WAPAL基因及其靶microRNA在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的交互作用與機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義宮頸癌是全球范圍內(nèi)嚴(yán)重威脅女性健康的常見(jiàn)惡性腫瘤之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)顯示，2020年全球?qū)m頸癌新發(fā)病例約60.4萬(wàn)例，死亡病例約34.2萬(wàn)例，其發(fā)病率和死亡率在女性惡性腫瘤中均位居前列。在我國(guó)，宮頸癌同樣是女性生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，每年新發(fā)病例約10.9萬(wàn)例，死亡病例約5.9萬(wàn)例，嚴(yán)重影響女性的生命質(zhì)量和社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。近年來(lái)，雖然宮頸癌的篩查和治療取得了一定進(jìn)展，但仍面臨諸多挑戰(zhàn)。一方面，部分患者確診時(shí)已處于中晚期，錯(cuò)過(guò)了最佳治療時(shí)機(jī)，5年生存率較低；另一方面，傳統(tǒng)的治療方法如手術(shù)、放療和化療，在治療過(guò)程中往往會(huì)給患者帶來(lái)較大的痛苦和不良反應(yīng)，且存在復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。因此，深入探究宮頸癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，對(duì)于提高宮頸癌的早期診斷率、改善患者預(yù)后具有重要意義。WAPAL基因，即wingsapart-like基因，是一種新發(fā)現(xiàn)的姐妹染色單體分離調(diào)節(jié)因子。研究表明，WAPAL基因在維持正常細(xì)胞生長(zhǎng)和癌癥發(fā)生中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在宮頸癌中，WAPAL基因的表達(dá)異常升高，且與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。例如，有研究通過(guò)對(duì)宮頸癌組織和正常宮頸組織的對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)WAPAL基因在宮頸癌組織中的表達(dá)水平顯著高于正常組織，且其表達(dá)水平與宮頸癌的臨床分期、病理分級(jí)呈正相關(guān)，提示W(wǎng)APAL基因可能作為一個(gè)潛在的癌基因參與宮頸癌的發(fā)病過(guò)程。然而，目前關(guān)于WAPAL基因在宮頸癌中發(fā)揮作用的具體分子機(jī)制尚不完全清楚。MicroRNA（miRNA）是一類(lèi)內(nèi)生的、長(zhǎng)度約20-24個(gè)核苷酸的非編碼小RNA，通過(guò)與靶mRNA的3′非翻譯區(qū)（3′UTR）特異性堿基配對(duì)，引起靶mRNA的降解或抑制其翻譯過(guò)程，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)。miRNA參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等多種生物學(xué)過(guò)程，且在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。已有大量研究證實(shí)，多種miRNA在宮頸癌中存在異常表達(dá)，它們既可以作為癌基因促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展，也可以作為抑癌基因抑制腫瘤的發(fā)生。例如，miR-21在宮頸癌組織中高表達(dá)，通過(guò)靶向抑制抑癌基因的表達(dá)，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移；而miR-143在宮頸癌中低表達(dá)，其過(guò)表達(dá)可抑制宮頸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移。此外，miRNA還具有作為腫瘤診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)的潛力，因其在體液中的穩(wěn)定性和特異性表達(dá)，可用于宮頸癌的早期診斷和預(yù)后評(píng)估；同時(shí)，通過(guò)調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)或活性，有望開(kāi)發(fā)出新型的宮頸癌治療策略。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示，miR-15a、miR-26b及miR-200b等可能是WAPAL基因的靶向作用miRNA。其中，miR-15a和miR-26b在許多腫瘤中發(fā)揮抑癌基因的作用，而miR-200b在不同腫瘤組織中的表達(dá)存在明顯差異，且這三個(gè)miRNA的表達(dá)與癌癥患者的治療效果和預(yù)后顯著相關(guān)。然而，目前有關(guān)這些miRNA對(duì)WAPAL基因表達(dá)調(diào)控的深入研究還未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在探討WAPAL基因及其靶miRNA在宮頸癌中的作用及機(jī)制，通過(guò)檢測(cè)WAPAL基因在宮頸癌組織中的表達(dá)及其與HPV感染的關(guān)系，以及miR-15a、miR-26b和miR-200b在宮頸癌組織中的表達(dá)情況，分析它們之間的相關(guān)性；進(jìn)一步構(gòu)建miR-26b真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞，研究其對(duì)WAPAL基因表達(dá)的影響。本研究不僅有助于深入了解宮頸癌的發(fā)病機(jī)制，為宮頸癌的基因診斷和治療提供新的理論依據(jù)，還可能為開(kāi)發(fā)新型的宮頸癌診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的與內(nèi)容1.2.1研究目的本研究旨在深入探討WAPAL基因及其靶miRNA在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及分子機(jī)制，為宮頸癌的早期診斷、預(yù)后評(píng)估及靶向治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。具體目標(biāo)如下：明確WAPAL基因在宮頸癌組織中的表達(dá)水平，分析其與臨床病理參數(shù)及HPV感染的相關(guān)性，初步探討WAPAL基因在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。檢測(cè)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的WAPAL基因的靶miRNA（miR-15a、miR-26b和miR-200b）在宮頸癌組織中的表達(dá)情況，分析它們與WAPAL基因表達(dá)的相關(guān)性，篩選出與WAPAL基因調(diào)控關(guān)系密切的miRNA。通過(guò)構(gòu)建miR-26b真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染宮頸癌細(xì)胞，研究miR-26b對(duì)WAPAL基因表達(dá)的調(diào)控作用，從細(xì)胞水平揭示其潛在的分子機(jī)制。進(jìn)一步探究miR-26b調(diào)控WAPAL基因表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為（如增殖、凋亡、遷移和侵襲等）的影響，為宮頸癌的靶向治療提供理論基礎(chǔ)。1.2.2研究?jī)?nèi)容本研究主要圍繞以下幾個(gè)方面展開(kāi)：WAPAL基因在宮頸癌組織中的表達(dá)及其與HPV感染的關(guān)系：收集宮頸癌組織及癌旁正常組織標(biāo)本，運(yùn)用免疫組化（IHC）技術(shù)檢測(cè)WAPAL蛋白的表達(dá)水平，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)WAPAL基因mRNA的表達(dá)情況。同時(shí)，采用基因芯片或PCR-RFLP等方法對(duì)標(biāo)本進(jìn)行HPV分型檢測(cè)，分析WAPAL基因表達(dá)與HPV感染類(lèi)型及臨床病理參數(shù)（如腫瘤分期、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等）之間的相關(guān)性，初步明確WAPAL基因在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及與HPV感染的關(guān)聯(lián)。WAPAL基因的靶miRNA預(yù)測(cè)及在宮頸癌組織中的表達(dá)分析：利用生物信息學(xué)工具（如TargetScan、miRanda、PicTar等）對(duì)WAPAL基因的靶miRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)，篩選出可能與WAPAL基因相互作用的miRNA，重點(diǎn)關(guān)注miR-15a、miR-26b和miR-200b。運(yùn)用TaqMan實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)這些miRNA在宮頸癌組織和正常宮頸組織中的表達(dá)水平，分析其表達(dá)差異，并通過(guò)Pearson相關(guān)分析探討它們與WAPAL基因表達(dá)之間的相關(guān)性，確定與WAPAL基因調(diào)控關(guān)系密切的miRNA。miR-26b對(duì)WAPAL基因表達(dá)的調(diào)控作用研究：根據(jù)miR-26b的成熟序列，設(shè)計(jì)并合成miR-26b模擬物和陰性對(duì)照，構(gòu)建miR-26b真核表達(dá)載體。將構(gòu)建好的載體及陰性對(duì)照分別轉(zhuǎn)染至宮頸癌細(xì)胞系（如SiHa、HeLa等），通過(guò)熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染后，采用qRT-PCR和蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)分別檢測(cè)WAPAL基因mRNA和蛋白水平的表達(dá)變化，明確miR-26b對(duì)WAPAL基因表達(dá)的調(diào)控作用。miR-26b調(diào)控WAPAL基因表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響：運(yùn)用細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（如CCK-8法、EdU法）、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)（如AnnexinV-FITC/PI雙染法、TUNEL法）、細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)（如Transwell小室實(shí)驗(yàn)、劃痕愈合實(shí)驗(yàn)）等方法，研究miR-26b調(diào)控WAPAL基因表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為的影響。進(jìn)一步通過(guò)裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)，在體內(nèi)驗(yàn)證miR-26b對(duì)宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用，深入探討其在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制。1.3研究方法與技術(shù)路線1.3.1研究方法標(biāo)本采集：收集[醫(yī)院名稱]婦科20[起始年份]-20[結(jié)束年份]期間行手術(shù)切除的宮頸癌組織標(biāo)本[X]例，同時(shí)選取相應(yīng)的癌旁正常宮頸組織標(biāo)本作為對(duì)照。所有標(biāo)本均經(jīng)病理確診，患者術(shù)前未接受放療、化療及其他抗腫瘤治療。詳細(xì)記錄患者的年齡、臨床分期、病理類(lèi)型、病理分級(jí)等臨床病理資料。免疫組化（IHC）檢測(cè)：采用免疫組化SP法檢測(cè)WAPAL蛋白在宮頸癌組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變組織（CIN）及正常宮頸組織中的表達(dá)情況。具體步驟如下：將石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，進(jìn)行抗原修復(fù)，3%過(guò)氧化氫孵育以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，山羊血清封閉，加入一抗（兔抗人WAPAL多克隆抗體）4℃孵育過(guò)夜，次日加入二抗（羊抗兔IgG）室溫孵育，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。結(jié)果判斷：以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性染色，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比及染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10%為陰性（-），10%-50%為弱陽(yáng)性（+），51%-80%為中度陽(yáng)性（++），＞80%為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)：使用Trizol試劑提取宮頸癌組織和正常宮頸組織中的總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，運(yùn)用SYBRGreen熒光染料法進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，檢測(cè)WAPAL基因mRNA及miR-15a、miR-26b、miR-200b的表達(dá)水平。內(nèi)參基因分別為GAPDH（用于WAPAL基因mRNA檢測(cè)）和U6（用于miRNA檢測(cè)）。引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中相關(guān)基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，引物由[公司名稱]合成。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性[預(yù)變性時(shí)間]，然后95℃變性[變性時(shí)間]，60℃退火[退火時(shí)間]，72℃延伸[延伸時(shí)間]，共[循環(huán)次數(shù)]個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。HPV分型檢測(cè)：采用基因芯片或PCR-RFLP等方法對(duì)宮頸病變組織進(jìn)行HPV分型檢測(cè)。以提取的組織DNA為模板，針對(duì)HPV各型別的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物與基因芯片上的探針進(jìn)行雜交，通過(guò)掃描芯片讀取結(jié)果，確定HPV感染的型別；或?qū)CR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切，根據(jù)酶切片段的大小進(jìn)行HPV分型。生物信息學(xué)分析：運(yùn)用生物信息學(xué)工具（如TargetScan、miRanda、PicTar等）預(yù)測(cè)WAPAL基因的靶miRNA，分析miRNA與WAPAL基因3′UTR的互補(bǔ)配對(duì)情況及結(jié)合自由能，篩選出可能的靶miRNA。同時(shí)，對(duì)預(yù)測(cè)得到的靶miRNA進(jìn)行功能注釋和信號(hào)通路富集分析，初步了解其在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的潛在作用機(jī)制。細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：選擇宮頸癌細(xì)胞系SiHa、HeLa等，在含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)miR-26b的成熟序列，設(shè)計(jì)并合成miR-26b模擬物和陰性對(duì)照，采用脂質(zhì)體Lipofectamine2000將其轉(zhuǎn)染至宮頸癌細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染前24h，將細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按照脂質(zhì)體說(shuō)明書(shū)操作，將miR-26b模擬物或陰性對(duì)照與脂質(zhì)體混合，室溫孵育[孵育時(shí)間]后加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，繼續(xù)培養(yǎng)[培養(yǎng)時(shí)間]后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測(cè)：收集轉(zhuǎn)染后的宮頸癌細(xì)胞，加入RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取適量蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉，加入一抗（兔抗人WAPAL多克隆抗體、鼠抗人β-actin單克隆抗體）4℃孵育過(guò)夜，次日加入相應(yīng)的二抗（羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG）室溫孵育，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，使用凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析條帶灰度值，以β-actin為內(nèi)參，計(jì)算WAPAL蛋白的相對(duì)表達(dá)量。細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：采用CCK-8法或EdU法檢測(cè)miR-26b調(diào)控WAPAL基因表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖能力的影響。CCK-8法：將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于96孔板中，每組設(shè)置[復(fù)孔數(shù)]個(gè)復(fù)孔，分別于培養(yǎng)24h、48h、72h后，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育[孵育時(shí)間]，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（OD）值，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。EdU法：按照EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于24孔板中，培養(yǎng)[培養(yǎng)時(shí)間]后，加入EdU工作液繼續(xù)孵育[孵育時(shí)間]，固定、通透、染色后，在熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)EdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)：運(yùn)用AnnexinV-FITC/PI雙染法或TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。AnnexinV-FITC/PI雙染法：收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌，加入AnnexinV-FITC和PI染色液，室溫避光孵育[孵育時(shí)間]，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。TUNEL法：按照TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，將細(xì)胞固定、通透后，加入TdT酶和熒光素標(biāo)記的dUTP，37℃孵育[孵育時(shí)間]，在熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)：采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)或劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。Transwell小室實(shí)驗(yàn)：將Transwell小室置于24孔板中，上室加入無(wú)血清培養(yǎng)基重懸的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。對(duì)于侵襲實(shí)驗(yàn)，上室預(yù)先鋪Matrigel基質(zhì)膠。培養(yǎng)[培養(yǎng)時(shí)間]后，取出小室，擦去上室未遷移或侵襲的細(xì)胞，用結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下計(jì)數(shù)遷移或侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞融合成單層后，用200μL移液器槍頭在細(xì)胞層上劃一條直線，用PBS沖洗掉劃下的細(xì)胞，加入無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別于0h、24h、48h在顯微鏡下觀察并拍照，測(cè)量劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移率。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)：選取4-6周齡的BALB/c裸鼠，將轉(zhuǎn)染miR-26b模擬物或陰性對(duì)照的宮頸癌細(xì)胞（1×10?個(gè)/只）接種于裸鼠右側(cè)腋下。定期觀察裸鼠的生長(zhǎng)狀態(tài)和腫瘤生長(zhǎng)情況，用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，處死裸鼠，取出腫瘤組織，稱重并進(jìn)行病理分析，觀察腫瘤的形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化，檢測(cè)WAPAL基因及相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。1.3.2技術(shù)路線本研究的技術(shù)路線如圖1所示：臨床標(biāo)本采集：收集宮頸癌組織及癌旁正常組織標(biāo)本，記錄臨床病理資料。WAPAL基因表達(dá)及HPV感染檢測(cè)：免疫組化檢測(cè)WAPAL蛋白表達(dá)。qRT-PCR檢測(cè)WAPAL基因mRNA表達(dá)?；蛐酒騊CR-RFLP法進(jìn)行HPV分型檢測(cè)。靶miRNA預(yù)測(cè)與表達(dá)分析：生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè)WAPAL基因的靶miRNA。qRT-PCR檢測(cè)miR-15a、miR-26b、miR-200b在宮頸癌組織中的表達(dá)。分析miRNA與WAPAL基因表達(dá)的相關(guān)性。miR-26b真核表達(dá)載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)染：設(shè)計(jì)并合成miR-26b模擬物和陰性對(duì)照。構(gòu)建miR-26b真核表達(dá)載體。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將載體轉(zhuǎn)染至宮頸癌細(xì)胞。細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)：qRT-PCR和Westernblot檢測(cè)WAPAL基因mRNA和蛋白表達(dá)變化。CCK-8法或EdU法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力。AnnexinV-FITC/PI雙染法或TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。Transwell小室實(shí)驗(yàn)或劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力。動(dòng)物水平實(shí)驗(yàn)：裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。數(shù)據(jù)分析與結(jié)果討論：對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，總結(jié)研究結(jié)果，討論WAPAL基因及其靶miRNA在宮頸癌中的作用及機(jī)制。[此處插入技術(shù)路線圖]通過(guò)以上研究方法和技術(shù)路線，本研究將系統(tǒng)地探討WAPAL基因及其靶miRNA在宮頸癌中的作用及分子機(jī)制，為宮頸癌的診斷和治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。二、WAPAL基因與microRNA的相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1WAPAL基因概述WAPAL基因，全稱為wingsapart-likeproteinhomolog，又被稱為FOE（FriendofEBNA2protein）或KIAA0261。其基因定位于染色體10q23.2，屬于蛋白編碼基因。WAPAL基因編碼的蛋白質(zhì)是一種與黏連蛋白（cohesin）相關(guān)的重要因子，在細(xì)胞的多種生理過(guò)程中發(fā)揮著不可或缺的作用。從基因結(jié)構(gòu)上看，WAPAL基因包含多個(gè)外顯子和內(nèi)含子，其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)為轉(zhuǎn)錄出具有特定功能的mRNA提供了基礎(chǔ)。通過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程，最終形成相對(duì)分子量約為160KD的WAPAL蛋白。該蛋白含有多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域賦予了WAPAL蛋白獨(dú)特的生物學(xué)活性，使其能夠參與到細(xì)胞內(nèi)的多種分子相互作用中。在細(xì)胞周期進(jìn)程中，WAPAL基因發(fā)揮著關(guān)鍵作用，尤其是在有絲分裂過(guò)程中的姐妹染色單體分離階段。姐妹染色單體的正確分離是保證細(xì)胞遺傳物質(zhì)穩(wěn)定傳遞的基礎(chǔ)，而WAPAL蛋白在這一過(guò)程中扮演著核心角色。它能夠與黏連蛋白復(fù)合物相互作用，參與黏連蛋白從染色質(zhì)上的卸載過(guò)程，從而促進(jìn)姐妹染色單體的分離。在細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂后期時(shí)，WAPAL蛋白被激活，通過(guò)一系列的分子機(jī)制，促使黏連蛋白從姐妹染色單體之間解離，使得姐妹染色單體能夠在紡錘體微管的牽引下，準(zhǔn)確地分離到兩個(gè)子代細(xì)胞中。如果WAPAL基因功能異常，導(dǎo)致WAPAL蛋白表達(dá)缺失或活性降低，將可能引起姐妹染色單體分離異常，進(jìn)而導(dǎo)致染色體數(shù)目異常和非整倍體的產(chǎn)生。非整倍體的細(xì)胞往往具有生長(zhǎng)和增殖異常的特性，這與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究表明，WAPAL基因的異常表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在緊密聯(lián)系。在宮頸癌中，已有大量研究證實(shí)WAPAL基因呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。例如，對(duì)宮頸癌組織和正常宮頸組織進(jìn)行對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中WAPAL基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著高于正常組織。而且，WAPAL基因的表達(dá)水平與宮頸癌的臨床分期、病理分級(jí)呈正相關(guān)，即隨著臨床分期的進(jìn)展和病理分級(jí)的升高，WAPAL基因的表達(dá)水平也隨之升高。這提示W(wǎng)APAL基因可能作為一個(gè)癌基因參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，其高表達(dá)可能促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為。此外，在其他多種腫瘤中，如乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌等，也觀察到WAPAL基因的異常表達(dá)，且與腫瘤的預(yù)后不良相關(guān)。這些研究結(jié)果表明，WAPAL基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用，可能成為腫瘤診斷、治療和預(yù)后評(píng)估的潛在靶點(diǎn)。2.2microRNA概述MicroRNA（miRNA）是一類(lèi)內(nèi)生的、長(zhǎng)度約21-23個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小RNA分子，在真核生物中廣泛存在。1993年，科學(xué)家VictorAmbros和GaryRuvkun等人在秀麗隱桿線蟲(chóng)中首次發(fā)現(xiàn)了lin-4，這是第一個(gè)被鑒定出來(lái)的miRNA。當(dāng)時(shí)研究發(fā)現(xiàn)lin-4并不編碼蛋白質(zhì)，卻能通過(guò)與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)，對(duì)基因表達(dá)起到調(diào)控作用，這一發(fā)現(xiàn)開(kāi)啟了miRNA研究的新篇章。隨后，在2000年，GaryRuvkun的團(tuán)隊(duì)又在線蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)了另一條miRNA——let-7，并且發(fā)現(xiàn)let-7在果蠅、斑馬魚(yú)、海膽和人類(lèi)等多種生物中都有表達(dá)，這進(jìn)一步證明了miRNA介導(dǎo)的基因調(diào)控機(jī)制具有普遍性。此后，越來(lái)越多的miRNA被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)和研究，截至目前，根據(jù)miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)的統(tǒng)計(jì)，人類(lèi)基因組中已鑒定出的miRNA前體有1982條，成熟miRNA有2694條。從結(jié)構(gòu)上看，miRNA基因通常位于基因組的非編碼區(qū)域，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本（pri-miRNA），長(zhǎng)度可達(dá)數(shù)百至數(shù)千個(gè)核苷酸。pri-miRNA在細(xì)胞核內(nèi)首先被Ⅲ型核酸內(nèi)切酶Drosha和其輔助因子DGCR8識(shí)別并切割，在距離莖環(huán)結(jié)構(gòu)分界點(diǎn)約11個(gè)堿基處進(jìn)行剪切，從而產(chǎn)生長(zhǎng)度約為70-100個(gè)核苷酸的發(fā)夾狀前體miRNA（pre-miRNA）。pre-miRNA隨后通過(guò)核孔轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，在另一種Ⅲ型核酸內(nèi)切酶Dicer和多種蛋白的作用下，進(jìn)一步被切割成雙鏈miRNA。雙鏈miRNA會(huì)與包含Argonaute蛋白的蛋白質(zhì)復(fù)合體結(jié)合，形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC），又稱miRNP（microribonucleoprotein）。在RISC中，miRNA雙鏈中5′-端堿基配對(duì)穩(wěn)定性較差的鏈會(huì)被保留，形成成熟的miRNA，而另一條鏈則會(huì)迅速降解。miRNA的作用機(jī)制主要是通過(guò)與靶mRNA的3′非翻譯區(qū)（3′UTR）特異性堿基配對(duì)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控。當(dāng)miRNA與靶mRNA的互補(bǔ)程度較高時(shí)，如在植物中大部分miRNA-mRNA的配對(duì)情況，miRNA會(huì)介導(dǎo)RISC對(duì)靶mRNA進(jìn)行切割，導(dǎo)致靶mRNA降解，從而直接降低靶mRNA的水平；而當(dāng)miRNA與靶mRNA的互補(bǔ)程度較低時(shí)，如在動(dòng)物中大部分miRNA-mRNA的配對(duì)情況，miRNA主要通過(guò)抑制靶mRNA的翻譯過(guò)程，阻礙蛋白質(zhì)的合成，來(lái)調(diào)控基因表達(dá)，且這一過(guò)程并不影響靶mRNA的穩(wěn)定性。此外，單個(gè)miRNA可以通過(guò)與多個(gè)靶mRNA的3′UTR相互作用，調(diào)控多個(gè)不同基因的表達(dá)；反之，單個(gè)基因也可以被多個(gè)miRNA共同調(diào)節(jié)，這種復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)使得miRNA在細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著精細(xì)且廣泛的作用，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、代謝、應(yīng)激反應(yīng)等多種生物學(xué)過(guò)程。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，miRNA扮演著極為重要的角色。大量研究表明，多種miRNA在腫瘤組織中的表達(dá)與正常組織相比存在顯著差異。一些miRNA可以作為癌基因發(fā)揮作用，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。例如，miR-21在多種腫瘤如乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌、宮頸癌等中均呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。miR-21通過(guò)靶向抑制多個(gè)抑癌基因，如PTEN、PDCD4等的表達(dá)，激活下游的PI3K/AKT、MAPK等信號(hào)通路，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡。另一方面，一些miRNA則具有抑癌基因的功能，能夠抑制腫瘤的發(fā)展。以miR-143為例，在宮頸癌、胃癌、肝癌等多種腫瘤中，miR-143的表達(dá)水平明顯降低。miR-143通過(guò)靶向作用于一些癌基因如KRAS、MAPK1等，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。此外，miRNA還與腫瘤的耐藥性密切相關(guān)。例如，在宮頸癌的化療過(guò)程中，miR-21的高表達(dá)會(huì)導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑等化療藥物產(chǎn)生耐藥性，其機(jī)制可能是通過(guò)抑制PTEN的表達(dá)，激活PI3K/AKT信號(hào)通路，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的抗凋亡能力和DNA損傷修復(fù)能力；而miR-34a的低表達(dá)則與宮頸癌對(duì)放療的抵抗有關(guān)，miR-34a可以通過(guò)靶向調(diào)控SIRT1等基因，影響腫瘤細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞周期進(jìn)程，進(jìn)而影響放療的敏感性。這些研究表明，miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥等各個(gè)環(huán)節(jié)都發(fā)揮著關(guān)鍵作用，有望成為腫瘤診斷、治療和預(yù)后評(píng)估的重要生物標(biāo)志物和潛在靶點(diǎn)。2.3WAPAL基因與microRNA在腫瘤中的研究現(xiàn)狀近年來(lái)，WAPAL基因與microRNA在腫瘤領(lǐng)域的研究取得了顯著進(jìn)展，為深入理解腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了新的視角。在WAPAL基因與腫瘤的研究方面，大量研究表明WAPAL基因在多種腫瘤中呈現(xiàn)異常表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。在乳腺癌中，研究發(fā)現(xiàn)WAPAL基因的高表達(dá)與腫瘤的侵襲性和不良預(yù)后相關(guān)。通過(guò)對(duì)乳腺癌細(xì)胞系的研究發(fā)現(xiàn)，敲低WAPAL基因的表達(dá)可以抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，其機(jī)制可能與影響細(xì)胞周期調(diào)控和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程有關(guān)。在肺癌中，WAPAL基因的表達(dá)水平也顯著高于正常肺組織，且與肺癌的分期和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。進(jìn)一步研究表明，WAPAL基因通過(guò)調(diào)控黏連蛋白的功能，影響染色體的穩(wěn)定性和基因表達(dá)，從而促進(jìn)肺癌細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移。此外，在結(jié)直腸癌、卵巢癌、肝癌等多種腫瘤中，也都觀察到WAPAL基因的異常表達(dá)及其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用。這些研究結(jié)果表明，WAPAL基因可能成為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)，通過(guò)靶向抑制WAPAL基因的表達(dá)或功能，有望開(kāi)發(fā)出新型的腫瘤治療策略。在microRNA與腫瘤的研究方面，隨著對(duì)miRNA功能的深入了解，發(fā)現(xiàn)眾多miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、診斷和治療中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。例如，miR-125b在多種腫瘤中被報(bào)道為癌基因。在乳腺癌中，miR-125b高表達(dá)，它通過(guò)靶向抑制抑癌基因如BRCA1等的表達(dá)，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡。在肺癌中，miR-125b也參與了腫瘤細(xì)胞的耐藥過(guò)程，通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，降低肺癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。相反，miR-34a在腫瘤中常發(fā)揮抑癌基因的作用。在結(jié)直腸癌中，miR-34a的表達(dá)水平明顯降低，其過(guò)表達(dá)可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。機(jī)制研究表明，miR-34a通過(guò)靶向調(diào)控多個(gè)癌基因如SIRT1、c-Myc等，影響細(xì)胞周期進(jìn)程和凋亡信號(hào)通路，從而發(fā)揮抑癌作用。此外，miRNA還在腫瘤的診斷和預(yù)后評(píng)估中具有重要價(jià)值。一些miRNA在腫瘤患者的血清、血漿、尿液等體液中呈現(xiàn)特異性表達(dá)，可作為潛在的腫瘤生物標(biāo)志物用于腫瘤的早期診斷和病情監(jiān)測(cè)。例如，血清中的miR-21在多種腫瘤患者中均顯著升高，可作為腫瘤診斷的輔助指標(biāo)；而miR-155的高表達(dá)與腫瘤患者的不良預(yù)后相關(guān)，可用于評(píng)估腫瘤患者的預(yù)后情況。盡管WAPAL基因與microRNA在腫瘤研究中已取得了上述重要進(jìn)展，但在宮頸癌中的研究仍存在諸多不足。一方面，對(duì)于WAPAL基因在宮頸癌中的具體作用機(jī)制尚未完全明確。雖然已知WAPAL基因在宮頸癌組織中高表達(dá)且與腫瘤的惡性程度相關(guān)，但它如何通過(guò)調(diào)控下游基因或信號(hào)通路來(lái)影響宮頸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，以及與其他腫瘤相關(guān)分子之間的相互作用關(guān)系仍有待深入研究。另一方面，關(guān)于WAPAL基因與microRNA在宮頸癌中的相互調(diào)控關(guān)系研究較少。雖然通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)了一些可能靶向WAPAL基因的miRNA，但這些miRNA對(duì)WAPAL基因表達(dá)調(diào)控的具體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和分子機(jī)制研究還十分有限。此外，目前對(duì)于miRNA在宮頸癌中的研究主要集中在單個(gè)miRNA的功能和作用機(jī)制上，而對(duì)于多個(gè)miRNA之間以及miRNA與其他分子（如mRNA、lncRNA等）之間形成的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用研究相對(duì)較少。深入研究這些問(wèn)題，將有助于全面揭示宮頸癌的發(fā)病機(jī)制，為宮頸癌的診斷和治療提供更堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)和更有效的策略。三、WAPAL基因在宮頸癌中的表達(dá)及與HPV感染的關(guān)系3.1材料與方法3.1.1標(biāo)本來(lái)源收集[醫(yī)院名稱]婦科20[起始年份]-20[結(jié)束年份]期間行手術(shù)切除的宮頸癌組織標(biāo)本[X]例，患者年齡范圍為[最小年齡]-[最大年齡]歲，平均年齡（[平均年齡]±[標(biāo)準(zhǔn)差]）歲。所有標(biāo)本均經(jīng)病理確診，且患者術(shù)前未接受放療、化療及其他抗腫瘤治療。同時(shí)，選取相應(yīng)的癌旁正常宮頸組織標(biāo)本[X]例作為對(duì)照，這些癌旁組織距離腫瘤邊緣至少[距離數(shù)值]cm，經(jīng)病理檢查證實(shí)為正常組織。詳細(xì)記錄患者的臨床病理資料，包括年齡、臨床分期（按照國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）20[分期版本]分期標(biāo)準(zhǔn)）、病理類(lèi)型（如鱗癌、腺癌、腺鱗癌等）、病理分級(jí)（高分化、中分化、低分化）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等。3.1.2免疫組化檢測(cè)WAPAL蛋白表達(dá)采用免疫組化SP法檢測(cè)WAPAL蛋白在宮頸癌組織、宮頸上皮內(nèi)瘤變組織（CIN）及正常宮頸組織中的表達(dá)情況。具體操作步驟如下：切片準(zhǔn)備：將石蠟包埋的組織標(biāo)本切成厚度為[切片厚度數(shù)值]μm的切片，將切片置于載玻片上，60℃烤箱中烘烤[烘烤時(shí)間數(shù)值]h，使切片牢固附著在載玻片上。脫蠟與水化：將切片依次放入二甲苯I、二甲苯II中各浸泡[浸泡時(shí)間數(shù)值]min，進(jìn)行脫蠟處理；然后將切片依次通過(guò)100%酒精I(xiàn)、100%酒精I(xiàn)I各[浸泡時(shí)間數(shù)值]min，95%酒精[浸泡時(shí)間數(shù)值]min，85%酒精[浸泡時(shí)間數(shù)值]min，75%酒精[浸泡時(shí)間數(shù)值]min進(jìn)行梯度水化，最后用蒸餾水沖洗2次，每次[沖洗時(shí)間數(shù)值]min?？乖迯?fù)：將切片置于盛有0.01M檸檬酸鈉緩沖液（pH6.0）的容器中，采用微波修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù)。將容器放入微波爐中，高火加熱至沸騰，然后中火維持[維持時(shí)間數(shù)值]min，自然冷卻至室溫，用PBS沖洗3次，每次[沖洗時(shí)間數(shù)值]min。滅活內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶：將切片浸入3%的H?O?溶液中，室溫孵育[孵育時(shí)間數(shù)值]min，以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化氫酶，然后用PBST沖洗3次，每次[沖洗時(shí)間數(shù)值]min。封閉：滴加用PBST稀釋的5%山羊血清封閉液，37℃濕盒中孵育[孵育時(shí)間數(shù)值]h，以減少非特異性染色。孵育一抗：甩去封閉液，不洗，滴加兔抗人WAPAL多克隆抗體（按照抗體說(shuō)明書(shū)推薦的稀釋比例用5%山羊血清稀釋?zhuān)?℃濕盒中孵育過(guò)夜。復(fù)溫與清洗：將切片從4℃冰箱中取出，37℃復(fù)溫[復(fù)溫時(shí)間數(shù)值]min，然后用PBST沖洗3次，每次[沖洗時(shí)間數(shù)值]min。孵育二抗：滴加生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗（按照抗體說(shuō)明書(shū)推薦的稀釋比例用5%山羊血清稀釋?zhuān)?7℃濕盒中孵育[孵育時(shí)間數(shù)值]min，然后用PBST沖洗3次，每次[沖洗時(shí)間數(shù)值]min。顯色：滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下觀察顯色情況，當(dāng)陽(yáng)性部位呈現(xiàn)棕黃色時(shí)，立即用蒸餾水沖洗終止顯色。復(fù)染：將切片用蘇木精復(fù)染[復(fù)染時(shí)間數(shù)值]min，然后用自來(lái)水沖洗，再用1%鹽酸酒精分化[分化時(shí)間數(shù)值]s，最后用自來(lái)水沖洗返藍(lán)。脫水、透明與封片：將切片依次通過(guò)75%酒精、85%酒精、95%酒精、100%酒精I(xiàn)、100%酒精I(xiàn)I各[浸泡時(shí)間數(shù)值]min進(jìn)行脫水，然后放入二甲苯I、二甲苯II中各浸泡[浸泡時(shí)間數(shù)值]min進(jìn)行透明，最后用中性樹(shù)膠封片。結(jié)果判斷：以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性染色。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比及染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜10%為陰性（-），10%-50%為弱陽(yáng)性（+），51%-80%為中度陽(yáng)性（++），＞80%為強(qiáng)陽(yáng)性（+++）。3.1.3實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)WAPAL基因mRNA表達(dá)使用Trizol試劑提取宮頸癌組織和正常宮頸組織中的總RNA，具體步驟如下：組織勻漿：將新鮮的組織標(biāo)本剪成小塊，放入含有1mlTrizol試劑的勻漿器中，充分勻漿至組織完全破碎。分離RNA：將勻漿液轉(zhuǎn)移至離心管中，室溫靜置[靜置時(shí)間數(shù)值]min，使核酸蛋白復(fù)合物完全解離。然后加入0.2ml氯仿，蓋緊管蓋，劇烈振蕩15s，室溫靜置[靜置時(shí)間數(shù)值]min，4℃下12000rpm離心15min。離心后，混合液體分為三層，上層無(wú)色水相含有RNA，中層為白色蛋白層，下層為紅色酚氯仿相。小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中。沉淀RNA：向水相中加入等體積的異丙醇，混勻，室溫靜置[靜置時(shí)間數(shù)值]min，4℃下12000rpm離心10min，此時(shí)RNA沉淀在管底部形成膠狀沉淀。清洗RNA沉淀：棄去上清液，加入1ml75%乙醇（用DEPC水配制），輕輕顛倒離心管，使RNA沉淀懸浮，4℃下7500rpm離心5min。棄去上清液，重復(fù)清洗一次。干燥RNA沉淀：將離心管置于室溫，使RNA沉淀自然干燥5-10min，注意不要過(guò)度干燥，以免RNA難以溶解。溶解RNA沉淀：向離心管中加入適量的無(wú)RNA酶的水，用移液器反復(fù)吹打，使RNA沉淀完全溶解，將RNA溶液保存于-80℃?zhèn)溆?。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，具體反應(yīng)體系和條件按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。以cDNA為模板，運(yùn)用SYBRGreen熒光染料法進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，檢測(cè)WAPAL基因mRNA的表達(dá)水平。內(nèi)參基因選用GAPDH。引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中WAPAL基因和GAPDH基因序列，利用PrimerPremier5.0軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，引物由[公司名稱]合成。WAPAL基因上游引物序列為[上游引物序列]，下游引物序列為[下游引物序列]；GAPDH基因上游引物序列為[上游引物序列]，下游引物序列為[下游引物序列]。反應(yīng)體系（20μl）：SYBRGreenMasterMix10μl，上游引物（10μM）0.8μl，下游引物（10μM）0.8μl，cDNA模板2μl，ddH?O6.4μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性[預(yù)變性時(shí)間數(shù)值]min，然后95℃變性[變性時(shí)間數(shù)值]s，60℃退火[退火時(shí)間數(shù)值]s，72℃延伸[延伸時(shí)間數(shù)值]s，共[循環(huán)次數(shù)數(shù)值]個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算WAPAL基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。3.1.4HPV分型檢測(cè)采用基因芯片法對(duì)宮頸病變組織進(jìn)行HPV分型檢測(cè)。具體步驟如下：DNA提?。菏褂肈NA提取試劑盒提取宮頸病變組織中的DNA，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。提取的DNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度和純度，A260/A280比值在1.8-2.0之間的DNA樣品用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。PCR擴(kuò)增：以提取的DNA為模板，針對(duì)HPV各型別的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系（25μl）：10×PCR緩沖液2.5μl，MgCl?（25mM）2μl，dNTPs（10mM）0.5μl，上游引物（10μM）0.5μl，下游引物（10μM）0.5μl，TaqDNA聚合酶（5U/μl）0.2μl，DNA模板2μl，ddH?O16.8μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性[預(yù)變性時(shí)間數(shù)值]min，然后95℃變性[變性時(shí)間數(shù)值]s，55℃退火[退火時(shí)間數(shù)值]s，72℃延伸[延伸時(shí)間數(shù)值]s，共[循環(huán)次數(shù)數(shù)值]個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸[延伸時(shí)間數(shù)值]min?；蛐酒s交：將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與基因芯片上的探針進(jìn)行雜交。將基因芯片放入雜交儀中，加入適量的雜交液和擴(kuò)增產(chǎn)物，按照雜交儀的操作程序進(jìn)行雜交，雜交溫度為[雜交溫度數(shù)值]℃，雜交時(shí)間為[雜交時(shí)間數(shù)值]h。芯片掃描與結(jié)果分析：雜交結(jié)束后，用洗滌液沖洗芯片，去除未雜交的物質(zhì)。然后將芯片放入芯片掃描儀中進(jìn)行掃描，讀取芯片上的信號(hào)，根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度和位置確定HPV感染的型別。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.2.1WAPAL蛋白在宮頸癌組織中的表達(dá)免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，WAPAL蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核，在正常宮頸組織、CIN組織及宮頸癌組織中的表達(dá)存在顯著差異（圖2）。在正常宮頸組織中，WAPAL蛋白陽(yáng)性表達(dá)率較低，僅為[正常宮頸組織陽(yáng)性表達(dá)率數(shù)值]%，且染色強(qiáng)度多為陰性或弱陽(yáng)性，陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于宮頸上皮的基底層細(xì)胞，表現(xiàn)為細(xì)胞核內(nèi)呈現(xiàn)淡棕黃色或幾乎無(wú)明顯染色。在CIN組織中，隨著病變程度的加重，WAPAL蛋白陽(yáng)性表達(dá)率逐漸升高。CINⅠ組織中WAPAL蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為[CINⅠ陽(yáng)性表達(dá)率數(shù)值]%，CINⅡ組織中為[CINⅡ陽(yáng)性表達(dá)率數(shù)值]%，CINⅢ組織中為[CINⅢ陽(yáng)性表達(dá)率數(shù)值]%，染色強(qiáng)度也逐漸增強(qiáng)，從弱陽(yáng)性到中度陽(yáng)性不等，陽(yáng)性細(xì)胞在宮頸上皮中的分布范圍逐漸擴(kuò)大，從基底層向中上層擴(kuò)展。在宮頸癌組織中，WAPAL蛋白陽(yáng)性表達(dá)率顯著增高，達(dá)到[宮頸癌組織陽(yáng)性表達(dá)率數(shù)值]%，且染色強(qiáng)度多為中度陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性，細(xì)胞核內(nèi)呈現(xiàn)深棕黃色，陽(yáng)性細(xì)胞幾乎遍布整個(gè)癌組織，尤其是在癌巢的中心區(qū)域和浸潤(rùn)前沿，陽(yáng)性表達(dá)更為明顯。[此處插入免疫組化結(jié)果圖，圖中應(yīng)清晰顯示正常宮頸組織、CIN組織及宮頸癌組織中WAPAL蛋白的表達(dá)情況，不同組織的圖片應(yīng)標(biāo)注明確，陽(yáng)性染色區(qū)域應(yīng)清晰可辨]對(duì)不同組織中WAPAL蛋白陽(yáng)性表達(dá)率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用χ2檢驗(yàn)，結(jié)果顯示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果表明，正常宮頸組織與CINⅠ組織、CINⅡ組織、CINⅢ組織及宮頸癌組織之間，以及不同級(jí)別CIN組織之間，WAPAL蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均存在顯著差異（P<0.05），說(shuō)明隨著宮頸病變程度的加重，WAPAL蛋白的表達(dá)逐漸升高。3.2.2WAPAL基因mRNA在宮頸癌組織中的表達(dá)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，相對(duì)于正常宮頸組織，宮頸癌組織中WAPAL基因mRNA呈顯著高表達(dá)（圖3）。以正常宮頸組織中WAPAL基因mRNA的表達(dá)量為1，宮頸癌組織中WAPAL基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量為[宮頸癌組織mRNA相對(duì)表達(dá)量數(shù)值]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。[此處插入實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果柱狀圖，橫坐標(biāo)為正常宮頸組織和宮頸癌組織，縱坐標(biāo)為WAPAL基因mRNA相對(duì)表達(dá)量，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，通過(guò)柱狀圖可直觀對(duì)比兩組間的表達(dá)差異]進(jìn)一步分析WAPAL基因mRNA表達(dá)與宮頸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系，結(jié)果顯示，WAPAL基因mRNA表達(dá)與宮頸癌的臨床分期、病理分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P<0.05）。在臨床分期方面，Ⅰ期宮頸癌組織中WAPAL基因mRNA相對(duì)表達(dá)量為[Ⅰ期相對(duì)表達(dá)量數(shù)值]，Ⅱ期為[Ⅱ期相對(duì)表達(dá)量數(shù)值]，Ⅲ期為[Ⅲ期相對(duì)表達(dá)量數(shù)值]，隨著臨床分期的進(jìn)展，WAPAL基因mRNA表達(dá)水平逐漸升高；在病理分級(jí)方面，高分化宮頸癌組織中WAPAL基因mRNA相對(duì)表達(dá)量為[高分化相對(duì)表達(dá)量數(shù)值]，中分化為[中分化相對(duì)表達(dá)量數(shù)值]，低分化為[低分化相對(duì)表達(dá)量數(shù)值]，WAPAL基因mRNA表達(dá)與病理分級(jí)呈正相關(guān)；在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌組織中WAPAL基因mRNA相對(duì)表達(dá)量為[有轉(zhuǎn)移相對(duì)表達(dá)量數(shù)值]，明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織（相對(duì)表達(dá)量為[無(wú)轉(zhuǎn)移相對(duì)表達(dá)量數(shù)值]）。3.2.3HPV感染與WAPAL基因表達(dá)的關(guān)系HPV分型檢測(cè)結(jié)果顯示，在[X]例宮頸癌組織標(biāo)本中，HPV陽(yáng)性率為[HPV陽(yáng)性率數(shù)值]%，其中高危型HPV感染占[高危型HPV感染比例數(shù)值]%，低危型HPV感染占[低危型HPV感染比例數(shù)值]%。高危型HPV中，以HPV16和HPV18感染最為常見(jiàn)，分別占[HPV16感染比例數(shù)值]%和[HPV18感染比例數(shù)值]%。分析HPV感染類(lèi)型與WAPAL基因蛋白表達(dá)的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高危型HPV16/18感染的宮頸病變組織中WAPAL基因蛋白的表達(dá)顯著高于低危型HPV6/11感染及HPV陰性者（P<0.05）（圖4）。在高危型HPV16/18感染的組織中，WAPAL蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為[高危型陽(yáng)性表達(dá)率數(shù)值]%，且染色強(qiáng)度多為中度陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性；而在低危型HPV6/11感染及HPV陰性的組織中，WAPAL蛋白陽(yáng)性表達(dá)率分別為[低危型陽(yáng)性表達(dá)率數(shù)值]%和[HPV陰性陽(yáng)性表達(dá)率數(shù)值]%，染色強(qiáng)度多為陰性和弱陽(yáng)性。[此處插入不同HPV感染類(lèi)型下WAPAL蛋白表達(dá)情況的柱狀圖或餅狀圖，直觀展示不同感染類(lèi)型與WAPAL蛋白表達(dá)的關(guān)系]同時(shí)，對(duì)HPV感染與WAPAL基因mRNA表達(dá)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，HPV陽(yáng)性的宮頸癌組織中WAPAL基因mRNA表達(dá)水平顯著高于HPV陰性組織（P<0.05），且高危型HPV感染組的WAPAL基因mRNA表達(dá)水平高于低危型HPV感染組（P<0.05）。這表明HPV感染，尤其是高危型HPV16/18感染，可能與WAPAL基因的高表達(dá)密切相關(guān)，共同參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。3.3結(jié)果討論本研究通過(guò)免疫組化和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，對(duì)WAPAL基因在宮頸癌組織中的表達(dá)及其與HPV感染的關(guān)系進(jìn)行了深入分析，結(jié)果顯示W(wǎng)APAL基因在宮頸癌組織中呈高表達(dá)，且與HPV感染密切相關(guān)。WAPAL基因在宮頸癌組織中的高表達(dá)具有重要的生物學(xué)意義。從細(xì)胞生物學(xué)角度來(lái)看，WAPAL基因參與姐妹染色單體分離過(guò)程，其高表達(dá)可能導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控異常，使細(xì)胞增殖失控。在本研究中，隨著宮頸病變程度的加重，從正常宮頸組織到CIN組織再到宮頸癌組織，WAPAL蛋白和mRNA的表達(dá)水平逐漸升高，且WAPAL基因mRNA表達(dá)與宮頸癌的臨床分期、病理分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。這表明WAPAL基因的高表達(dá)不僅促進(jìn)了宮頸癌細(xì)胞的增殖，還可能增強(qiáng)了癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。在臨床分期較晚、病理分級(jí)較高以及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的宮頸癌組織中，WAPAL基因的高表達(dá)更為明顯，提示W(wǎng)APAL基因可能作為評(píng)估宮頸癌惡性程度和預(yù)后的重要指標(biāo)。HPV感染，尤其是高危型HPV16/18感染，與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，這已是學(xué)界共識(shí)。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，高危型HPV16/18感染的宮頸病變組織中WAPAL基因蛋白和mRNA的表達(dá)顯著高于低危型HPV6/11感染及HPV陰性者。HPV病毒的致癌機(jī)制主要與其編碼的癌蛋白E6和E7有關(guān)。E6蛋白可與p53蛋白結(jié)合，導(dǎo)致p53蛋白降解，從而使細(xì)胞失去對(duì)DNA損傷的修復(fù)和凋亡調(diào)控能力；E7蛋白則與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白（Rb）結(jié)合，釋放轉(zhuǎn)錄因子E2F，促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期，加速細(xì)胞增殖。而WAPAL基因的高表達(dá)可能在HPV感染導(dǎo)致宮頸癌的過(guò)程中起到協(xié)同作用。HPV感染可能通過(guò)激活某些信號(hào)通路，上調(diào)WAPAL基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)宮頸上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。高危型HPV16/18感染后，病毒基因整合到宿主基因組中，可能引發(fā)一系列分子事件，導(dǎo)致WAPAL基因的表達(dá)調(diào)控失衡，使其表達(dá)水平升高。WAPAL基因的高表達(dá)又進(jìn)一步影響細(xì)胞周期、染色體穩(wěn)定性等，與HPV的致癌作用相互促進(jìn)，共同推動(dòng)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。綜上所述，本研究結(jié)果表明WAPAL基因的高表達(dá)和HPV感染在宮頸癌的發(fā)生中均起著重要作用，且二者之間存在密切關(guān)聯(lián)。WAPAL基因有望成為宮頸癌診斷、預(yù)后評(píng)估及治療的新靶點(diǎn)，深入研究WAPAL基因與HPV感染之間的相互作用機(jī)制，將為宮頸癌的防治提供更全面的理論依據(jù)和新的策略。后續(xù)研究可進(jìn)一步探討WAPAL基因高表達(dá)促進(jìn)宮頸癌發(fā)生發(fā)展的具體分子機(jī)制，以及針對(duì)WAPAL基因的靶向治療方法在宮頸癌治療中的應(yīng)用前景。四、WAPAL基因的靶microRNA生物信息學(xué)分析及在宮頸癌組織中的表達(dá)4.1生物信息學(xué)預(yù)測(cè)為了全面、準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)WAPAL基因的靶miRNA，本研究綜合運(yùn)用了多個(gè)權(quán)威的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)和分析軟件，包括TargetScan、miRanda和PicTar。這些工具基于不同的算法和原理，從多個(gè)角度對(duì)miRNA與WAPAL基因之間的潛在相互作用進(jìn)行預(yù)測(cè)，以提高預(yù)測(cè)結(jié)果的可靠性。TargetScan是一款廣泛應(yīng)用的miRNA靶基因預(yù)測(cè)工具，它主要通過(guò)搜索與miRNA種子區(qū)域（seedregion）互補(bǔ)配對(duì)的保守位點(diǎn)來(lái)識(shí)別潛在靶基因。在本研究中，將WAPAL基因的3′非翻譯區(qū)（3′UTR）序列輸入TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析。種子區(qū)域通常是指miRNA5′端的第2-8個(gè)核苷酸，這一段序列在miRNA與靶mRNA的相互作用中起著關(guān)鍵作用。TargetScan通過(guò)對(duì)大量物種的基因組序列進(jìn)行比對(duì)，尋找與miRNA種子區(qū)域互補(bǔ)且在進(jìn)化上保守的位點(diǎn)，以此預(yù)測(cè)靶基因。例如，當(dāng)miRNA的種子區(qū)域與WAPAL基因3′UTR上的某一段序列能夠形成穩(wěn)定的堿基配對(duì)時(shí)，該位點(diǎn)就被認(rèn)為是潛在的結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)應(yīng)的WAPAL基因可能是該miRNA的靶基因。miRanda則采用了更為復(fù)雜的算法，不僅考慮了miRNA與靶mRNA的堿基互補(bǔ)配對(duì)情況，還綜合分析了二者結(jié)合時(shí)的自由能變化。自由能是衡量分子穩(wěn)定性的一個(gè)重要指標(biāo)，在miRNA與靶mRNA結(jié)合過(guò)程中，自由能越低，說(shuō)明二者的結(jié)合越穩(wěn)定，相互作用的可能性也就越大。miRanda通過(guò)計(jì)算miRNA與WAPAL基因3′UTR結(jié)合時(shí)的自由能，篩選出自由能較低的配對(duì)組合，從而預(yù)測(cè)出可能的靶miRNA。同時(shí)，miRanda還考慮了結(jié)合位點(diǎn)的位置、序列保守性等因素，進(jìn)一步提高了預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。PicTar同樣是一款功能強(qiáng)大的miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件，它通過(guò)構(gòu)建一個(gè)復(fù)雜的數(shù)學(xué)模型，整合了多個(gè)物種的基因組信息、miRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)等多方面的信息，對(duì)miRNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。在對(duì)WAPAL基因進(jìn)行分析時(shí)，PicTar能夠綜合考慮這些不同來(lái)源的信息，從多個(gè)維度評(píng)估m(xù)iRNA與WAPAL基因之間的潛在聯(lián)系。例如，通過(guò)分析不同組織中miRNA和WAPAL基因的表達(dá)譜，若發(fā)現(xiàn)二者的表達(dá)呈現(xiàn)明顯的負(fù)相關(guān)或正相關(guān)趨勢(shì)，結(jié)合其他預(yù)測(cè)結(jié)果，就可以更有把握地判斷它們之間存在相互作用的可能性。經(jīng)過(guò)上述三種生物信息學(xué)工具的預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示miR-15a、miR-26b及miR-200b與WAPAL基因的3′UTR存在高度互補(bǔ)的序列，且在多個(gè)預(yù)測(cè)工具中均被識(shí)別為潛在的靶miRNA。具體來(lái)說(shuō)，在TargetScan的預(yù)測(cè)結(jié)果中，miR-15a、miR-26b及miR-200b的種子區(qū)域與WAPAL基因3′UTR上的特定序列具有良好的互補(bǔ)性，且這些互補(bǔ)位點(diǎn)在進(jìn)化上具有較高的保守性。在miRanda的分析中，這三種miRNA與WAPAL基因3′UTR結(jié)合時(shí)的自由能較低，表明它們之間能夠形成較為穩(wěn)定的相互作用。PicTar的預(yù)測(cè)結(jié)果也顯示，miR-15a、miR-26b及miR-200b與WAPAL基因在多個(gè)生物學(xué)信息維度上存在密切的關(guān)聯(lián)，進(jìn)一步支持了它們作為WAPAL基因靶miRNA的可能性?；谶@些綜合預(yù)測(cè)結(jié)果，本研究將miR-15a、miR-26b及miR-200b篩選出來(lái)，作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究的重點(diǎn)對(duì)象，以深入探究它們對(duì)WAPAL基因表達(dá)的調(diào)控作用及在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的潛在機(jī)制。4.2材料與方法4.2.1標(biāo)本來(lái)源收集[醫(yī)院名稱]婦科20[起始年份]-20[結(jié)束年份]期間行手術(shù)切除的宮頸癌組織標(biāo)本[X]例，患者年齡范圍為[最小年齡]-[最大年齡]歲，平均年齡（[平均年齡]±[標(biāo)準(zhǔn)差]）歲。所有標(biāo)本均經(jīng)病理確診，且患者術(shù)前未接受放療、化療及其他抗腫瘤治療。同時(shí)，選取相應(yīng)的癌旁正常宮頸組織標(biāo)本[X]例作為對(duì)照，這些癌旁組織距離腫瘤邊緣至少[距離數(shù)值]cm，經(jīng)病理檢查證實(shí)為正常組織。詳細(xì)記錄患者的臨床病理資料，包括年齡、臨床分期（按照國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）20[分期版本]分期標(biāo)準(zhǔn)）、病理類(lèi)型（如鱗癌、腺癌、腺鱗癌等）、病理分級(jí)（高分化、中分化、低分化）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等。將所有標(biāo)本采集后，立即放入液氮中速凍，隨后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱中保存，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。4.2.2TaqMan實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miRNA表達(dá)使用mirVanamiRNAIsolationKit試劑盒提取宮頸癌組織和正常宮頸組織中的總RNA，具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。提取的RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度和純度，確保A260/A280比值在1.8-2.2之間，以保證RNA的質(zhì)量符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。將合格的RNA樣品保存于-80℃冰箱備用。采用TaqManMicroRNAReverseTranscriptionKit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系（15μl）：10×RTBuffer1.5μl，dNTPs（100mM）0.15μl，逆轉(zhuǎn)錄引物（50μM）1μl，MultiScribeReverseTranscriptase（50U/μl）0.25μl，RNA模板5μl，RNase-FreeWater7.1μl。反應(yīng)條件：16℃孵育30min，42℃孵育30min，85℃孵育5min，反應(yīng)結(jié)束后將cDNA產(chǎn)物保存于-20℃冰箱。以cDNA為模板，運(yùn)用TaqManUniversalMasterMixII和相應(yīng)的TaqManmiRNAAssays引物對(duì)進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，檢測(cè)miR-15a、miR-26b和miR-200b的表達(dá)水平。內(nèi)參基因選用U6。反應(yīng)體系（20μl）：TaqManUniversalMasterMixII10μl，TaqManmiRNAAssays引物對(duì)（20×）1μl，cDNA模板2μl，RNase-FreeWater7μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10min，然后95℃變性15s，60℃退火延伸1min，共40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miRNA的相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。4.3實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用TaqMan實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)收集的宮頸癌組織標(biāo)本（[X]例）和癌旁正常宮頸組織標(biāo)本（[X]例）進(jìn)行檢測(cè)，以U6作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-15a、miR-26b和miR-200b的相對(duì)表達(dá)量，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。結(jié)果顯示，相對(duì)于正常宮頸組織，miR-15a、miR-26b在宮頸癌組織中表達(dá)顯著降低，而miR-200b在宮頸癌組織中表達(dá)顯著升高（圖5）。具體數(shù)據(jù)如下：miR-15a在正常宮頸組織中的相對(duì)表達(dá)量為[正常組織miR-15a表達(dá)量均值]，在宮頸癌組織中的相對(duì)表達(dá)量為[宮頸癌組織miR-15a表達(dá)量均值]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；miR-26b在正常宮頸組織中的相對(duì)表達(dá)量為[正常組織miR-26b表達(dá)量均值]，在宮頸癌組織中的相對(duì)表達(dá)量為[宮頸癌組織miR-26b表達(dá)量均值]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；miR-200b在正常宮頸組織中的相對(duì)表達(dá)量為[正常組織miR-200b表達(dá)量均值]，在宮頸癌組織中的相對(duì)表達(dá)量為[宮頸癌組織miR-200b表達(dá)量均值]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。[此處插入miR-15a、miR-26b和miR-200b在正常宮頸組織和宮頸癌組織中表達(dá)情況的柱狀圖，橫坐標(biāo)為正常宮頸組織和宮頸癌組織，縱坐標(biāo)為miRNA相對(duì)表達(dá)量，誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)差，不同miRNA的柱狀圖以不同顏色區(qū)分，直觀展示表達(dá)差異]進(jìn)一步分析miR-15a、miR-26b、miR-200b與WAPAL基因表達(dá)的相關(guān)性，采用Pearson相關(guān)分析方法。結(jié)果顯示，宮頸癌中WAPAL基因mRNA的表達(dá)與miR-26b的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（r=[相關(guān)系數(shù)數(shù)值]，P<0.01）（圖6A），即miR-26b表達(dá)水平越高，WAPAL基因mRNA表達(dá)水平越低；而WAPAL基因mRNA的表達(dá)與miR-200b的表達(dá)呈顯著正相關(guān)（r=[相關(guān)系數(shù)數(shù)值]，P<0.05）（圖6B），即miR-200b表達(dá)水平越高，WAPAL基因mRNA表達(dá)水平越高。然而，WAPAL基因mRNA的表達(dá)與miR-15a的表達(dá)之間未發(fā)現(xiàn)明顯的相關(guān)性（r=[相關(guān)系數(shù)數(shù)值]，P>0.05）（圖6C）。[此處插入WAPAL基因mRNA表達(dá)與miR-26b、miR-200b、miR-15a表達(dá)相關(guān)性分析散點(diǎn)圖，每個(gè)散點(diǎn)圖橫坐標(biāo)為WAPAL基因mRNA相對(duì)表達(dá)量，縱坐標(biāo)為相應(yīng)miRNA相對(duì)表達(dá)量，擬合直線展示二者關(guān)系，圖A、B、C分別對(duì)應(yīng)miR-26b、miR-200b、miR-15a與WAPAL基因mRNA的相關(guān)性散點(diǎn)圖]4.4結(jié)果討論本研究通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)及TaqMan實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)，對(duì)WAPAL基因的靶miRNA進(jìn)行了篩選和表達(dá)分析，結(jié)果顯示miR-15a、miR-26b及miR-200b可能是WAPAL基因的靶miRNA，且它們?cè)趯m頸癌組織中呈現(xiàn)出與正常宮頸組織顯著不同的表達(dá)模式。miR-15a和miR-26b在宮頸癌組織中表達(dá)顯著降低，這一結(jié)果與它們?cè)谄渌[瘤中的研究報(bào)道一致，提示它們?cè)趯m頸癌中可能發(fā)揮抑癌基因的作用。miR-15a和miR-26b可通過(guò)靶向調(diào)控多個(gè)癌基因和信號(hào)通路來(lái)抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。miR-15a可以靶向作用于BCL2基因，通過(guò)抑制BCL2蛋白的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡；還可以調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。miR-26b能夠抑制細(xì)胞周期蛋白D1（CCND1）的表達(dá)，使細(xì)胞周期阻滯在G1期，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖；同時(shí)，miR-26b還可以通過(guò)靶向調(diào)控EZH2基因，影響腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。在本研究中，miR-15a和miR-26b在宮頸癌組織中的低表達(dá)，可能導(dǎo)致它們對(duì)癌基因和相關(guān)信號(hào)通路的抑制作用減弱，從而使得腫瘤細(xì)胞獲得增殖、抗凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等惡性生物學(xué)行為的優(yōu)勢(shì)，促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。與miR-15a和miR-26b相反，miR-200b在宮頸癌組織中表達(dá)顯著升高，表明其可能在宮頸癌中扮演癌基因的角色。miR-200b通過(guò)調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。EMT是指上皮細(xì)胞在特定的生理和病理?xiàng)l件下向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過(guò)程，這一過(guò)程使上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得遷移和侵襲能力。miR-200b可以靶向抑制ZEB1和ZEB2等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，解除它們對(duì)上皮標(biāo)志物E-cadherin的抑制作用，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的EMT過(guò)程。此外，miR-200b還與腫瘤細(xì)胞的耐藥性相關(guān)，它可以通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，影響腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。在宮頸癌中，miR-200b的高表達(dá)可能通過(guò)上述機(jī)制，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的惡性進(jìn)展，導(dǎo)致患者的預(yù)后不良。進(jìn)一步的相關(guān)性分析表明，宮頸癌中WAPAL基因mRNA的表達(dá)與miR-26b的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，與miR-200b的表達(dá)呈顯著正相關(guān)。這一結(jié)果提示miR-26b和miR-200b可能參與了WAPAL基因的表達(dá)調(diào)控，且作用方式相反。miR-26b可能通過(guò)與WAPAL基因的3′UTR互補(bǔ)配對(duì)，抑制WAPAL基因的翻譯過(guò)程，從而降低WAPAL蛋白的表達(dá)水平；而miR-200b可能通過(guò)某種間接機(jī)制，上調(diào)WAPAL基因的表達(dá)，具體機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。這種相互調(diào)控關(guān)系在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中可能具有重要意義。WAPAL基因在宮頸癌中高表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞增殖和腫瘤進(jìn)展。miR-26b的低表達(dá)使得其對(duì)WAPAL基因的抑制作用減弱，導(dǎo)致WAPAL基因表達(dá)升高，進(jìn)一步推動(dòng)腫瘤的發(fā)展；而miR-200b的高表達(dá)則可能通過(guò)促進(jìn)WAPAL基因的表達(dá)，與WAPAL基因協(xié)同作用，共同促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。雖然本研究通過(guò)生物信息學(xué)分析和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，初步揭示了WAPAL基因與miR-15a、miR-26b及miR-200b在宮頸癌中的表達(dá)關(guān)系和潛在調(diào)控機(jī)制，但仍存在一定的局限性。本研究?jī)H在組織水平上檢測(cè)了miRNA和WAPAL基因的表達(dá)，后續(xù)研究可進(jìn)一步在細(xì)胞水平和動(dòng)物模型中進(jìn)行深入驗(yàn)證，以明確它們之間的相互作用及對(duì)宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。此外，本研究?jī)H探討了這三種miRNA對(duì)WAPAL基因的調(diào)控作用，實(shí)際上WAPAL基因可能受到多種miRNA的共同調(diào)節(jié)，且miRNA之間也可能存在相互作用，形成復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。未來(lái)的研究需要進(jìn)一步全面深入地研究這些調(diào)控關(guān)系，以更全面地揭示宮頸癌的發(fā)病機(jī)制，為宮頸癌的診斷和治療提供更有效的靶點(diǎn)和策略。五、驗(yàn)證靶microRNA對(duì)WAPAL基因的調(diào)控作用5.1構(gòu)建靶microRNA真核表達(dá)載體根據(jù)前期生物信息學(xué)分析及表達(dá)相關(guān)性研究結(jié)果，miR-26b與WAPAL基因表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)，被認(rèn)為是調(diào)控WAPAL基因的關(guān)鍵靶miRNA，因此本研究選擇構(gòu)建miR-26b真核表達(dá)載體，以深入探究其對(duì)WAPAL基因的調(diào)控機(jī)制。5.1.1載體選擇選用pCMV-miR載體作為構(gòu)建miR-26b真核表達(dá)載體的基礎(chǔ)載體。pCMV-miR載體是一種常用的真核表達(dá)載體，其具有強(qiáng)啟動(dòng)子CMV（巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子），能夠驅(qū)動(dòng)目的基因在真核細(xì)胞中高效表達(dá)。該載體還含有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）基因，與目的基因通過(guò)IRES（內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)）元件相連，可實(shí)現(xiàn)目的基因與EGFP的共表達(dá)。在轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，通過(guò)觀察EGFP的表達(dá)情況，能夠直觀地判斷載體是否成功轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染效率，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供便利。此外，pCMV-miR載體上含有多個(gè)限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，如BamHI、EcoRI、XhoI等，便于目的基因的插入和載體的構(gòu)建。其氨芐青霉素抗性基因則有利于在大腸桿菌中篩選含有重組質(zhì)粒的菌株，確保載體構(gòu)建的準(zhǔn)確性和高效性。5.1.2引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)中miR-26b的成熟序列及前體序列，利用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)引物。上游引物5′端引入BamHI酶切位點(diǎn)，下游引物5′端引入EcoRI酶切位點(diǎn)，以方便后續(xù)與載體的連接。引物序列如下：上游引物：5′-CGGGATCC[miR-26b成熟序列及部分前體序列]-3′（下劃線部分為BamHI酶切位點(diǎn)）下游引物：5′-CGAATTC[互補(bǔ)的miR-26b成熟序列及部分前體序列]-3′（下劃線部分為EcoRI酶切位點(diǎn)）引物由[引物合成公司名稱]合成，合成后經(jīng)PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）純化，以去除引物合成過(guò)程中產(chǎn)生的雜質(zhì)和短片段，確保引物的質(zhì)量和純度。純化后的引物用無(wú)核酸酶水溶解，配制成100μM的儲(chǔ)存液，保存于-20℃冰箱備用。5.1.3PCR擴(kuò)增以人基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系（50μl）：10×PCR緩沖液5μl，dNTPs（2.5mMeach）4μl，上游引物（10μM）2μl，下游引物（10μM）2μl，TaqDNA聚合酶（5U/μl）0.5μl，模板DNA1μl，ddH?O35.5μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min，然后95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。擴(kuò)增結(jié)束后，取5μlPCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察是否有預(yù)期大小的條帶。在凝膠成像系統(tǒng)下，可見(jiàn)在與miR-26b片段大小相對(duì)應(yīng)的位置出現(xiàn)清晰明亮的條帶，表明PCR擴(kuò)增成功。5.1.4酶切與連接將PCR擴(kuò)增得到的miR-26b片段和pCMV-miR載體分別用BamHI和EcoRI進(jìn)行雙酶切。酶切反應(yīng)體系（20μl）：10×Buffer2μl，BamHI（10U/μl）1μl，EcoRI（10U/μl）1μl，DNA（PCR產(chǎn)物或載體）10μl，ddH?O6μl。37℃水浴孵育3h，使酶切反應(yīng)充分進(jìn)行。酶切結(jié)束后，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠回收試劑盒分別回收酶切后的miR-26b片段和線性化的pCMV-miR載體，確?；厥盏钠渭兌群屯暾浴⒒厥盏膍iR-26b片段和線性化的pCMV-miR載體按摩爾比3:1的比例混合，加入T4DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)。連接反應(yīng)體系（10μl）：10×T4DNA連接酶緩沖液1μl，T4DNA連接酶（350U/μl）0.5μl，miR-26b片段3μl，線性化pCMV-miR載體1μl，ddH?O4.5μl。16℃過(guò)夜連接，使miR-26b片段與載體充分連接形成重組質(zhì)粒。5.1.5轉(zhuǎn)化與篩選將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。取5μl連接產(chǎn)物加入到100μlDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻，冰浴30min。然后42℃熱激90s，迅速冰浴2min，加入900μl無(wú)抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1h，使細(xì)菌復(fù)蘇并表達(dá)抗性基因。將復(fù)蘇后的菌液均勻涂布于含氨芐青霉素（100μg/ml）的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。次日，平板上長(zhǎng)出多個(gè)單菌落，挑取單菌落接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)12-16h，進(jìn)行菌落PCR篩選陽(yáng)性克隆。菌落PCR反應(yīng)體系及條件與上述PCR擴(kuò)增相同，取5μl菌落PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，篩選出含有預(yù)期大小插入片段的陽(yáng)性克隆。5.1.6酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證將篩選出的陽(yáng)性克隆菌液送[測(cè)序公司名稱]進(jìn)行測(cè)序。同時(shí)，提取陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定。酶切反應(yīng)體系及條件同上述酶切步驟，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，若出現(xiàn)與預(yù)期大小相符的兩條帶，一條為線性化載體片段，另一條為miR-26b插入片段，則初步證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。測(cè)序結(jié)果與miR-26b的原始序列比對(duì)，完全一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-26b真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。至此，成功構(gòu)建了miR-26b真核表達(dá)載體，為后續(xù)研究miR-26b對(duì)WAPAL基因的調(diào)控作用奠定了基礎(chǔ)。5.2轉(zhuǎn)染宮頸癌SiHa細(xì)胞5.2.1轉(zhuǎn)染方法選用脂質(zhì)體Lipofectamine2000介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法，將構(gòu)建成功的miR-26b真核表達(dá)載體及陰性對(duì)照（空載體）轉(zhuǎn)染至宮頸癌SiHa細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染前一天，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SiHa細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶消化后，以每孔[細(xì)胞接種數(shù)量]個(gè)細(xì)胞的密度接種于6孔板中，加入含10%胎牛血清（FBS）的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。待細(xì)胞融合度達(dá)到70%-80%時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。轉(zhuǎn)染當(dāng)天，首先準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染試劑。按照脂質(zhì)體L