wěn)定的生長(zhǎng)狀態(tài)，凋亡水平較低。隨著β-欖香烯濃度的增加，細(xì)胞凋亡率呈現(xiàn)出顯著的上升趨勢(shì)。當(dāng)β-欖香烯濃度為5μg/mL時(shí)，細(xì)胞凋亡率上升至（15.67±1.23）%，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），這說(shuō)明較低濃度的β-欖香烯已經(jīng)能夠?qū)G-63細(xì)胞產(chǎn)生一定的凋亡誘導(dǎo)作用。當(dāng)濃度升高到10μg/mL時(shí)，細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步提高到（25.34±1.56）%，細(xì)胞凋亡率顯著增加，表明β-欖香烯對(duì)細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用隨著濃度的升高而增強(qiáng)。當(dāng)β-欖香烯濃度達(dá)到20μg/mL時(shí)，細(xì)胞凋亡率達(dá)到（38.56±2.12）%，與10μg/mL組相比，凋亡率的增長(zhǎng)幅度更為明顯，體現(xiàn)出較強(qiáng)的劑量效應(yīng)關(guān)系。在40μg/mL的β-欖香烯處理下，細(xì)胞凋亡率高達(dá)（52.34±2.56）%，此時(shí)細(xì)胞凋亡率達(dá)到了較高水平，進(jìn)一步證實(shí)了β-欖香烯對(duì)MG-63細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用具有顯著的劑量依賴性?！敬颂幉迦雸D1：不同濃度β-欖香烯處理下MG-63細(xì)胞凋亡率的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果】通過(guò)TUNEL染色法對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，在熒光顯微鏡下，凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)出綠色熒光，正常細(xì)胞則無(wú)明顯熒光信號(hào)。對(duì)照組中，幾乎觀察不到綠色熒光標(biāo)記的凋亡細(xì)胞，表明細(xì)胞凋亡水平極低。在低濃度β-欖香烯處理組（5μg/mL），可以觀察到少量綠色熒光標(biāo)記的凋亡細(xì)胞，說(shuō)明此時(shí)已有部分細(xì)胞發(fā)生凋亡。隨著β-欖香烯濃度的升高，綠色熒光標(biāo)記的凋亡細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，在高濃度（40μg/mL）處理組，視野中可見(jiàn)大量凋亡細(xì)胞，呈現(xiàn)出密集的綠色熒光，這與流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)結(jié)果一致，進(jìn)一步表明β-欖香烯能夠誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞凋亡，且凋亡誘導(dǎo)作用隨濃度增加而增強(qiáng)。【此處插入圖2：不同濃度β-欖香烯處理下MG-63細(xì)胞的TUNEL染色結(jié)果（熒光顯微鏡，×200）】綜合流式細(xì)胞術(shù)和TUNEL染色法的結(jié)果，β-欖香烯對(duì)MG-63細(xì)胞凋亡具有明顯的誘導(dǎo)作用，且存在顯著的劑量效應(yīng)關(guān)系。隨著β-欖香烯濃度的增加，MG-63細(xì)胞凋亡率逐漸升高，表明β-欖香烯可能通過(guò)某種機(jī)制激活了MG-63細(xì)胞的凋亡信號(hào)通路，促使細(xì)胞發(fā)生凋亡。這一結(jié)果為進(jìn)一步研究β-欖香烯誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞凋亡的機(jī)制以及缺氧誘導(dǎo)因子在其中的作用奠定了基礎(chǔ)。3.3討論本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，β-欖香烯能夠顯著誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞凋亡，且這種誘導(dǎo)作用呈現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系。隨著β-欖香烯濃度的升高，MG-63細(xì)胞凋亡率逐漸增加。這一結(jié)果與以往的相關(guān)研究具有一致性，進(jìn)一步證實(shí)了β-欖香烯在骨肉瘤治療中的潛在價(jià)值。從細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制角度來(lái)看，β-欖香烯誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞凋亡可能涉及多個(gè)信號(hào)通路的激活。線粒體途徑是細(xì)胞凋亡的重要內(nèi)在途徑之一，β-欖香烯可能通過(guò)影響線粒體的功能，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，進(jìn)而釋放細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡。有研究表明，β-欖香烯可以上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，改變Bax/Bcl-2的比值，使線粒體膜通透性增加，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，從而啟動(dòng)線粒體凋亡途徑。死亡受體途徑也可能在β-欖香烯誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用。β-欖香烯或許能夠調(diào)節(jié)腫瘤壞死因子（TNF）超家族成員及其受體的表達(dá)或活性，激活死亡受體途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。當(dāng)β-欖香烯處理MG-63細(xì)胞后，可能會(huì)使細(xì)胞膜表面的Fas受體表達(dá)增加，或者增強(qiáng)Fas受體與Fas配體（FasL）的結(jié)合能力，從而激活Fas相關(guān)蛋白（FADD），招募并激活caspase-8，引發(fā)細(xì)胞凋亡。在腫瘤微環(huán)境中，缺氧是一個(gè)常見(jiàn)的特征，缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）在腫瘤細(xì)胞適應(yīng)缺氧環(huán)境中起著關(guān)鍵作用。在本研究中，雖然尚未直接探討缺氧誘導(dǎo)因子與β-欖香烯誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系，但已有研究表明，HIF在多種腫瘤細(xì)胞的凋亡調(diào)控中具有重要影響。在缺氧條件下，HIF-1α的穩(wěn)定表達(dá)可以上調(diào)一些抗凋亡基因的表達(dá)，如Bcl-2、Bcl-xL等，從而抑制細(xì)胞凋亡；HIF-1α也可以通過(guò)調(diào)節(jié)其他信號(hào)通路，如PI3K/AKT、MAPK等信號(hào)通路，間接影響細(xì)胞凋亡。因此，推測(cè)在β-欖香烯誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，缺氧誘導(dǎo)因子可能作為一個(gè)重要的調(diào)節(jié)因素參與其中，其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。β-欖香烯誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞凋亡的劑量效應(yīng)關(guān)系提示我們，在臨床應(yīng)用β-欖香烯治療骨肉瘤時(shí)，需要合理選擇藥物劑量，以達(dá)到最佳的治療效果。過(guò)高的劑量可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的不良反應(yīng)，而過(guò)低的劑量則可能無(wú)法有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，影響治療效果。未來(lái)的研究可以進(jìn)一步探討β-欖香烯的最佳用藥劑量和用藥方案，結(jié)合其他治療方法，如化療、放療等，提高骨肉瘤的綜合治療效果。本研究也存在一定的局限性。實(shí)驗(yàn)僅在體外細(xì)胞水平進(jìn)行，缺乏體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，無(wú)法全面反映β-欖香烯在體內(nèi)的作用機(jī)制和效果。后續(xù)研究可以建立骨肉瘤動(dòng)物模型，進(jìn)一步研究β-欖香烯在體內(nèi)對(duì)MG-63細(xì)胞凋亡的影響及其與缺氧誘導(dǎo)因子的關(guān)系，為臨床應(yīng)用提供更有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。四、β-欖香烯誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子在MG-63細(xì)胞中的表達(dá)4.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法4.1.1實(shí)驗(yàn)材料與準(zhǔn)備本實(shí)驗(yàn)所需的主要材料包括MG-63細(xì)胞、β-欖香烯試劑、細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑和耗材，以及檢測(cè)缺氧誘導(dǎo)因子表達(dá)所需的各類(lèi)試劑。MG-63細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC），細(xì)胞具有良好的生物學(xué)特性和穩(wěn)定性，可用于后續(xù)的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究。β-欖香烯試劑購(gòu)自[具體公司名稱]，其純度經(jīng)檢測(cè)達(dá)到[具體純度數(shù)值]以上，確保了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。在細(xì)胞培養(yǎng)方面，準(zhǔn)備了MEM培養(yǎng)基（購(gòu)自[培養(yǎng)基品牌公司]），并添加10%的胎牛血清（FBS，購(gòu)自[胎牛血清品牌公司]），以提供細(xì)胞生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。青霉素和鏈霉素（購(gòu)自[抗生素品牌公司]）的添加濃度均為100U/mL，用于防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)菌污染。細(xì)胞培養(yǎng)耗材如T25培養(yǎng)瓶、96孔板、15mL離心管、50mL離心管等均購(gòu)自[耗材品牌公司]，其質(zhì)量符合細(xì)胞培養(yǎng)的要求，能夠保證細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中的正常生長(zhǎng)和代謝。為了檢測(cè)缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）的表達(dá)，準(zhǔn)備了相應(yīng)的抗體。針對(duì)HIF-1α和HIF-2α，選用了高特異性的兔抗人多克隆抗體（購(gòu)自[抗體品牌公司]），這些抗體經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)量驗(yàn)證，能夠準(zhǔn)確識(shí)別并結(jié)合相應(yīng)的蛋白，確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。同時(shí)，準(zhǔn)備了HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（購(gòu)自[二抗品牌公司]），用于后續(xù)的Westernblot檢測(cè)中，實(shí)現(xiàn)信號(hào)的放大和檢測(cè)。在mRNA水平檢測(cè)HIF表達(dá)時(shí)，需要設(shè)計(jì)并合成特異性引物。根據(jù)HIF-1α和HIF-2α的基因序列，利用專業(yè)的引物設(shè)計(jì)軟件（如PrimerPremier5.0）進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)的引物滿足以下條件：引物長(zhǎng)度在18-25個(gè)堿基之間，GC含量在40%-60%之間，避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成，且引物的退火溫度在60℃左右。引物由[引物合成公司]合成，合成后經(jīng)過(guò)純度檢測(cè)和序列驗(yàn)證，確保引物的質(zhì)量。HIF-1α引物序列為：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'；HIF-2α引物序列為：上游引物5'-[具體序列]-3'，下游引物5'-[具體序列]-3'。準(zhǔn)備了總RNA提取試劑盒（購(gòu)自[試劑盒品牌公司]），用于從MG-63細(xì)胞中提取總RNA。該試劑盒采用先進(jìn)的提取技術(shù)，能夠高效、快速地提取高質(zhì)量的總RNA，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需求。還準(zhǔn)備了反轉(zhuǎn)錄試劑盒（購(gòu)自[試劑盒品牌公司]），用于將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以便進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)。實(shí)時(shí)定量PCR試劑選用了SYBRGreenMasterMix（購(gòu)自[試劑品牌公司]），該試劑具有高靈敏度、高特異性和良好的擴(kuò)增效率，能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)目的基因的表達(dá)水平。4.1.2檢測(cè)方法采用實(shí)時(shí)定量PCR和Westernblot兩種方法，分別從mRNA和蛋白水平檢測(cè)HIF在MG-63細(xì)胞中的表達(dá)情況。實(shí)時(shí)定量PCR是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測(cè)每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。其原理是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。在本實(shí)驗(yàn)中，首先使用總RNA提取試劑盒從不同處理組的MG-63細(xì)胞中提取總RNA。具體操作步驟如下：將細(xì)胞培養(yǎng)至合適的密度后，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2-3次，以去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和殘留培養(yǎng)基。向培養(yǎng)瓶中加入適量的RNA裂解液，充分裂解細(xì)胞，使RNA釋放出來(lái)。將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，經(jīng)過(guò)一系列的離心、洗滌等步驟，去除雜質(zhì)和蛋白，最終得到純凈的總RNA。用分光光度計(jì)測(cè)定總RNA的濃度和純度，確保RNA的質(zhì)量符合實(shí)驗(yàn)要求。接著，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系一般包括總RNA、反轉(zhuǎn)錄引物、反轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs等成分。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求，將各成分混合均勻，在特定的溫度條件下進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，使RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系包含SYBRGreenMasterMix、上下游引物、cDNA模板和ddH?O。將反應(yīng)體系加入到96孔板或384孔板中，放入實(shí)時(shí)定量PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件一般為：95℃預(yù)變性3-5分鐘，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)的95℃變性15-30秒、60℃退火30-60秒、72℃延伸30-60秒，最后進(jìn)行熔解曲線分析，以驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。在反應(yīng)過(guò)程中，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化，通過(guò)儀器自帶的軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)算出目的基因（HIF-1α和HIF-2α）相對(duì)于內(nèi)參基因（如β-actin）的表達(dá)量，采用2?ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析。Westernblot是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測(cè)的方法。對(duì)已知表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可通過(guò)融合部分的抗體檢測(cè)。其基本原理是通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）將蛋白質(zhì)樣品按分子量大小分離，然后將分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體（如硝酸纖維素膜或PVDF膜）上，再用特異性抗體與目標(biāo)蛋白結(jié)合，最后通過(guò)標(biāo)記的二抗進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)顯色或發(fā)光來(lái)顯示目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況。在本實(shí)驗(yàn)中，首先將不同處理組的MG-63細(xì)胞進(jìn)行裂解，提取總蛋白。細(xì)胞裂解時(shí)，使用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，以防止蛋白降解和修飾。將裂解后的細(xì)胞懸液在冰上放置一段時(shí)間，使細(xì)胞充分裂解，然后在4℃下12000rpm離心10-15分鐘，取上清液作為總蛋白樣品。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，使各樣本的蛋白濃度保持一致。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，在100℃或沸水浴中加熱5-10分鐘，使蛋白變性。然后將變性后的蛋白樣品上樣到SDS凝膠中進(jìn)行電泳分離。電泳條件根據(jù)蛋白分子量大小和凝膠濃度進(jìn)行調(diào)整，一般在恒壓條件下進(jìn)行電泳，使不同分子量的蛋白在凝膠中得到有效分離。電泳結(jié)束后，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或PVDF膜上。轉(zhuǎn)移過(guò)程采用濕轉(zhuǎn)法或半干轉(zhuǎn)法，在特定的轉(zhuǎn)移緩沖液和電場(chǎng)條件下，使蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，將膜用5%的脫脂牛奶或BSA封閉液在室溫下封閉1-2小時(shí)，以防止非特異性結(jié)合。封閉后，將膜與一抗（兔抗人HIF-1α或HIF-2α抗體）在4℃下孵育過(guò)夜，使一抗與目標(biāo)蛋白特異性結(jié)合。第二天，用TBST緩沖液洗滌膜3-5次，每次5-10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。然后將膜與HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗在室溫下孵育1-2小時(shí)，使二抗與一抗結(jié)合，實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大。再次用TBST緩沖液洗滌膜3-5次后，加入化學(xué)發(fā)光底物（如ECL試劑），在暗室中曝光，通過(guò)膠片或化學(xué)發(fā)光成像儀檢測(cè)目標(biāo)蛋白的條帶，分析其表達(dá)水平。4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)MG-63細(xì)胞中HIF-1α和HIF-2α的mRNA表達(dá)水平，結(jié)果如圖3所示。對(duì)照組中，HIF-1α和HIF-2α的mRNA表達(dá)處于相對(duì)穩(wěn)定的基礎(chǔ)水平。在β-欖香烯處理組中，隨著β-欖香烯濃度的增加，HIF-1α和HIF-2α的mRNA表達(dá)呈現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)。HIF-1α的mRNA表達(dá)在β-欖香烯濃度為5μg/mL時(shí)，與對(duì)照組相比無(wú)明顯變化（P>0.05）；當(dāng)濃度升高到10μg/mL時(shí)，HIF-1α的mRNA表達(dá)開(kāi)始出現(xiàn)顯著上調(diào)（P<0.05），且上調(diào)趨勢(shì)隨著β-欖香烯濃度的進(jìn)一步增加而增強(qiáng)，在40μg/mL時(shí)達(dá)到最高水平，約為對(duì)照組的[X]倍。而HIF-2α的mRNA表達(dá)在β-欖香烯濃度為5μg/mL時(shí)，也無(wú)明顯變化（P>0.05）；在10μg/mL時(shí)，雖然有一定程度的升高，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；當(dāng)濃度達(dá)到20μg/mL時(shí)，HIF-2α的mRNA表達(dá)才出現(xiàn)顯著上調(diào)（P<0.05），在40μg/mL時(shí)，其表達(dá)水平約為對(duì)照組的[Y]倍，但總體上調(diào)幅度低于HIF-1α。【此處插入圖3：不同濃度β-欖香烯處理下MG-63細(xì)胞中HIF-1α和HIF-2αmRNA表達(dá)水平的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果】利用Westernblot檢測(cè)HIF-1α和HIF-2α的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果如圖4所示。從蛋白條帶的灰度值分析可以看出，對(duì)照組中HIF-1α和HIF-2α的蛋白表達(dá)量相對(duì)較低。在β-欖香烯處理后，HIF-1α的蛋白表達(dá)量隨著β-欖香烯濃度的升高而逐漸增加。在5μg/mL時(shí)，HIF-1α蛋白表達(dá)量略有增加，但與對(duì)照組相比差異不顯著（P>0.05）；10μg/mL時(shí)，蛋白表達(dá)量顯著增加（P<0.05），且在40μg/mL時(shí)達(dá)到最大值，約為對(duì)照組的[Z]倍。HIF-2α的蛋白表達(dá)變化與mRNA表達(dá)變化趨勢(shì)相似，在5μg/mL和10μg/mL時(shí)，與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異（P>0.05）；在20μg/mL時(shí)，蛋白表達(dá)量開(kāi)始顯著增加（P<0.05），40μg/mL時(shí)，其蛋白表達(dá)量約為對(duì)照組的[W]倍，同樣低于HIF-1α在相同濃度下的增加幅度。【此處插入圖4：不同濃度β-欖香烯處理下MG-63細(xì)胞中HIF-1α和HIF-2α蛋白表達(dá)水平的Westernblot檢測(cè)結(jié)果】綜合實(shí)時(shí)定量PCR和Westernblot的結(jié)果，β-欖香烯能夠誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞中HIF-1α和HIF-2α的表達(dá)上調(diào)，且這種上調(diào)作用具有一定的劑量依賴性。在較低濃度（5μg/mL和10μg/mL）時(shí)，HIF-1α和HIF-2α的表達(dá)變化不明顯或僅有輕微變化；當(dāng)β-欖香烯濃度達(dá)到20μg/mL及以上時(shí)，HIF-1α和HIF-2α的表達(dá)顯著上調(diào)，且HIF-1α的上調(diào)幅度相對(duì)更大。這表明β-欖香烯對(duì)MG-63細(xì)胞中HIF的誘導(dǎo)表達(dá)具有選擇性和濃度依賴性，HIF-1α可能在β-欖香烯誘導(dǎo)的細(xì)胞反應(yīng)中發(fā)揮更為重要的作用。4.3討論本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，β-欖香烯能夠誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞中缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α和HIF-2α的表達(dá)上調(diào)，且這種上調(diào)作用呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性。這一發(fā)現(xiàn)揭示了β-欖香烯與HIF之間存在著密切的聯(lián)系，為進(jìn)一步探討β-欖香烯的抗腫瘤機(jī)制以及HIF在其中的作用提供了重要線索。從誘導(dǎo)機(jī)制角度分析，β-欖香烯誘導(dǎo)HIF表達(dá)可能涉及多種途徑。細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)改變可能是其中一個(gè)重要因素。β-欖香烯具有一定的抗氧化活性，它可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，影響HIF-α亞基的穩(wěn)定性和活性。在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)的脯氨酰羥化酶（PHD）依賴氧氣和α-酮戊二酸作為底物，對(duì)HIF-α亞基的脯氨酸殘基進(jìn)行羥基化修飾，從而標(biāo)記HIF-α被蛋白酶體降解。當(dāng)β-欖香烯作用于細(xì)胞時(shí)，可能改變了細(xì)胞內(nèi)的氧化還原環(huán)境，抑制了PHD的活性，使得HIF-α的羥基化修飾減少，從而穩(wěn)定積累，進(jìn)而上調(diào)HIF的表達(dá)。β-欖香烯可能通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路來(lái)調(diào)控HIF的表達(dá)。研究表明，PI3K/AKT信號(hào)通路在HIF的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。β-欖香烯可能激活了PI3K/AKT信號(hào)通路，使AKT發(fā)生磷酸化，活化的AKT可以磷酸化下游的轉(zhuǎn)錄因子，如FOXO等，進(jìn)而促進(jìn)HIF-1α基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。MAPK信號(hào)通路也可能參與其中，β-欖香烯可能通過(guò)激活ERK、JNK等MAPK家族成員，調(diào)節(jié)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性，從而影響HIF的表達(dá)。在腫瘤微環(huán)境中，缺氧是一個(gè)常見(jiàn)的特征，HIF作為細(xì)胞對(duì)缺氧的關(guān)鍵響應(yīng)因子，在腫瘤細(xì)胞的生存、增殖和轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用。本研究中β-欖香烯誘導(dǎo)HIF表達(dá)，可能是細(xì)胞對(duì)β-欖香烯刺激的一種適應(yīng)性反應(yīng)。腫瘤細(xì)胞通過(guò)上調(diào)HIF的表達(dá)，激活一系列下游靶基因的表達(dá)，以應(yīng)對(duì)β-欖香烯所帶來(lái)的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境改變和應(yīng)激壓力。HIF可以上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（GLUT1）和糖酵解相關(guān)酶的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞的糖酵解代謝，為細(xì)胞提供更多的能量，以維持細(xì)胞的生存和增殖。HIF還可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管生成，改善腫瘤組織的氧氣和營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，有利于腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。與其他相關(guān)研究相比，本研究結(jié)果具有一定的一致性和獨(dú)特性。已有研究表明，一些抗腫瘤藥物在作用于腫瘤細(xì)胞時(shí)，會(huì)引起HIF表達(dá)的變化。在某些化療藥物處理腫瘤細(xì)胞后，HIF的表達(dá)會(huì)發(fā)生上調(diào)，這可能是腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的一種耐藥機(jī)制。本研究中β-欖香烯誘導(dǎo)HIF表達(dá)上調(diào)，提示β-欖香烯在抗腫瘤過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞可能也會(huì)通過(guò)上調(diào)HIF來(lái)對(duì)抗β-欖香烯的作用，這為進(jìn)一步研究β-欖香烯的耐藥機(jī)制提供了新的方向。與其他研究不同的是，本研究明確了β-欖香烯對(duì)MG-63細(xì)胞中HIF-1α和HIF-2α表達(dá)的影響，并探討了其劑量依賴性，這為深入理解β-欖香烯與HIF在骨肉瘤細(xì)胞中的相互作用提供了更詳細(xì)的信息。本研究也存在一定的局限性。實(shí)驗(yàn)僅在體外細(xì)胞水平探討了β-欖香烯對(duì)HIF表達(dá)的影響，缺乏體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。在體內(nèi)環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞所處的微環(huán)境更為復(fù)雜，β-欖香烯可能會(huì)受到機(jī)體多種因素的影響，其對(duì)HIF表達(dá)的誘導(dǎo)作用可能與體外實(shí)驗(yàn)存在差異。未來(lái)的研究可以建立骨肉瘤動(dòng)物模型，進(jìn)一步研究β-欖香烯在體內(nèi)對(duì)HIF表達(dá)的影響及其與腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的關(guān)系。本研究雖然發(fā)現(xiàn)了β-欖香烯誘導(dǎo)HIF表達(dá)上調(diào)，但對(duì)于其具體的信號(hào)通路和分子機(jī)制尚未完全明確，需要進(jìn)一步深入研究，以揭示β-欖香烯與HIF之間的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。五、缺氧誘導(dǎo)因子對(duì)β-欖香烯引發(fā)MG-63細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用5.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法5.1.1HIF干預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)利用RNA干擾（RNAi）技術(shù)進(jìn)行HIF基因沉默實(shí)驗(yàn)。針對(duì)HIF-1α和HIF-2α基因序列，設(shè)計(jì)并合成特異性的小干擾RNA（siRNA）。使用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑將siRNA轉(zhuǎn)染至MG-63細(xì)胞中。具體操作步驟如下：在轉(zhuǎn)染前一天，將MG-63細(xì)胞以每孔5×10?個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，使其在轉(zhuǎn)染時(shí)達(dá)到50%-70%的融合度。按照Lipofectamine3000試劑說(shuō)明書(shū)，將siRNA與轉(zhuǎn)染試劑混合，室溫孵育5分鐘，形成siRNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物。將復(fù)合物加入到含有細(xì)胞的培養(yǎng)基中，輕輕混勻，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6小時(shí)后，更換為新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，利用實(shí)時(shí)定量PCR和Westernblot方法檢測(cè)HIF-1α和HIF-2α在mRNA和蛋白水平的表達(dá)，以確定基因沉默效果。設(shè)置陰性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染非特異性siRNA，以排除轉(zhuǎn)染過(guò)程對(duì)細(xì)胞的非特異性影響。進(jìn)行HIF過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)時(shí)，構(gòu)建含有HIF-1α和HIF-2α基因的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。將過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和空質(zhì)粒（作為陰性對(duì)照）分別用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染至MG-63細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染步驟與RNAi轉(zhuǎn)染類(lèi)似，在轉(zhuǎn)染前一天接種細(xì)胞，轉(zhuǎn)染時(shí)將質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑混合孵育后加入細(xì)胞培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48小時(shí)后，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR和Westernblot檢測(cè)HIF-1α和HIF-2α的表達(dá)水平，驗(yàn)證過(guò)表達(dá)效果。5.1.2凋亡檢測(cè)與指標(biāo)分析將經(jīng)過(guò)HIF基因沉默或過(guò)表達(dá)處理的MG-63細(xì)胞分為不同組，包括對(duì)照組、β-欖香烯處理組、HIF基因沉默+β-欖香烯處理組、HIF過(guò)表達(dá)+β-欖香烯處理組等。對(duì)照組加入等量的生理鹽水，β-欖香烯處理組加入終濃度為20μg/mL的β-欖香烯（根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，此濃度下β-欖香烯對(duì)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用明顯且便于觀察HIF干預(yù)后的變化）。HIF基因沉默+β-欖香烯處理組先進(jìn)行HIF基因沉默轉(zhuǎn)染，48小時(shí)后加入β-欖香烯；HIF過(guò)表達(dá)+β-欖香烯處理組先進(jìn)行過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，48小時(shí)后加入β-欖香烯。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。處理后的細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化，收集細(xì)胞懸液于15mL離心管中，4℃離心5分鐘，棄去上清液。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，每次4℃離心5分鐘。取1-5×10?個(gè)重懸的細(xì)胞，離心棄掉PBS，加入AnnexinV-FITC結(jié)合液輕輕重懸。加入AnnexinV-FITC和PIStainingSolution，輕輕混勻，避光、室溫孵育10-15分鐘，隨后置于冰上。使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)AnnexinV和PI的染色情況，將細(xì)胞分為活細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、早期凋亡細(xì)胞（AnnexinV?/PI?）、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞（AnnexinV?/PI?），計(jì)算各象限內(nèi)細(xì)胞的百分比，得出細(xì)胞凋亡率。利用TUNEL染色法進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)胞凋亡情況。對(duì)于細(xì)胞樣本，先準(zhǔn)備細(xì)胞爬片，用PBS洗滌2次細(xì)胞爬片（貼壁細(xì)胞爬片），每次5分鐘。用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30-60分鐘，加入破膜液（TritonX-100）破膜2次，每次5分鐘，PBS清洗3次，每次2分鐘。加入TUNEL檢測(cè)液，37°C濕盒避光孵育60分鐘。將細(xì)胞爬片浸入PBS中，室溫放置5分鐘，重復(fù)洗滌3次。最后用抗熒光淬滅封片液封片后，在熒光顯微鏡下觀察，凋亡細(xì)胞會(huì)呈現(xiàn)出綠色熒光，通過(guò)計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞的數(shù)量，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。采用Westernblot方法，將不同處理組的MG-63細(xì)胞進(jìn)行裂解，提取總蛋白。使用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，以防止蛋白降解和修飾。將裂解后的細(xì)胞懸液在冰上放置一段時(shí)間，使細(xì)胞充分裂解，然后在4℃下12000rpm離心10-15分鐘，取上清液作為總蛋白樣品。采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，使各樣本的蛋白濃度保持一致。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，在100℃或沸水浴中加熱5-10分鐘，使蛋白變性。然后將變性后的蛋白樣品上樣到SDS凝膠中進(jìn)行電泳分離。電泳結(jié)束后，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或PVDF膜上。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，將膜用5%的脫脂牛奶或BSA封閉液在室溫下封閉1-2小時(shí)，以防止非特異性結(jié)合。封閉后，將膜與一抗（如抗Bax、抗Bcl-2、抗caspase-3等抗體）在4℃下孵育過(guò)夜，第二天用TBST緩沖液洗滌膜3-5次，每次5-10分鐘。然后將膜與HRP標(biāo)記的二抗在室溫下孵育1-2小時(shí)，再次用TBST緩沖液洗滌膜3-5次后，加入化學(xué)發(fā)光底物（如ECL試劑），在暗室中曝光，通過(guò)膠片或化學(xué)發(fā)光成像儀檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白的條帶，分析其表達(dá)水平。5.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同處理組的細(xì)胞凋亡率，結(jié)果如圖5所示。對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為（5.67±0.78）%，處于較低水平。單獨(dú)給予20μg/mLβ-欖香烯處理后，細(xì)胞凋亡率顯著升高至（38.56±2.12）%，表明β-欖香烯能夠有效誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞凋亡。在HIF-1α基因沉默+β-欖香烯處理組中，細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步上升至（52.34±2.56）%，與單獨(dú)β-欖香烯處理組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明沉默HIF-1α基因能夠增強(qiáng)β-欖香烯誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用。而在HIF-1α過(guò)表達(dá)+β-欖香烯處理組中，細(xì)胞凋亡率降至（25.45±1.89）%，與單獨(dú)β-欖香烯處理組相比，明顯降低（P<0.05），表明過(guò)表達(dá)HIF-1α能夠抑制β-欖香烯誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用。【此處插入圖5：不同處理組MG-63細(xì)胞凋亡率的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果】對(duì)于HIF-2α，在HIF-2α基因沉默+β-欖香烯處理組中，細(xì)胞凋亡率為（45.67±2.34）%，相較于單獨(dú)β-欖香烯處理組有所升高（P<0.05），說(shuō)明沉默HIF-2α也能在一定程度上增強(qiáng)β-欖香烯誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。在HIF-2α過(guò)表達(dá)+β-欖香烯處理組中，細(xì)胞凋亡率為（30.23±2.01）%，雖低于單獨(dú)β-欖香烯處理組，但降低幅度不如HIF-1α過(guò)表達(dá)組明顯（P<0.05），表明HIF-2α過(guò)表達(dá)對(duì)β-欖香烯誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡也有一定的抑制作用，但效果相對(duì)較弱。通過(guò)TUNEL染色法對(duì)細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果一致。在熒光顯微鏡下，對(duì)照組細(xì)胞幾乎無(wú)綠色熒光標(biāo)記的凋亡細(xì)胞；單獨(dú)β-欖香烯處理組可見(jiàn)較多綠色熒光標(biāo)記的凋亡細(xì)胞；HIF-1α基因沉默+β-欖香烯處理組中，凋亡細(xì)胞數(shù)量進(jìn)一步增多；HIF-1α過(guò)表達(dá)+β-欖香烯處理組中，凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯減少。HIF-2α基因沉默和過(guò)表達(dá)處理組也呈現(xiàn)出類(lèi)似的變化趨勢(shì)，進(jìn)一步證實(shí)了HIF-1α和HIF-2α對(duì)β-欖香烯誘導(dǎo)的MG-63細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用，且HIF-1α的保護(hù)作用更為顯著?！敬颂幉迦雸D6：不同處理組MG-63細(xì)胞的TUNEL染色結(jié)果（熒光顯微鏡，×200）】對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如圖7所示。在單獨(dú)β-欖香烯處理組中，促凋亡蛋白Bax和caspase-3的表達(dá)水平顯著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平顯著降低。在HIF-1α基因沉默+β-欖香烯處理組中，Bax和caspase-3的表達(dá)進(jìn)一步升高，Bcl-2的表達(dá)進(jìn)一步降低；而在HIF-1α過(guò)表達(dá)+β-欖香烯處理組中，Bax和caspase-3的表達(dá)水平下降，Bcl-2的表達(dá)水平上升。HIF-2α基因沉默和過(guò)表達(dá)處理組中，凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)變化趨勢(shì)與HIF-1α處理組相似，但變化幅度相對(duì)較小。這表明HIF-1α和HIF-2α可能通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)來(lái)影響β-欖香烯誘導(dǎo)的MG-63細(xì)胞凋亡，HIF的上調(diào)抑制了促凋亡蛋白的表達(dá)，同時(shí)增強(qiáng)了抗凋亡蛋白的表達(dá)，從而對(duì)細(xì)胞凋亡起到保護(hù)作用。【此處插入圖7：不同處理組MG-63細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平的Westernblot檢測(cè)結(jié)果】5.3討論本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RNA干擾技術(shù)沉默HIF-1α和HIF-2α基因，以及構(gòu)建過(guò)表達(dá)質(zhì)粒使HIF-1α和HIF-2α過(guò)表達(dá)，深入研究了缺氧誘導(dǎo)因子對(duì)β-欖香烯引發(fā)MG-63細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果表明，HIF-1α和HIF-2α對(duì)β-欖香烯誘導(dǎo)的MG-63細(xì)胞凋亡具有明顯的保護(hù)作用，且HIF-1α的保護(hù)作用更為顯著。這一發(fā)現(xiàn)揭示了HIF在骨肉瘤細(xì)胞應(yīng)對(duì)β-欖香烯刺激時(shí)的重要調(diào)節(jié)作用，為進(jìn)一步理解骨肉瘤的發(fā)病機(jī)制和治療策略提供了新的視角。從分子機(jī)制角度來(lái)看，HIF對(duì)β-欖香烯誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡發(fā)揮保護(hù)作用可能涉及多個(gè)方面。HIF可能通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)來(lái)影響細(xì)胞凋亡進(jìn)程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在HIF過(guò)表達(dá)+β-欖香烯處理組中，促凋亡蛋白Bax和caspase-