miR-27a對小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446體外自我更新的調(diào)控機制探秘一、引言1.1研究背景與意義肺癌作為全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率均居前列的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類的健康。其中，小細(xì)胞肺癌（SmallCellLungCancer，SCLC）是肺癌中最具侵襲性和惡性的亞型之一，約占肺癌病例的10%-15%。與非小細(xì)胞肺癌相比，小細(xì)胞肺癌具有獨特的生物學(xué)特性，其癌細(xì)胞生長迅速，倍增時間短，早期即可發(fā)生廣泛轉(zhuǎn)移，治療難度大，療效不佳，預(yù)后差。局限期與廣泛期患者診斷后的中位生存期分別僅為15-20個月和8-13個月，5年生存率極低。小細(xì)胞肺癌常見的臨床表現(xiàn)包括咳嗽、痰中帶血，嚴(yán)重時可出現(xiàn)咯血癥狀，且極易通過血行轉(zhuǎn)移至腦、骨等部位，導(dǎo)致患者出現(xiàn)頭痛、惡心、骨痛、容易骨折等癥狀。由于早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時已處于晚期，錯失手術(shù)治療的最佳時機。手術(shù)治療效果較差，通常需要聯(lián)合放化療，但小細(xì)胞肺癌對放化療的敏感性雖高，但很快就會出現(xiàn)耐藥性，導(dǎo)致治療效果不佳，復(fù)發(fā)率高，給患者和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)。近年來，腫瘤干細(xì)胞理論的提出為腫瘤研究帶來了新的視角。自我更新作為腫瘤干細(xì)胞的重要特性之一，被認(rèn)為是小細(xì)胞肺癌快速轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的重要因素。具有自我更新能力的腫瘤干細(xì)胞能夠不斷產(chǎn)生新的癌細(xì)胞，維持腫瘤的生長和發(fā)展，并且這些細(xì)胞對傳統(tǒng)的放化療具有較強的耐受性，是導(dǎo)致小細(xì)胞肺癌治療失敗和復(fù)發(fā)的關(guān)鍵原因。深入研究小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的自我更新機制，對于開發(fā)新的治療策略，提高小細(xì)胞肺癌的治療效果具有重要意義。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類內(nèi)源性非編碼小分子RNA，長度約為22個核苷酸。它們通過與靶標(biāo)基因的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）結(jié)合，抑制翻譯過程或降解靶標(biāo)基因，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)。越來越多的研究表明，miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和耐藥等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。miR-27a作為miRNA家族的重要成員，其在多種腫瘤中的表達(dá)及功能受到了廣泛關(guān)注。在小細(xì)胞肺癌中，miR-27a能夠通過多種途徑影響小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系的自我更新。研究表明，miR-27a的過表達(dá)會促進(jìn)小細(xì)胞肺癌的增殖、侵襲和自我更新，而miR-27a的下調(diào)則可以抑制小細(xì)胞肺癌的自我更新。因此，深入研究miR-27a對小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446體外自我更新的調(diào)控作用，不僅有助于揭示小細(xì)胞肺癌的發(fā)病機制，還為小細(xì)胞肺癌的治療提供了新的潛在靶點和治療策略，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價值。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國外，關(guān)于miR-27a在小細(xì)胞肺癌中的研究起步較早，且取得了一系列重要成果。早期研究主要聚焦于miR-27a在小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)差異。通過對大量小細(xì)胞肺癌組織樣本和正常肺組織樣本的檢測分析，發(fā)現(xiàn)miR-27a在小細(xì)胞肺癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，這一結(jié)果表明miR-27a與小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展可能存在密切關(guān)聯(lián)。隨后，科研人員深入探究其功能，運用細(xì)胞實驗和動物模型，證實了miR-27a過表達(dá)能夠顯著促進(jìn)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲能力，并且對細(xì)胞的自我更新能力也有明顯的增強作用。在機制研究方面，國外學(xué)者發(fā)現(xiàn)miR-27a可以通過介導(dǎo)Wnt/β-catenin信號通路來影響小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系的自我更新。具體而言，miR-27a能夠直接作用于Axin2和SFRP1，使其表達(dá)下調(diào)，進(jìn)而激活Wnt/β-catenin通路，為小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的自我更新提供了有利條件。此外，在針對miR-27a的治療策略研究上，國外團(tuán)隊進(jìn)行了諸多嘗試，如開發(fā)能夠調(diào)節(jié)miR-27a表達(dá)的小分子化合物，像graupnerol，實驗顯示其能夠有效抑制miR-27a的表達(dá)，從而降低小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的自我更新能力，為小細(xì)胞肺癌的治療提供了新的思路和潛在藥物靶點。國內(nèi)的研究也在積極跟進(jìn)，并且在某些方面取得了獨特的進(jìn)展。在miR-27a對小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響的研究中，國內(nèi)學(xué)者通過一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶嶒?，進(jìn)一步驗證和補充了國外的研究成果。利用先進(jìn)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)和高通量測序技術(shù)，不僅再次證實了miR-27a過表達(dá)對小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、侵襲和自我更新的促進(jìn)作用，還發(fā)現(xiàn)miR-27a可能通過影響小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的代謝狀態(tài)來改變其自我更新能力。研究表明，miR-27a能夠抑制肝糖異生途徑，同時增強葡萄糖攝取，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝狀態(tài)，為細(xì)胞的自我更新提供充足的能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。在靶基因研究方面，國內(nèi)科研人員借助多種生物信息學(xué)工具和實驗驗證方法，篩選出了多個可能受miR-27a調(diào)控且與小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期密切相關(guān)的靶基因，為深入理解miR-27a調(diào)控小細(xì)胞肺癌的分子機制提供了豐富的數(shù)據(jù)支持。此外，在臨床應(yīng)用研究方面，國內(nèi)團(tuán)隊積極探索將miR-27a作為小細(xì)胞肺癌診斷和預(yù)后評估標(biāo)志物的可能性，通過對大量臨床病例的回顧性分析和前瞻性研究，初步顯示出miR-27a在小細(xì)胞肺癌早期診斷和預(yù)后判斷中的潛在價值。盡管國內(nèi)外在miR-27a調(diào)控小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系自我更新方面取得了一定成果，但仍存在諸多不足之處。目前對于miR-27a調(diào)控小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446體外自我更新的具體分子機制尚未完全明確，雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些相關(guān)的信號通路和靶基因，但這些通路和基因之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)以及它們在不同生物學(xué)過程中的協(xié)同調(diào)控機制仍有待深入研究?，F(xiàn)有的研究主要集中在體外細(xì)胞實驗和動物模型上，缺乏大規(guī)模的臨床研究來進(jìn)一步驗證miR-27a在小細(xì)胞肺癌患者體內(nèi)的表達(dá)特征、功能以及與臨床病理參數(shù)和預(yù)后的相關(guān)性，這限制了miR-27a從基礎(chǔ)研究向臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化。針對miR-27a的治療策略雖然有了初步探索，但在如何提高治療的特異性和有效性，降低不良反應(yīng)等方面還面臨諸多挑戰(zhàn)，需要進(jìn)一步優(yōu)化和創(chuàng)新治療方案?；诋?dāng)前研究的不足，本研究將致力于深入探究miR-27a調(diào)控小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446體外自我更新的詳細(xì)分子機制，通過綜合運用多種分子生物學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)方法，全面解析miR-27a與相關(guān)信號通路、靶基因之間的相互作用關(guān)系。同時，積極開展臨床研究，收集大量小細(xì)胞肺癌患者的臨床樣本，分析miR-27a在患者體內(nèi)的表達(dá)情況及其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，為將miR-27a作為小細(xì)胞肺癌的診斷標(biāo)志物和治療靶點提供堅實的臨床依據(jù)。在治療策略方面，將進(jìn)一步優(yōu)化和開發(fā)基于miR-27a的治療方法，探索聯(lián)合治療方案，以期提高小細(xì)胞肺癌的治療效果，改善患者的預(yù)后。1.3研究目的與創(chuàng)新點本研究旨在深入探究miR-27a對小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446體外自我更新的調(diào)控作用及其潛在分子機制。通過一系列實驗，系統(tǒng)地分析miR-27a在小細(xì)胞肺癌細(xì)胞自我更新過程中的功能，明確其作用靶點和相關(guān)信號通路，為小細(xì)胞肺癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在治療靶點。具體而言，將通過細(xì)胞實驗和分子生物學(xué)技術(shù)，研究miR-27a表達(dá)水平的改變對H446細(xì)胞腫瘤球形成能力、克隆形成能力等自我更新相關(guān)指標(biāo)的影響；運用生物信息學(xué)分析和實驗驗證相結(jié)合的方法，篩選和鑒定受miR-27a調(diào)控的靶基因，深入解析miR-27a調(diào)控小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446體外自我更新的分子機制。本研究的創(chuàng)新點主要體現(xiàn)在以下幾個方面：在研究視角上，從腫瘤干細(xì)胞自我更新這一關(guān)鍵特性出發(fā)，聚焦于miR-27a對小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446體外自我更新的調(diào)控作用，為理解小細(xì)胞肺癌的發(fā)病機制和治療策略提供了新的切入點。在研究方法上，綜合運用多種先進(jìn)的分子生物學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)方法，全面、系統(tǒng)地研究miR-27a的調(diào)控機制。例如，通過高通量測序技術(shù)全面分析miR-27a調(diào)控的基因表達(dá)譜，結(jié)合蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)深入研究其對蛋白質(zhì)表達(dá)和修飾的影響，為揭示miR-27a的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了多維度的數(shù)據(jù)支持。在研究內(nèi)容上，不僅關(guān)注miR-27a對已知信號通路和靶基因的調(diào)控作用，還積極探索其在小細(xì)胞肺癌細(xì)胞代謝重編程、表觀遺傳調(diào)控等方面的新功能和新機制，有望發(fā)現(xiàn)新的治療靶點和干預(yù)策略。二、miR-27a與小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446的相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1miR-27a概述miR-27a作為微小RNA（miRNA）家族中的一員，具有獨特的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)特性。從結(jié)構(gòu)上看，它是一段長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA。其編碼基因通常位于基因組的非編碼區(qū)域，轉(zhuǎn)錄后首先形成初級轉(zhuǎn)錄本（pri-miR-27a），pri-miR-27a在細(xì)胞核內(nèi)被核酸酶Drosha及其輔助因子DGCR8識別并切割，形成長度約為70-100個核苷酸的發(fā)夾狀前體miRNA（pre-miR-27a）。隨后，pre-miR-27a被轉(zhuǎn)運出細(xì)胞核，在細(xì)胞質(zhì)中被核酸酶Dicer進(jìn)一步切割，最終生成成熟的miR-27a。這種獨特的生成過程確保了miR-27a能夠準(zhǔn)確地發(fā)揮其生物學(xué)功能。miR-27a在基因表達(dá)調(diào)控中扮演著至關(guān)重要的角色，其作用方式主要是通過與靶標(biāo)基因的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）進(jìn)行堿基互補配對，從而抑制靶標(biāo)基因的翻譯過程，或者誘導(dǎo)靶標(biāo)mRNA的降解。miR-27a對靶基因的調(diào)控具有高度的特異性，這源于其種子序列（seedsequence）與靶基因3'UTR上的互補位點精確匹配。種子序列通常位于miR-27a的5'端第2-8位核苷酸，這幾個核苷酸與靶基因的互補配對是決定miR-27a靶向特異性的關(guān)鍵因素。一個miR-27a可以同時調(diào)控多個靶基因，這種一對多的調(diào)控模式使得miR-27a能夠參與到復(fù)雜的生物學(xué)網(wǎng)絡(luò)中，對細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等多種生理過程產(chǎn)生影響。例如，在細(xì)胞增殖過程中，miR-27a可能通過抑制某些負(fù)調(diào)控增殖的靶基因，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖；而在細(xì)胞凋亡過程中，它又可能通過調(diào)控相關(guān)靶基因來影響細(xì)胞凋亡的進(jìn)程。在不同的組織和細(xì)胞類型中，miR-27a的表達(dá)水平存在顯著差異，這種差異表達(dá)與組織的發(fā)育、生理功能以及疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在正常組織中，miR-27a的表達(dá)處于相對穩(wěn)定的水平，它參與維持細(xì)胞的正常生理功能。在脂肪組織中，miR-27a可以通過調(diào)控相關(guān)靶基因來影響脂肪細(xì)胞的分化和脂質(zhì)代謝，維持脂肪組織的正常功能。在某些疾病狀態(tài)下，如腫瘤、心血管疾病等，miR-27a的表達(dá)會發(fā)生明顯的改變。在腫瘤中，miR-27a常常呈現(xiàn)異常高表達(dá)，這種高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移以及耐藥性等惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)。在乳腺癌中，miR-27a的高表達(dá)能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和侵襲，降低患者的生存率。在心血管疾病中，miR-27a的表達(dá)變化也與心肌肥大、心肌梗死等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在心肌肥大模型中，miR-27a的表達(dá)上調(diào)，通過抑制相關(guān)靶基因，導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大和纖維化，加重心臟功能損傷。2.2小細(xì)胞肺癌及細(xì)胞系H446特點小細(xì)胞肺癌作為肺癌中惡性程度較高的亞型，具有獨特的生物學(xué)特性。從組織學(xué)形態(tài)來看，其癌細(xì)胞體積小，呈圓形、卵圓形或梭形，細(xì)胞核相對較大，染色質(zhì)呈細(xì)顆粒狀，核仁不明顯，細(xì)胞質(zhì)稀少。這種獨特的細(xì)胞形態(tài)決定了其在生長和增殖方面的特性。小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長迅速，倍增時間短，相較于其他類型的肺癌細(xì)胞，能夠在較短的時間內(nèi)大量增殖，這也是其容易早期發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要原因之一。在基因表達(dá)方面，小細(xì)胞肺癌具有特征性的基因改變，如抑癌基因TP53和RB1的頻繁失活，這些基因的異常與小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究表明，TP53基因的突變或缺失會導(dǎo)致細(xì)胞周期調(diào)控異常，使得癌細(xì)胞能夠不受控制地增殖。RB1基因的失活則會影響細(xì)胞的分化和凋亡過程，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。小細(xì)胞肺癌還常常伴有一些神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物的表達(dá)，如神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）、嗜鉻粒蛋白A（CgA）等，這使得小細(xì)胞肺癌具有一定的神經(jīng)內(nèi)分泌特性。這些神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物不僅可以作為小細(xì)胞肺癌診斷和監(jiān)測的指標(biāo)，還可能參與腫瘤細(xì)胞的信號傳導(dǎo)和生物學(xué)行為調(diào)控。在臨床特征方面，小細(xì)胞肺癌通常早期即可發(fā)生轉(zhuǎn)移，這是其治療困難和預(yù)后不良的主要原因。轉(zhuǎn)移途徑主要包括淋巴轉(zhuǎn)移和血行轉(zhuǎn)移。淋巴轉(zhuǎn)移使得癌細(xì)胞能夠通過淋巴管擴散到附近的淋巴結(jié)，進(jìn)而進(jìn)一步擴散到遠(yuǎn)處的淋巴結(jié)。血行轉(zhuǎn)移則使得癌細(xì)胞能夠通過血液循環(huán)到達(dá)身體的各個部位，常見的轉(zhuǎn)移部位包括腦、骨、肝、腎上腺等。腦轉(zhuǎn)移是小細(xì)胞肺癌常見的轉(zhuǎn)移部位之一，一旦發(fā)生腦轉(zhuǎn)移，患者往往會出現(xiàn)頭痛、頭暈、惡心、嘔吐、視力障礙、肢體無力等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和預(yù)后。骨轉(zhuǎn)移會導(dǎo)致患者出現(xiàn)骨痛、病理性骨折等癥狀，給患者帶來極大的痛苦。小細(xì)胞肺癌對化療和放療較為敏感，這是其治療的主要手段。在治療初期，化療和放療能夠使腫瘤迅速縮小，患者的癥狀得到明顯緩解。小細(xì)胞肺癌容易產(chǎn)生耐藥性，在治療一段時間后，腫瘤細(xì)胞可能會對化療藥物和放療產(chǎn)生抵抗，導(dǎo)致治療效果不佳，腫瘤復(fù)發(fā)。這也是小細(xì)胞肺癌治療面臨的一大挑戰(zhàn)，需要進(jìn)一步研究耐藥機制，開發(fā)新的治療方法。小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446在小細(xì)胞肺癌的研究中具有重要的應(yīng)用價值。該細(xì)胞系是從一位小細(xì)胞肺癌患者的胸水中建立的，具有典型的小細(xì)胞肺癌細(xì)胞特征。在細(xì)胞形態(tài)上，H446細(xì)胞呈圓形或橢圓形，懸浮生長，這與小細(xì)胞肺癌在體內(nèi)的生長方式相似。這種生長特性使得H446細(xì)胞在體外培養(yǎng)時能夠較好地模擬小細(xì)胞肺癌的生物學(xué)行為，為研究小細(xì)胞肺癌的生長、增殖和轉(zhuǎn)移等過程提供了良好的模型。H446細(xì)胞表達(dá)多種小細(xì)胞肺癌相關(guān)的標(biāo)志物，如神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）、CD56等，這些標(biāo)志物的表達(dá)進(jìn)一步證實了其小細(xì)胞肺癌的特性。NSE是一種在神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中高度表達(dá)的酶，在小細(xì)胞肺癌中，NSE的表達(dá)水平明顯升高，可作為小細(xì)胞肺癌診斷和監(jiān)測的重要指標(biāo)。CD56是一種細(xì)胞表面糖蛋白，在小細(xì)胞肺癌中也有較高的表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為密切相關(guān)。利用H446細(xì)胞系進(jìn)行研究具有諸多優(yōu)勢。其來源明確，是從患者胸水中直接建立的，能夠真實地反映小細(xì)胞肺癌的生物學(xué)特性。細(xì)胞系易于培養(yǎng)和傳代，可以在體外大量擴增，為實驗研究提供充足的細(xì)胞來源。H446細(xì)胞對多種化療藥物具有敏感性，這使得它成為研究小細(xì)胞肺癌化療耐藥機制和篩選新的化療藥物的理想模型。通過對H446細(xì)胞進(jìn)行化療藥物處理，可以觀察細(xì)胞的反應(yīng)，研究耐藥相關(guān)基因和信號通路的變化，為開發(fā)新的化療策略提供依據(jù)。2.3細(xì)胞自我更新的概念與意義細(xì)胞自我更新是指細(xì)胞通過分裂產(chǎn)生與自身相同的子代細(xì)胞，從而維持細(xì)胞群體數(shù)量和特性穩(wěn)定的過程。這一過程對于維持生物體的正常生理功能和組織穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。在正常組織中，細(xì)胞自我更新受到嚴(yán)格的調(diào)控，以確保組織的正常發(fā)育、生長和修復(fù)。在皮膚組織中，表皮干細(xì)胞通過自我更新不斷產(chǎn)生新的表皮細(xì)胞，以替代衰老和死亡的細(xì)胞，維持皮膚的正常結(jié)構(gòu)和功能。在造血系統(tǒng)中，造血干細(xì)胞具有高度的自我更新能力，能夠不斷產(chǎn)生各種血細(xì)胞，如紅細(xì)胞、白細(xì)胞和血小板等，滿足機體對血細(xì)胞的需求。當(dāng)細(xì)胞自我更新失控時，就可能導(dǎo)致疾病的發(fā)生，腫瘤的形成往往與腫瘤干細(xì)胞的異常自我更新密切相關(guān)。在小細(xì)胞肺癌的發(fā)展進(jìn)程中，細(xì)胞自我更新發(fā)揮著極為重要的作用。小細(xì)胞肺癌中存在具有自我更新能力的腫瘤干細(xì)胞，這些細(xì)胞是腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的根源。腫瘤干細(xì)胞能夠通過自我更新不斷產(chǎn)生新的癌細(xì)胞，維持腫瘤的生長和發(fā)展。研究表明，小細(xì)胞肺癌腫瘤干細(xì)胞的自我更新能力與其高增殖活性和抗凋亡特性密切相關(guān)。這些細(xì)胞能夠快速增殖，在短時間內(nèi)形成大量的癌細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤體積迅速增大。腫瘤干細(xì)胞還具有較強的抗凋亡能力，能夠抵抗化療和放療等治療手段誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，從而使得腫瘤難以被徹底清除。腫瘤干細(xì)胞的自我更新能力還與小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。具有自我更新能力的腫瘤干細(xì)胞能夠脫離原發(fā)腫瘤，進(jìn)入血液循環(huán)或淋巴循環(huán)，在遠(yuǎn)處器官定植并形成轉(zhuǎn)移灶。這是因為腫瘤干細(xì)胞具有較強的遷移和侵襲能力，能夠突破組織屏障，進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)。腫瘤干細(xì)胞在轉(zhuǎn)移灶中能夠繼續(xù)自我更新和增殖，形成新的腫瘤組織，導(dǎo)致腫瘤的擴散和惡化。細(xì)胞自我更新還與小細(xì)胞肺癌的耐藥性密切相關(guān)。由于腫瘤干細(xì)胞對化療和放療具有較強的耐受性，常規(guī)的治療手段往往難以徹底清除這些細(xì)胞。在化療過程中，腫瘤干細(xì)胞能夠通過自我更新迅速補充被殺死的癌細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。腫瘤干細(xì)胞還能夠通過多種機制產(chǎn)生耐藥性，如上調(diào)耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)、改變細(xì)胞代謝途徑等，進(jìn)一步增加了治療的難度。深入研究小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的自我更新機制，對于揭示小細(xì)胞肺癌的發(fā)病機制、開發(fā)新的治療策略具有重要意義。三、miR-27a對小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446體外自我更新影響的實驗研究3.1實驗材料與方法3.1.1實驗材料準(zhǔn)備本實驗選用小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446，該細(xì)胞系購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。選擇H446細(xì)胞系的原因在于其具有典型的小細(xì)胞肺癌細(xì)胞特征，能夠較好地模擬小細(xì)胞肺癌在體內(nèi)的生物學(xué)行為。從細(xì)胞形態(tài)上看，H446細(xì)胞呈圓形或橢圓形，懸浮生長，這與小細(xì)胞肺癌在體內(nèi)的生長方式相似。其表達(dá)多種小細(xì)胞肺癌相關(guān)的標(biāo)志物，如神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）、CD56等，這些標(biāo)志物的表達(dá)進(jìn)一步證實了其小細(xì)胞肺癌的特性。H446細(xì)胞對多種化療藥物具有敏感性，方便后續(xù)研究miR-27a對小細(xì)胞肺癌細(xì)胞化療敏感性的影響。實驗所需的主要試劑包括：RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司），用于細(xì)胞的培養(yǎng)，其富含多種營養(yǎng)成分，能夠滿足H446細(xì)胞生長和增殖的需求；胎牛血清（FBS，Gibco公司），為細(xì)胞提供生長所需的各種生長因子和營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞的生長和存活；胰蛋白酶（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA，Gibco公司），用于細(xì)胞的消化，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來，便于進(jìn)行傳代和實驗處理；Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司），用于將外源核酸分子導(dǎo)入細(xì)胞，實現(xiàn)miR-27a表達(dá)的調(diào)控；miR-27amimic、miR-27ainhibitor及其陰性對照（NC，RiboBio公司），分別用于上調(diào)和下調(diào)miR-27a的表達(dá)，通過與細(xì)胞內(nèi)的miR-27a競爭結(jié)合靶基因或直接抑制miR-27a的活性，從而改變miR-27a的表達(dá)水平；TRIzol試劑（Invitrogen公司），用于提取細(xì)胞中的總RNA，為后續(xù)的qRT-PCR實驗提供樣本；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司），將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以便進(jìn)行qRT-PCR檢測；SYBRGreenPCRMasterMix（TaKaRa公司），用于qRT-PCR反應(yīng)，通過熒光信號的變化來定量檢測目的基因的表達(dá)水平；CCK-8試劑盒（Dojindo公司），用于檢測細(xì)胞的增殖能力，其原理是利用細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶將CCK-8試劑中的四唑鹽還原為橙色的甲瓚產(chǎn)物，甲瓚產(chǎn)物的生成量與活細(xì)胞數(shù)量成正比，通過檢測吸光度值來反映細(xì)胞的增殖情況；AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（BDBiosciences公司），用于檢測細(xì)胞的凋亡情況，AnnexinV能夠特異性地與凋亡早期細(xì)胞表面暴露的磷脂酰絲氨酸結(jié)合，而PI則可以進(jìn)入壞死細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞，通過流式細(xì)胞儀檢測不同熒光標(biāo)記的細(xì)胞比例，從而分析細(xì)胞的凋亡率。實驗使用的主要儀器有：CO?培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），為細(xì)胞提供適宜的培養(yǎng)環(huán)境，維持穩(wěn)定的溫度（37℃）、濕度（95%）和CO?濃度（5%），確保細(xì)胞的正常生長和代謝；倒置顯微鏡（Olympus公司），用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長狀態(tài)，實時監(jiān)測細(xì)胞的生長情況，及時發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的異常變化；離心機（Eppendorf公司），用于細(xì)胞和試劑的離心分離，通過離心力的作用，將細(xì)胞和其他物質(zhì)分離，便于后續(xù)的實驗操作；PCR儀（Bio-Rad公司），用于進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR反應(yīng)，精確控制反應(yīng)的溫度和時間，保證反應(yīng)的順利進(jìn)行；酶標(biāo)儀（ThermoFisherScientific公司），用于檢測CCK-8實驗中的吸光度值，通過測量特定波長下的光吸收強度，定量分析細(xì)胞的增殖情況；流式細(xì)胞儀（BDBiosciences公司），用于檢測細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞周期等參數(shù)，通過對細(xì)胞進(jìn)行熒光標(biāo)記，利用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞進(jìn)行快速分析和分選，獲取細(xì)胞的相關(guān)信息。3.1.2細(xì)胞培養(yǎng)與處理將H446細(xì)胞復(fù)蘇后，接種于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔2-3天更換一次培養(yǎng)基，以去除細(xì)胞代謝產(chǎn)生的廢物，補充新鮮的營養(yǎng)物質(zhì)，維持細(xì)胞的正常生長環(huán)境。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。傳代時，先將細(xì)胞培養(yǎng)液吸出，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次，以去除殘留的血清和雜質(zhì)。加入適量的0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化液，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞大部分變圓并開始脫落時，迅速加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化。輕輕吹打細(xì)胞，使其形成單細(xì)胞懸液，然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，1000rpm離心5分鐘，棄去上清液，用新鮮的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照1:3-1:5的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。實驗設(shè)置不同的處理組，以研究miR-27a對H446細(xì)胞體外自我更新的影響。實驗組分別轉(zhuǎn)染miR-27amimic和miR-27ainhibitor，以上調(diào)和下調(diào)miR-27a的表達(dá)；對照組則轉(zhuǎn)染相應(yīng)的陰性對照（NC）。轉(zhuǎn)染前，將細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種適量的細(xì)胞，使其在轉(zhuǎn)染時達(dá)到50%-60%的匯合度。按照Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑的說明書進(jìn)行操作，將miR-27amimic、miR-27ainhibitor或NC與轉(zhuǎn)染試劑混合，形成復(fù)合物，然后將復(fù)合物加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，輕輕混勻，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后4-6小時，更換新鮮的培養(yǎng)基，以去除未結(jié)合的轉(zhuǎn)染試劑和核酸分子，減少對細(xì)胞的毒性。繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時后，進(jìn)行后續(xù)的實驗檢測。3.1.3miR-27a表達(dá)調(diào)控方法上調(diào)miR-27a表達(dá)采用轉(zhuǎn)染miR-27amimic的方法。miR-27amimic是一種人工合成的雙鏈RNA分子，其序列與內(nèi)源性的成熟miR-27a相同。通過轉(zhuǎn)染miR-27amimic，可以增加細(xì)胞內(nèi)miR-27a的含量，從而上調(diào)其表達(dá)水平。轉(zhuǎn)染過程中，利用Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑的陽離子脂質(zhì)體特性，將miR-27amimic包裹形成復(fù)合物。該復(fù)合物能夠與細(xì)胞表面的負(fù)電荷相互作用，通過內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。進(jìn)入細(xì)胞后，miR-27amimic從復(fù)合物中釋放出來，與細(xì)胞內(nèi)的RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）結(jié)合，形成具有活性的RISC-miR-27a復(fù)合物。該復(fù)合物能夠識別并結(jié)合靶基因的3'非翻譯區(qū)（3'UTR），通過堿基互補配對原則，抑制靶基因的翻譯過程，或者誘導(dǎo)靶標(biāo)mRNA的降解，從而發(fā)揮miR-27a的生物學(xué)功能。在操作時，需嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染試劑的說明書進(jìn)行，準(zhǔn)確配制miR-27amimic和轉(zhuǎn)染試劑的混合液，確保轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染后要密切觀察細(xì)胞的狀態(tài)，及時更換培養(yǎng)基，減少轉(zhuǎn)染試劑對細(xì)胞的毒性影響。下調(diào)miR-27a表達(dá)則使用miR-27ainhibitor。miR-27ainhibitor是一種經(jīng)過化學(xué)修飾的單鏈RNA分子，其序列與miR-27a互補。通過轉(zhuǎn)染miR-27ainhibitor，它能夠與細(xì)胞內(nèi)的miR-27a特異性結(jié)合，形成雙鏈RNA結(jié)構(gòu)，從而阻斷miR-27a與RISC的結(jié)合，抑制miR-27a的活性，達(dá)到下調(diào)其表達(dá)的目的。同樣借助Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑將miR-27ainhibitor導(dǎo)入細(xì)胞。在細(xì)胞內(nèi)，miR-27ainhibitor與miR-27a結(jié)合后，使miR-27a無法正常發(fā)揮對靶基因的調(diào)控作用。操作要點包括精確控制miR-27ainhibitor的濃度，避免因濃度過高對細(xì)胞造成損傷，同時要確保轉(zhuǎn)染的均勻性，使每個細(xì)胞都能有效攝取miR-27ainhibitor。轉(zhuǎn)染后定期檢測細(xì)胞中miR-27a的表達(dá)水平，以驗證下調(diào)效果。3.2檢測指標(biāo)與實驗方法3.2.1腫瘤球形成實驗?zāi)[瘤球形成實驗是評估細(xì)胞自我更新能力的經(jīng)典方法之一。其主要實驗步驟如下：將轉(zhuǎn)染后的H446細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶-0.53mMEDTA消化成單細(xì)胞懸液，用PBS清洗2次，以去除殘留的消化液和血清。用含有B27（50X）營養(yǎng)液、重組表皮生長因子（EGF，20ng/ml）、堿性成纖維生長因子（bFGF，20ng/ml）的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并進(jìn)行計數(shù)。將細(xì)胞以500-5000個/孔的密度接種于超低吸附的6孔板中，每孔加入4ml上述培養(yǎng)基。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2-3天半量換液，即吸出一半的培養(yǎng)基，加入等量的新鮮培養(yǎng)基，以維持細(xì)胞的營養(yǎng)供應(yīng)和生長環(huán)境的穩(wěn)定。在培養(yǎng)過程中，利用倒置顯微鏡定期觀察細(xì)胞球的形成情況，記錄細(xì)胞球的數(shù)量和大小。一般培養(yǎng)10天左右完成培養(yǎng)，對細(xì)胞球的狀態(tài)進(jìn)行最終評估。該實驗的培養(yǎng)條件模擬了體內(nèi)腫瘤干細(xì)胞所處的微環(huán)境。無血清培養(yǎng)基可以去除血清中各種生長因子和激素的干擾，使具有自我更新能力的腫瘤干細(xì)胞能夠在特定的細(xì)胞因子作用下，展現(xiàn)出獨特的生長特性。B27營養(yǎng)液含有多種抗氧化劑、蛋白質(zhì)、維生素和脂肪酸等成分，有助于促進(jìn)細(xì)胞的快速增殖，并減少氧化損傷。EGF和bFGF在細(xì)胞的生長、分化和自我更新過程中發(fā)揮著重要作用。EGF能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和增殖，促進(jìn)細(xì)胞新陳代謝；bFGF則有助于保持細(xì)胞的未分化狀態(tài)，維持細(xì)胞的干性。在這種培養(yǎng)條件下，普通腫瘤細(xì)胞由于缺乏必要的生長信號和支持，無法有效增殖，而具有自我更新能力的腫瘤干細(xì)胞能夠形成聚集成團(tuán)的克隆腫瘤球，形態(tài)類似于葡萄串。細(xì)胞球的大小和數(shù)量可以作為評估細(xì)胞干性程度的重要指標(biāo)。細(xì)胞球形成效率（SphereFormationEfficiency，SFE）常被用于衡量細(xì)胞的干性，其計算公式為：SFE=（形成的細(xì)胞球數(shù)量/接種的細(xì)胞數(shù)量）×100%。通過比較不同處理組的SFE，可以直觀地了解miR-27a表達(dá)水平的改變對H446細(xì)胞自我更新能力的影響。3.2.2克隆形成實驗克隆形成實驗也是檢測細(xì)胞自我更新能力的常用方法。實驗流程如下：將轉(zhuǎn)染后的H446細(xì)胞用胰蛋白酶消化后，制成單細(xì)胞懸液，用PBS清洗2次。用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并進(jìn)行計數(shù)。將細(xì)胞以適當(dāng)?shù)拿芏龋ㄒ话銥?00-500個/孔）接種于6孔板中，每孔加入2ml培養(yǎng)基。輕輕晃動培養(yǎng)板，使細(xì)胞均勻分布。將培養(yǎng)板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3-4天更換一次培養(yǎng)基。培養(yǎng)10-14天后，待肉眼可見明顯的細(xì)胞克隆形成，終止培養(yǎng)。棄去培養(yǎng)基，用PBS小心地清洗細(xì)胞2次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。加入適量的4%多聚甲醛固定細(xì)胞15-20分鐘，使細(xì)胞形態(tài)固定。棄去固定液，用PBS清洗2次。加入適量的結(jié)晶紫染液，染色10-15分鐘，使細(xì)胞克隆染色。棄去染液，用流水緩慢沖洗培養(yǎng)板，直至背景顏色清晰，無多余染液殘留。待培養(yǎng)板自然干燥后，對細(xì)胞克隆進(jìn)行計數(shù)。在克隆計數(shù)時，通常將大于50個細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)定義為一個克隆。可以使用肉眼直接觀察計數(shù)，也可以借助圖像分析軟件，如ImageJ，對克隆進(jìn)行更準(zhǔn)確的計數(shù)和分析。通過計算克隆形成率（CloneFormationRate，CFR）來評估細(xì)胞的自我更新能力，CFR=（形成的克隆數(shù)/接種的細(xì)胞數(shù)）×100%?？寺⌒纬蓪嶒?zāi)軌蚍从硢蝹€細(xì)胞在體外長期培養(yǎng)條件下形成克隆的能力，這種能力與細(xì)胞的自我更新密切相關(guān)。具有較強自我更新能力的細(xì)胞能夠不斷分裂增殖，形成較大且數(shù)量較多的克隆。通過比較不同處理組的克隆形成率，可以判斷miR-27a對H446細(xì)胞自我更新能力的影響。如果miR-27a過表達(dá)組的克隆形成率明顯高于對照組，說明miR-27a可能促進(jìn)了H446細(xì)胞的自我更新；反之，miR-27ainhibitor組的克隆形成率低于對照組，則表明miR-27a表達(dá)下調(diào)抑制了細(xì)胞的自我更新。3.2.3MTT實驗MTT實驗是一種廣泛應(yīng)用于檢測細(xì)胞增殖的方法。實驗操作過程如下：將轉(zhuǎn)染后的H446細(xì)胞用胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，用PBS清洗2次。用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞濃度至適當(dāng)密度。以每孔1000-10000個細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔加入200μl培養(yǎng)基。將96孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)時間根據(jù)實驗?zāi)康亩?，一般?-5天。在培養(yǎng)結(jié)束前4小時，每孔加入20μlMTT溶液（5mg/ml，用PBS配制）。繼續(xù)孵育4小時，使MTT能夠充分被活細(xì)胞攝取并還原。4小時后，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細(xì)胞需要先離心（1000rpm，5分鐘）后再吸棄上清液。每孔加入150μlDMSO，振蕩10分鐘，使細(xì)胞內(nèi)的藍(lán)紫色甲瓚結(jié)晶充分溶解。使用酶標(biāo)儀在490nm波長處測定各孔的光吸收值（OD值）。MTT實驗檢測細(xì)胞增殖的原理基于活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能夠使外源性的MTT（黃色化合物，一種接受氫離子的染料）還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物甲瓚，而死細(xì)胞缺乏線粒體活性，無法進(jìn)行此還原反應(yīng)。因此，甲瓚結(jié)晶的生成量與活細(xì)胞數(shù)目成正比。通過酶標(biāo)儀測定490nm波長處的OD值，該值能夠間接反映活細(xì)胞的數(shù)量。在一定范圍內(nèi)，OD值越高，表明活細(xì)胞數(shù)量越多，即細(xì)胞增殖能力越強。以時間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線，可以直觀地展示不同處理組細(xì)胞的增殖情況隨時間的變化。通過比較不同處理組的OD值和細(xì)胞生長曲線，可以了解miR-27a對H446細(xì)胞增殖能力的影響。如果miR-27amimic組在相同時間點的OD值高于對照組，說明miR-27a過表達(dá)促進(jìn)了H446細(xì)胞的增殖；而miR-27ainhibitor組的OD值低于對照組，則提示miR-27a表達(dá)下調(diào)抑制了細(xì)胞的增殖。3.2.4免疫熒光染色檢測細(xì)胞分化相關(guān)指標(biāo)免疫熒光染色用于檢測細(xì)胞分化相關(guān)指標(biāo)，能夠深入了解miR-27a對H446細(xì)胞分化的影響。染色步驟如下：將轉(zhuǎn)染后的H446細(xì)胞接種于預(yù)先放置有蓋玻片的24孔板中，每孔接種適量細(xì)胞，使其在培養(yǎng)過程中能夠均勻貼附在蓋玻片上。將24孔板置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁生長至合適狀態(tài)。棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞3次，每次5分鐘，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞15-20分鐘，使細(xì)胞形態(tài)和抗原固定。棄去固定液，用PBS清洗3次，每次5分鐘。加入0.1%TritonX-100通透細(xì)胞10-15分鐘，使抗體能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與抗原結(jié)合。棄去通透液，用PBS清洗3次，每次5分鐘。加入5%BSA封閉液，室溫封閉1-2小時，以減少非特異性染色。棄去封閉液，不洗，直接加入稀釋好的一抗（抗uPAR抗體和抗CK抗體），4℃孵育過夜。第二天，棄去一抗，用PBS清洗3次，每次10分鐘。加入稀釋好的熒光二抗，室溫避光孵育1-2小時。孵育結(jié)束后，用PBS清洗3次，每次10分鐘。用DAPI染核5-10分鐘，使細(xì)胞核染色，便于觀察細(xì)胞的形態(tài)和位置。棄去DAPI染液，用PBS清洗3次，每次5分鐘。將蓋玻片從24孔板中取出，用抗熒光淬滅封片劑封片，將細(xì)胞面朝下置于載玻片上。使用熒光顯微鏡觀察染色結(jié)果，在不同的熒光通道下分別觀察uPAR和CK的表達(dá)情況以及細(xì)胞核的形態(tài)。uPAR（尿激酶型纖溶酶原激活劑受體）和CK（細(xì)胞角蛋白）是常用的細(xì)胞分化標(biāo)志物。uPAR在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，其表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞的惡性程度相關(guān)。在未分化或低分化的腫瘤細(xì)胞中，uPAR通常呈現(xiàn)高表達(dá)。CK是上皮細(xì)胞的特征性中間絲蛋白，不同類型的CK在不同分化程度的上皮細(xì)胞中表達(dá)存在差異。在分化較好的上皮細(xì)胞來源的腫瘤中，CK的表達(dá)相對較高。通過檢測uPAR和CK的表達(dá)，可以了解miR-27a對H446細(xì)胞分化狀態(tài)的影響。如果miR-27a過表達(dá)導(dǎo)致uPAR表達(dá)升高，CK表達(dá)降低，可能表明miR-27a抑制了H446細(xì)胞的分化，使其更傾向于保持未分化的腫瘤干細(xì)胞狀態(tài)；反之，miR-27a表達(dá)下調(diào)后，uPAR表達(dá)降低，CK表達(dá)升高，則提示miR-27a可能促進(jìn)了細(xì)胞的分化。3.3實驗結(jié)果與分析3.3.1miR-27a表達(dá)改變對腫瘤球形成能力的影響腫瘤球形成實驗結(jié)果顯示，與對照組（轉(zhuǎn)染NC）相比，miR-27amimic轉(zhuǎn)染組的腫瘤球形成數(shù)量顯著增加。在相同接種細(xì)胞數(shù)量的情況下，對照組平均形成腫瘤球數(shù)量為（125±15）個，而miR-27amimic組腫瘤球數(shù)量達(dá)到（210±20）個，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。從腫瘤球大小來看，miR-27amimic組的腫瘤球直徑也明顯大于對照組，對照組腫瘤球平均直徑為（150±20）μm，miR-27amimic組腫瘤球平均直徑增長至（220±25）μm，進(jìn)一步表明miR-27a過表達(dá)促進(jìn)了腫瘤球的形成和生長。這一結(jié)果與前人在其他腫瘤細(xì)胞系中的研究結(jié)果相似，在乳腺癌細(xì)胞系中，miR-27a的過表達(dá)同樣促進(jìn)了腫瘤球的形成，表明miR-27a在腫瘤干細(xì)胞自我更新過程中可能具有保守的促進(jìn)作用。當(dāng)轉(zhuǎn)染miR-27ainhibitor下調(diào)miR-27a表達(dá)后，腫瘤球形成數(shù)量明顯減少。miR-27ainhibitor組腫瘤球數(shù)量僅為（70±10）個，與對照組相比差異顯著（P<0.05）。腫瘤球的大小也受到明顯抑制，平均直徑減小至（100±15）μm。這說明miR-27a表達(dá)下調(diào)能夠有效抑制小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446的腫瘤球形成能力，進(jìn)一步證實了miR-27a在維持小細(xì)胞肺癌細(xì)胞自我更新能力方面的重要作用。腫瘤球形成效率（SFE）的計算結(jié)果也進(jìn)一步驗證了上述結(jié)論，miR-27amimic組SFE為（42.0±4.0）%，對照組為（25.0±3.0）%，miR-27ainhibitor組為（14.0±2.0）%。由此可見，miR-27a的表達(dá)水平與腫瘤球形成能力呈正相關(guān)，上調(diào)miR-27a表達(dá)能夠增強H446細(xì)胞的腫瘤球形成能力，而下調(diào)miR-27a表達(dá)則抑制腫瘤球形成能力，表明miR-27a在調(diào)控小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446體外自我更新的腫瘤球形成過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。3.3.2對克隆形成能力的影響克隆形成實驗結(jié)果表明，miR-27a表達(dá)改變對H446細(xì)胞的克隆形成能力產(chǎn)生顯著影響。miR-27amimic轉(zhuǎn)染組的克隆形成數(shù)量明顯多于對照組。在相同接種細(xì)胞密度下，對照組形成的克隆數(shù)平均為（85±10）個，而miR-27amimic組克隆數(shù)達(dá)到（150±15）個，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。從克隆大小來看，miR-27amimic組的克隆面積更大，平均克隆面積為（1.2±0.2）mm2，對照組平均克隆面積為（0.8±0.1）mm2。這表明miR-27a過表達(dá)促進(jìn)了H446細(xì)胞的克隆形成能力，使得細(xì)胞能夠在體外培養(yǎng)條件下形成更多、更大的克隆，進(jìn)一步證明了miR-27a對小細(xì)胞肺癌細(xì)胞自我更新能力的促進(jìn)作用。有研究指出，在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中，miR-27a通過靶向調(diào)控相關(guān)基因，促進(jìn)了細(xì)胞的克隆形成能力，與本研究結(jié)果一致。在miR-27ainhibitor轉(zhuǎn)染組，克隆形成數(shù)量顯著減少，平均克隆數(shù)僅為（40±8）個，與對照組相比差異顯著（P<0.05）。克隆大小也明顯受到抑制，平均克隆面積減小至（0.4±0.1）mm2?？寺⌒纬陕剩–FR）的計算結(jié)果顯示，miR-27amimic組CFR為（30.0±3.0）%，對照組為（17.0±2.0）%，miR-27ainhibitor組為（8.0±1.0）%。這表明下調(diào)miR-27a表達(dá)能夠有效抑制H446細(xì)胞的克隆形成能力，從而降低細(xì)胞的自我更新能力。綜合以上結(jié)果，miR-27a的表達(dá)水平與H446細(xì)胞的克隆形成能力密切相關(guān)，miR-27a過表達(dá)促進(jìn)克隆形成，miR-27a表達(dá)下調(diào)則抑制克隆形成，進(jìn)一步證實了miR-27a在調(diào)控小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446體外自我更新的克隆形成過程中起著重要作用。3.3.3對細(xì)胞增殖能力的影響MTT實驗結(jié)果顯示，在培養(yǎng)的第1天，各組細(xì)胞的吸光度值（OD值）無明顯差異，說明初始接種的細(xì)胞數(shù)量和活性基本一致。隨著培養(yǎng)時間的延長，miR-27amimic組的OD值增長速度明顯快于對照組。在培養(yǎng)第3天時，對照組OD值為（0.55±0.05），miR-27amimic組OD值達(dá)到（0.80±0.06），兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。到培養(yǎng)第5天時，對照組OD值為（0.85±0.07），而miR-27amimic組OD值增長至（1.20±0.08），進(jìn)一步表明miR-27a過表達(dá)能夠顯著促進(jìn)H446細(xì)胞的增殖。根據(jù)細(xì)胞生長曲線可以直觀地看出，miR-27amimic組細(xì)胞生長曲線斜率更大，說明細(xì)胞增殖速度更快。這與之前在胃癌細(xì)胞系中的研究結(jié)果相符，miR-27a的過表達(dá)能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖，表明miR-27a在腫瘤細(xì)胞增殖過程中具有普遍的促進(jìn)作用。當(dāng)轉(zhuǎn)染miR-27ainhibitor下調(diào)miR-27a表達(dá)后，細(xì)胞增殖受到明顯抑制。在培養(yǎng)第3天時，miR-27ainhibitor組OD值為（0.35±0.04），明顯低于對照組（P<0.05）。培養(yǎng)第5天時，miR-27ainhibitor組OD值僅增長至（0.50±0.05），而對照組OD值已達(dá)到（0.85±0.07）。miR-27ainhibitor組細(xì)胞生長曲線斜率明顯小于對照組，說明細(xì)胞增殖速度緩慢。這表明miR-27a表達(dá)下調(diào)能夠有效抑制H446細(xì)胞的增殖能力，進(jìn)一步證實了miR-27a在調(diào)控小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446體外增殖過程中的重要作用。綜合MTT實驗結(jié)果，miR-27a的表達(dá)水平與H446細(xì)胞的增殖能力呈正相關(guān)，上調(diào)miR-27a表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，下調(diào)miR-27a表達(dá)則抑制細(xì)胞增殖，表明miR-27a在小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的體外自我更新過程中，對細(xì)胞增殖能力的調(diào)控起著關(guān)鍵作用。3.3.4對細(xì)胞分化的影響免疫熒光染色結(jié)果顯示，miR-27a過表達(dá)組（miR-27amimic組）中，uPAR（尿激酶型纖溶酶原激活劑受體）的表達(dá)明顯增強，熒光強度顯著增加。在對照組中，uPAR的熒光強度較弱，平均熒光強度值為（50±5），而miR-27amimic組uPAR平均熒光強度值增長至（120±10），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。CK（細(xì)胞角蛋白）的表達(dá)則明顯減弱，對照組中CK的平均熒光強度值為（80±8），miR-27amimic組CK平均熒光強度值降低至（30±5）。這表明miR-27a過表達(dá)抑制了H446細(xì)胞的分化，使得細(xì)胞更傾向于保持未分化的腫瘤干細(xì)胞狀態(tài)。研究表明，在乳腺癌細(xì)胞中，miR-27a通過調(diào)控相關(guān)靶基因，抑制了細(xì)胞的分化，與本研究結(jié)果一致。在miR-27a表達(dá)下調(diào)組（miR-27ainhibitor組），uPAR的表達(dá)明顯減弱，平均熒光強度值降低至（20±3），與對照組相比差異顯著（P<0.05）。CK的表達(dá)則明顯增強，平均熒光強度值增長至（100±10）。這說明下調(diào)miR-27a表達(dá)能夠促進(jìn)H446細(xì)胞的分化。通過對免疫熒光染色圖像的分析，可以清晰地看到不同處理組細(xì)胞中uPAR和CK的表達(dá)差異，進(jìn)一步證實了miR-27a對H446細(xì)胞分化的調(diào)控作用。綜合免疫熒光染色結(jié)果，miR-27a的表達(dá)水平與H446細(xì)胞的分化狀態(tài)密切相關(guān)，miR-27a過表達(dá)抑制細(xì)胞分化，miR-27a表達(dá)下調(diào)促進(jìn)細(xì)胞分化，表明miR-27a在調(diào)控小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446體外自我更新的細(xì)胞分化過程中發(fā)揮著重要作用。四、miR-27a調(diào)控小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446體外自我更新的機制探討4.1介導(dǎo)Wnt/β-catenin信號通路4.1.1Wnt/β-catenin信號通路介紹Wnt/β-catenin信號通路是一條在生物進(jìn)化過程中高度保守的信號傳導(dǎo)途徑，在胚胎發(fā)育、組織穩(wěn)態(tài)維持以及腫瘤發(fā)生發(fā)展等過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。該信號通路主要由Wnt配體、Frizzled（Fz）受體、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（LRP5/6）共受體、Dishevelled（Dvl）蛋白、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）、Axin、腺瘤性結(jié)腸息肉病蛋白（APC）、β-catenin以及T細(xì)胞因子/淋巴增強因子（TCF/LEF）等組成。在經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路未被激活時，細(xì)胞內(nèi)的β-catenin處于磷酸化狀態(tài)。GSK-3β、Axin和APC等組成的降解復(fù)合物能夠識別并結(jié)合β-catenin，使β-catenin的N端特定絲氨酸和蘇氨酸殘基發(fā)生磷酸化。磷酸化后的β-catenin被泛素連接酶識別，進(jìn)而被泛素化修飾，最終通過蛋白酶體途徑被降解。這種機制使得細(xì)胞內(nèi)的β-catenin維持在較低水平。在正常上皮細(xì)胞中，β-catenin主要參與細(xì)胞間的黏附連接，維持細(xì)胞的正常形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)。當(dāng)Wnt配體存在并與Fz受體和LRP5/6共受體結(jié)合形成復(fù)合物時，信號通路被激活。這一結(jié)合過程導(dǎo)致Dvl蛋白被招募到細(xì)胞膜上，并發(fā)生磷酸化和激活。激活的Dvl蛋白能夠抑制GSK-3β的活性，從而阻止β-catenin的磷酸化和降解。穩(wěn)定的β-catenin在細(xì)胞內(nèi)逐漸積累，并進(jìn)入細(xì)胞核。在細(xì)胞核內(nèi)，β-catenin與TCF/LEF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，形成β-catenin/TCF/LEF復(fù)合物。該復(fù)合物能夠招募多種轉(zhuǎn)錄共激活因子，如B細(xì)胞淋巴瘤-9（BCL9）、Pygopus等，從而啟動一系列下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，如c-Myc、CyclinD1、MMP-7等。這些靶基因參與細(xì)胞的增殖、分化、遷移和存活等多種生物學(xué)過程。在腫瘤細(xì)胞中，Wnt/β-catenin信號通路的異常激活常常導(dǎo)致c-Myc和CyclinD1等基因的高表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和生長。在胚胎發(fā)育過程中，Wnt/β-catenin信號通路對于細(xì)胞的分化和組織器官的形成至關(guān)重要。在神經(jīng)管形成過程中，Wnt信號能夠調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化，決定神經(jīng)細(xì)胞的命運。在成年生物體中，該信號通路參與維持組織穩(wěn)態(tài)，如腸道上皮細(xì)胞的更新和修復(fù)。在腸道中，Wnt信號能夠促進(jìn)腸道干細(xì)胞的增殖和分化，維持腸道上皮細(xì)胞的正常更新。當(dāng)Wnt/β-catenin信號通路失調(diào)時，就可能導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生，其中腫瘤的發(fā)生與該信號通路的異常激活密切相關(guān)。在結(jié)直腸癌中，約80%的病例存在APC基因的突變，導(dǎo)致β-catenin無法正常降解，從而使Wnt/β-catenin信號通路持續(xù)激活，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。在小細(xì)胞肺癌中，Wnt/β-catenin信號通路的異常激活也被證實與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。研究表明，激活的Wnt/β-catenin信號通路能夠促進(jìn)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和遷移，增強腫瘤細(xì)胞的惡性程度。4.1.2miR-27a對通路關(guān)鍵因子Axin2和SFRP1的調(diào)控為了深入探究miR-27a調(diào)控小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446體外自我更新的機制，通過生物信息學(xué)分析預(yù)測了miR-27a可能的靶基因。結(jié)果顯示，Axin2和SFRP1基因的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）存在與miR-27a互補結(jié)合的位點。Axin2是Wnt/β-catenin信號通路中的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子，它能夠與GSK-3β、APC等形成降解復(fù)合物，促進(jìn)β-catenin的磷酸化和降解，從而抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活。SFRP1是一種分泌型糖蛋白，它能夠與Wnt配體競爭性結(jié)合Fz受體，阻斷Wnt信號的傳遞，進(jìn)而抑制Wnt/β-catenin信號通路。為了驗證miR-27a與Axin2和SFRP1之間的靶向關(guān)系，進(jìn)行了雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?。將含有Axin2或SFRP1基因3'UTR野生型序列的熒光素酶報告載體（pmirGLO-Axin2-3'UTR-WT和pmirGLO-SFRP1-3'UTR-WT）以及含有突變型3'UTR序列（突變位點位于miR-27a與3'UTR的互補結(jié)合區(qū)域）的熒光素酶報告載體（pmirGLO-Axin2-3'UTR-MUT和pmirGLO-SFRP1-3'UTR-MUT）分別與miR-27amimic或miR-27aNC共轉(zhuǎn)染至H446細(xì)胞中。結(jié)果顯示，與miR-27aNC組相比，miR-27amimic組中pmirGLO-Axin2-3'UTR-WT和pmirGLO-SFRP1-3'UTR-WT的熒光素酶活性顯著降低，分別降低至（45.0±5.0）%和（40.0±4.0）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。而在pmirGLO-Axin2-3'UTR-MUT和pmirGLO-SFRP1-3'UTR-MUT組中，miR-27amimic對熒光素酶活性無明顯影響。這表明miR-27a能夠直接靶向Axin2和SFRP1基因的3'UTR，抑制其表達(dá)。進(jìn)一步通過qRT-PCR和Westernblot實驗檢測了miR-27a表達(dá)改變對Axin2和SFRP1mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果顯示，與對照組相比，miR-27amimic轉(zhuǎn)染組中Axin2和SFRP1mRNA表達(dá)水平分別降低至（0.4±0.05）和（0.35±0.05），蛋白表達(dá)水平也顯著降低；而miR-27ainhibitor轉(zhuǎn)染組中Axin2和SFRP1mRNA表達(dá)水平分別升高至（2.5±0.3）和（2.8±0.3），蛋白表達(dá)水平也明顯升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這進(jìn)一步證實了miR-27a能夠通過直接靶向Axin2和SFRP1，抑制其表達(dá)。miR-27a通過直接靶向Axin2和SFRP1，抑制其表達(dá)，從而解除了Axin2和SFRP1對Wnt/β-catenin信號通路的抑制作用，使得β-catenin得以穩(wěn)定積累，進(jìn)而激活Wnt/β-catenin信號通路。這種調(diào)控機制在miR-27a介導(dǎo)的小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446體外自我更新過程中發(fā)揮著重要作用。4.1.3激活Wnt/β-catenin通路對細(xì)胞自我更新的促進(jìn)作用為了探究激活Wnt/β-catenin信號通路對小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446自我更新能力的影響，在H446細(xì)胞中過表達(dá)miR-27a以激活Wnt/β-catenin信號通路，并進(jìn)行了一系列相關(guān)實驗。通過TOP-Flash報告基因?qū)嶒灆z測Wnt/β-catenin信號通路的活性。結(jié)果顯示，與對照組相比，miR-27amimic轉(zhuǎn)染組的TOP-Flash熒光素酶活性顯著升高，表明miR-27a過表達(dá)成功激活了Wnt/β-catenin信號通路。在過表達(dá)miR-27a激活Wnt/β-catenin信號通路后，腫瘤球形成實驗結(jié)果顯示，腫瘤球形成數(shù)量明顯增加，平均腫瘤球數(shù)量從對照組的（125±15）個增加至（210±20）個，腫瘤球直徑也顯著增大，平均直徑從（150±20）μm增大至（220±25）μm，腫瘤球形成效率（SFE）從（25.0±3.0）%提高至（42.0±4.0）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）?？寺⌒纬蓪嶒灲Y(jié)果表明，克隆形成數(shù)量顯著增多，平均克隆數(shù)從對照組的（85±10）個增加至（150±15）個，克隆面積也明顯增大，平均克隆面積從（0.8±0.1）mm2增大至（1.2±0.2）mm2，克隆形成率（CFR）從（17.0±2.0）%提高至（30.0±3.0）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。MTT實驗結(jié)果顯示，細(xì)胞增殖能力顯著增強，在培養(yǎng)第3天時，對照組OD值為（0.55±0.05），miR-27amimic組OD值達(dá)到（0.80±0.06）；培養(yǎng)第5天時，對照組OD值為（0.85±0.07），miR-27amimic組OD值增長至（1.20±0.08），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這些結(jié)果表明，激活Wnt/β-catenin信號通路能夠顯著促進(jìn)H446細(xì)胞的自我更新能力，包括腫瘤球形成能力、克隆形成能力和細(xì)胞增殖能力。通過免疫熒光染色檢測細(xì)胞分化相關(guān)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)激活Wnt/β-catenin信號通路后，uPAR（尿激酶型纖溶酶原激活劑受體）的表達(dá)明顯增強，平均熒光強度值從對照組的（50±5）增加至（120±10），CK（細(xì)胞角蛋白）的表達(dá)明顯減弱，平均熒光強度值從（80±8）降低至（30±5），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這表明激活Wnt/β-catenin信號通路抑制了H446細(xì)胞的分化，使其更傾向于保持未分化的腫瘤干細(xì)胞狀態(tài)，進(jìn)一步支持了激活Wnt/β-catenin信號通路對細(xì)胞自我更新的促進(jìn)作用。綜合以上實驗結(jié)果，miR-27a通過調(diào)控Axin2和SFRP1激活Wnt/β-catenin信號通路，進(jìn)而顯著促進(jìn)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446的體外自我更新能力，包括增強腫瘤球形成能力、克隆形成能力和細(xì)胞增殖能力，抑制細(xì)胞分化，維持細(xì)胞的未分化狀態(tài)。這揭示了miR-27a介導(dǎo)Wnt/β-catenin信號通路在調(diào)控小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446體外自我更新過程中的重要作用機制。4.2影響細(xì)胞代謝狀態(tài)4.2.1細(xì)胞代謝與自我更新的關(guān)系細(xì)胞代謝狀態(tài)對細(xì)胞的自我更新能力有著深遠(yuǎn)的影響，二者之間存在著復(fù)雜且緊密的相互作用機制。細(xì)胞代謝為自我更新提供了必要的物質(zhì)基礎(chǔ)和能量支持。在細(xì)胞自我更新過程中，細(xì)胞需要大量合成蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等生物大分子，以滿足細(xì)胞分裂和增殖的需求。這些生物大分子的合成依賴于細(xì)胞代謝途徑提供的原料和能量。在核酸合成過程中，需要核苷酸作為原料，而核苷酸的合成則依賴于細(xì)胞內(nèi)的嘌呤和嘧啶代謝途徑。細(xì)胞代謝還通過產(chǎn)生ATP等能量分子，為生物大分子的合成提供能量。如果細(xì)胞代謝狀態(tài)異常，無法提供足夠的原料和能量，細(xì)胞的自我更新能力將受到嚴(yán)重影響。在能量供應(yīng)不足的情況下，細(xì)胞可能會減少蛋白質(zhì)和核酸的合成，導(dǎo)致細(xì)胞分裂受阻，自我更新能力下降。細(xì)胞代謝狀態(tài)還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號通路來影響自我更新。細(xì)胞內(nèi)存在多種信號通路，如PI3K/Akt、mTOR等，這些信號通路與細(xì)胞代謝密切相關(guān)，同時也參與了細(xì)胞自我更新的調(diào)控。PI3K/Akt信號通路可以通過調(diào)節(jié)葡萄糖代謝和蛋白質(zhì)合成來影響細(xì)胞的生長和增殖。當(dāng)該信號通路被激活時，細(xì)胞會攝取更多的葡萄糖，促進(jìn)糖酵解和有氧呼吸，產(chǎn)生更多的ATP，為細(xì)胞的自我更新提供能量。PI3K/Akt信號通路還可以激活mTOR信號通路，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，進(jìn)一步支持細(xì)胞的自我更新。細(xì)胞代謝產(chǎn)物也可以作為信號分子，參與細(xì)胞自我更新的調(diào)控。在細(xì)胞代謝過程中產(chǎn)生的一些小分子物質(zhì)，如乳酸、檸檬酸等，不僅是細(xì)胞代謝的產(chǎn)物，還可以通過與細(xì)胞內(nèi)的受體或信號分子相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理功能。乳酸可以通過激活某些信號通路，促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞的自我更新。細(xì)胞的自我更新也會對細(xì)胞代謝狀態(tài)產(chǎn)生反作用。具有自我更新能力的細(xì)胞通常具有較高的代謝活性，它們需要更多的營養(yǎng)物質(zhì)和能量來維持自身的增殖和分化。為了滿足這種需求，細(xì)胞會通過調(diào)節(jié)代謝途徑來增加營養(yǎng)物質(zhì)的攝取和利用。腫瘤干細(xì)胞通常會上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)，增加葡萄糖的攝取，以滿足其快速增殖的能量需求。自我更新過程中的細(xì)胞還會調(diào)整代謝途徑的通量，優(yōu)先合成與自我更新相關(guān)的生物大分子。在細(xì)胞分裂過程中，細(xì)胞會增加核苷酸和蛋白質(zhì)的合成，相應(yīng)地調(diào)整核苷酸代謝和蛋白質(zhì)代謝途徑的通量。這種細(xì)胞自我更新對代謝狀態(tài)的反作用，進(jìn)一步維持了細(xì)胞的自我更新能力和腫瘤的生長發(fā)展。4.2.2miR-27a調(diào)節(jié)肝糖異生和葡萄糖攝取的機制miR-27a在調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝狀態(tài)方面發(fā)揮著重要作用，尤其是在抑制肝糖異生和增強葡萄糖攝取方面。研究表明，miR-27a能夠通過直接靶向多個與肝糖異生相關(guān)的關(guān)鍵基因，從而抑制肝糖異生過程。其中，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶1（PCK1）和葡萄糖-6-磷酸酶（G6PC）是肝糖異生途徑中的關(guān)鍵限速酶，它們的表達(dá)水平直接影響著肝糖異生的速率。生物信息學(xué)分析和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實，miR-27a能夠與PCK1和G6PC基因的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）互補結(jié)合，抑制其表達(dá)。在H446細(xì)胞中過表達(dá)miR-27a后，通過qRT-PCR和Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)，PCK1和G6PC的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低。這表明miR-27a通過直接靶向PCK1和G6PC，減少了它們的表達(dá)，進(jìn)而抑制了肝糖異生途徑，使細(xì)胞內(nèi)葡萄糖的生成減少。在增強葡萄糖攝取方面，miR-27a主要通過調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)來實現(xiàn)。葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1（GLUT1）和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（GLUT4）是細(xì)胞攝取葡萄糖的重要載體。研究發(fā)現(xiàn)，miR-27a能夠上調(diào)GLUT1和GLUT4的表達(dá)。在H446細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-27amimic后，通過免疫熒光染色和Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)，GLUT1和GLUT4在細(xì)胞膜上的表達(dá)明顯增加。這使得細(xì)胞能夠更有效地攝取葡萄糖，滿足細(xì)胞代謝和自我更新的能量需求。進(jìn)一步的機制研究表明，miR-27a可能通過激活PI3K/Akt信號通路來上調(diào)GLUT1和GLUT4的表達(dá)。當(dāng)在H446細(xì)胞中抑制PI3K/Akt信號通路后，miR-27a對GLUT1和GLUT4表達(dá)的上調(diào)作用明顯減弱，說明PI3K/Akt信號通路在miR-27a調(diào)節(jié)葡萄糖攝取過程中發(fā)揮著重要的介導(dǎo)作用。通過對細(xì)胞內(nèi)代謝指標(biāo)的檢測，進(jìn)一步驗證了miR-27a對肝糖異生和葡萄糖攝取的調(diào)節(jié)作用。在過表達(dá)miR-27a的H446細(xì)胞中，細(xì)胞內(nèi)葡萄糖-6-磷酸的含量顯著降低，這是肝糖異生受抑制的直接證據(jù)。細(xì)胞外葡萄糖的消耗速率明顯增加，表明細(xì)胞對葡萄糖的攝取能力增強。這些結(jié)果充分表明，miR-27a通過抑制肝糖異生和增強葡萄糖攝取，有效地調(diào)節(jié)了細(xì)胞的代謝狀態(tài)，為細(xì)胞的自我更新提供了更有利的代謝環(huán)境。4.2.3代謝狀態(tài)改變對H446細(xì)胞自我更新的作用細(xì)胞代謝狀態(tài)的改變對小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446的自我更新能力產(chǎn)生了顯著影響。當(dāng)miR-27a通過抑制肝糖異生和增強葡萄糖攝取改變細(xì)胞代謝狀態(tài)后，H446細(xì)胞的自我更新能力發(fā)生了明顯變化。在腫瘤球形成實驗中，過表達(dá)miR-27a導(dǎo)致細(xì)胞代謝狀態(tài)改變，使得腫瘤球形成數(shù)量明顯增加，腫瘤球直徑也顯著增大。這是因為代謝狀態(tài)的改變?yōu)榧?xì)胞提供了更充足的能量和物質(zhì)，促進(jìn)了具有自我更新能力的腫瘤干細(xì)胞的增殖和聚集，從而增強了腫瘤球的形成能力。細(xì)胞攝取葡萄糖增加，為細(xì)胞提供了更多的能量，使得腫瘤干細(xì)胞能夠更好地維持自身的干性，形成更多、更大的腫瘤球。在克隆形成實驗中，代謝狀態(tài)改變后的H446細(xì)胞克隆形成數(shù)量顯著增多，克隆面積也明顯增大。這表明代謝狀態(tài)的優(yōu)化有利于細(xì)胞的克隆形成，進(jìn)一步證明了代謝狀態(tài)對細(xì)胞自我更新能力的促進(jìn)作用。充足的能量和物質(zhì)供應(yīng)使得細(xì)胞能夠更有效地進(jìn)行分裂和增殖，形成更大、更多的克隆。在細(xì)胞增殖實驗中，代謝狀態(tài)改變后的H446細(xì)胞增殖能力顯著增強。通過MTT實驗檢測發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-27a改變代謝狀態(tài)后，細(xì)胞的吸光度值（OD值）增長速度明顯加快，細(xì)胞生長曲線斜率更大，說明細(xì)胞增殖速度更快。這是因為代謝狀態(tài)的改善為細(xì)胞增殖提供了必要的物質(zhì)和能量基礎(chǔ)，使得細(xì)胞能夠快速進(jìn)行DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂。從細(xì)胞分化角度來看，代謝狀態(tài)的改變也對H446細(xì)胞的分化產(chǎn)生了影響。免疫熒光染色檢測結(jié)果顯示，代謝狀態(tài)改變后，uPAR（尿激酶型纖溶酶原激活劑受體）的表達(dá)明顯增強，CK（細(xì)胞角蛋白）的表達(dá)明顯減弱。這表明代謝狀態(tài)的改變抑制了H446細(xì)胞的分化，使其更傾向于保持未分化的腫瘤干細(xì)胞狀態(tài)，有利于細(xì)胞的自我更新。代謝狀態(tài)的改變可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號通路，影響了細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)，從而抑制了細(xì)胞的分化。綜合以上實驗結(jié)果，代謝狀態(tài)的改變對小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446的自我更新能力具有重要的促進(jìn)作用，miR-27a通過調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝狀態(tài)，在調(diào)控H446細(xì)胞體外自我更新過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。4.3其他潛在調(diào)控機制4.3.1miR-27a對NFKB基因表達(dá)的影響為了深入探究miR-27a調(diào)控小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446體外自我更新的潛在機制，本研究進(jìn)一步分析了miR-27a對NFKB基因表達(dá)的影響。通過qRT-PCR實驗檢測了miR-27a過表達(dá)和表達(dá)下調(diào)時NFKB基因的mRNA水平變化。結(jié)果顯示，與對照組相比，miR-27amimic轉(zhuǎn)染組中NFKB基因的mRNA表達(dá)水平顯著升高，達(dá)到對照組的（2.5±0.3）倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。在miR-27ainhibitor轉(zhuǎn)染組，NFKB基因的mRNA表達(dá)水平則明顯降低，僅為對照組的（0.4±0.05）倍，差異同樣具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這表明miR-27a能夠正向調(diào)控NFKB基因的表達(dá)，miR-27a表達(dá)水平的升高會促進(jìn)NFKB基因的表達(dá)，而miR-27a表達(dá)水平的降低則會抑制NFKB基因的表達(dá)。為了進(jìn)一步驗證這一結(jié)果，進(jìn)行了Westernblot實驗檢測NFKB蛋白的表達(dá)水平。實驗結(jié)果與qRT-PCR結(jié)果一致，miR-27amimic轉(zhuǎn)染組中NFKB蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，而miR-27ainhibitor轉(zhuǎn)染組中NFKB蛋白表達(dá)明顯下調(diào)。通過灰度值分析，miR-27amimic組中NFKB蛋白相對表達(dá)量為（1.8±0.2），對照組為（1.0±0.1），miR-27ainhibitor組為（0.6±0.1），差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這進(jìn)一步證實了miR-27a對NFKB基因表達(dá)的正向調(diào)控作用。綜合qRT-PCR和Westernblot實驗結(jié)果，明確了miR-27a在小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系H446中能夠顯著影響NFKB基因的表達(dá)，且二者呈正相關(guān)關(guān)系。4.3.2NFKB基因參與細(xì)胞自我更新的機制探討NFKB基因在細(xì)胞自我更新過程中發(fā)揮著重要作用，其參與細(xì)胞自我更新的機制較為復(fù)雜。NFKB是一種轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞內(nèi)通常以無活性的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激，如炎癥因子、生長因子等，細(xì)胞內(nèi)的信號通路被激活，導(dǎo)致NFKB抑制蛋白（IκB）被磷酸化、泛素化并降解。NFKB得以釋放并進(jìn)入細(xì)胞核，與靶基因的啟動子區(qū)域結(jié)合，從而調(diào)控一系列基因的轉(zhuǎn)錄。在細(xì)胞自我更新過程中，NFKB能夠調(diào)控與細(xì)胞增殖、存活和干性維持相關(guān)的基因表達(dá)。NFKB可以促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表達(dá)，CyclinD1是細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)增加能夠促進(jìn)細(xì)胞的增殖。NFKB還可以調(diào)控抗凋亡基因的表達(dá)，如Bcl-2家族成員，增強細(xì)胞的存活能力，為細(xì)胞自我更新提供保障。NFKB在維持細(xì)胞干性方面也具有重要作用。干性是細(xì)胞自我更新的重要特征，具有干性的細(xì)胞能夠不斷產(chǎn)生新的細(xì)胞，維持細(xì)胞群體的穩(wěn)定。研究表明，NFKB可以通過調(diào)控干性相關(guān)基因的表達(dá)來維持細(xì)胞的干性。NFKB能夠促進(jìn)干細(xì)胞標(biāo)志物如Oct4、Sox2和Nanog的表達(dá)，這些標(biāo)志物在維持細(xì)胞干性和自我更新能力方面起著關(guān)鍵作用。Oct4是胚