人胃腺癌細胞株AGS、SGC-7901增殖誘導配體mRNA的表達〔作者:___________單位:___________:___________〕

【摘要】目的：比擬人AGS、SGC-7901兩種胃癌細胞株中增殖誘導配體(APRIL)mRNA的表達水平。方法：通過半定量RT-PCR檢測APRILmRNA，篩選出APRILmRNA高表達細胞株。結(jié)果：以GAPDH為內(nèi)參，通過計算機圖像掃描系統(tǒng)分析各株細胞APRILmRNA的表達量,獲得人胃腺癌細胞株APRILmRNA表達量的相對值，AGS0.09，SGC-79010.61。結(jié)論：SGC-7901為APRILmRNA高表達細胞株。

【關(guān)鍵詞】胃腺癌聚合酶鏈反響增殖誘導配體

[Abstract]Objective:Todetecttheexpressionofhuman’sstomachadenocarcinomacellline’sAPRILinthemRNAlevelbysemi-quantitaiveRT-PCR.Methods:WedetectedtheexpressionofAPRILmRNAinstomachadenocarcinomacellline(AGSandSGC-7901)byRT-PCR,andthenselectedhigh-levelexpressioncellline.Results:Usingbytheimagescanningsystem，GAPDHastheinternalcontrol,wegettherelativevalueofAGS0.09，SGC-79010.61.Conclusion:Selectinghigh-levelexpressionAPRILmRNAcelllineinstomachadenocarcinomabysemi-quantitativeRT-PCR,itdoesplayafundamentalroleintheresearchformolecularmechanismforstomachcancerdevelopingandmetastasizing.

[Keywords]Stomachadenocarcinoma;Polymerasechainreaction;Aproliferation-inducingligand

增殖誘導配體〔aproliferation-inducingligand，APRIL〕是腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor，TNF)超家族的成員之一[1，2]。主要通過靶細胞外表的兩個受體——穿膜蛋白活化物(TACI)和B細胞成熟抗原(BCMA)結(jié)合，從而促進腫瘤細胞的增殖，調(diào)節(jié)體液免疫，并參與B、T淋巴細胞增殖和活化[3~8]。已有研究證實APRIL在體內(nèi)和體外均能刺激腫瘤細胞生長，說明它與腫瘤生長的調(diào)節(jié)關(guān)系密切[3]。我們研究發(fā)現(xiàn)APRIL在胃癌病變演變過程中呈現(xiàn)累積和漸進趨勢。提示APRIL在胃癌發(fā)生、開展過程中可能起重要作用，但其分子機制還有待進一步研究證實。本研究采用半定量RT-PCR技術(shù)從2株胃腺癌細胞株中篩選出APRIL基因高表達細胞株，為進一步了解它在胃腺癌發(fā)生、開展過程中的作用及其分子機制等研究奠定實驗根底。

1材料與方法

1.1材料〔1〕細胞株及培養(yǎng)液：胃腺癌細胞株AGS、SGC-7901和胰腺癌細胞株CFPAC-1〔中科院上海生科院細胞資源中心〕，DMEM、IMDM、RPMI1640和Ham’sF12k細胞培養(yǎng)基〔美國Invitrogen公司〕，新生牛血清和胎牛血清〔Hyclone公司〕；〔2〕主要試劑和儀器：TRIzol〔Invitrogen公司〕，TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Taq聚合酶、限制性內(nèi)切酶〔TaKaRa生物技術(shù)公司，大連〕，XPThermalcyclePCR儀〔杭州博日〕，QueueStabil-Therm37℃恒溫孵育箱(RevcoTechnologiesUSA)；〔3〕引物：根據(jù)GenBankAPRIL基因序列〔NM003808.2〕和磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)基因序列〔NM002064〕，利用VECTORNTI軟件，設計引物，并由上海申能博彩生物工程公司合成。序列

APRIL1-F:5’–TCCGATGTGACAGAGGTGATG-3’,

APRIL1-R:5’-AATGGAAGACACCTGCGCTAT-3’;

APRIL2-R:5’-GCATACTTCTTATACATCGGAATAG-3’;

GAPDH-F:5’-TTAGCACCCCTGGCCAAGG-3’,

GAPDH-R:5’-CTTACTCCTTGGAGGCCATG-3’。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)分別用含10%胎牛血清的DMEM、IMDM、RPMI1640、Ham’sF12k和RPMI1640培養(yǎng)液，單層培養(yǎng)CFPAC-1、胰腺癌細胞株和AGS、SGC-7901胃腺癌細胞株于37℃、5%CO2飽和濕度恒溫孵育箱內(nèi)，以0.25%胰蛋白酶傳代消化。

1.2.2RNA提取和RT-PCR反響細胞株單層培養(yǎng)貼壁生長達90%時，0.25%胰蛋白酶消化搜集細胞，以106個腫瘤細胞加1mlTRIzol提取細胞總RNA，核酸蛋白紫外分析儀(島津公司〕檢測RNA的質(zhì)量和濃度。取總RNA1μg進行逆轉(zhuǎn)錄反響〔按說明書操作進行〕，42℃1h，95℃15min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，cDNA分裝置-20℃保存。將各細胞株等比例混合的cDNA為模板，取0.5μl在25μlPCR反響液〔含1×PCRBuffer，0.3mmol/LdNTPs，APRIL1號上下游引物和GAPDH上下游引物分別為0.6μmol/L和0.08μmol/L，TaKaRaTaqDNA聚合酶0.5U〕中進行PCR反響，并以無菌水為模板作空白對照。各反響管于XPThermalcyclePCR儀進行PCR：95℃預變性30s，然后94℃30s，55℃30s，72℃35s選取最正確PCR循環(huán)數(shù)，72℃延伸7min，4℃維持。

1.2.3玻璃粉法回收DNAPCR產(chǎn)物1.5%瓊脂糖凝膠電泳，將目的片段從膠上割下置離心管中，參加16mol/LNaI200μl55℃溫浴5min溶解，再參加1×TE(pH8.0)的玻璃粉溶液10μl，冰浴10min〔每隔3min吹打1次〕，離心去上清液，參加200μlNewwash液〔無菌水、乙醇、NaCl〕吹打均勻后離心10s去上清，這樣重復2次后55℃烘干，參加1×TE10μl吹打均勻后55℃加熱3min，離心5min取上清置另一Eppendorf管-20℃保存。

1.2.4酶切鑒定以引物APRIL1-F和APRIL1-R擴增APRIL基因第391~655位長度265bp片段。在APRIL基因第391~655位中含XhoI酶切位點，XhoI限制性內(nèi)切酶0.5μl每10μl體系，37℃酶切APRIL擴增片段3h，瓊脂糖凝膠電泳觀察條帶。

1.2.5套式PCR鑒定對擴增片段瓊脂糖凝膠電泳割膠回收作為模板,以APRIL1-F和APRIL2－R為引物PCR擴增第391~601位長度210bp的片段，1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀測結(jié)果。

1.2.6半定量PCR循環(huán)數(shù)確定及半定量PCR為了解各細胞株APRIL表達上下情況，需要在內(nèi)參GAPDH基因片段擴增產(chǎn)物濃度一致的情況下，比擬APRIL基因片段擴增產(chǎn)物濃度的上下。所以在其他條件〔反響液成份、退火溫度、延伸時間〕一致情況下，通過觀察PCR從27~33個循環(huán)GAPDH片段擴增產(chǎn)物濃度變化，確定其PCR反響的平臺期，確定觀察各細胞株APRIL表達上下的最正確循環(huán)數(shù)。根據(jù)PCR循環(huán)數(shù)摸索確定的最正確循環(huán)數(shù)，以各細胞株的cDNA為模板同時PCR擴增GAPDH和APRIL〔同步驟1.3.1〕，1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，通過計算機圖像掃描系統(tǒng)檢測獲得各細胞株APRIL表達量的相對值，根據(jù)該值確定APRIL高表達腫瘤細胞株。

2結(jié)果

2.1總RNA的質(zhì)量和純度及PCR擴增產(chǎn)物檢測以cDNA為模板，APRIL1-F、APRIL1-R和GAPDH-F、GAPDH-R兩對引物，在同一PCR管里擴增應得265bp、和540bp大小的目的片段，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示擴增出的目的片段大小與預期值相符合〔見圖1〕。

2.2PCR產(chǎn)物鑒定APRIL引物擴增片段經(jīng)XhoI限制性內(nèi)切酶酶切后電泳顯示較APRIL片段小，約150bp大小片段〔見圖2〕；APRIL1-F和APRIL2-R為引物，以回收的265bp大小APRIL片段為模板，PCR擴增391~601bp長度210bp的APRIL片段，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示擴增出的目的片段大小與預期值相符合〔見圖3〕。

2.3半定量PCR最正確循環(huán)數(shù)確實定及PCR半定量以混合的cDNA為模板，APRIL1-F、APRIL1-R和GAPDH-F、GAPDH-R兩對引物同時擴增，在其他條件一致情況下，27~33個循環(huán)的PCR，電泳結(jié)果顯示擴增出的GAPDH和APRIL片段條帶亮度隨循環(huán)數(shù)的增加而增加，第31循環(huán)時GAPDH的PCR反響進入平臺期，APRIL的PCR產(chǎn)物從第31循環(huán)開始已比擬明顯〔圖1〕。于是確定在第31循環(huán)對各細胞株APRIL表達進行半定量PCR。選取最正確PCR循環(huán)數(shù)，對各株細胞同時擴增GAPDH和APRIL基因片段。通過計算機圖像掃描系統(tǒng)分析各株細胞的APRILmRNA的表達量,AGS：0.09，SGC-7901：0.61。結(jié)果顯示在人胃腺癌細胞株中，SGC-7901的APRILmRNA水平表達相對較高〔見圖4、5〕。

3討論

TNF及其受體超家族通過誘導多種生物學效應，如細胞的增殖、分化及凋亡等，在機體的防御、炎癥反響、免疫調(diào)節(jié)等過程中起重要作用。APRIL是TNF超家族的成員之一，首先由Hahne等[1]發(fā)現(xiàn)并克隆成功，全長250個氨基酸，其編碼基因位于染色體17p13.1。研究發(fā)現(xiàn)，APRIL具有獨特的促進腫瘤細胞增殖的生物學效應。APRILmRNA在許多人類腫瘤細胞株〔結(jié)腸癌細胞株SW480、肺癌細胞株A459、黑色素瘤細胞株G361等〕和腫瘤組織〔結(jié)腸癌、胃癌、食管癌等〕中高表達，外加的低濃度重組APRIL能刺激體外培養(yǎng)多種人類腫瘤細胞株的增殖，轉(zhuǎn)染APRIL基因到NIH-3T3后裸鼠移植瘤腫瘤生長速度明顯高于NIH-3T3裸鼠移植瘤。這些證據(jù)充分說明APRIL在腫瘤發(fā)生過程中扮演自分泌生長因子的角色。APRIL作為一種細胞因子，在對靶細胞發(fā)生作用時，必須與其特異性受體結(jié)合，進而引起細胞內(nèi)一系列反響。

人胃腺癌細胞株是否存在APRIL基因表達國內(nèi)外鮮有報道。我們利用半定量RT-PCR對兩株胃癌細胞株〔AGS和SGC-7901〕APRILmRNA表達量的上下進行篩選。擴增GAPDH和APRIL基因片段瓊脂糖電泳后,依次通過酶切鑒定、套式PCR鑒定，最后通過計算機圖像掃描系統(tǒng)分析各株細胞的APRILmRNA的表達量,獲得各細胞株APRILmRNA表達量的相對值，AGS0.09，SGC-79010.61。結(jié)果顯示在胃腺癌細胞株中，SGC-7901的APRILmRNA水平表達相對較高。通過篩選表達APRIL人胃腺癌細胞株，為下一步研究APRIL基因在胃癌發(fā)生、開展中內(nèi)在機制及其信號傳導通路奠定根底。

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