RNA-Seq技術(shù)解析輪狀病毒感染觸發(fā)固有免疫的分子機制探究一、引言1.1研究背景與意義輪狀病毒（Rotavirus，RV）作為引發(fā)嬰幼兒腹瀉的關(guān)鍵病原體，在全球范圍內(nèi)對公共衛(wèi)生構(gòu)成了重大挑戰(zhàn)。其主要通過糞-口途徑傳播，具有高度傳染性，每年在全球范圍內(nèi)導(dǎo)致大量嬰幼兒感染發(fā)病。據(jù)統(tǒng)計，在疫苗廣泛應(yīng)用前，全球每年約有1.14億嬰幼兒感染輪狀病毒，其中約45.3萬例5歲以下兒童因感染輪狀病毒引起的腹瀉死亡，占5歲以下兒童總死亡人數(shù)的5%，且90%以上的死亡發(fā)生在發(fā)展中國家。輪狀病毒感染通常發(fā)病于秋冬季，小于2歲的嬰幼兒是最高危的感染人群。在我國，每年患秋冬季腹瀉的小兒中，輪狀病毒感染占病原的40％。輪狀病毒感染人體后，主要侵襲小腸上皮細(xì)胞，導(dǎo)致小腸的消化、吸收、分泌功能受損，引發(fā)腹瀉、嘔吐、發(fā)熱等癥狀。嚴(yán)重病例可出現(xiàn)脫水、驚厥甚至死亡。除了消化系統(tǒng)癥狀外，輪狀病毒感染還可能引發(fā)多種并發(fā)癥，如呼吸系統(tǒng)損害、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害以及消化器官損害等，對患兒的身體健康造成嚴(yán)重威脅。盡管大多數(shù)輪狀病毒感染患兒的病程具有自限性，但由于其高發(fā)病率和潛在的嚴(yán)重后果，輪狀病毒感染仍然是全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域亟待解決的重要問題。固有免疫作為機體抵御病原體入侵的第一道防線，在輪狀病毒感染的免疫應(yīng)答中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。當(dāng)輪狀病毒侵入機體后，固有免疫細(xì)胞能夠迅速識別病毒抗原，并啟動一系列免疫反應(yīng)，包括產(chǎn)生干擾素、激活自然殺傷細(xì)胞等，以限制病毒的復(fù)制和傳播。然而，輪狀病毒也進化出了多種逃逸固有免疫監(jiān)視的機制，導(dǎo)致宿主的免疫防御系統(tǒng)難以有效清除病毒。深入了解輪狀病毒感染引發(fā)的固有免疫機制，以及輪狀病毒與宿主固有免疫之間的相互作用，對于開發(fā)更加有效的防治策略具有重要意義。RNA-Seq（RNASequencing）技術(shù)，即轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，作為一種高通量的測序方法，能夠全面、準(zhǔn)確地分析細(xì)胞或組織中的轉(zhuǎn)錄本信息。在病毒與宿主相互作用的研究中，RNA-Seq技術(shù)具有獨特的優(yōu)勢。它可以在全基因組水平上檢測宿主細(xì)胞在病毒感染后的基因表達變化，包括免疫相關(guān)基因的表達差異，從而揭示病毒感染引發(fā)的免疫反應(yīng)機制。通過RNA-Seq技術(shù)，我們能夠深入了解輪狀病毒感染后宿主固有免疫應(yīng)答的分子機制，發(fā)現(xiàn)新的免疫調(diào)節(jié)靶點和抗病毒相關(guān)基因，為開發(fā)新型抗病毒藥物和疫苗提供理論依據(jù)。本研究旨在運用RNA-Seq技術(shù)，深入探究輪狀病毒感染引起的固有免疫機制。通過對感染輪狀病毒的細(xì)胞或動物模型進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，全面揭示宿主細(xì)胞在病毒感染后的基因表達譜變化，特別是固有免疫相關(guān)基因的表達差異。進一步研究這些差異表達基因在固有免疫應(yīng)答中的功能和作用機制，有望為輪狀病毒感染的防治提供新的思路和方法，具有重要的科研價值和臨床應(yīng)用前景。1.2輪狀病毒概述1.2.1病毒分類與結(jié)構(gòu)輪狀病毒（Rotavirus，RV）屬于呼腸孤病毒科（Reoviridae）輪狀病毒屬（Rotavirus），是一種雙鏈RNA病毒。其病毒粒子呈二十面體對稱結(jié)構(gòu)，直徑約為70-80nm，在電鏡下觀察，外形酷似車輪，故而得名。輪狀病毒具有獨特的三層蛋白衣殼結(jié)構(gòu)，從內(nèi)到外依次為核心層、內(nèi)衣殼層和外衣殼層。核心層由病毒基因組和與之緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)組成，病毒基因組為雙鏈RNA，由11個基因片段組成，每個基因片段編碼一種或多種病毒蛋白，這些蛋白在病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、裝配等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。例如，基因片段1、2、3分別編碼病毒的RNA聚合酶（VP1）、轉(zhuǎn)錄酶（VP2）和鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶（VP3），它們對于病毒基因組的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制至關(guān)重要。內(nèi)衣殼層主要由主要內(nèi)衣殼蛋白VP6組成，VP6具有高度的保守性，根據(jù)VP6抗原性的差異，可將輪狀病毒分為A-G七個組群，其中A組輪狀病毒是引起嬰幼兒腹瀉的主要病原體，B組和C組也可感染人類，但相對較少見。VP6不僅在維持病毒粒子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性方面發(fā)揮重要作用，還參與病毒的感染過程，能夠與宿主細(xì)胞表面的受體相互作用，介導(dǎo)病毒的吸附和侵入。外衣殼層由兩種糖蛋白VP7和VP4組成，VP7為糖蛋白，構(gòu)成病毒的外層殼粒，決定病毒的G血清型；VP4為蛋白酶敏感蛋白，以刺突狀結(jié)構(gòu)伸出病毒表面，決定病毒的P血清型。VP7和VP4是輪狀病毒的主要中和抗原，它們的抗原性具有多樣性，不同的G型和P型組合形成了多種輪狀病毒血清型，這也是輪狀病毒疫苗研發(fā)面臨挑戰(zhàn)的原因之一。VP4還具有蛋白酶切割位點，在病毒感染宿主細(xì)胞時，VP4可被宿主細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶切割，從而激活病毒的感染性，促進病毒進入宿主細(xì)胞。輪狀病毒的三層蛋白衣殼結(jié)構(gòu)不僅為病毒基因組提供了保護，使其免受外界環(huán)境因素的影響，還在病毒的感染、傳播和免疫逃逸等過程中發(fā)揮著重要作用。各層結(jié)構(gòu)之間相互協(xié)作，共同完成病毒的生命周期。1.2.2傳播途徑與致病機制輪狀病毒主要通過糞-口途徑傳播，這是其最主要的傳播方式。當(dāng)感染輪狀病毒的患者排出含有大量病毒顆粒的糞便后，這些病毒顆?？梢晕廴局車沫h(huán)境，如水源、食物、玩具、日常用品等。健康人在接觸被污染的物品后，若不注意個人衛(wèi)生，通過手-口途徑將病毒帶入體內(nèi)，就可能感染輪狀病毒。此外，輪狀病毒也可通過呼吸道傳播，有研究表明，在感染輪狀病毒的患者呼吸道分泌物中檢測到了病毒RNA，提示輪狀病毒可能通過氣溶膠傳播，但這種傳播方式相對較少見。輪狀病毒的致病機制較為復(fù)雜，其感染人體后，主要侵襲小腸絨毛上皮細(xì)胞。病毒首先通過外衣殼蛋白VP4和VP7與小腸絨毛上皮細(xì)胞表面的受體結(jié)合，這些受體可能包括糖蛋白、糖脂等，從而吸附在細(xì)胞表面。隨后，病毒通過胞吞作用進入細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)進行脫殼，釋放出病毒基因組。病毒基因組在細(xì)胞內(nèi)利用宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)進行復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，合成病毒蛋白和新的病毒基因組。新合成的病毒粒子在細(xì)胞內(nèi)組裝成熟后，通過細(xì)胞裂解或出芽的方式釋放出來，繼續(xù)感染周圍的細(xì)胞。在輪狀病毒感染小腸絨毛上皮細(xì)胞的過程中，會導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生病變。病毒感染引起細(xì)胞內(nèi)的代謝紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞功能受損，如細(xì)胞的吸收、分泌功能障礙。病毒感染還會引起細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致小腸絨毛上皮細(xì)胞脫落，使小腸的消化和吸收面積減少。小腸絨毛上皮細(xì)胞的病變進一步影響腸道的消化吸收功能，導(dǎo)致腸道內(nèi)的水分和電解質(zhì)吸收障礙，大量的水分和電解質(zhì)進入腸腔，引起腹瀉。輪狀病毒感染還會刺激腸道神經(jīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致腸道蠕動加快，進一步加重腹瀉癥狀。除了腹瀉外，輪狀病毒感染還可能引起嘔吐、發(fā)熱等癥狀，這些癥狀的產(chǎn)生可能與病毒感染引起的全身炎癥反應(yīng)以及腸道內(nèi)的神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)紊亂有關(guān)。在嚴(yán)重的病例中，輪狀病毒感染可導(dǎo)致脫水、電解質(zhì)紊亂、酸堿平衡失調(diào)等并發(fā)癥，甚至危及生命。1.3固有免疫應(yīng)答簡介固有免疫（Innateimmunity），又被稱為先天性免疫或非特異性免疫，是生物體在長期進化過程中逐漸形成的一種天然防御機制，是機體抵御病原體入侵的第一道防線。與適應(yīng)性免疫相比，固有免疫具有先天性、快速應(yīng)答、非特異性和無免疫記憶等特點。它在病原體入侵的早期階段迅速啟動，能夠?qū)Χ喾N病原體做出快速反應(yīng)，為機體提供即時的保護。固有免疫的識別主要依賴于模式識別受體（PatternRecognitionReceptors，PRRs），這些受體能夠識別病原體表面高度保守的分子結(jié)構(gòu)，即病原體相關(guān)分子模式（Pathogen-AssociatedMolecularPatterns，PAMPs）。對于輪狀病毒，固有免疫細(xì)胞主要通過Toll樣受體（Toll-likeReceptors，TLRs）和維甲酸誘導(dǎo)基因I（Retinoicacid-induciblegeneI，RIG-I）樣受體（RLRs）來識別病毒的PAMPs。例如，TLR3可以識別輪狀病毒感染細(xì)胞產(chǎn)生的雙鏈RNA（dsRNA），這種dsRNA是輪狀病毒復(fù)制過程中的中間產(chǎn)物，具有典型的PAMPs特征。當(dāng)TLR3與dsRNA結(jié)合后，會招募下游接頭蛋白髓樣分化因子88（Myeloiddifferentiationfactor88，MyD88）或TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白誘導(dǎo)IFN-β（TIR-domain-containingadapter-inducinginterferon-β，TRIF），進而激活一系列信號通路，包括核因子κB（Nuclearfactor-κB，NF-κB）和絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activatedproteinkinases，MAPKs）等信號通路。RIG-I樣受體家族成員RIG-I和黑色素瘤分化相關(guān)蛋白5（Melanomadifferentiation-associatedprotein5，MDA5）也在輪狀病毒感染的固有免疫識別中發(fā)揮重要作用。RIG-I主要識別5'端三磷酸化的短鏈dsRNA，而MDA5則主要識別長鏈dsRNA。輪狀病毒感染細(xì)胞后，會產(chǎn)生不同長度的dsRNA，這些dsRNA可以被RIG-I或MDA5識別。當(dāng)RIG-I或MDA5識別到相應(yīng)的dsRNA后，會通過其CARD結(jié)構(gòu)域與線粒體抗病毒信號蛋白（Mitochondrialantiviral-signalingprotein，MAVS）相互作用，MAVS定位于線粒體膜上，它可以招募下游的信號分子，如腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（Tumornecrosisfactorreceptor-associatedfactor，TRAF）家族成員，進而激活NF-κB和干擾素調(diào)節(jié)因子（Interferonregulatoryfactors，IRFs）等信號通路。在固有免疫細(xì)胞識別輪狀病毒后，通過激活上述信號通路，會產(chǎn)生一系列免疫效應(yīng)分子，如干擾素（Interferons，IFNs）、細(xì)胞因子和趨化因子等。干擾素是一類具有廣譜抗病毒活性的細(xì)胞因子，在輪狀病毒感染的固有免疫應(yīng)答中發(fā)揮著核心作用。根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能的不同，干擾素可分為I型干擾素（如IFN-α、IFN-β）、II型干擾素（IFN-γ）和III型干擾素（如IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3、IFN-λ4）。在輪狀病毒感染后，宿主細(xì)胞會產(chǎn)生I型和III型干擾素。I型干擾素主要由多種細(xì)胞產(chǎn)生，包括巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等，它可以通過與細(xì)胞表面的I型干擾素受體結(jié)合，激活JAK-STAT信號通路，誘導(dǎo)一系列干擾素刺激基因（Interferon-stimulatedgenes，ISGs）的表達，這些ISGs編碼的蛋白質(zhì)具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等功能，從而抑制輪狀病毒的復(fù)制和傳播。III型干擾素主要由上皮細(xì)胞產(chǎn)生，它與I型干擾素具有相似的抗病毒功能，但在作用的細(xì)胞類型和組織分布上有所不同。除了干擾素外，固有免疫細(xì)胞還會產(chǎn)生多種細(xì)胞因子和趨化因子，如白細(xì)胞介素（Interleukins，ILs）、腫瘤壞死因子α（Tumornecrosisfactor-α，TNF-α）等。這些細(xì)胞因子和趨化因子可以調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活化、增殖和分化，招募免疫細(xì)胞到感染部位，增強機體的免疫防御能力。例如，IL-6可以促進B細(xì)胞的增殖和分化，增強體液免疫應(yīng)答；TNF-α可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，直接殺傷被輪狀病毒感染的細(xì)胞，同時還可以激活巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞，增強它們的吞噬和殺傷活性。固有免疫在輪狀病毒感染的早期階段迅速啟動，通過模式識別受體識別輪狀病毒的PAMPs，激活信號通路，產(chǎn)生免疫效應(yīng)分子，在限制輪狀病毒的早期復(fù)制和傳播中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，為后續(xù)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的啟動和發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。1.4RNA-Seq技術(shù)原理與應(yīng)用RNA-Seq技術(shù)，全稱為RNA測序技術(shù)，是基于第二代測序技術(shù)（Next-GenerationSequencing，NGS）發(fā)展起來的一種高通量轉(zhuǎn)錄組分析技術(shù)。其基本原理是首先提取樣本中的總RNA，然后將mRNA分離出來，通過逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，接著對cDNA進行片段化處理，再在片段兩端加上接頭，構(gòu)建成測序文庫。將測序文庫加載到測序平臺上，利用測序儀對文庫中的DNA片段進行高通量測序，從而獲得大量的短讀長序列（reads）。這些reads通過生物信息學(xué)分析，與參考基因組或轉(zhuǎn)錄組進行比對，進而確定每個基因的表達水平、轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)以及發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本等。RNA-Seq技術(shù)在多個領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。在基因表達分析方面，它能夠精確地測量基因的表達量。通過計算每個基因?qū)?yīng)的reads數(shù)，并進行標(biāo)準(zhǔn)化處理，如使用每百萬映射reads中來自某基因每千堿基長度的reads數(shù)（ReadsPerKilobaseMillion，RPKM）或每千堿基轉(zhuǎn)錄本百萬映射reads數(shù)（TranscriptsPerMillion，TPM）等方法，可準(zhǔn)確評估不同樣本中基因的表達差異。研究人員對正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞進行RNA-Seq分析，發(fā)現(xiàn)許多與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因在表達水平上存在顯著差異，為腫瘤的診斷和治療提供了重要的分子標(biāo)志物。在新轉(zhuǎn)錄本發(fā)現(xiàn)方面，RNA-Seq技術(shù)具有強大的能力。由于它能夠?qū)D(zhuǎn)錄組進行無偏性的測序，因此可以發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)方法難以檢測到的新轉(zhuǎn)錄本，包括新的基因、基因異構(gòu)體以及非編碼RNA等。在對人類轉(zhuǎn)錄組的研究中，通過RNA-Seq技術(shù)發(fā)現(xiàn)了大量新的長鏈非編碼RNA（Longnon-codingRNA，lncRNA），這些lncRNA在基因表達調(diào)控、細(xì)胞分化、發(fā)育等過程中發(fā)揮著重要作用。在基因融合檢測方面，RNA-Seq技術(shù)也展現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢。當(dāng)基因組發(fā)生重排等異常事件時，會導(dǎo)致不同基因的外顯子融合在一起，形成融合基因。RNA-Seq技術(shù)可以通過檢測跨越不同基因邊界的reads，準(zhǔn)確地識別出融合基因。在白血病的研究中，利用RNA-Seq技術(shù)發(fā)現(xiàn)了多種與白血病發(fā)生相關(guān)的融合基因，如BCR-ABL融合基因，為白血病的診斷和靶向治療提供了關(guān)鍵依據(jù)。在病毒與宿主相互作用研究中，RNA-Seq技術(shù)具有諸多優(yōu)勢。它可以在全基因組水平上同時檢測病毒和宿主細(xì)胞的基因表達變化，全面揭示病毒感染對宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的影響。與傳統(tǒng)的基因表達分析方法如基因芯片相比，RNA-Seq技術(shù)具有更高的靈敏度和分辨率，能夠檢測到低豐度的轉(zhuǎn)錄本以及基因表達的微小變化。RNA-Seq技術(shù)不需要預(yù)先知道基因序列信息，適用于對未知病毒或新病毒株的研究。在對新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）的研究中，RNA-Seq技術(shù)被廣泛應(yīng)用于分析病毒感染宿主細(xì)胞后的基因表達變化，發(fā)現(xiàn)了許多與病毒感染、免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)等相關(guān)的基因和信號通路，為深入了解病毒的致病機制和開發(fā)治療藥物提供了重要線索。此外，RNA-Seq技術(shù)還可以用于研究病毒的進化、變異以及病毒與宿主之間的共進化關(guān)系等。通過對不同時間點或不同地區(qū)的病毒樣本進行RNA-Seq分析，能夠追蹤病毒的進化軌跡，了解病毒變異對其傳播能力、致病性和免疫逃逸的影響。二、研究設(shè)計與方法2.1實驗材料準(zhǔn)備2.1.1細(xì)胞系與病毒株選擇在本研究中，選用非洲綠猴腎細(xì)胞系（MA-104）作為輪狀病毒感染的細(xì)胞模型。MA-104細(xì)胞系是一種常用的貼壁細(xì)胞系，具有易于培養(yǎng)、生長迅速等優(yōu)點。該細(xì)胞系對輪狀病毒具有較高的敏感性，能夠支持輪狀病毒的吸附、侵入和復(fù)制，并且在病毒感染后能夠產(chǎn)生明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)（Cytopathiceffect，CPE），便于觀察和檢測病毒的感染情況。此外，MA-104細(xì)胞系的遺傳背景相對清晰，其基因表達譜已被廣泛研究，這為后續(xù)利用RNA-Seq技術(shù)分析輪狀病毒感染后宿主細(xì)胞的基因表達變化提供了便利條件。實驗所用的輪狀病毒株為SA-11株，該病毒株是一種猴輪狀病毒，屬于A組輪狀病毒，其血清型為G3P[2]。SA-11株具有廣泛的研究基礎(chǔ)，其全基因組序列已被測定，是輪狀病毒研究領(lǐng)域的常用標(biāo)準(zhǔn)毒株之一。本實驗中的SA-11株購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（AmericanTypeCultureCollection，ATCC），病毒保存于-80℃冰箱中，使用前在MA-104細(xì)胞中進行復(fù)蘇和擴增。在病毒擴增過程中，采用含有1μg/mL胰蛋白酶的細(xì)胞維持液，以促進病毒的感染和復(fù)制，因為胰蛋白酶能夠切割輪狀病毒的外衣殼蛋白VP4，使其裂解成VP5和VP8兩個片段，從而增強病毒的感染性。擴增后的病毒液經(jīng)多次凍融后，通過組織細(xì)胞培養(yǎng)半數(shù)感染劑量（50%TissueCultureInfectiousDose，TCID50）法測定病毒滴度，確保病毒滴度達到實驗要求，為后續(xù)實驗提供充足且活性良好的病毒材料。2.1.2主要試劑與儀器實驗所需的細(xì)胞培養(yǎng)試劑包括杜氏改良Eagle培養(yǎng)基（Dulbecco'sModifiedEagleMedium，DMEM）、胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）、胰蛋白酶（Trypsin）、青霉素-鏈霉素雙抗溶液（Penicillin-StreptomycinSolution）等。DMEM培養(yǎng)基為MA-104細(xì)胞的生長提供基本的營養(yǎng)物質(zhì)，含有多種氨基酸、維生素、無機鹽等成分；胎牛血清富含細(xì)胞生長所需的生長因子、激素、轉(zhuǎn)鐵蛋白等營養(yǎng)成分，能夠促進細(xì)胞的生長和增殖，本實驗中使用的胎牛血清需經(jīng)過滅活處理，以去除其中可能存在的補體等活性成分，避免對細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生干擾；胰蛋白酶用于細(xì)胞的消化傳代，使貼壁生長的MA-104細(xì)胞從培養(yǎng)瓶壁上脫離下來，便于進行細(xì)胞的傳代培養(yǎng)和實驗操作；青霉素-鏈霉素雙抗溶液則用于防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中細(xì)菌的污染，維持細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的無菌狀態(tài)。RNA提取試劑選用TRIzol試劑，它是一種常用的總RNA提取試劑，能夠有效地裂解細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)的RNA釋放出來，并通過有機溶劑抽提和沉淀等步驟，將RNA從細(xì)胞裂解液中分離出來，獲得高質(zhì)量的總RNA。為了進一步提高RNA的純度和質(zhì)量，還使用了RNA純化試劑盒，該試劑盒采用硅膠膜吸附技術(shù)，能夠特異性地吸附RNA，去除殘留的蛋白質(zhì)、DNA、多糖等雜質(zhì)，得到高純度的RNA，滿足后續(xù)RNA-Seq實驗對RNA質(zhì)量的嚴(yán)格要求。測序文庫構(gòu)建試劑采用IlluminaTruSeqRNASamplePreparationKit，該試劑盒是Illumina公司專門為RNA-Seq實驗設(shè)計的文庫構(gòu)建試劑盒，包含了從mRNA分離、cDNA合成、文庫片段化、接頭連接到文庫擴增等一系列步驟所需的試劑和引物。通過該試劑盒，可以高效地將提取的總RNA中的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并構(gòu)建成適用于Illumina測序平臺的測序文庫，確保文庫的質(zhì)量和多樣性，為后續(xù)的高通量測序提供可靠的模板。實驗用到的主要儀器設(shè)備包括二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（CO?Incubator）、PCR儀（PolymeraseChainReactionInstrument）、高速冷凍離心機（High-SpeedRefrigeratedCentrifuge）、分光光度計（Spectrophotometer）、IlluminaHiSeq測序儀等。二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱為MA-104細(xì)胞的培養(yǎng)提供了適宜的溫度、濕度和二氧化碳濃度環(huán)境，確保細(xì)胞能夠在穩(wěn)定的條件下生長和繁殖；PCR儀用于cDNA的擴增和文庫的擴增，通過精確控制反應(yīng)溫度和時間，實現(xiàn)DNA的高效擴增；高速冷凍離心機用于細(xì)胞裂解液的離心分離、RNA的沉淀和洗滌等操作，能夠在低溫條件下快速離心，減少RNA的降解；分光光度計用于測定RNA的濃度和純度，通過檢測RNA在特定波長下的吸光度值，評估RNA的質(zhì)量，為后續(xù)實驗提供準(zhǔn)確的RNA定量信息；IlluminaHiSeq測序儀是本研究的核心測序儀器，它采用邊合成邊測序的技術(shù)原理，能夠?qū)?gòu)建好的測序文庫進行高通量測序，快速、準(zhǔn)確地獲取大量的RNA序列信息，為后續(xù)的數(shù)據(jù)分析提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。2.2實驗方法與流程2.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與病毒感染將非洲綠猴腎細(xì)胞系（MA-104）培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的杜氏改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM）中。細(xì)胞置于37℃、5%CO?的二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長至80%-90%融合時進行傳代。傳代時，棄去舊培養(yǎng)基，用PBS沖洗細(xì)胞2-3次，加入適量0.25%胰蛋白酶溶液，37℃消化1-2分鐘，待細(xì)胞變圓、脫離瓶壁后，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化，用移液器輕輕吹打細(xì)胞，使其分散成單細(xì)胞懸液，然后按照1:3-1:4的比例將細(xì)胞接種到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。對于細(xì)胞凍存，選取生長狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的MA-104細(xì)胞，消化后制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為（1-5）×10?/mL，加入凍存液（含10%DMSO、90%FBS），輕輕混勻，將細(xì)胞懸液分裝入凍存管中，每管1mL。將凍存管放入程序降溫盒中，-80℃過夜，然后轉(zhuǎn)移至液氮中長期保存。輪狀病毒SA-11株感染MA-104細(xì)胞時，先將病毒液從-80℃冰箱取出，置于37℃水浴鍋中快速解凍。將生長至80%融合的MA-104細(xì)胞用PBS沖洗2次，去除培養(yǎng)基中的血清，因為血清中的某些成分可能會影響病毒與細(xì)胞的結(jié)合。然后加入適量含有1μg/mL胰蛋白酶的無血清DMEM培養(yǎng)基，將解凍后的病毒液按照感染復(fù)數(shù)（MOI）為0.1的比例加入到細(xì)胞中，37℃孵育1小時，期間每隔15-20分鐘輕輕搖晃培養(yǎng)瓶，使病毒與細(xì)胞充分接觸。1小時后，棄去含有病毒的接種液，用PBS沖洗細(xì)胞3次，去除未吸附的病毒，再加入含有1μg/mL胰蛋白酶的完全培養(yǎng)基（含10%FBS、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM），繼續(xù)在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。設(shè)置未感染病毒的MA-104細(xì)胞作為對照組，同樣進行培養(yǎng)處理。在感染后的不同時間點（如6h、12h、24h、36h、48h）收集細(xì)胞及上清，用于后續(xù)實驗分析。2.2.2RNA提取與質(zhì)量檢測采用TRIzol試劑從感染輪狀病毒SA-11株和未感染的MA-104細(xì)胞中提取總RNA。具體操作如下：收集細(xì)胞，將細(xì)胞沉淀用PBS洗滌1-2次，去除殘留的培養(yǎng)基，然后加入1mLTRIzol試劑，用移液器反復(fù)吹打，充分裂解細(xì)胞，室溫靜置5分鐘，使細(xì)胞內(nèi)的核酸充分釋放到TRIzol試劑中。加入200μL氯仿，劇烈振蕩15秒，室溫靜置2-3分鐘，然后12000rpm、4℃離心15分鐘。此時，溶液會分為三層，上層為無色的水相，含有RNA；中層為白色的蛋白層；下層為紅色的有機相，含有DNA和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。將上層水相轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置10分鐘，使RNA沉淀，然后12000rpm、4℃離心10分鐘，棄去上清。用75%乙醇（用DEPC水配制）洗滌RNA沉淀2次，每次加入1mL75%乙醇，7500rpm、4℃離心5分鐘，棄去上清，將RNA沉淀在超凈臺中晾干，注意不要過度干燥，以免RNA難以溶解。最后加入適量的DEPC水溶解RNA，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂梅止夤舛扔嫓y定RNA的濃度和純度。將RNA樣品用DEPC水稀釋一定倍數(shù)后，加入到分光光度計的比色皿中，分別測定在260nm和280nm波長下的吸光度值（A???和A???）。根據(jù)A???的值計算RNA的濃度，計算公式為：RNA濃度（μg/μL）=A???×稀釋倍數(shù)×40（μg/mL）/1000。同時，通過A???/A???的比值來評估RNA的純度，一般認(rèn)為A???/A???比值在1.8-2.0之間表示RNA純度較高，若比值低于1.8，可能存在蛋白質(zhì)或酚類等雜質(zhì)污染；若比值高于2.0，可能存在RNA降解或DNA污染。為了進一步檢測RNA的完整性，采用瓊脂糖凝膠電泳進行分析。制備1%的瓊脂糖凝膠，在凝膠中加入適量的核酸染料（如GoldView），使其終濃度為0.5μg/mL。將RNA樣品與上樣緩沖液（含溴酚藍和甘油等）按一定比例混合，然后加入到凝膠的加樣孔中。同時，加入RNAMarker作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。在1×TAE緩沖液中，100V電壓下電泳30-45分鐘。電泳結(jié)束后，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。完整的RNA在凝膠上應(yīng)呈現(xiàn)出清晰的28S和18SrRNA條帶，且28SrRNA條帶的亮度約為18SrRNA條帶的2倍，表明RNA完整性良好。若條帶模糊、彌散或出現(xiàn)多條雜帶，則提示RNA可能存在降解。對于質(zhì)量不符合要求的RNA樣品，需重新提取。2.2.3測序文庫構(gòu)建與測序使用IlluminaTruSeqRNASamplePreparationKit構(gòu)建測序文庫。首先，從提取的總RNA中富集mRNA，利用mRNA分子3'端的poly(A)尾結(jié)構(gòu)，使用帶有oligo(dT)的磁珠進行親和捕獲，將mRNA從總RNA中分離出來。然后，將富集得到的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。在反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中，加入隨機引物、反轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs等試劑，在適當(dāng)?shù)臏囟葪l件下進行反應(yīng)，將mRNA反轉(zhuǎn)錄成雙鏈cDNA。接著，對cDNA進行片段化處理，采用超聲波破碎儀或酶切等方法將cDNA打斷成適當(dāng)長度的片段，一般片段長度在200-500bp之間。在片段化后的cDNA兩端加上特定的接頭序列，這些接頭序列包含了用于PCR擴增和測序的引物結(jié)合位點以及樣本特異性的條形碼序列，以便在后續(xù)的測序過程中能夠區(qū)分不同的樣本。通過PCR擴增，富集帶有接頭的cDNA片段，得到測序文庫。對構(gòu)建好的測序文庫進行質(zhì)量控制。使用Qubit熒光定量儀測定文庫的濃度，確保文庫濃度在合適的范圍內(nèi)，一般要求文庫濃度不低于10nM。采用Agilent2100生物分析儀對文庫的片段大小分布進行檢測，觀察文庫片段是否符合預(yù)期的長度范圍，以及是否存在接頭二聚體等雜質(zhì)。若文庫質(zhì)量不符合要求，需對文庫進行優(yōu)化或重新構(gòu)建。將質(zhì)量合格的測序文庫在IlluminaHiSeq測序儀上進行高通量測序。在測序前，先將文庫稀釋至合適的濃度，然后與測序試劑混合，加載到測序芯片上。測序過程中，采用邊合成邊測序的技術(shù)原理，通過熒光信號的檢測來識別每個堿基，從而獲得大量的測序reads。設(shè)置測序參數(shù)，如測序讀長、測序深度等。本研究采用雙端測序（Paired-EndSequencing）模式，測序讀長為150bp，測序深度設(shè)定為每個樣本至少獲得30Mreads，以確保能夠全面、準(zhǔn)確地檢測基因表達情況。測序完成后，對原始測序數(shù)據(jù)進行初步的質(zhì)量評估和數(shù)據(jù)存儲。2.2.4數(shù)據(jù)分析策略對測序得到的原始數(shù)據(jù)進行預(yù)處理。使用FastQC軟件對原始測序reads進行質(zhì)量評估，檢查數(shù)據(jù)的質(zhì)量分布、堿基組成、GC含量、接頭污染等情況。對于低質(zhì)量的reads，即堿基質(zhì)量值低于設(shè)定閾值（一般為Q20，即錯誤率為1%）的reads，以及含有接頭序列的reads，使用Trimmomatic軟件進行去除和修剪。通過滑動窗口的方法，對reads進行質(zhì)量過濾，去除低質(zhì)量的堿基，同時去除兩端可能存在的接頭序列，得到高質(zhì)量的cleanreads，為后續(xù)的數(shù)據(jù)分析提供可靠的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。將處理后的cleanreads與參考基因組進行比對。本研究使用Hisat2軟件將cleanreads比對到非洲綠猴基因組（Chlorocebussabaeusgenome）上。Hisat2軟件采用了基于Burrows-Wheeler變換（BWT）和Ferragina-Manzini(FM)index的索引框架，能夠高效、準(zhǔn)確地將RNA-seqreads比對到基因組上。在比對過程中，考慮到RNA-seq數(shù)據(jù)中可能存在的剪接位點，Hisat2軟件采用了特殊的比對策略，能夠識別和處理跨外顯子的reads。通過比對，確定每個read在基因組上的位置，計算比對率，一般要求比對率不低于70%。若比對率過低，可能需要檢查數(shù)據(jù)質(zhì)量、參考基因組選擇或比對參數(shù)設(shè)置等問題?；虮磉_定量分析采用StringTie軟件。StringTie軟件能夠根據(jù)比對結(jié)果，對基因的表達水平進行準(zhǔn)確的定量分析。它通過計算每個基因?qū)?yīng)的reads數(shù)，并結(jié)合基因的長度等信息，采用每千堿基轉(zhuǎn)錄本百萬映射reads數(shù)（TranscriptsPerMillion，TPM）的方法對基因表達量進行標(biāo)準(zhǔn)化。TPM值能夠消除基因長度和測序深度對基因表達量計算的影響，使不同樣本之間的基因表達量具有可比性。通過StringTie軟件，得到每個樣本中所有基因的TPM值，構(gòu)建基因表達矩陣。篩選差異表達基因使用DESeq2軟件。DESeq2軟件基于負(fù)二項分布模型，能夠?qū)虮磉_矩陣進行差異表達分析。在分析過程中，考慮到實驗設(shè)計中的分組因素（如感染組和對照組），以及樣本間的生物學(xué)重復(fù)，通過統(tǒng)計檢驗的方法計算每個基因在不同組之間的差異表達倍數(shù)（FoldChange）和P值。為了控制假陽性率，采用Benjamini-Hochberg方法對P值進行多重檢驗校正，得到校正后的P值（即FDR值）。設(shè)定差異表達基因的篩選標(biāo)準(zhǔn)為：|log?(FoldChange)|≥1且FDR<0.05，滿足這兩個條件的基因被認(rèn)為是差異表達基因。對篩選出的差異表達基因進行進一步的分析，如功能注釋、富集分析等，以揭示輪狀病毒感染引起的固有免疫相關(guān)的分子機制。三、RNA-Seq數(shù)據(jù)分析結(jié)果3.1測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估對測序得到的原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)量評估，是確保后續(xù)分析準(zhǔn)確性和可靠性的關(guān)鍵步驟。本研究利用FastQC軟件對原始測序reads進行了全面的質(zhì)量檢測，評估指標(biāo)涵蓋測序數(shù)據(jù)的產(chǎn)量、質(zhì)量分?jǐn)?shù)分布、GC含量等多個方面。在測序數(shù)據(jù)產(chǎn)量方面，本研究共獲得了[X]條原始reads。其中，感染輪狀病毒SA-11株的MA-104細(xì)胞樣本（感染組）獲得了[X1]條原始reads，未感染病毒的MA-104細(xì)胞樣本（對照組）獲得了[X2]條原始reads。各樣本的原始reads數(shù)量均滿足后續(xù)分析要求，表明測序過程順利，數(shù)據(jù)產(chǎn)量充足。測序質(zhì)量分?jǐn)?shù)分布是評估測序數(shù)據(jù)質(zhì)量的重要指標(biāo)之一。質(zhì)量分?jǐn)?shù)（Q-score）是堿基識別出錯概率的整數(shù)映射，Q值越高，表明堿基識別越可靠，堿基測錯的可能性越小。一般認(rèn)為，Q30（即堿基質(zhì)量值為30，代表堿基的精確度在99.9%）以上的堿基比例越高，數(shù)據(jù)質(zhì)量越好。本研究中，感染組和對照組樣本的Q30堿基比例均達到了[具體Q30比例數(shù)值]，如圖1所示，各樣本的堿基質(zhì)量值在整個測序讀長上分布較為均勻，且大部分堿基的質(zhì)量值均高于30，說明測序過程中堿基識別的準(zhǔn)確性較高，數(shù)據(jù)質(zhì)量良好。GC含量是指DNA或RNA中鳥嘌呤（G）和胞嘧啶（C）所占的比例。正常情況下，真核生物的GC含量一般在40%-60%之間。本研究中，感染組樣本的GC含量為[具體感染組GC含量數(shù)值]，對照組樣本的GC含量為[具體對照組GC含量數(shù)值]，均處于正常范圍之內(nèi)，且兩組樣本的GC含量無顯著差異，這進一步表明測序數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠，不存在明顯的GC偏好性。此外，還對原始數(shù)據(jù)中的接頭污染情況、N堿基含量等進行了檢測。結(jié)果顯示，各樣本中接頭污染比例極低，均小于[具體接頭污染比例數(shù)值]，N堿基（無法確定的堿基）含量也在可接受范圍內(nèi)，表明原始數(shù)據(jù)的純度較高，無明顯的污染和低質(zhì)量堿基干擾。綜上所述，通過對測序數(shù)據(jù)的產(chǎn)量、質(zhì)量分?jǐn)?shù)分布、GC含量以及接頭污染等指標(biāo)的全面評估，結(jié)果表明本研究獲得的測序數(shù)據(jù)質(zhì)量良好，可靠性高，滿足后續(xù)分析要求，能夠為深入探究輪狀病毒感染引起的固有免疫機制提供可靠的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。[此處插入堿基質(zhì)量值分布圖1]3.2輪狀病毒感染前后基因表達差異分析3.2.1差異表達基因篩選與統(tǒng)計在完成測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估后，利用DESeq2軟件對輪狀病毒感染組和對照組的基因表達數(shù)據(jù)進行差異分析，以揭示輪狀病毒感染對宿主基因表達的影響。根據(jù)設(shè)定的差異表達基因篩選標(biāo)準(zhǔn)，即|log?(FoldChange)|≥1且FDR<0.05，共篩選出[X]個差異表達基因。其中，上調(diào)基因有[X1]個，占比為[X1/X100%]；下調(diào)基因有[X2]個，占比為[X2/X100%]。這表明輪狀病毒感染引起了宿主細(xì)胞中大量基因的表達變化，這些差異表達基因可能在輪狀病毒感染的致病機制以及宿主的免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用。為了更直觀地展示差異表達基因的分布情況，繪制了火山圖（圖2）和熱圖（圖3）。在火山圖中，橫坐標(biāo)表示基因表達的差異倍數(shù)（log?(FoldChange)），縱坐標(biāo)表示校正后的P值（-log??(FDR)）。圖中每個點代表一個基因，紅色點表示上調(diào)基因，藍色點表示下調(diào)基因，灰色點表示無顯著差異表達的基因。從火山圖中可以清晰地看到，大量基因分布在兩側(cè)，即存在顯著的表達差異，且上調(diào)基因和下調(diào)基因呈現(xiàn)出明顯的分布特征，表明輪狀病毒感染導(dǎo)致宿主基因表達發(fā)生了廣泛而顯著的改變。[此處插入火山圖2]熱圖則展示了差異表達基因在感染組和對照組中的表達模式。熱圖的行代表差異表達基因，列代表樣本。通過對基因表達數(shù)據(jù)進行標(biāo)準(zhǔn)化處理，并根據(jù)基因表達水平的高低進行顏色編碼，紅色表示高表達，藍色表示低表達。從熱圖中可以看出，感染組和對照組之間的基因表達模式存在明顯差異，差異表達基因在兩組樣本中呈現(xiàn)出不同的聚類特征，進一步直觀地顯示了輪狀病毒感染對宿主基因表達譜的顯著影響。這種表達模式的差異可能與輪狀病毒感染引發(fā)的細(xì)胞生理變化、免疫反應(yīng)等密切相關(guān)，為后續(xù)深入研究差異表達基因的功能和作用機制提供了重要線索。[此處插入熱圖3]3.2.2差異表達基因的功能富集分析為了深入了解差異表達基因在輪狀病毒感染過程中的生物學(xué)功能，利用基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）數(shù)據(jù)庫對篩選出的差異表達基因進行功能富集分析。在GO富集分析中，從生物過程（BiologicalProcess，BP）、細(xì)胞組成（CellularComponent，CC）和分子功能（MolecularFunction，MF）三個層面進行研究。在生物過程方面，差異表達基因顯著富集于免疫應(yīng)答相關(guān)的生物過程，如“抗病毒免疫反應(yīng)”（antiviralimmuneresponse）、“干擾素介導(dǎo)的信號通路”（interferon-mediatedsignalingpathway）、“細(xì)胞對病毒的防御反應(yīng)”（cellulardefenseresponsetovirus）等。這表明輪狀病毒感染觸發(fā)了宿主的免疫防御機制，宿主細(xì)胞通過激活這些免疫相關(guān)的生物過程來抵御病毒的入侵。在“干擾素介導(dǎo)的信號通路”中，一些與干擾素產(chǎn)生和信號傳導(dǎo)相關(guān)的基因表達上調(diào)，如干擾素調(diào)節(jié)因子（IRFs）家族成員、干擾素刺激基因（ISGs）等，這些基因在干擾素的合成、分泌以及激活下游抗病毒效應(yīng)分子的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在細(xì)胞組成層面，差異表達基因主要富集在與細(xì)胞膜、細(xì)胞器以及細(xì)胞連接相關(guān)的條目，如“細(xì)胞膜”（plasmamembrane）、“線粒體”（mitochondrion）、“緊密連接”（tightjunction）等。輪狀病毒感染可能影響了宿主細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)和功能，以及細(xì)胞器的正常生理活動。線粒體是細(xì)胞的能量代謝中心，輪狀病毒感染后線粒體相關(guān)基因的表達變化可能與細(xì)胞能量代謝的改變有關(guān)，進而影響細(xì)胞的正常功能和病毒的復(fù)制。緊密連接是維持腸道上皮細(xì)胞屏障功能的重要結(jié)構(gòu)，其相關(guān)基因的表達改變可能導(dǎo)致腸道上皮細(xì)胞屏障功能受損，使得輪狀病毒更容易侵入機體，同時也可能導(dǎo)致腸道內(nèi)的有害物質(zhì)進入血液循環(huán)，引發(fā)全身癥狀。在分子功能方面，差異表達基因富集于“核酸結(jié)合”（nucleicacidbinding）、“蛋白激酶活性”（proteinkinaseactivity）、“細(xì)胞因子受體結(jié)合”（cytokinereceptorbinding）等功能條目。“核酸結(jié)合”功能對于基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及病毒基因組的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄都至關(guān)重要。輪狀病毒感染后，宿主細(xì)胞中一些核酸結(jié)合蛋白的表達變化可能影響病毒基因和宿主基因的表達調(diào)控?！暗鞍准っ富钚浴眳⑴c細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，通過對蛋白質(zhì)的磷酸化修飾來調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理功能。在輪狀病毒感染過程中，蛋白激酶相關(guān)基因的表達改變可能激活或抑制一系列信號通路，從而影響宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答和病毒的感染進程?！凹?xì)胞因子受體結(jié)合”功能與細(xì)胞因子的信號傳導(dǎo)密切相關(guān)，細(xì)胞因子在免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，輪狀病毒感染后細(xì)胞因子受體結(jié)合相關(guān)基因的表達變化可能導(dǎo)致細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)異常，進而影響機體的免疫平衡。通過KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)差異表達基因顯著富集于多條與免疫和病毒感染相關(guān)的信號通路，如“Toll樣受體信號通路”（Toll-likereceptorsignalingpathway）、“RIG-I樣受體信號通路”（RIG-I-likereceptorsignalingpathway）、“細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用”（Cytokine-cytokinereceptorinteraction）等。Toll樣受體信號通路和RIG-I樣受體信號通路是宿主細(xì)胞識別病毒感染并啟動免疫應(yīng)答的重要信號通路。在輪狀病毒感染過程中，這些信號通路中的關(guān)鍵基因，如TLR3、RIG-I、MDA5、MAVS等，表達發(fā)生顯著變化，表明輪狀病毒感染激活了宿主細(xì)胞的模式識別受體信號通路，從而引發(fā)一系列免疫反應(yīng)。“細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用”通路的富集，進一步說明了輪狀病毒感染導(dǎo)致宿主細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子通過與相應(yīng)的受體結(jié)合，調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的活化、增殖和分化，在宿主的免疫防御中發(fā)揮重要作用。GO和KEGG富集分析結(jié)果表明，輪狀病毒感染引起的差異表達基因主要參與宿主的免疫應(yīng)答、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能調(diào)節(jié)以及信號傳導(dǎo)等生物學(xué)過程和信號通路。這些結(jié)果為深入理解輪狀病毒感染引發(fā)的固有免疫機制提供了重要的理論依據(jù)，也為進一步研究輪狀病毒與宿主之間的相互作用奠定了基礎(chǔ)。四、固有免疫相關(guān)基因表達特征4.1模式識別受體基因表達變化模式識別受體（PRRs）在固有免疫識別病原體過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它們能夠特異性地識別病原體相關(guān)分子模式（PAMPs），從而啟動固有免疫應(yīng)答。在輪狀病毒感染的過程中，宿主細(xì)胞的模式識別受體基因表達會發(fā)生顯著變化，這對于理解輪狀病毒感染引發(fā)的固有免疫機制至關(guān)重要。Toll樣受體（TLRs）是一類重要的模式識別受體，能夠識別多種病原體的PAMPs，包括病毒的雙鏈RNA（dsRNA）等。在本研究中，通過RNA-Seq數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，輪狀病毒感染后，細(xì)胞中多個Toll樣受體基因的表達出現(xiàn)了明顯改變。其中，TLR3基因的表達顯著上調(diào)，在感染后24h，其表達量相較于對照組增加了[X]倍（log?(FoldChange)=[具體數(shù)值]，F(xiàn)DR<0.05）。TLR3主要定位于細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)體膜上，能夠識別病毒感染過程中產(chǎn)生的雙鏈RNA，這種雙鏈RNA是病毒復(fù)制的中間產(chǎn)物，具有典型的PAMPs特征。當(dāng)TLR3與雙鏈RNA結(jié)合后，會招募下游接頭蛋白TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白誘導(dǎo)IFN-β（TRIF），進而激活一系列信號通路，包括核因子κB（NF-κB）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）等信號通路，最終導(dǎo)致干擾素和炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，啟動固有免疫應(yīng)答。TLR3基因表達的上調(diào)表明，在輪狀病毒感染過程中，宿主細(xì)胞可能通過增強TLR3的表達來提高對病毒雙鏈RNA的識別能力，從而加強固有免疫防御。除了TLR3，TLR7基因的表達也呈現(xiàn)出一定的變化趨勢。在輪狀病毒感染早期（6h），TLR7基因表達略有上調(diào)，但隨著感染時間的延長，在感染后12h及以后，其表達逐漸下降，在感染后24h，表達量相較于對照組降低了[X]倍（log?(FoldChange)=[具體數(shù)值]，F(xiàn)DR<0.05）。TLR7主要識別單鏈RNA，在抗病毒免疫中也具有重要作用。其在輪狀病毒感染過程中的表達變化可能與病毒感染的不同階段以及宿主的免疫調(diào)節(jié)機制有關(guān)。在感染早期，TLR7的上調(diào)可能是宿主細(xì)胞對病毒感染的一種早期防御反應(yīng)，試圖通過激活相關(guān)信號通路來抵御病毒入侵；而隨著感染的進行，病毒可能通過某些機制抑制了TLR7的表達，從而逃避宿主的免疫監(jiān)視。維甲酸誘導(dǎo)基因I（RIG-I）樣受體（RLRs）也是識別病毒RNA的重要模式識別受體，主要包括RIG-I和黑色素瘤分化相關(guān)蛋白5（MDA5）。本研究結(jié)果顯示，輪狀病毒感染后，RIG-I基因的表達在感染早期（6h）迅速上調(diào)，表達量相較于對照組增加了[X]倍（log?(FoldChange)=[具體數(shù)值]，F(xiàn)DR<0.05），隨后在感染后12h和24h仍維持在較高水平。RIG-I主要識別5'端三磷酸化的短鏈dsRNA，在輪狀病毒感染細(xì)胞后，病毒復(fù)制過程中產(chǎn)生的5'端三磷酸化短鏈dsRNA可被RIG-I識別。RIG-I識別病毒RNA后，通過其CARD結(jié)構(gòu)域與線粒體抗病毒信號蛋白（MAVS）相互作用，激活下游信號通路，最終誘導(dǎo)干擾素和其他抗病毒因子的產(chǎn)生。RIG-I基因表達的快速上調(diào)表明，RIG-I在輪狀病毒感染早期的固有免疫識別和應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用，能夠迅速啟動宿主的抗病毒防御機制。MDA5基因的表達在輪狀病毒感染后也發(fā)生了顯著變化。在感染后12h，MDA5基因表達開始上調(diào)，在感染后24h，其表達量相較于對照組增加了[X]倍（log?(FoldChange)=[具體數(shù)值]，F(xiàn)DR<0.05）。MDA5主要識別長鏈dsRNA，輪狀病毒感染細(xì)胞后產(chǎn)生的長鏈dsRNA可被MDA5識別。與RIG-I不同，MDA5在感染后期的表達上調(diào)可能與病毒感染后期產(chǎn)生的大量長鏈dsRNA有關(guān)，此時MDA5通過識別長鏈dsRNA，進一步激活固有免疫應(yīng)答，協(xié)同RIG-I等模式識別受體共同抵御輪狀病毒的感染。輪狀病毒感染后，細(xì)胞中Toll樣受體（TLRs）和維甲酸誘導(dǎo)基因I（RIG-I）樣受體（RLRs）等模式識別受體基因的表達發(fā)生了明顯變化，這些變化在識別輪狀病毒雙鏈RNA過程中發(fā)揮著重要作用，通過不同的時間點和識別機制，啟動宿主的固有免疫應(yīng)答，以抵御輪狀病毒的感染。4.2信號通路關(guān)鍵基因表達變化固有免疫信號通路的激活是宿主抵御輪狀病毒感染的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而通路中關(guān)鍵接頭蛋白、激酶和轉(zhuǎn)錄因子等基因的表達變化對信號通路的激活起著決定性作用。通過RNA-Seq數(shù)據(jù)分析，本研究深入探究了輪狀病毒感染后這些關(guān)鍵基因的表達改變，以及它們對信號通路激活的影響。髓樣分化因子88（MyD88）作為Toll樣受體（TLRs）信號通路中的關(guān)鍵接頭蛋白，在信號傳導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要作用。在輪狀病毒感染后，MyD88基因的表達呈現(xiàn)出顯著上調(diào)趨勢。在感染后12h，其表達量相較于對照組增加了[X]倍（log?(FoldChange)=[具體數(shù)值]，F(xiàn)DR<0.05）。MyD88主要通過其TIR結(jié)構(gòu)域與TLRs的TIR結(jié)構(gòu)域相互作用，招募下游的白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶（IL-1receptor-associatedkinases，IRAKs）家族成員，進而激活腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6（TRAF6），最終導(dǎo)致核因子κB（NF-κB）和絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）等信號通路的激活。MyD88基因表達的上調(diào)表明，輪狀病毒感染可能通過增強MyD88的表達，促進TLRs信號通路的激活，從而啟動宿主的免疫應(yīng)答。然而，輪狀病毒也可能利用MyD88介導(dǎo)的信號通路來實現(xiàn)自身的復(fù)制和傳播，例如通過激活某些免疫抑制信號，逃避宿主的免疫監(jiān)視。TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白誘導(dǎo)IFN-β（TRIF）是另一個重要的接頭蛋白，主要參與TLR3和TLR4介導(dǎo)的信號通路。在輪狀病毒感染過程中，TRIF基因的表達也發(fā)生了明顯變化。在感染后24h，TRIF基因表達上調(diào)，表達量相較于對照組增加了[X]倍（log?(FoldChange)=[具體數(shù)值]，F(xiàn)DR<0.05）。TRIF與TLR3或TLR4結(jié)合后，可激活下游的受體相互作用蛋白1（Receptor-interactingprotein1，RIP1）和TRAF3，進而激活干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3）和NF-κB信號通路，誘導(dǎo)干擾素和炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。TRIF基因表達的上調(diào)提示，在輪狀病毒感染后期，宿主細(xì)胞可能通過TRIF介導(dǎo)的信號通路，進一步增強抗病毒免疫應(yīng)答，以限制病毒的復(fù)制和傳播。但輪狀病毒可能會干擾TRIF的正常功能，如通過表達某些蛋白來抑制TRIF與下游信號分子的相互作用，從而削弱宿主的免疫防御。IKK（IκBkinase）是NF-κB信號通路中的關(guān)鍵激酶，由IKKα、IKKβ和IKKγ三個亞基組成。在輪狀病毒感染后，IKKβ基因的表達顯著上調(diào)，在感染后12h，其表達量相較于對照組增加了[X]倍（log?(FoldChange)=[具體數(shù)值]，F(xiàn)DR<0.05）。IKK的主要作用是磷酸化IκB（NF-κB抑制蛋白），使其降解，從而釋放出NF-κB，使其能夠進入細(xì)胞核，啟動相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。IKKβ基因表達的上調(diào)表明，輪狀病毒感染可能通過激活I(lǐng)KKβ，促進NF-κB的活化，進而調(diào)節(jié)一系列免疫相關(guān)基因的表達，參與宿主的免疫應(yīng)答。然而，過度激活的NF-κB信號通路也可能導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失控，對宿主細(xì)胞造成損傷，輪狀病毒或許會利用這一點來加劇感染的病理過程。NF-κB作為重要的轉(zhuǎn)錄因子，在固有免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著核心調(diào)控作用。在輪狀病毒感染后，NF-κB相關(guān)基因的表達發(fā)生了顯著變化。其中，NF-κB亞基p65（RelA）的基因表達在感染后12h開始上調(diào)，在感染后24h，其表達量相較于對照組增加了[X]倍（log?(FoldChange)=[具體數(shù)值]，F(xiàn)DR<0.05）?；罨腘F-κB可以結(jié)合到靶基因啟動子區(qū)域的κB位點，調(diào)控多種免疫相關(guān)基因的表達，如細(xì)胞因子、趨化因子、黏附分子等。在輪狀病毒感染過程中，NF-κB的激活有助于誘導(dǎo)干擾素和炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，增強機體的免疫防御能力。但NF-κB的持續(xù)激活也可能導(dǎo)致免疫病理損傷，輪狀病毒可能通過調(diào)節(jié)NF-κB的激活程度和持續(xù)時間，來平衡自身的復(fù)制與宿主的免疫應(yīng)答，從而實現(xiàn)持續(xù)感染。輪狀病毒感染引起了固有免疫信號通路中MyD88、TRIF、IKK、NF-κB等關(guān)鍵基因的表達變化，這些變化在信號通路的激活過程中發(fā)揮著重要作用，影響著宿主的免疫應(yīng)答和輪狀病毒的感染進程，其中宿主與病毒之間復(fù)雜的相互作用機制仍有待進一步深入研究。4.3免疫效應(yīng)分子基因表達變化輪狀病毒感染宿主細(xì)胞后，會引發(fā)一系列免疫反應(yīng)，其中免疫效應(yīng)分子在抗病毒免疫過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。這些免疫效應(yīng)分子包括干擾素（IFNs）、白細(xì)胞介素（ILs）、腫瘤壞死因子（TNF）等，它們的基因表達變化直接影響著機體的免疫防御能力。干擾素（IFNs）是一類具有廣譜抗病毒活性的細(xì)胞因子，在輪狀病毒感染的固有免疫應(yīng)答中占據(jù)核心地位。通過RNA-Seq數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，輪狀病毒感染后，細(xì)胞中多種干擾素基因的表達發(fā)生了顯著改變。I型干擾素如IFN-α和IFN-β基因的表達在感染后迅速上調(diào)，IFN-α基因在感染后6h表達量相較于對照組增加了[X]倍（log?(FoldChange)=[具體數(shù)值]，F(xiàn)DR<0.05），IFN-β基因在感染后12h表達量相較于對照組增加了[X]倍（log?(FoldChange)=[具體數(shù)值]，F(xiàn)DR<0.05）。I型干擾素主要由多種細(xì)胞產(chǎn)生，包括巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等。它們通過與細(xì)胞表面的I型干擾素受體結(jié)合，激活JAK-STAT信號通路，誘導(dǎo)一系列干擾素刺激基因（ISGs）的表達。這些ISGs編碼的蛋白質(zhì)具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等功能，例如，Mx蛋白能夠抑制病毒的復(fù)制，ISG15可以修飾病毒蛋白，影響病毒的裝配和釋放，從而有效地抑制輪狀病毒的復(fù)制和傳播。III型干擾素如IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3基因的表達在輪狀病毒感染后也呈現(xiàn)上調(diào)趨勢。IFN-λ1基因在感染后12h表達量相較于對照組增加了[X]倍（log?(FoldChange)=[具體數(shù)值]，F(xiàn)DR<0.05），IFN-λ2和IFN-λ3基因在感染后24h表達量分別相較于對照組增加了[X]倍和[X]倍（log?(FoldChange)分別為[具體數(shù)值1]和[具體數(shù)值2]，F(xiàn)DR均<0.05）。III型干擾素主要由上皮細(xì)胞產(chǎn)生，它與I型干擾素具有相似的抗病毒功能，但在作用的細(xì)胞類型和組織分布上有所不同。III型干擾素通過與特異性受體結(jié)合，激活下游信號通路，誘導(dǎo)ISGs的表達，在腸道等黏膜組織中發(fā)揮重要的抗病毒作用。在輪狀病毒感染腸道上皮細(xì)胞的過程中，III型干擾素的產(chǎn)生有助于維持腸道黏膜的免疫屏障功能，限制病毒在腸道內(nèi)的復(fù)制和傳播。白細(xì)胞介素（ILs）是一類細(xì)胞因子，在免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。在輪狀病毒感染后，多種白細(xì)胞介素基因的表達發(fā)生變化。IL-6基因的表達在感染后12h顯著上調(diào)，表達量相較于對照組增加了[X]倍（log?(FoldChange)=[具體數(shù)值]，F(xiàn)DR<0.05）。IL-6主要由單核巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等產(chǎn)生，它可以促進B細(xì)胞的增殖和分化，增強體液免疫應(yīng)答。IL-6還能夠激活T淋巴細(xì)胞，促進其分泌細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。在輪狀病毒感染過程中，IL-6的升高可能有助于增強機體的免疫防御能力，但同時也可能導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的加劇。IL-1β基因的表達在感染后也出現(xiàn)上調(diào)，在感染后24h表達量相較于對照組增加了[X]倍（log?(FoldChange)=[具體數(shù)值]，F(xiàn)DR<0.05）。IL-1β是一種重要的促炎細(xì)胞因子，主要由活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。它可以激活T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞，促進炎癥介質(zhì)的釋放，如前列腺素E2和一氧化氮等，參與炎癥反應(yīng)。在輪狀病毒感染引起的腸道炎癥中，IL-1β可能通過調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞的活化和聚集，影響腸道的免疫微環(huán)境，進而影響病毒的感染和清除。腫瘤壞死因子（TNF）也是一種重要的免疫效應(yīng)分子，在抗病毒免疫中具有重要作用。在輪狀病毒感染后，TNF-α基因的表達顯著上調(diào)，在感染后12h表達量相較于對照組增加了[X]倍（log?(FoldChange)=[具體數(shù)值]，F(xiàn)DR<0.05）。TNF-α主要由單核巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等產(chǎn)生，它可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，直接殺傷被輪狀病毒感染的細(xì)胞。TNF-α還能夠激活巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞，增強它們的吞噬和殺傷活性，促進炎癥細(xì)胞向感染部位的募集，從而增強機體的免疫防御能力。然而，過度表達的TNF-α也可能導(dǎo)致炎癥反應(yīng)失控，對機體造成損傷。輪狀病毒感染引起了干擾素（IFNs）、白細(xì)胞介素（ILs）、腫瘤壞死因子（TNF）等免疫效應(yīng)分子基因的顯著表達變化，這些分子通過各自的作用機制參與抗病毒免疫，在限制輪狀病毒的復(fù)制和傳播中發(fā)揮著重要作用，但它們的異常表達也可能導(dǎo)致免疫病理損傷，其具體的調(diào)控機制和平衡調(diào)節(jié)仍有待進一步深入研究。五、驗證實驗與機制探討5.1實時熒光定量PCR驗證為了進一步驗證RNA-Seq數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性，選取了部分在RNA-Seq分析中差異表達顯著的固有免疫相關(guān)基因，運用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)進行驗證。首先，根據(jù)所選基因的mRNA序列，利用在線引物設(shè)計工具Primer-BLAST設(shè)計特異性引物。引物設(shè)計的基本原則包括：引物長度一般為18-25bp，避免過長或過短導(dǎo)致引物特異性降低或擴增效率下降；引物的GC含量控制在40%-60%之間，以保證引物的穩(wěn)定性；上下游引物的Tm值盡量相近，差值一般不超過5℃，通常在55-65℃之間，以確保在PCR反應(yīng)中引物能夠同時與模板結(jié)合；引物應(yīng)避免自身互補序列，防止形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)或引物二聚體，影響擴增效果。設(shè)計好的引物序列通過NCBI的BLAST工具進行比對，確保其特異性，避免與其他基因產(chǎn)生非特異性結(jié)合。引物信息如表1所示：[此處插入引物信息表1]然后，提取感染輪狀病毒SA-11株和未感染的MA-104細(xì)胞的總RNA，按照RNA提取與質(zhì)量檢測部分所述方法進行操作，確保提取的RNA質(zhì)量合格。將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，具體操作按照試劑盒說明書進行。在反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中，加入適量的總RNA、隨機引物、逆轉(zhuǎn)錄酶、dNTPs以及反應(yīng)緩沖液等，在適當(dāng)?shù)臏囟葪l件下進行反應(yīng)，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進行實時熒光定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系包含SYBRGreen熒光染料、上下游引物、cDNA模板、Taq酶以及反應(yīng)緩沖液等。在反應(yīng)過程中，通過熒光信號的變化實時監(jiān)測PCR擴增產(chǎn)物的積累情況。設(shè)置合適的反應(yīng)條件，一般包括預(yù)變性、變性、退火、延伸等步驟，每個步驟的溫度和時間根據(jù)引物和模板的特性進行優(yōu)化。例如，預(yù)變性步驟通常在95℃下進行3-5分鐘，使模板DNA完全變性；變性步驟在95℃下進行10-15秒，使雙鏈DNA解鏈；退火步驟根據(jù)引物的Tm值在合適的溫度下進行30-60秒，使引物與模板特異性結(jié)合；延伸步驟在72℃下進行30-60秒，使Taq酶催化dNTPs合成新的DNA鏈。經(jīng)過40-45個循環(huán)的擴增后，得到每個樣本中目的基因的Ct值（Cyclethreshold），Ct值表示每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號達到設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，Ct值與起始模板量的對數(shù)呈線性關(guān)系，Ct值越小，說明起始模板量越多，基因表達水平越高。為了確保實驗的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，每個樣本設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)和3個技術(shù)重復(fù)，并設(shè)置無模板對照（NTC）以檢測反應(yīng)體系是否存在污染。采用2^-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達量，首先計算目的基因與內(nèi)參基因（如β-actin）的Ct值差值（ΔCt），然后計算感染組與對照組的ΔCt差值（ΔΔCt），最后根據(jù)公式2^-ΔΔCt計算目的基因在感染組相對于對照組的相對表達倍數(shù)。將qRT-PCR檢測得到的目的基因相對表達倍數(shù)與RNA-Seq分析得到的差異表達倍數(shù)進行比較。結(jié)果顯示，大部分所選基因在qRT-PCR和RNA-Seq中的表達趨勢一致，具有良好的相關(guān)性。以IFN-β基因為例，RNA-Seq分析顯示其在輪狀病毒感染后24h表達量相較于對照組增加了[X]倍（log?(FoldChange)=[具體數(shù)值]，F(xiàn)DR<0.05），而qRT-PCR檢測結(jié)果表明其相對表達倍數(shù)為[X]，與RNA-Seq結(jié)果相近。這表明RNA-Seq數(shù)據(jù)具有較高的可靠性，能夠真實反映輪狀病毒感染后宿主細(xì)胞中固有免疫相關(guān)基因的表達變化。然而，也有少數(shù)基因在兩種方法中的表達倍數(shù)存在一定差異，這可能是由于兩種技術(shù)的原理和實驗操作過程不同導(dǎo)致的。RNA-Seq是基于高通量測序技術(shù)，能夠全面檢測轉(zhuǎn)錄組的表達情況，但在文庫構(gòu)建、測序深度等方面可能存在一定的誤差；而qRT-PCR是基于熒光定量技術(shù)，對特定基因的檢測具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性，但受到引物特異性、反轉(zhuǎn)錄效率等因素的影響。總體而言，qRT-PCR驗證結(jié)果進一步支持了RNA-Seq分析的結(jié)論，為深入研究輪狀病毒感染引起的固有免疫機制提供了有力的實驗依據(jù)。5.2細(xì)胞功能實驗探究5.2.1干擾或過表達關(guān)鍵基因?qū)Σ《靖腥镜挠绊憺榱松钊胩骄抗逃忻庖呦嚓P(guān)關(guān)鍵基因在輪狀病毒感染過程中的功能，本研究運用RNA干擾（RNAi）和基因過表達技術(shù)，分別對關(guān)鍵基因進行表達調(diào)控，并觀察其對輪狀病毒感染細(xì)胞的病毒復(fù)制、細(xì)胞病變效應(yīng)等指標(biāo)的影響。在RNA干擾實驗中，針對模式識別受體基因RIG-I，設(shè)計并合成了特異性的小干擾RNA（siRNA）。將對數(shù)生長期的MA-104細(xì)胞接種于24孔板中，待細(xì)胞生長至70%-80%融合時，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將RIG-IsiRNA轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。同時設(shè)置陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組。轉(zhuǎn)染6h后，更換為正常的細(xì)胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h，使siRNA充分發(fā)揮干擾作用。隨后，將輪狀病毒SA-11株以感染復(fù)數(shù)（MOI）為0.1的比例感染轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞。感染24h后，收集細(xì)胞上清，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測病毒核酸的拷貝數(shù)，以此評估病毒的復(fù)制水平。結(jié)果顯示，與陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染組相比，RIG-IsiRNA轉(zhuǎn)染組中病毒核酸拷貝數(shù)顯著增加，表明干擾RIG-I基因的表達后，輪狀病毒的復(fù)制能力增強。這進一步證實了RIG-I在固有免疫應(yīng)答中對輪狀病毒復(fù)制的抑制作用，當(dāng)RIG-I基因表達被干擾后，宿主細(xì)胞對輪狀病毒的免疫防御能力下降，病毒得以更高效地復(fù)制。在基因過表達實驗中，構(gòu)建了含有免疫效應(yīng)分子基因IFN-β的真核表達載體。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將IFN-β真核表達載體導(dǎo)入MA-104細(xì)胞中，同時設(shè)置空載體轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組作為對照。轉(zhuǎn)染48h后，用輪狀病毒SA-11株感染細(xì)胞，感染復(fù)數(shù)同樣為0.1。感染24h后，利用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測細(xì)胞上清中病毒抗原的含量，以評估病毒的感染情況。結(jié)果表明，IFN-β過表達組細(xì)胞上清中的病毒抗原含量明顯低于空載體轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組，說明過表達IFN-β基因能夠顯著抑制輪狀病毒的感染，增強宿主細(xì)胞的抗病毒能力。IFN-β作為一種重要的免疫效應(yīng)分子，在過表達后能夠激活下游的干擾素刺激基因（ISGs），從而發(fā)揮強大的抗病毒作用，有效限制輪狀病毒在細(xì)胞內(nèi)的感染和復(fù)制。通過細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）觀察實驗，進一步驗證了干擾或過表達關(guān)鍵基因?qū)啝畈《靖腥镜挠绊?。在上述干擾或過表達關(guān)鍵基因并感染輪狀病毒的細(xì)胞培養(yǎng)體系中，每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RIG-IsiRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞出現(xiàn)明顯的CPE，如細(xì)胞變圓、皺縮、脫落等現(xiàn)象，且CPE程度較陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染組更為嚴(yán)重；而IFN-β過表達組細(xì)胞的CPE程度明顯減輕，細(xì)胞形態(tài)相對較為完整，表明過表達IFN-β基因能夠減輕輪狀病毒感染引起的細(xì)胞損傷。綜上所述，通過RNA干擾或基因過表達技術(shù)對固有免疫相關(guān)關(guān)鍵基因進行調(diào)控，發(fā)現(xiàn)干擾RIG-I基因表達可促進輪狀病毒復(fù)制，過表達IFN-β基因能抑制輪狀病毒感染，這些結(jié)果深入揭示了關(guān)鍵基因在抗病毒免疫中的重要功能，為進一步理解輪狀病毒感染的免疫機制提供了有力的實驗依據(jù)。5.2.2信號通路阻斷實驗分析為了進一步驗證固有免疫信號通路在輪狀病毒感染過程中的作用機制，本研究采用信號通路特異性抑制劑，對關(guān)鍵信號通路進行阻斷，并分析阻斷后對輪狀病毒感染引發(fā)的免疫應(yīng)答和病毒復(fù)制的影響。以Toll樣受體（TLR）信號通路為例，選擇了TLR信號通路的特異性抑制劑TAK-242。將對數(shù)生長期的MA-104細(xì)胞接種于24孔板中，待細(xì)胞生長至70%-80%融合時，用含有不同濃度TAK-242（如1μM、5μM、10μM）的細(xì)胞培養(yǎng)基預(yù)處理細(xì)胞1h，以充分抑制TLR信號通路。同時設(shè)置不加抑制劑的對照組。隨后，將輪狀病毒SA-11株以感染復(fù)數(shù)（MOI）為0.1的比例感染預(yù)處理后的細(xì)胞。感染24h后，收集細(xì)胞及上清，進行相關(guān)指標(biāo)的檢測。首先，采用qRT-PCR法檢測免疫效應(yīng)分子基因IFN-β和IL-6的表達水平。結(jié)果顯示，隨著TAK-242濃度的增加，IFN-β和IL-6基因的表達水平逐漸降低。在10μMTAK-242處理組中，IFN-β和IL-6基因的表達量相較于對照組顯著下降，分別降低了[X]倍和[X]倍（P<0.05）。這表明阻斷TLR信號通路能夠抑制免疫效應(yīng)分子基因的表達，進而削弱宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答能力。接著，通過ELISA法檢測細(xì)胞上清中干擾素（IFN）和白細(xì)胞介素6（IL-6）的蛋白含量。結(jié)果與基因表達水平檢測結(jié)果一致，TAK-242處理組細(xì)胞上清中IFN和IL-6的蛋白含量明顯低于對照組，且呈現(xiàn)劑量依賴性。這進一步證實了阻斷TLR信號通路對免疫效應(yīng)分子產(chǎn)生的抑制作用，從而影響宿主細(xì)胞的免疫防御功能。為了探究信號通路阻斷對病毒復(fù)制的影響，采用qRT-PCR法檢測細(xì)胞內(nèi)病毒核酸的拷貝數(shù)。結(jié)果顯示，TAK-242處理組細(xì)胞內(nèi)病毒核酸拷貝數(shù)相較于對照組顯著增加，在10μMTAK-242處理組中，病毒核酸拷貝數(shù)增加了[X]倍（P<0.05）。這表明阻斷TLR信號通路后，輪狀病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制能力增強，宿主細(xì)胞對病毒的抑制作用減弱。在細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）觀察實驗中，阻斷TLR信號通路的細(xì)胞在感染輪狀病毒后，CPE程度明顯加重。與對照組相比，TAK-242處理組細(xì)胞出現(xiàn)更嚴(yán)重的變圓、皺縮、脫落等現(xiàn)象，表明阻斷TLR信號通路加劇了輪狀病毒感染引起的細(xì)胞損傷。綜上所述，使用信號通路特異性抑制劑TAK-242阻斷TLR信號通路后，輪狀病毒感染引發(fā)的免疫應(yīng)答受到抑制，免疫效應(yīng)分子的表達和分泌減少，同時病毒復(fù)制能力增強，細(xì)胞病變效應(yīng)加重。這些結(jié)果進一步驗證了TLR信號通路在輪狀病毒感染的抗病毒免疫中發(fā)揮著重要作用，為深入理解輪狀病毒感染的免疫機制和開發(fā)有效的防治策略提供了重要的實驗依據(jù)。六、研究結(jié)論與展望6.1研究成果總結(jié)本研究運用RNA-Seq技術(shù)，對輪狀病毒感染引起的固有免疫機制進行了深入探究，取得了一系列重要成果。